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AT395076B - Vorrichtung und verfahren fuer die diagnostische bestimmung klinischer parameter - Google Patents

Vorrichtung und verfahren fuer die diagnostische bestimmung klinischer parameter Download PDF

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AT395076B
AT395076B AT0908485A AT908485A AT395076B AT 395076 B AT395076 B AT 395076B AT 0908485 A AT0908485 A AT 0908485A AT 908485 A AT908485 A AT 908485A AT 395076 B AT395076 B AT 395076B
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Ennio Iaccheri
Paola Piro
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Boehringer Biochemia Srl
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Description

AT 395 076 B
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren für die diagnostische Bestimmung klinischer Parameter durch direkte Probenahme von biologischen Materialien.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus einem Träger mit einem Schaft und einer kegelförmigen Spitze, auf welche eine vorbestimmte Menge eines für die zu untersuchenden Parameter spezifischen Antikörpers oder Antigens fixiert ist. Das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren ist durch folgende Stufen gekennzeichnet: a) eine erfindungsgemäße Vorrichtung wird mit dem die zu untersuchenden Parameter enthaltenden biologischen Materialien in Berührung gebracht, b) unspezifisch an die mit Antigen bzw. Antikörpern beschichtete Oberfläche gebundene Antikörper oder Antigene werden ausgewaschen, c) das durch spezifische Bindung fixierte Antigen oder der Antikörper werden mittels chemischer, enzymatischer, immunochemischer oder immunoenzymatischer Reaktionen bestimmt
Die auf der Spitze der erfindungsgemäßen Vorrichtung fixierten Antigene oder Antikörper binden in der Folge durch immunchemische Reaktion die im zu untersuchenden Material anwesenden Antikörper oder Antigene in einem Verhältnis, welches proportional ist zur im Material selbst enthaltenen Menge.
Nach dem Waschen mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Lösung zur Entfernung von Substanzen, welche nichtdurch spezifischeBindungan das vorher an die Vorrichtung fixierte Antigen oder den Antikörper fixiert sind, wird eine direkte quantitative und/oder qualitative Bestimmung des zu untersuchenden klinischen Parameters durchgeführt, indem man auf schon bekannte Techniken zurückgreift, welche chemischen, immunochemischen, immunoenzymatischen, enzymatischen Reaktionen beruhen.
Die Bestimmung vieler Parameter von klinischem Interesse durch Analysebiologischer Flüssigkeiten erforderte bislang die Überführung einer exakt gemessenen Menge in einen geeigneten Behälter, wo sie dann mit einer vorbestimmten Menge an Reagenzien inkubiert werden, um so eine Nachweisreaktion hervorzurufen. Während die konventionellen Methoden keine spezifischen Schwierigkeiten mit sich bringen, wenn die biologischen Materialien leicht zu entnehmen und in relativ hoher Menge verfügbar sind, wie dies üblicherweise der Fall ist bei Urin oder Blut, trifft das nicht zu, wenn analytische Bestimmungen an biologischen Materialien durchgeführt werden müssen, welche in kleinen oder sehr geringen Mengen vorliegen (beispielsweise Exsudate, Eiter, Schleim, Speichel) oder die man schwer aus histologischen verändertem Gewebe und/oder aus Geweben aus schwer zugänglichen Bereichen, z. B. Pusteln, Syphilomen und Geschwüren, gewinnen kann.
Die Nachteile der vorstehend erwähnten Technik werden durch die erfindungsgemäße Vorrichtung und durch das erfindungsgemäße Verfahren überwunden, indem man das zu untersuchende Material auf direktem Wege sammelt, ohne daß man auf eine Messung der Probe zurückgreifen muß. Die Probe kann tatsächlich auf direktem Wege am Patienten gewonnen werden oder anschließend aus ein«: Probe einer Flüssigkeit oder eines biologischen Gewebes, welche nach üblichen Labortechniken gewonnen wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung sind in besondererWeise zur Diagnose von Virusarten und zur analytischen Bestimmung von Progesteron in Milchproben geeignet.
Gegenwärtig basieren die einzig verfügbaren diagnostischen Methoden zum Nachweis von Virusarten in biologischen Geweben (wie während Virusinfektionen oder zur Ermittlung möglicher Träger innerhalb einer Population erforderlich) auf Zellkulturverfahren, welche teure Apparaturen, ausgebildetes Personal und lange Zeit (3 oder mehr Tage) zur Auswertung der Ergebnisse erfordern.
