DE68917613T2

DE68917613T2 - Natriumdecylsulfat enthaltende Waschlösung, Testsatz und Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden.

Info

Publication number: DE68917613T2
Application number: DE68917613T
Authority: DE
Inventors: Norbert Sarunas Norkus; Margaret J Smith-Lewis; Harold Chester Warren Iii
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1988-02-12
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1995-04-27
Anticipated expiration: 2009-02-11
Also published as: EP0328413B1; DE68917613D1; CA1306676C; JPH01227962A; US4965191A; US5599715A; JPH0731197B2; EP0328413A3; EP0328413A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine verbesserte Waschlösung, einen Testsatz sowie ein Verfahren, das sich für die Bestimmung eines immunologischen Liganden, wie z. B. menschliches chorionisches Gonadotropin (hCG) in flüssigen Proben, wie z. B. biologischen Flüssigkeiten, eignet.
Es besteht ein fortgesetztes Bedürfnis in der medizinischen Praxis, in der Forschung und bei diagnostischen Verfahren zur raschen, genauen und qualitativen oder quantitativen Bestimmung von biologischen Substanzen, die in biologischen Flüssigkeiten in niedrigen Konzentrationen vorliegen. Beispielsweise muß das Verhandensein von Arzneimitteln, Narkotika, Hormonen, Steroiden, Polypeptiden, Prostaglandinen oder infektiösen Organismen im Blut, Urin, im Speichel, in vaginalen Sekretionen, in Samenflüssigkeiten und anderen biologischen Flüssigkeiten in genauer und schneller Weise für eine geeignete Diagnose oder Behandlungsverfahren bestimmt werden.
Um derartige Bestimmungen durchführen zu können, sind verschiedene Methoden zur Isolierung und Identifizierung von biologischen Substanzen entwickelt worden, bei denen spezifische Bindungsreaktionen zwischen der zu bestimmenden Substanz (hier als "Ligand" bezeichnet) und Verbindungen, die spezifisch mit der Substanz reaktiv sind (hier als "Rezeptoren" bezeichnet) durchgeführt werden. Radioaktive Markierungen oder Enzymmarkierungen sind angewandt worden, um den erhaltenen reaktiven Komplex zu bestimmen.
Ein besonderer Testtyp, der entwickelt worden ist, ist als immunometrisches oder als ein "Sandwich"- Bestimmungsverfahren bekannt geworden. Zu einem solchen Bestimmungsverfahren gehört die "Sandwichanordnung" des Liganden (z. B. eines Antigens) mit zwei oder mehreren Rezeptormolekülen (z. B. Antikörpern) die mit der Verbindung in einer nicht-störenden Weise und an verschiedenen epitopischen Zentren einen Komplex bilden. Beispiele für derartige Bestimmungsverfahren werden in verschiedenen Literaturstellen beschrieben, einschließlich den U.S.-Patentschriften 44 86 530 sowie 44 96 654 und der britischen Patentschrift 20 74 727.
Ein Ligand von besonderem Interesse ist menschliches chorionisches Gonadotropin (hCG), ein Hormon, dessen Konzentration bei Frauen kurz nach der Empfängnis ansteigt. Wünschenswert ist es hCG in den angemessenen Konzentrationen zu bestimmen, um die Schwangerschaft früh zu erkennen. Ein sehr geeignetes Bestimmungsverfahren sowie eine Testvorrichtung für hCG-Bestimmungen werden in der EP-Anmeldung 03 21 261 beschrieben, wobei ein biotinylierter Antikörper für hCG eingesetzt wird, der in der Testvorrichtung immobilisiert wird, unter Verwendung eines Acrylamidpolymeren. Im Falle dieses Bestimmungsverfahrens wie auch im Falle anderer bekannter Verfahren wird eine abgepufferte Waschlösung zur Abtrennung des komplex gebundenen Materials von nicht komplex gebundenen Materialien eingesetzt.
Heterogene Sandwich-Bestimmungsverfahren für Analyte, wie z. B. hCG werden von Valkirs und Mitarbeitern in der Literaturstelle Clin. Chem., 31 (9), 1427-1431 (1985) beschrieben. Zum Wegwaschen von nicht komplex gebundenen Materialien durch eine poröse Membran wird eine nicht näher beschriebene Detergens-Lösung verwendet. Zu in üblicherweise verwendeten Detergentien gehören Natriumdodecylsulfat und TRITONTM X-100, ein nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel, wie es beschrieben wird von Qualtiere und Mitarbeitern in der Literaturstelle J. Immun., 119 (3), 1645-1651 (1977), und TWEENTM 20, ein nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel, wie es beschrieben wird von Maggio (Herausgeber), in dem Buch Enzyme-Immunoassay, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, Seiten 181-194.
Es wurde jedoch gefunden, daß die Inhalte der Waschlösung, die verwendet wird, den Hintergrund des Tests zu beeinflussen vermögen. Ein unerwünschter Hintergrund (d. h. bestimmbare Species von anderen Quellen als hCG) machen es schwierig niedrige hCG- Konzentrationen zu ermitteln. Mit anderen Worten, diese bestimmbaren Species von anderen Quellen vermindern die Bestimmungs-Empfindlichkeit. Ist überdies der Hintergrund beständig hoch genug, so besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit von falschen Ergebnissen in den Bestimmungsverfahren.
Dieses Problem wurde wirksam gelöst durch Verwendung einer Waschlösung mit mindestens 0,01 Gew.-% einer Dodecylsulfatverbindung, z. B. Natriumdodecylsulfat. Ungleich anderen ähnlichen oberflächenaktiven Stoffen zeigte sich, daß die Dodecylverbindung den Hintergrund in Bestimmungsverfahren für hCG vermindert.
In den meisten Fällen arbeitet die oben beschriebene Waschlösung zufriedenstellend. Es hat sich jedoch gezeigt, daß wenn die Waschlösung oder wenn Testsätze, die die Waschlösung enthalten, Temperaturen unter 10ºC ausgesetzt werden, während des Transportes oder der Lagerung, die Dodecylsulfatverbindung kristallisiert. Um dies zu vermeiden kann der Verbraucher die Lösung in gewisserweise wärmen. Dies kann jedoch zu einem unerwünschten Zeitverlust vor der Verwendung führen und macht das Bestimmungsverfahren schwerfällig und zeitaufwendig.