Beispiele für Virusarten, deren Auftreten oft nachgewiesen werden muß, sind unter anderem Herpesvirusarten (Typ 1 und 2), Epstein-Barr-Virus, Varicella-Zoster-Virus, Human-T-Lymphocytes-Virus 3 (HTLV-3).
Es istdeshalb sehr wünschenswert,ein Verfahren bzw.eineVorrichtungzumNachweisder genannten Virusarten zur Hand zu haben, welche auch durch nicht besonders ausgebildetes Personal und ohne besondere Apparaturen durchgefühlt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders einfach, kostensparend, schnell, sich«- und genau. Man kann mit seiner Hilfe jedes Virus nachweisen, vorausgesetzt, daß ein spezifischer Antikörper und ein spezifischer enzym-markierter Antikörperverfügbar ist. Der Antikörper gegen das zubestimmende Virus haftetauf der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Nach der Agglutinationsreaktion wird die Vorrichtung mit dem enzymmaririerten Antikörper in Berührung gebracht und dann in die entsprechende Nachweislösung getaucht, indem man den nichtspezifisch gebundenen enzymmarkierten Antikörper entfernt hat
Im Falle von Herpes-Virus z. B. wird ein monoclonales oder polyclonales Anti-HVS an der Vorrichtung adsorbiert.
In ähnlicher Weise kann eine für den Nachweis von HTLV-3, ein für die als Aquired Immuno Deficiency Syndrome (AIDS) bekannte Krankheit verantwortliches Virus, geeignete Vorrichtung bereitgestellt werden.
Ein anderer wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß es möglich ist, das Virus sogar in -2-
AT 395 076 B inaktiver nichtreplikativer Phase nachzuweisen, während die Zellkulturmethoden es erfordern, daß das Virus replikationsfähig ist, andernfalls eine Aktivierung (mitin der Folge weiteren schwierigen Arbeitsgängen) erforderlich ist.
Eine weitere bevorzugte Anwendungsweiseder Erfindung besteht im Nachweis von Progesteron in Milchproben. 5 Erfindungsgemäß bestehtdiemit einem Antikörperoder einem AntigenbeschichteteSpitzeausKunststoffmaterial, welches gegebenenfalls vorher mit Glutaraldehyd, Cellulosederivaten oder Kieselsäurederivaten behandelt wurde, oder aus mit Kunststoffmaterialien überzogenem Metall oder aus Metallen, welche galvanisch durch Abscheiden von Gold oder anderen kolloidalen Metallen erhalten wurden.
Als geeignete Materialien für die Spitze können Kunststoffmaterialien verwendet werden, welche Antikörper 10 oder Antigene durch Adsorption binden können, wie Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyurethane, Polyvinylchlorid, BUNA-N, Nylon, PoWacrylate, Polymethacrylate, Polytetrafluorethylenharze (TEFLON ®), Phenolharze, Polyacrylamide, DELRIN ®, LEXAN ®, Cellulosederivate, Siliconderivate.
Die genannten Materialien können auch zum Überziehen der Spitze aus Metall dienen.
Die Bindung des Antikörpers oder des Antigens an der Spitze kann chemischer Art sein, sofern das 15 Kunststoffmaterial funktionelle Gruppen, wie Amino-, Hydroxy-, Carboxy- oder Isocyanogruppen, enthält, welche
Proteinverbindungen über eine chemische Bindung fixieren können. Das geeignete Kunststoffmaterial kann durch Eintauchen in auf pH 9 gepufferte Lösung von Glutaraldehyd oder gemäß anderer ähnlicher üblicher, z. B. auf dem Gebiet der Enzymimmobilisierung bekannter Methoden, aktiviert werden.