Dies ist besonders nachteilig in vielen Situationen, in denen ein unmittelbares Ergebnis erwünscht ist.
Infolgedessen besteht ein Bedürfnis nach einer Waschlösung, die den Bestimmungshintergrund niedrig hält, jedoch nicht der Gefahr einer Kristallisation bei relativ niedrigen Temperaturen unterliegt.
Die oben erwähnten Probleme werden mit einem Testsatz überwunden, der für die Bestimmung eines immunologischen Liganden geeignet ist und umfaßt:
(a) einen oder mehrere Rezeptoren für einen immunologischen Liganden, von denen mindestens einer für Bestimmungen markiert ist, und
(b) eine wäßrige Waschlösung, die auf einen pH- Wert von 5 bis 9 abgepuffert ist,
wobei der Testsatz dadurch gekennzeichnet ist, daß die Waschlösung 1,8 bis 4 Gew.-% Natriumdecylsulfat enthält.
Durch diese Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden bereitgestellt, das die folgenden Stufen umfaßt:
A. Das Kontaktieren einer Probe, von der angenommen wird, daß sie einen immunologischen Liganden enthält, mit einer Testvorrichtung mit einem in Wasser unlöslichen Substrat mit einem oder mehreren Test-Behältnissen, von denen ein jedes eine in Wasser unlösliche, mikroporöse Filtrationsmembran enthält, und wobei in mindestens einem der Testbehältnisse ein erster Rezeptor für den Liganden immobilisiert ist, zur Bildung eines Reaktionsproduktes des Liganden mit dem Rezeptor, wobei der erste Rezeptor unlöslich ist oder unlöslich gemacht werden kann durch eine spezifische Bindungsreaktion,
B. das Kontaktieren der Probe vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktierungsstufe (A) mit einem zweiten Rezeptor für den Liganden, der mit einem Enzym markiert ist, zur Bildung eines bestimmbaren Komplexes des Liganden mit dem ersten und dem zweiten Rezeptor,
C. die Trennung des erhaltenen markierten, unlöslich gemachten Komplexes von nicht komplex gebundenen Materialien durch Abwaschen von nicht umgesetzten Materialien durch die Filtrations-Membran mit einer Waschlösung, die auf einen pH-Wert von 7 bis 8 mit Natriumphosphat abgepuffert ist und 1,8 bis 4 Gew.-% Natriumdecylsulfat enthält,
D. Bestimmung der Menge an bestimmbaren Komplex auf der Filtrations-Membran durch das Kontaktieren des unlöslichen Komplexes mit einem Substrat für das Enzym und einem einen Farbstoff bildenden Reagenz, das einen Farbstoff durch enzymatische Reaktion des Enzymes auf dem Substrat bildet.
Die Waschlösung dieser Erfindung stellt ein Mittel dar, um den Hintergrund in Bestimmungsverfahren, insbesondere Bestimmungsverfahren für immunologische Liganden, wie z. B. hCG, sehr niedrig zu halten. Überdies unterliegt sie nicht den Kristallisationsproblemen, die im Falle von Natriumdodecylsulfat-Waschlösungen auftreten.
Das kritische Merkmal der Waschlösung dieser Erfindung, welche diese Vorteile bietet, ist das Vorhandensein von 1,8 bis 4 Gew.-% Natriumdecylsulfat. Aus dem unten folgenden Beispiel 1 ist offensichtlich, daß ähnliche Verbindungen nicht zu den gleichen Ergebnissen führen.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit eine verbesserte Waschlösung, einen Testsatz und ein Verfahren zur Verwendung im Rahmen analytischer Methoden, bei denen ein bestimmbarer immunologischer Komplex zwischen Ligand und Rezeptor gebildet wird. Wie oben angegeben, besteht ein immunologischer Ligand aus einer Verbindung von biologischen Interesse, die bestimmt werden soll. Spezifische Beispiele von Liganden werden im folgenden beschrieben. Ein Rezeptor ist eine Verbindung, die speziell mit dem Liganden eine Komplexbildung eingeht. Das Verfahren kann angewandt werden, um eine rasche Bestimmung durchzuführen, so daß eine Untersuchung in der Praxis eines Arztes durchgeführt werden kann oder im Haus des Benutzers, unter Gewinnung von unmittelbaren Resultaten. Das Bestimmungsverfahren kann dazu angewandt werden, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines mono- oder multivalenten oder multideterminanten Liganden zu bestimmen. Vorzugsweise wird es angewandt, um einen multideterminanten Liganden zu bestimmen, wie z. B. hCG. Ein monovalenter Ligand hat ein einzelnes epitopisches Zentrum für eine Komplexbildung mit einem Rezeptor. Ein multivalenter Ligand weist zwei oder mehr epitopische Zentren für eine Komplexbildung mit einem Vielfachen des gleichen Rezeptors auf. Ein multideterminanter Ligand weist zwei oder mehrere epitopische Zentren zur Komplexbildung mit zwei oder mehreren verschiedenen Rezeptoren auf.
Spezieller ausgedrückt, läßt sich die vorliegende Erfindung zur Bestimmung eines immunologischen Liganden in Testproben einsetzen, für welche es natürlich vorkommende oder auf synthetischem Wege produzierte spezifische Bindungs-Rezeptoren gibt. Diese Bestimmung oder Untersuchung kann im wesentlichen auf der Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des Liganden beruhen oder es kann sich um eine quantitative Bestimmung der Menge des Liganden handeln. Insbesondere kann die Erfindung zur Bestimmung oder Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten von Tieren, des Menschens oder von Pflanzen eingesetzt werden, vorzugsweise jedoch zur Untersuchung von Flüssigkeiten des Menschens. Zu derartigen Flüssigkeiten gehören, ohne daß eine Begrenzung hierauf beabsichtigt ist, ganzes Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, spinale Flüssigkeit, seminale Flüssigkeit, Tränenflüssigkeit, vaginale Sekretionen, Sputum, Schweiß und dergleichen wie auch Stuhlproben. Es ist ferner möglich flüssige Präparate von menschlichem oder tierischem Gewebe zu untersuchen, wie beispielsweise des skelettalen Muskels, des Herzens, der Niere, der Lungen, des Gehirns, des Knochenmarks, der Haut und dergleichen.