Methoden zum Überziehen der Spitze mit einem Antikörper oder einem Antigen sind in der US-PS 4 003 988 20 und in IMMUNOASS AY USING ANTIGEN-ENZYME CONJUGATES B. K. Van Weemen und A. H. W. Schuurs
FebsLetters - Bd. 15, Nr. 3 - Juni 1971 - S. 232-5; SOLID PHASE ANTIBODY ASSAY BY MEANS OFENZYME CONJUGATED TO ANTI-IMMUNOGLOBULIN P. Leinikki und Suvi Passila J. Clin. Path., 1976, 29 -S. 1116-20; ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAYWTTHPOLYVALENTGONOCOCCAL ANTIGEN B. R. Brodeur, F. E. Ashton und B. B. Diena The Journal of Medical Microbiology - Bd. 15, Nr. 1 -1981 - S. 1-9; 25 A MICORPLATE ENZYME-IMMUNOASSAY FOR TOXOPLASMA ANTIBODY J. Clin. Path., 1976, S. 150 - 3 und in ENZYMOLOGY (Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides - Preparation and Characterization) Bd. I - Ed. Howard H. Weetall - Marcel Dekker, Inc., New York (1975) beschrieben.
Der oder die zum Überziehen des Trägers erfindungsgemäß verwendeten Antikörper können polyclonal oder monoclonal sein oder gegebenenfalls Gemische davon und können in Bezug auf eine oder mehrere aktive Stellen des 30 zu untersuchenden Antigens spezifisch sein. Überdies kann diese Spezifität auf ein oder mehrere Antigene gerichtet sein.
Sowohl Antikörper als auch Antigene können ohne mengenmäßige Begrenzung auf dem Träger fixiert sein: Allerdings sollte man eine für das beabsichtigte Analyseverfahren geeignete Menge festlegen, welche möglicherweise zwischen einem Picogramm und einem Milligramm pro Quadratzentimeter liegt 35 Beispiele für mögliche Anwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung und Methode sind unter anderem die
Direktbestimmung von Virusarten und/oder Bakterien, die Bestimmung von Antikörpern und/oder Antigenen, welche mit einem spezifischen Krankheitszustand assoziiert sind, die Bestimmung eines Antikörpertiters nach immunologischer Behandlung, die Bestimmung von Drogen und deren Stoffwechselprodukten, die Bestimmung von Hormonen und die Bestimmung gängiger klinischer Parameter. Der Träger kann auch solchermaßen überzogen 40 sein, daß die Bestimmung oder die Prüfung verschiedener, nicht notwendigerweise klinisch bedingter Parameter ermöglicht wird, zum Beispiel die Bestimmung von Chorion-Gonadotropin und Kokain im Urin.
Die Nachweisreaktion wird in geeigneter Weise gewöhnlich ausgeführt mit Hilfe eines mit einem geeigneten Enzym markierten Antikörpers, welcher spezifisch ist für den auf dem Träger nach der Probenahme fixierten Antigen-Antiköiper-Komplex. Zu diesem Zweck wird die den auf ihr fixierten Antigen-Antikörper-Komplex 45 tragende Vorrichtung mit einer geeigneten Puffer- und/oder wäßrigen Lösung gewaschen, um unspezifisch gebundenes Antigen oder Antikörper zu entfernen, und wird anschließend eine geeignete Zeit lang in eine Lösung des genannten, mit einem Enzym konjugierten Antikörpers getaucht und inkubiert.
Die genannten Antikörperlösungen enthalten vorzugsweise nichtionische, ionische und amphotere Puffer- und Emulgiermittel mit einer Konzentration enzymmariderten Antikörpers im Bereich von 0,01 bis 0,005 Gew.-%. Der 50 enzymmarkierte Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex wird anschließendaufdemTrägerfixiert.NachEntfernung möglicherweise unspezifisch gebundenen markierten Antikörpers durch Waschen mit geeigneten Puffer- und/oder wäßrigen Lösungen ermöglicht das Eintauchen des wie vorstehend behandelten Trägers in eine Lösung mit einem auf einem Substrat des Enzyms aufgebauten chromogenen System eine einfache und direkte Antigenbestimmung des enzymatischen Reaktionsproduktes durch colorimetrische, spektrophotometrische oder andere verschiedene 55 Techniken.
Beiliegende, der Veranschaulichung und nicht der Begrenzung der Erfindung dienende Figur zeigt schematisch die erfindungsgemäße Vernichtung. -3-
AT 395 076 B
Mit (1) ist die mit dem Antikörper oder mit dem Antigen überzogene kegelförmige Spitze bezeichnet.