Ein immunologischer Ligand ist im breiten Sinne definiert als eine immunologische Species, die besteht aus (1) einer beliebigen Substanz, die wenn sie einem immunokompetenten Wirt präsentiert wird, zur Bildung eines spezifischen Antikörpers führt, der eine Bindung mit der Substanz einzugehen vermag, oder (2) dem auf diese Weise produzierten Antikörper, wobei der Ligand an einer Antigen-Antikörper-Reaktion teilnimmt.
Zu repräsentativen immunologischen Liganden, die unter Verwendung der Waschlösung der vorliegenden Erfindung bestimmbar sind, gehören primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Arzneimittel, Haptene, Enyzme, Steroide, Lipide, Nukleinsäuren, Hormone, Vitamine, Polysaccharide, Glykolipide, Alkaloide, Organismen [Bakterien (z. B. Streptokokkus A), Protozoen, Pilze, Viren (z. B. Retroviren, wie z. B. HTLV-I oder HIV-I, oder Herpes-Viren, wie z. B. Herpes- Simplex-Viren I und II), Rickettsie und dergleichen ) und Bestandteile hiervon, Blutbestandteile, Gewebe und Organantigene und andere Materialien, die dem Fachmann bekannt sind.
In manchen Fällen ist der Ligand ein Antikörper, der gegen ein Arzneimittel, Hormon, Antibiotikum oder eine andere Verbindung mit antigenen Eigenschaften gerichtet ist. In derartigen Fällen ist der Rezeptor ein antigenes Material, das eine spezifische Komplexbildung mit dem Antikörper von Interesse eingeht. In den Fällen, in der der Ligand ein Antigen ist und der Rezeptor ein Antikörper, können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper verwendet werden und bei diesen kann es sich um ganze Moleküle oder verschiedene Fragmente hiervon handeln. Vorzugsweise werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung biotinylierte monoklonale Antikörper verwendet. In anderen Fällen ist der Ligand ein Antikörper und der Rezeptor ist ein Anti-Antikörper.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform eignet sich die Erfindung zur Bestimmung von hCG als frühem Indikator für eine Schwangerschaft. Im Falle dieser Ausführungsform werden ein oder mehrere unterschiedliche Antikörper für hCG mit dem Antigen unter Bildung eines immunologischen Komplexes umgesetzt. Einer der Antikörper ist für die Bestimmung in geeigneter Weise markiert. Nicht komplex gebundene Materialien werden dann von dem bestimmbaren Komplex entfernt, und zwar unter Verwendung der Waschlösung der vorliegenden Erfindung, worauf sich geeignete Bestimmungsverfahren anschließen. Vorzugsweise werden die Antikörper in einer Testvorrichtung wie unten beschrieben immobilisiert, um Reagenzien für die Bildung des Komplexes mit hCG an unterschiedlichen epitopischen Zentren in einem geeigneten Format bereitzustellen. In besonders vorteilhafter Weise ist mindestens einer dieser Antikörper biotinyliert und der andere ist markiert.
Die Waschlösung der Erfindung ist eine wäßrige, abgepufferte Lösung, die in vorteilhafterweise den Hintergrund bei Bestimmungsverfahren niedrig hält. Sie wird ganz allgemein dazu angewandt, um die Trennung von nicht komplex gebundenen Materialien von immunologischen Komplexen zu unterstützen. Enthalten in der Waschlösung ist Natriumdecylsulfat.
Dem Wesen nach sind keine anderen oberflächenaktiven Mittel in der Waschlösung in ins Gewicht fallenden Mengen vorhanden (d. h. in Mengen von größer als 0,01 Gew.-%).
Die Sulfatverbindung, wie oben identifiziert (oder Mischungen hiervon) liegt in der Waschlösung in einer Konzentration von 1,8 bis 4 Gew.-% (bezogen auf das gesamte Lösungsgewicht) vor.
Die Lösung ist mit einer oder mehreren geeigneten Puffersubstanzen auf einen pH-Wert von 5 bis 9 und vorzugsweise auf einen pH-Wert von 7 bis 8 abgepuffert. Zu geeigneten Puffern gehören Natriumphosphat; N-(2-Acetamido)- 2-amino-ethansulfonsäure; N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin; 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure; 4-Morpholinoethansulfonsäure; 4-Morpholinopropansulfonsäure; 2-[Tris(hydroxymethyl)-methyl-amino]-1-ethansulfonsäure; N-(Tris(hydroxymethyl)-methyl)glycin; Tris(hydroxymethyl) aminomethan und andere bekannte Puffersubstanzen. Natriumphosphatpuffer wird bevorzugt verwendet.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Ionenstärke der Waschlösung bei mindestens 0,1 und in besonders vorteilhafterweise bei 0,1 bis 0,5 liegt. Geeignete Ionenstärken können erreicht werden durch Verwendung eines geeigneten Puffers mit den entsprechenden Ionen in geeigneter Konzentration, um sowohl die Lösung abzupuffern als auch die gewünschte Ionenstärke einzustellen. Liefert alternativ der Puffer nicht die gewünschte Ionenstärke, so können der Waschlösung ein oder mehrere in Wasser lösliche ionisierbare Verbindungen zugesetzt werden (wie beispielsweise mono- oder divalente Salze, die keine oberflächenaktiven Mittel sind). Geeignete Salze weisen im allgemeinen ein Alkalimetall-Ammonium- oder Erdalkalimetallkation auf und geeignete Anionen. Bevorzugt verwendet werden Alkalimetallsalze, wie z. B. Natriumchlorid, Lithiumchlorid sowie Kaliumchlorid. Andere Salze, die verwendet werden können, sind für den Fachmann leicht erkennbar.
Wie oben beschrieben, enthält der Testsatz der vorliegenden Erfindung die hier beschriebene Waschlösung wie auch einen oder mehrere Rezeptoren für den Liganden, wobei einer hiervon für die Bestimmung markiert ist. Besteht die Markierung aus einem Enzym, so kann der Testsatz ferner ein geeignetes Bestimmungssystem aufweisen, das mit dem Enzym reaktiv ist, unter Erzeugung einer bestimmbaren Species (z. B. eines Farbstoffes).