Der Stiel (2) dient als Handgriff und kann eine für die Verwendung bequeme und leicht zu handhabende Gestalt und Größe haben, (3), (4) und (5) bezeichnen den Antikörper, das Antigen bzw. den enzymmarkierten Antikörper.
Die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele erläutern einige mögliche Anwendungsformen der Erfindung.
Beispiel 1: a) Herstellung einer für die Bestimmung von Herpesvirus (HSV) geeigneten Vorrichtung
Die Spitze von Nadeln aus Polyvinylchlorid wurde mit Anü-HSV-2-Antiserum, das im Verhältnis 1:300 mit 50 mM Carbonat-Bicarbonat-Pufferlösung von pH 9,6 verdünnt war, inkubiert. Zum Fixieren des Antiserums auf der Spitze wurde diese in die Vertiefungen eines Mikrogefäßes aus Polyvinylchlorid mit je 0,15 ml Antiserum getaucht Das Mikrogefäß wurde dann 2 Stunden bei 37 °C und anschließend über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtkammer inkubiert.
Am Ende der Inkubation wurden die Nadeln vorsichtig mit salzhaltiger Phosphat-Pufferlösung von pH 7,4 (KH2PO4 15 mM, Na2HPC>4 85 mM, NaCl 15 mM, KCl 25 mM), enthaltend 0,05 % Tween gewaschen, in die Vertiefungen eines anderen Gefäßes mit derselben salzhaltigen Pufferlösung, enthaltend 0,3 % Rinderserumalbumin, eingeführt und eine Stunde bei 37 °C in einer Feuchtkammer inkubiert Diese Behandlung dient dem Zweck, alle möglichen freien Stellen des Polyvinylchlorids abzusättigen, welche in den Folgeschritten ebenso Viruspartikel oder konjugiertes Antiserum adsorbieren könnten.
Auf ähnliche Weise werden Vorrichtungen für die Bestimmung von Epstein-Barr-Virus, Varicella-Zoster-Virus undHuman-T-Lymphocytes-Virus-3 (HTLV) hergestellt
bl ..In-vitro“-Bestimmung von HSV
Nach dem gleichen Schritt wurden die Nadeln während einer kurzen Zeit bei Raumtemperatur mit einer mit Salzlösung (0,9%ige NaCl) l:5-verdünnten HSV-Virus-Suspension in Berührung gebracht.
Nach dem Waschen wurden die Nadeln in Glasreagensröluen eingeführt welche mit Peroxidase konjugiertes HSV-2-Antiserum in einer Verdünnung 1:150 in salzhaltiger Phosphat-Pufferlösung mit0,05 % Tween 20 enthalten. Anschließend inkubierte man 30 bis 40 Minuten bei Raumtemperatur und wusch in salzhaltiger Phosphat-Pufferlösung mit 0,05 % Tween 20, um eine mögliche analytische Wechselwirkung von unspezifisch an das Antigen gebundenem konjugierten Antiserum zu verhindern.
Nach dem letzten Behandlungsschritt wurden die Nadeln in eine Chromogenlösung eingeführt welche aus 3,4 mg Orthophenylendiamin, gelöst in 10 ml Pufferlösung aus gleichen Teilen 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Na2HP04, bestand und der man unmittelbar vor Gebrauch 50 mcl einer 3%igen ^C^-Lösung zugegeben hatte.
Die erhaltenen Ergebnisse konnten die gute Spezifität und Sensitivität dieser Technik beweisen: In der Tat zeigten die positiven Proben mit Hilfe des chromogenen Systems eine intensive Farbe, welche sich von den nahezu farblosen negativen Proben merkbar abhob. c> Bestimmung von HSV durch direkte Probenahme
ZumZweckderDiagnoseeineraktuellenherpesbedingten,dieBildungvon Blasen hervorrufenden Virusinfektion, wird die nach der in a) beschriebenen Verfahrensweise hergestellte Verbindung mit ihrer lanzettartigen Spitze mit einer Blase in Berührung gebracht, wobei die Blase aufbricht und die Flüssigkeit aus der aufgebrochenen Blase mit den vorher auf der Nadel fixierten Anti-HSV-Anükörpem in Berührung kommt
Sobald die Flüssigprobenahme beendet ist, wird die Vorrichtung in eine Ampulle eingeführt, welche 300 mcl einer Lösung von mit Peroxidase konjugiertem Anti-HSV, verdünnt mit 30 mM Phosphat-Pufferlösung, enthaltend 0,05 % Tween 20 sowie 1 % Rinderserumalbumin, enthält
Nach 15 Minuten Inkubation wird der Träger 60 Sekunden mit fließendem Wasser gewaschen und in eine Ampulle überführt, welche 300 mcl einer Lösung von pH 5 enthält, welche die folgende prozentuale (Ge-wicht/Volumen) Zusammensetzung aufweist:
Tetramethylbenzidin 0,02 Zitronensäure 2,10 Natriumperborat 0,07 Natriumphosphat zweibasisch 3,00 Dimethylsulfoxid 20,00 Destilliertes Wasser 75,00 -4-
AT 395 076 B
Nach 15 Minuten Inkubation wird die in der Ampulle enthaltene Lösung untersucht Mögliches Ergebnis: a) keine Farbe bei negativem Ergebnis (Abwesenheit von HSV im Bläschen des Patienten); b) blaue Farbe bei positivem Ergebnis (Abwesenheit von HSV im Bläschen des Patienten). 5
Beispiel 2;
Bestimmung des Antistreptolvsin-OCASQVTiters
Die gemäß der Verfahrensweise nach Beispiel 1 mit Streptolysin überzogene Spitze wird einige Sekunden mit dem zu untersuchenden Serum oder mit einem Tropfen Blut aus einer Fingerspitze stehengelassen. Die Spitze wird 10 mit Wasser gewaschen und in eine Lösung getaucht, welche einen mit einem Enzym (alkalische Phosphatase oder
Peroxidase aus Serum) markierten Anti-IgG-Antikörper enthält. Es bildetsich auf derOberflächeder markierte Anti-IgG-Streptolysin-Antistreptolysin-Komplex aus, welcher nach Eintauchen in eine Lösung des Substrates (Paranitrophenylphosphat und Azinobenzothiazolinsulfonat) sich mehr oder weniger intensiv anfärbt, je nach dem Antikörpertiter des Serums oder des Blutes. 15
Beispiel 3;
Bestimmung von Momhin in Urin oder in Blut
Nach Beschichtung mit einem Antimorphin-Antikörper nach der Verfahrensweise nach Beispiel 1 wird die Spitze in eine Probe des zu untersuchenden Serums oder Blutes getaucht Nach 15 Minuten Inkubation wird die Spitze in 20 eine Lösung von mit Peroxidase konjugiertem Morphin in 30 mM Phosphat-Puffer von pH 7 getaucht. Nach 10 Minuten Inkubationszeit wird die Spitze ausgiebig gewaschen und in eine Testlösung aus Tetramethylbenzidin und Peiborat, hergestellt gemäß Beispiel lc), getaucht
Die Intensität der entwickelten Farbe ist umgekehrt proportional der Morphinkonzentration in dar zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit. 25
Beispiel 4:
Bestimmung von Kokain und Humanchorion-Gonadotronin im Urin
Die kegelförmige Spitze aus Polyvinylchlorid oder Polystyrol wird zur Beschichtung in ein Gemisch von Anti-Benzoylecgonin-Serum (hauptsächliches Stoffwechselprodukt von Kokain beim Menschen) und Anti-30 Humanchorion-Gonadotropin-Serum getaucht
Die verwendeten Antisera können polyclonal (vom Kaninchen oder von der Ziege) oder monoclonal (sowohl in vitro als auch in vivo hergestellt) sein oder aus Ansammlungen beider bestehen. Das Verhältnis beider Antisera im Gemisch wird angemessen ausgewählt, je nach der in der Bestimmung da beiden Parameter zu erreichenden Empfindlichkeit. 35 Entsprechende Verdünnungen in Carbonat-Bicarbonat-Pufferlösungkönnen zwischen 1:50 und 1:50.000liegen.
Beschichtungszeiten liegen zwischen 30 Minuten und 72 Stunden, bei Temperaturen zwischen +4 °C und +60 °C.
Die Spitze wird, sobald sie mit dem Gemisch aus Antisera beschichtet ist, mit einer zweiten Beschichtung aus einer Lösung von unspezifischen Immunoglobulinen oder aus einem normalen Kaninchenserum (anderenfalls kann 40 auch fötales Rinderserum verwendet werden) in einem Phosphat-Puffer bei einer Konzentration zwischen 0,1 und 5 %, unter Zeit- und Temperaturbedingungen, wie bei der Beschichtung mit dem Gemisch aus Antisera, versehen.