Das Bestimmungsverfahren dieser Erfindung wird normalerweise unter Verwendung einer Testvorrichtung durchgeführt, in der das komplex gebundene Material bestimmt wird. Derartige Vorrichtungen können Teil des Testsatzes sein, falls dies erwünscht ist und können in einfachster Form bestehen aus einem Teststreifen, einem Test-Slide, einem Filterpapier, einem Teströhrchen, einer Petrischale, einem Eintauch-Stäbchen und dergleichen, doch ist es üblicher wenn die Vorrichtung eine Wegwerf-Testvorrichtung ist, die eine oder mehrere Testzonen oder Behälter für analytische Zwecke aufweist. Eine solche Vorrichtung weist ein in Wasser unlösliches Substrat auf, das chemisch und immunologisch inert ist (d. h. nicht-reaktiv) mit dem Liganden, Rezeptor oder den Reagenzien, die bei der Bestimmung verwendet werden. Das Substrat kann ein flaches oder flächiges Material oder ein Material mit einer bestimmten Konfiguration sein, das einem oder mehreren Reagenzien angepaßt ist und das in bestimmter Weise mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wird. Entweder kann die Testprobe zur Vorrichtung zugegeben werden, z. B. einem Teststreifen oder einer Mikrotestplatte oder die Vorrichtung kann zur Probe zugegeben werden oder in anderer Weise mit der Probe in Kontakt gebracht werden, und zwar eine solche Zeitspanne lang, die ausreicht, damit die Bestimmung durchgeführt werden kann. Die Vorrichtung kann eine Wegwerf-Vorrichtung sein oder eine Vorrichtung, die wiederverwendbar ist.
Im Falle einer Ausführungsform kann die Vorrichtung dazu verwendet werden, um eine Reaktion zwischen Ligand und Rezeptor herbeizuführen, wobei der erhaltene Komplex dann in eine zweite Vorrichtung gebracht wird, in der die Menge des Liganden in geeigneter Weise bestimmt wird. Alternativ kann die Vorrichtung eine Vorrichtung sein, in der sämtliche Stufen des Bestimmungsverfahrens durchgeführt werden, wie beispielsweise eine Mikrotestplatte mit einer Vielzahl von vorgebildeten Test-Behältnissen. Es sind verschiedene Testvorrichtungen bekannt, wozu beispielsweise diejenigen gehören, die in den U.S.-Patentschriften 38 25 410, 38 88 629, 39 70 429 und 44 46 232 beschrieben werden. Besonders geeignete Vorrichtungen werden beschrieben in den EP-Anmeldungen 03 08 231 und 03 21 261.
Ganz speziell umfaßt die Testvorrichtung ein in Wasser unlösliches Substrat mit einer oder mehreren Testzonen, wobei eine jede eine Probe einer biologischen Probe und geeignete Reagenzien unterbringen kann.
Das Substrat kann aus jedem geeigneten in Wasser unlöslichen Material hergestellt werden, wie z. B. Glas, polymeren Materialien, fasrigen Materialien, zellulosischen Materialien und anderen bekannten Materialien.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform weist die Testvorrichtung drei Testzonen oder Behältnisse auf, die bestimmt sind um ein Testergebnis zu liefern sowie positive und negative Vergleichsergebnisse. Eine solche Vorrichtung ist besonders geeignet für eine Arztpraxis oder für den Privatverbrauch als Teil eines diagnostischen Testsatzes, z. B. eines Testsatzes für die Feststellung einer Schwangerschaft. Eine weitere Testvorrichtung wird in der EP-A-02 80 558 beschrieben und beansprucht. Andere Variationen von geeigneten Testvorrichtungen liegen im Aufgabenbereich eines Fachmannes. Vorzugsweise weist die Testvorrichtung eine in Wasser unlösliche mikroporöse Filtrations-Membran in jedem Test-Behältnis auf, um den immunologischen Komplex von nicht komplex gebundenen Materialien und Probenflüssigkeit abzufiltrieren.
Die Vorrichtung ist an beliebige Bestimmungsverfahren anpaßbar, bei denen chemische und biologische Reagenzien eingesetzt werden. Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere Antikörper (z. B. ein biotinylierter oder markierter Antikörper oder beide) für hCG innerhalb der Vorrichtung immobilisiert, wie es in der EP-Anmeldung 03 21 261 für die Bestimmung von hCG in einer Urinprobe beschrieben ist.
Wie oben beschrieben, umfaßt der Testsatz dieser Erfindung auch Bestimmungssysteme für die Bestimmung der Bildung eines immunologischen Komplexes. Dieses System kann so einfach sein wie ein zweiter Rezeptor für den Liganden, der in geeigneter Weise für die Bestimmung markiert ist. Zu geeigneten Bestimmungsmarkierungen gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf erfolgen soll, Radioisotope, chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, gefärbte Teilchen, Farbstoffe, Farbstoff- Vorläuferverbindungen und Enzyme. Viele geeignete Markierungen werden im Stande der Technik beschrieben, beispielsweise in der EP-A-02 01 079. Diese Markierungen können unter Verwendung geeigneter Reagenzien, einer geeigneten Vorrichtung und geeigneter Verfahren bestimmt werden.
Vorzugsweise ist die Markierung ein Enzym (z. B. Peroxidase, eine alkalische Phosphatase, eine Malat-Dehydrogenase, Glykoseoxidase, Urease, Catalase oder Glucose- 6-phosphatdehydrogenase). In einem solchen Falle umfaßt das Bestimmungssystem ein Enzymsubstrat und ein einen Farbstoff lieferndes Reagens, falls erforderlich. Die Reaktion des Enzyms mit dem Substrat kann zur Bildung einer bestimmbaren Species führen. Alternativ kann die enzymatische Reaktion lediglich der Beginn einer Reihe von Reaktionen sein, bei denen andere Reagenzien eine bestimmbare Species liefern, wie beispielsweise einen Farbstoff.
Wird beispielsweise Peroxidase als Markierung verwendet, so kann der Testsatz ferner Wasserperoxid sowie geeignete einen Farbstoff bildende Reagenzien enthalten, wie beispielsweise Tetramethylbenzidin oder einen Leucofarbstoff, der einen Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase liefert (z. B. einen Triarylimidazol-Leuco-Farbstoff, wie es in der U.S.-Patentschrift 40 89 747 beschrieben wird, oder einen Triarylmethan-Leuco-Farbstoff, wie es in der U.S.-Patentschrift 46 70 385 beschrieben wird). Eine bevorzugte, einen Farbstoff liefernde Zusammensetzung wird in der EP-Anmeldung 03 08 231 beschrieben. Geeignete Substrate und Farbstoff bildende Reagenzien für andere geeignete Enzyme liegen innerhalb des Fachwissens eines Fachmannes.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt der Testsatz:
(a) eine Testvorrichtung wie oben beschrieben mit einer Vielzahl von Testbehältnissen und einem Antikörper, der in mindestens einem der Testbehältnisse immobilisiert ist und reaktiv ist mit hCG an einem ersten epitopischen Zentrum, und die sich in einer trockenen Form befindet,
(b) einen zweiten Antikörper, der reaktiv mit hCG an einem zweiten epitopischen Zentrum ist und der mit Peroxidase markiert ist,
(c) ein Bestimmungssystem, das mit Peroxidase reaktiv ist und
(d) die Waschlösung dieser Erfindung.
Der Antikörper in der Testvorrichtung kann unlöslich gemacht werden durch Immobilisierung auf einem in Wasser unlöslichen Substrat, wie z. B. einer Oberfläche der Testvorrichtung, einer Membran, Glas oder polymeren Teilchen oder anderen Materialien, die bekannt sind. In vorteilhafter Weise besteht er aus einem in Wasser löslichen biotinylierten Antikörper, der immobilisiert wird mit einer Mischung mit einem Bindemittelmaterial, wie es in der EP- Anmeldung 03 21 261 beschrieben wird. Der Antikörper kann mittels einer Avidin-Biotin-Reaktion unlöslich gemacht werden, unter Verwendung eines unlöslich machenden Mittels mit einer unlöslichen Phase, an die Avidin oder ein Derivat hiervon gebunden ist. Das unlöslich machende Reagens kann, falls erwünscht, Teil des Testsatzes sein.
Ein solches unlöslich machendes Reagens weist eine unlösliche Phase auf, wie beispielsweise Glaskügelchen, Metallteilchen, Membranen, Polymerkügelchen, Glas- oder Cellulosefasern und anderen bekannten Stoffen, an die Moleküle des Avidins oder eines Derivates hiervon gebunden sind, wie z. B. Streptavidin, succinyliertes Avidin, monomeres Avidin und dergleichen. Ein bevorzugtes unlöslich machendes Reagens, das für die Durchführung dieser Erfindung geeignet ist, wird in der EP-Anmeldung 03 02 715 beschrieben. Ein repräsentatives Reagens wird in dem unten folgenden Beispiel beschrieben und verwendet. Diese bevorzugten Reagenzien werden hergestellt durch kovalente Bindung von Avidin an die unlösliche Phase, z. B. polymere Kügelchen, durch aktivierte 2- substituierte Ethylsufonyl- oder Vinylsulfonylgruppen oder durch aktive Halogenatome.
Avidin oder ein Derivat hiervon kann an eine unlösliche Phase in jeder geeigneten bekannten Weise gebunden werden, beispielsweise nach Verfahren, wie sie beschrieben werden in den U.S.-Patentschriften 42 98 685 (wie oben erwähnt), 44 96 654 (wie oben erwähnt) und 45 82 810 sowie in der PCT-Publikation 84/03 358 (veröffentlicht am 30. August 1984). Das Avidin kann durch Adsorption gebunden werden, wird jedoch vorzugsweise kovalent gebunden durch Umsetzung von reaktiven Resten im Avidinmolekül (wie beispielsweise reaktiven Amingruppen) mit den entsprechenden reaktiven Gruppen auf dem Träger (wie beispielsweise Carboxyl-, Halomethyl-, Vinylsulfonyl- oder Chloroethylsulfonylgruppen).
Der Testsatz der vorliegenden Erfindung kann ferner gegebenenfalls Reagenzien und andere Ausrüstungsteile, wie z. B. andere Waschlösungen, Pufferlösungen, Reagenzlösungen, Flaschen, Pipetten, Vorrichtungen zur Vorfilterung von Proben und anderen Materialien aufweisen, von denen bekannt ist, daß sie die Verwendung des Testsatzes erleichtern.
Im allgemeinen wird das Verfahren dieser Erfindung durchgeführt, in dem eine Probe, von der angenommen wird, daß sie den Liganden enthält, mit einem oder mehreren Rezeptoren für den Liganden in Kontakt gebracht wird, unter Bildung eines immunologischen Komplexes, wobei mindestens einer der Rezeptoren markiert ist, so daß der Komplex bestimmbar ist. Der Komplex wird dann von nicht komplex gebundenen Materialien durch Waschen des Komplexes mit der Waschlösung dieser Erfindung abgetrennt. Nach der Trennung wird entweder der Komplex oder werden entweder die nicht komplex gebundenen Materialien bestimmt, unter Anwendung der geeigneten Bestimmungsvorrichtung und Verfahren, beispielsweise unter Anwendung einer Lichtstreuung, colorimetrischer, fluorometrischer, radiometrischer oder anderer Techniken. Im allgemeinen wird das Bestimmungsverfahren bei Raumtemperatur durchgeführt.
Bei dieser Methode ist es wünschenswert, daß vor, gleichzeitig mit oder nach dem Kontakt der Probe mit dem Rezeptor die Probe in eine Testvorrichtung wie oben beschrieben gebracht wird und die nicht komplex gebundenen Materialien durch die Filtrationsmembran ausgewaschen werden, während der immunologische Komplex auf der Membran zurückgehalten wird. Wünschenswert ist ferner, daß der Komplex zu einem Zeitpunkt vor der Waschstufe unlöslich gemacht wird. Beispielsweise kann einer der Rezeptoren von Anfang an an ein unlösliches Substrat gebunden werden. Alternativ und vorzugsweise wird das oben beschriebene unlöslich machende Reagens dazu verwendet, um den Komplex nach seiner Bildung unlöslich zu machen, unter Anwendung einer Avidin- Biotin-Reaktion.
Im Falle der Bestimmung von hCG wird das Verfahren dadurch ausgeführt, daß eine Probe (gewöhnlich Urin), von der erwartet wird, daß sie hCG enthält, mit einem oder mehreren unterschiedlichen Antikörpern für hCG in einer geeigneten Testvorrichtung in Kontakt gebracht wird. Einer der Antikörper ist in geeigneter Weise für die Bestimmung markiert. Der Komplex wird von den nicht komplex gebundenen Materialien unter Anwendung der Waschlösung dieser Erfindung abgetrennt, worauf geeignete Bestimmungsverfahren durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann leicht in einer Arztpraxis durchgeführt werden oder zu Hause, zum Zwecke einer Frühbestimmung einer Schwangerschaft durch Untersuchung von Urinproben.
Die folgenden Beispiele sind repräsentativ für die Praxis dieser Erfindung, sollen den Schutzbereich dieser Erfindung jedoch nicht beschränken.