Die Spitze wird anschließend gewaschen, um etwaigen Überschuß von Antikörpern oder Proteinen, die nicht an der Spitze fixiert sind, zu entfernen. Auf diese Weise ist die Spitze nach den Waschungen gebrauchsfertig und kann in den zu untersuchenden Urin getaucht werden. 45 Bei Gegenwart eines oder beider Untersuchungsparameter bildet sich ein Komplex zwischen denselben und deren zugehörigem Antikörper, welcher physikalisch auf der Spitze fixiert ist.
Die Spitze wird anschließend gewaschen und in ein Gemisch aus Serum mit Anti-Humanchorion-Gonadotropin, welches mit Peroxidase konjugiert ist, und Benzoylecgonin, welches mit ß-Galactosidase konjugiert ist, getaucht: Das Verhältnis beider markierter Verbindungen soll so sein, daß eine gute Nachweisempfindlichkeit resultiert. 50 Nachdem man genügende Zeit für die Bildung der Komplexe (5 bis 60 Minuten) verstreichen läßt, wird die Spitze noch einmal gewaschen und in eine Lösung eines peroxidasespezifischen Substrats (z. B. Azinobenzothiazolinsulfonat, Phenol-4-amino-antipyrin usw.) und anschließend in eine zweites ß-galactosidasespezifisches Substrat (z. B. Clorphenolrot-ß-galactosid) eingetaucht Die erste Lösung färbt sich in Gegenwart von Humanchorion-Gonadotropin. DieFarbstärke der zweiten Lösungistumgekehrtproportional der Konzentration von Benzoylecgonin 55 in der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit -5-

Claims (9)

  1. AT 395 076 B Beispiel 5; at Herstellung einer für die Bestimmung von Progesteron in biologischen Flüssigkeiten, wie Milch. Urin. Serum und Plasma, geeigneten Vorrichtung S Polyvinylchlorid-Träger mit runder Spitze werden verwendet Man taucht diese Träger in eine Lösung von 2,5%-igem Glutaraldehyd in Phosphat-Puffer von pH 7,5 während einer Zeit zwischen 2 und 8 Stunden bei 37 °C oder bei Raumtemperatur. Anschließend werden die Träger ausgiebig mit einer Phosphat-Pufferlösung oder mit Wasser gewaschei. Anschließend werdet die Träger mit einen Antiprogesteron-Antikörper in Carbonat-Bicarbonat-Pufferlösung 10 von pH 9,6 bei Verdünnungen zwischei 1:100 und 1:1000in Berührung gebracht und man inkubiert 2 Stunden lang bei 37 °C und anschließend übe- Nacht bei 4 °C. NachBeendigung der Inkubationwerden die Trägeausgiebigmit salzhaltiger Phosphat-Pufferlösung, enthaltend 0,05 % Tween 20, von pH 7,4 gewaschen und mit derselben salzhaltigen Pufferlösung von pH 7,4, enthaltend 3 % Rinderserumalbumin, inkubiert und 1 Stunde bei 37 °C stehengelassen. IS Diese Behandlung dientdemZweck, etwaige freie Stellen im Polyvinylchlorid-Träger, die möglicherweise in den Folgeschritten denzubestimmendenProgesteronanteilausderbiologischenFlüssigkeitodernochderProgesteronanteil, der mit dem Enzym konjugiert ist, adsorbieren könnten. bl Bestimmung von Progesteron in Milch 20 Man nimmt den Polyvinylchlorid-Träger in die Hand und taucht ihn in die das zu untersuchende Progesteron enthaltende Milchprobe während ein»' Zeit zwischen 5 und 15 Minuten. Nach Beendigung der Inkubation wird der Träger in ein Reagensglas mit einer Lösung von H-R-Peroxidase-markiertem Progesteron in Phosphat-Pufferlösung von pH 7 getaucht, wobei die Verdünnung zwischen 1:1000 und 1:1.000.000 liegt. Der Träger wird 10 Minuten inkubiert, anschließend ausgiebig mit Phosphat-Pufferlösung oder Wasser gewaschen und in eine Testlösung von 25 TMB und Perborat oder H2O2, wie in Beispiel lc) beschrieben, getaucht. Die entwickelte Farbintensität ist umgekehrt proportional der Progesteronkonzentration in der Milchprobe. Diese Konzentration kann mit Hilfe einer Eichkurve direkt bestimmt werden. Es ist klar ersichtlich, daß diese Methode vollständig auf die Bestimmung von Progesteron in anderen biologischen Flüssigkeiten, wie Urin, Serum und Plasma, übertragen werden kann. 30 PATENTANSPRÜCHE 35 1. Vorrichtung für die diagnostische Bestimmung klinischer Parameter durch direkte Probenahme von biologischen Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Träger miteinem Schaft (2) und einer kegelförmigen Spitze (1), auf welcher eine vorbestimmte Menge eines für die zu untersuchenden Parameter spezifischen Antikörpers oder Antigens fixiert ist, besteht 40
  2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spitze (1) mit Antikörpern gegen Virusarten, wie Herpes-Virus, Epstein-Barr-Virus, Varicella-Zoster-Virus, Human-T-Lymphocytes-Virus (HSV) beschichtet ist
  3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spitze (1) mit einer vorbestimmten Menge Streptolysin beschichtet ist.
  4. 4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spitze (1) mit einer voibestimmten Menge eines Anti-Morphin-Antikörpers beschichtet ist 50
  5. 5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spitze (1) mit einer voibestimmten Menge eines Anti-Progesteron-Antikörpers beschichtet ist
  6. 6. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die miteinem Antikörper oder mit einem 55 Antigen beschichtete Spitze (1) aus Kunststoffmaterial, welches gegebenenfalls vorher mit Glutaraldehyd, Cellulosederivaten oder Kieselsäurederivaten behandelt wurde, oder aus mit Kunststoffmaterial überzogenem Metall oder aus Metallen, welche galvanisch durch Abscheidung von Gold oder anderen kolloidalen Metallen erhalten wurden, besteht -6- AT 395 076 B
  7. 7. Diagnostisches Verfahren zur Bestimmung klinischer Parameter, gekennzeichnet durch folgende Stufen: a) eine Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 7 wird mit den die zu untersuchenden Parameter enthaltenden biologischen Materialien in Berührung gebracht, b) unspezifisch an die mit Antigen bzw. Antikörpern beschichtete Oberfläche gebundene Antikörper oder Antigene werden ausgewaschen, c) das durch spezifische Bindung fixierte Antigen oder der Antikörper werden mittels chemischer, enzymatischer, immunochemischer oder immunoenzymatischer Reaktionen bestimmt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des fixierten Antigens oder Anti-körpers durch Eintauchen des an der Vorrichtung fixierten Antikörper-Antigen- oder Antigen-Antikörper-Komplexes in eine Testlösung, welche Antikörper gegen den Antikörper-Antigen-Komplex oder Antikörper gegen den Antigen-Antikörper-Komplex, die mit geeigneten Enzymen, wie Peroxidase, ß-Galactosidase oder alkalischer Serumphosphatase, konjugiert sind, enthält, undeinedarauffolgendecolorimetrischeReaktionmiteinemchromogenen Substrat der Enzyme durchgeführt wird.
  9. 9. Diagnostisches Verfahren nach den Ansprüchen 7 und 8 zur Bestimmung von Herpes-Virus (HS V) in biologischen Geweben, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen: a) diebiologischen Materialien werden mit der eine vorbestimmte Menge an HS V-Serum beschichteten Vorrichtung in Berührung gebracht, b) die den HSV-HSV-Antikörper-Komplex tragende Vorrichtung wird mit Salzwasser gewaschen, c) die den HS V-HS V-Antiköiper-Komplex tragende Vorrichtung wird in die Anti-HS V-Antiserum in Konjugation mit Peroxidase enthaltende, gepufferte Salzlösung getaucht und darin inkubiert, d) die den enzymmarkierten Komplex tragende Vorrichtung wird gewaschen, e) die den enzymmarkierten Komplex tragende Vorrichtung wird in eine Testlösung, die Orthophenylendiamin und H2O2 und Pufferagenzien und Lösungsmittel enthält, getaucht. Hiezu 1 Blatt Zeichnung -7-
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