Materialien

Antikörper-Biotin-Konjugate wurden hergestellt unter Verwendung von monoklonalen Anti-hCG-Antikörpern, erhalten von der Firma Immuno-Search, Inc. und Biotin- N-hydroxysuccinimid, unter Anwendung der Methode, die beschrieben wird von Hofmann und anderen in der Literaturstelle J. A. C. S. 100, 3585 (1978).
Antikörper-Peroxidase-Konjugate wurden hergestellt unter Verwendung von monoklonalen Anti-hCG-Antikörpern, erhalten von Cambridge Medical Diagnostics und Meerrettichperoxidase nach der Methode, die beschrieben wird von Yoshitake und anderen in der Literaturstelle Jur. J. Biochem. 101, 395 (1979).
Eine Leuco-Farbstofflösung wurde hergestellt aus 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol wie folgt:
Fester Leucofarbstoff (zur Herstellung einer 0,1%igen Lösung) wurde in einer Lösung von 20% Poly(vinylpyrrolidon) in einem Natriumphosphatpuffer (5 mmolar) gelöst. Diese Lösung wurde dann zu einer Lösung zugegeben, die enthielt Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid-Elektronenübertragsmittel (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure-Chelatbildner (10 pmolar) in einem Natriumphosphatpuffer unter Erzeugung einer End-Konzentration von 1% Poly(vinylpyrrolidon) und 0,005% Leucofarbstoff.
Succinyliertes Casein wurde hergestellt durch Umsetzung von Casein mit einem gleichen Gewicht von Succinsäureanhydrid vier Stunden lang bei 25ºC, worauf das Produkt durch Dialyse gereinigt wurde.

Beispiel 1

Bestimmung von hCG in Urin Herstellung des unlöslich machenden Reagens

Die drei im folgenden angegebenen Lösungen wurden kontinuierlich in einen 1365 ml Behälter gegeben, der von Sauerstoff befreites Wasser von 80ºC enthielt, mit den angegebenen Geschwindigkeiten:
Lösung 1: Styrol (739 g), m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol (82 g) und 1-Dodecanthiol (8,2 g) bei 2,5 g/Min., 380 Minuten lang.
Lösung 2: Ammoniumpersulfat (19,7 g) und destilliertes, von Sauerstoff befreites Wasser (1152 g) bei 2,14 g/Min., 380 Minuten lang.
Lösung 3: Natriumpyrosulfit (9,9 g) und destilliertes Wasser (1152 g) bei 2,27 g/Min., 380 Minuten lang.
Nach 380 Minuten wurde die Reaktion unterbrochen, unter Gewinnung von etwa 1218 g Latex mit einem Feststoffgehalt von 33,4%. Der Latex wurde drei Tage lang dialysiert, unter Gewinnung eines Latex mit einem Feststoffgehalt von 27,3% und einem pH-Wert von 5. Dieser Latex wurde auf einen Feststoffgehalt von 13,5% verdünnt. Eine NMR-Analyse bestätigte ein molares Verhältnis von Styrol zu dem zweiten Monomeren von 96 : 4. Die erhaltenen Latexteilchen hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 0,67 um, gemessen durch Transmissions-Elektronen-Mikroskopie.
Eine Probe (0,75 ml) des Latex, wie oben beschrieben, wurde auf 20 ml verdünnt mit Boratpuffer (50 mmolar, pH 8,5) worauf Avidin (5 mg) zugegeben wurde. Die erhaltene Suspension wurde bei 37ºC 18 Stunden lang bewegt, und zwar nach einer end-over-end-Methode, worauf sich eine Zentrifugation anschloß. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die Teilchen wurden einmal mit Puffer durch Zentrifugieren gewaschen und in 10 ml Glycinpuffer resuspendiert. Eine Biotin-Bindungsanalyse (d. h. eine Titration mit Tritium markierten Biotin) ergab, daß Avidin kovalent an die Teilchen gebunden war (7 · 10&supmin;&sup6; molare Bindungszentren pro 0,3% Kügelchen-Suspension) unter Bildung eines Reagens der vorliegenden Erfindung.

Bestimmungsverfahren

Sämtliche hier beschriebenen Bestimmungen wurden bei Raumtemperatur (im allgemeinen zwischen 200 und 25ºC) durchgeführt. Die Testvorrichtungen wurden zur Bestimmung von hCG in einer Urinprobe in folgender Weise verwendet. Jede Testvorrichtung umfaßte: ein negatives Vergleichs- Behältnis, um den Hintergrund darzustellen und um als Bezugstest zu wirken, ein positives Vergleichs-Behältnis um anzuzeigen, daß die Reagenzien und Verfahren in geeigneter Weise durchgeführt werden und ein Test-Behältnis zur Durchführung des Bestimmungsverfahren. Jedes Testbehältnis enthielt eine Filtermembran bestehend aus einer mikroporösen Nylon-Filtermembran (erhalten von der Firma Pall Corp.).
Jedes negative Vergleichs-Testbehältnis enthielt 4-Morpholinopropansulfonsäurepuffer (2 mg) und Poly- (acrylamid)bindemittel (60 ug). Das Testbehältnis zur Durchführung der Bestimmung enthielt eine getrocknete Beschichtung aus biotinylierten Anti-hCG-Antikörpern (3 ug) immobilisiert in einem Poly(acrylamid)Bindemittel (60 ug) und getrockneten Puffer (2 mg) in einer unterschiedlichen Position in dem Test-Behältnis. Das positive Vergleichs-Behältnis enthielt biotinylierte Anti-hCG- Antikörper (3 ug) immobilisiert in einem Poly(acrylamid) Bindemittel (60 ug) und getrocknetes hCG (400 mI.E.) in einer separaten Position von dem Puffer (2 mg) in dem Test-Behältnis.
Die Proben wurden vorgefiltert, um Verunreinigungen zu entfernen und es war bekannt, daß sie etwa 30-300 000 I.E./l hCG enthielten. Die Proben wurden sämtlichen Behältnissen der Testvorrichtung zugegeben, worauf sich die Zugabe eines mit Peroxidase markierten monoklonalen Anti-hCG-Antikörpers anschloß (40 ul einer 10&supmin;&sup9; molaren Lösung), wobei die Zugabe zu jedem Test-Behältnis erfolgte. Nach einer Inkubationsperiode von 2 Minuten wurde eine Suspension des oben beschriebenen unlöslichen immunoreaktiven Reagens (40 ul einer 0,6%igen Dispersion) zugegeben, wobei die Flüssigkeit durch Membran eines jeden Test-Behältnisses abtropfen gelassen wurde.
Die Waschlösung (200 ul) dieser Erfindung wurde hergestellt aus Natriumphosphat (0,1 molar, pH 7,2), Thiomersal-Präservativ (0,01 Gew.-%) sowie Natriumdecylsulfat (100 mmolar, 2,7 Gew.-%) worauf sie einem jedem Behältnis zugegeben wurde, um die nicht komplex gebundenen Materialien wegzuwaschen. Dann wurde in jedes Behältnis die oben beschriebenen Leuco-Farbstofflösung (40 ul) eingeführt. Nach zwei Minuten wurde der auf jeder Membran erzeugte Farbton bestimmt durch Reflexionsmessungen unter Anwendung einer Standardausrüstung und die erhaltenen Ergebnisse wurden in Durchlässigkeitsdichten (DT) umgerechnet, unter Anwendung der Williams-Clapper-Gleichung. Der Farbton wurde ferner untersucht durch Vergleich mit Farbwerten auf einer Farb-Gradienten-Karte (Werte von 0 bis 10, wobei 10 den dunkelsten Farbton darstellt). Ein dunkelrot er Farbton wurde in den Test- und positiven Vergleichs-Behältnissen festgestellt, was das Vorhandensein von hCG in der Urinprobe anzeigt. Das negative Vergleichs- Behältnis der Vorrichtung wurde wie in Tabelle II angegeben bewertet, unter Anwendung der Farb-Gradienten- Karte.
Der gleiche Test wurde unter Verwendung der gleichen Testvorrichtung und des Verfahrens durchgeführt, unter Verwendung verschiedener bekannter oberflächenaktiver Mittel oder Mischungen von oberflächenaktiven Mitteln anstelle von Natriumdecylsulfat in der Waschlösung. In Tabelle I unten sind die in den Vergleichs-Waschlösungen verwendeten Materialien aufgeführt. Sämtliche Waschlösungen, die getestet wurden, enthielten Natriumphosphat als Puffer. Der Vergleich B enthielt kein oberflächenaktives Mittel. Aus Tabelle II, welche die Hintergrunddaten veranschaulicht (festgestellt in dem negativen Vergleichs-Behältnis der Testvorrichtung) sowie die Aufbewahrungstests bei niedrigen Temperaturen, ermittelt im Falle einer jeden Waschlösung und jedes Bestimmungsverfahrens, ist offensichtlich, daß im Falle der Bestimmungsverfahren unter Verwendung der Vergleichs-Waschlösungen entweder ein nicht akzeptierbarer hoher Hintergrund auftrat oder eine nicht akzeptierbare Aufbewahrung bei niedriger Temperatur.
Der Aufbewahrungstest bei niedriger Temperatur wurde durchgeführt durch Aufbewahrung der Waschlösung 18-24 Stunden lang bei 4ºC, worauf die Lösung unmittelbar auf irgendwelche Anzeichen einer Kristallisation untersucht wurde. Die Ergebnisse wurden wie folgt bewertet:
A = kein Anzeichen einer Kristallisation nach der Aufbewahrung, U : nicht akzeptabel aufgrund einer Kristallisation eines Teiles oder des gesamten oberflächenaktiven Mittels in der Waschlösung, und M = unwesentlich, da eine geringfügige Kristallisation erfolgte, die die Verwendung bei einer Bestimmung nicht störte.
Insbesondere lieferte der Vergleich A unter Verwendung von Dodecylsulfat in der Waschlösung einen niedrigen Hintergrund, jedoch genügte die Lösung dem Aufbewahrungstest bei niedriger Temperatur nicht. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur 0,5 bis 4 Stunden lang stehengelassen, doch blieben zu viele Kristalle zurück, als daß sie für das Bestimmungsverfahren geeignet war. Die Öffnung der Flasche mit der Lösung verstopfte, wenn versucht wurde, mit der Lösung zu waschen.
Die Verwendung der Waschlösung dieser Erfindung vermindert in unerwarteter Weise den Hintergrund auf akzeptable Werte und die Waschlösung kristallisiert nicht, wenn sie dem Aufbewahrungstest bei niedrigen Temperaturen ausgesetzt wird.

TABELLE I

Bestimmungsverfahren Zusammensetzung der Waschlösung
Beispiel 1 Natriumdecylsulfat (2,4 Gew.-%)
Beispiel 1 Natriumdecylsulfat (1,9 Gew.-%)
Vergleich A Natriumdodecylsulfat (0,29 Gew.-%)
Vergleich B Natriumphosphat-Puffer allein
Vergleich C Lithiumdodecylsulfat (0,29 Gew.-%)
Vergleich D AVANEL S-70 (Natriumalkylethersulfonat von der Firma Jordan Chem. Co.) (1,4 Gew.-%)
Vergleich E MONAWET MM-80 (Dihexyl-Natrium-sulfosuccinat von der Firma Mona Industries, Inc.) (0,61 Gew.-%)
Vergleich F AEROSOL OT (Dioctylester der Natriumsuifoccucinsäure von der Firma American Cyanamide) (0,55 Gew.-%)
Vergleich G POLYSTEP B-12 (Natriumlaurylethersulfat von der Firma Stepan Co.) (0,77 Gew.-%)
Vergleich H STANDAPEL 125-E (sulfatierter Polyether des Laurylalkohols von der Firma Henkel Corp.) (1,37 Gew.-%)
Vergleich 1 HOSTAPUR SAS-90 (C&sub1;&sub4;-C&sub1;&sub7; Alkylsulfonat- Mischung von der Firma American Hoechst Corp.) (0,29 Gew.-%) Tabelle II Bestimmungs-Verfahren Aufbewahrungs-Test Konzentration Hintergrund negativer Vergleich* Beispiel Vergleich nicht untersucht
* Hintergrund bestimmt unter Verwendung der Farb- Gradientenkarte. Im Falle des negativen Vergleichs- Behältnisses muß er so nahe wie möglich bei 0 über dem hCG-Konzentrationsbereich liegen. Ein Hintergrund von 0,5 ist geringfügig und akzeptabel lediglich falls dieser einwillkürliches Ergebnis ist.

Beispiel 2

Bestimmung von Streptococcus A Antigen

Dieses Beispiel veranschaulicht die Durchführung dieser Erfindung zur Bestimmung von Streptococcus A Antigen in einer biologischen Flüssigkeitsprobe.
Streptococcus A Antigen wurde erhalten von Strep- Kulturen der Gruppe A unter Verwendung einer Standardsalpetrigsäure-Extraktion. Das Carbohydrat-Antigen der Gruppe A wurde von der Zellenpräparation gereinigt und dann zu einer Lösung von Zitronensäure (10 ul, 1,2 molar) und Natriumnitrit (120 ul, 8 molar) zugegeben, worauf mit 4-Morpholinopropansulfonsäure-Puffer (120 ul, 1 molar, pH 7,5) neutralisiert wurde.
Eine mikroporöse Nylon-Membran, beschichtet mit FC-134 (einem fluorochemischen oberflächenaktiven Mittel der Firma 3M Co.) wurde in eine 3-Behältnisse aufweisende Wegwerf-Vorrichtung eingebracht, ähnlich derjenigen, die oben beschrieben wurde. Eine Lösung von Poly[styrol-co-m & p- (2-chloroethylsulfonylmethyl)-styrol)-Kügelchen (2 ul einer Feststoff-Suspension von 1% mit 5% Polyacrylamid) wurde in den zentralen Bereich der Behältnisse der Wegwerf- Vorrichtung eingeführt. Die Kügelchen enthielten kovalent gebundene polyklonale Antikörper für Streptococcus A Antigen.
Zweihundert Mikroliter der Antigenextraktlösung wurden in die Behältnisse gegeben und durchfließen gelassen.
Eine Lösung enthaltend polyklonale Anti-Strep-A-Antikörper (konjugiert bezüglich Meerrettich-Peroxidase), succinylisiertes Casein (40 ul einer 3 mg/ml Lösung) und Puffer wurde zugegeben und durchfließen gelassen. Die Wegwerf-Vorrichtung wurde dann 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Dann wurden Waschlösungen zugegeben und durchfließen gelassen. Eine Vergleichs-Waschlösung enthielt Natriumdodecylsulfat (10 mmolar, 0,29 Gew.-%) in einem Natriumphosphatpuffer (pH 7,5). Das Bestimmungsverfahren dieser Erfindung verwendete Natriumdecylsulfat (69 mmolar, 1,8 Gew.-% oder 90 mmolar, 2,4 Gew.-%) in Natriumphosphatpuffer als Waschlösungen.
Eine Leuco-Farbstofflösung (entsprechend derjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, 120 ul) wurde zugegeben und nach einer zwei Minuten währenden Inkubation bei Raumtemperatur wurde der erhaltene Farbton im Falle der Testprobe und der negativen Vergleichs-Behältnisse der Wegwerf-Vorrichtung ermittelt und nach der Farb-Gradientenkarte wie oben beschrieben bewertet. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle III unten zusammengestellt und stellen Mittelwerte von drei Mal durchgeführten Tests dar. Es ist offensichtlich, daß beide Waschlösungen akzeptable niedrige Hintergrundwerte bei den Untersuchungen lieferten. Jedoch enthielt die zu Vergleichszwecken verwendete Waschlösung Natriumdodecylsulfat, das in der Lösung kristallisierte, wenn diese dem Aufbewahrungstest bei niedriger Temperatur wie in Beispiel 1 beschrieben ausgesetzt wurde. Tabelle III Antigen-Konzentration Vergleich Best-V. Hintergrund Beispiel

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden mit den Stufen:

A. Kontaktieren einer Probe, von der vermutet wird, daß sie einen immunologischen Liganden enthält, mit einem Testgerät mit einem in Wasser unlöslichen Substrat mit einem oder mehreren Test-Behältnissen, von denen ein jedes eine in Wasser unlösliche mikroporöse Filtrationsmembran enthält, und immobilisiert in mindestens einem der Testbehältnisse einen ersten Rezeptor für den Liganden, unter Bildung eines Reaktionsproduktes des Liganden mit dem Rezeptor, wobei der erste Rezeptor unlöslich gemacht ist oder durch eine spezielle Bindungsreaktion unlöslich gemacht werden kann,

B. Kontaktieren der Probe vor, gleichzeitig oder nach der Kontaktierungsstufe (A) mit einem zweiten Rezeptor für den Liganden, der mit einem Enzym markiert ist, unter Bildung eines feststellbaren Komplexes des Liganden mit den ersten und zweiten Rezeptoren,

C. Trennung des erhaltenen markierten, unlöslich gemachten Komplexes von nicht komplexgebundenen Materialien durch Auswaschen von nicht umgesetzten Materialien durch die Filtrationsmembran mit einer Waschlösung, die auf einen pH-Wert von 7 bis 8 mit Natriumphosphat abgepuffert ist und 1,8 bis 4 Gew.-% Natriumdecylsulfat enthält, und

D. Bestimmung der Menge an feststellbarem Komplex auf der Filtrationsmembran durch Kontaktieren des unlöslichen Komplexes mit einem Substrat für das Enzym und einem einen Farbstoff bildenden Reagenz, das einen Farbstoff durch enzymatische Reaktion des Enzymes auf dem Substrat bildet.

2. Verfahren nach Anspruch 1 für die Bestimmung hCG, worin die Rezeptoren Antikörper für hCG sind.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem die Waschlösung weiterhin ein zweites wasserlösliches Salz enthält, das in einer Konzentration vorhanden ist, die ausreicht, um eine Ionenstärke von 0,1 bis 0,5 zu erzeugen, wobei das Salz ein Alkalimetall-, Ammonium- oder Erdalkalimetallkation aufweist.

4. Test-Satz, der sich für die Bestimmung eines immunologischen Liganden eignet, mit:

(a) einem oder mehreren Rezeptoren für einen immunologischen Liganden, wobei mindestens einer für die Bestimmung markiert ist, und

(b) einer wäßrigen Waschlösung, die auf einen pH-Wert von 5 bis 9 abgepuffert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Waschlösung 1,8 bis 4 Gew.-% Natriumdecylsulfat enthält.

5. Test-Satz nach Anspruch 4, in dem mindestens ein Rezeptor ein Antikörper ist, der mit einem Enzym markiert ist, und der ferner ein Erkennungssystem aufweist, das mit dem Enzym reaktiv ist.

6. Test-Satz nach einem der Ansprüche 4 und 5, in dem mindestens ein Rezeptor ein Antikörper für hCG ist.

7. Test-Satz nach Anspruch 4 mit mindestens einem biotinylierten Rezeptor und einem unlöslichen Reagenz mit Avidin.