DE60302348T2 - Verwendung von cyclopamine zur behandlung von psoriasis und anderen hauterkrankungen - Google Patents

Description

• Die zelluläre Differenzierung spielt eine kritische Rolle in der Herstellung von multizellulären Organismen. Beim Menschen differenzieren die Zellen vieler Gewebe nicht nur während der Entwicklung, sondern auch während des postnatalen Lebens, um neue Zelltypen zu generieren, die für das korrekte Funktionieren des Organismus benötigt werden. Signale für die Differenzierung eines Zelltyps in einen anderen können von den anderen zellulären und nicht-zellulären Gewebekomponenten der unmittelbaren Umgebung und/oder von weiter entfernt liegenden Geweben und Organen (z.B. in Form von Hormonen) stammen. Die Reaktionen einer Zelle auf eingehende Signale sind ebenfalls komplex und hängen von der Natur der Liganden oder dem Signalsatz sowie den eher intrinsischen Merkmalen der jeweiligen Zelle (z.B. ihr Differenzierungsstatus und ihre Chromatinstruktur) ab. Während des täglichen Lebens eines Menschen gehen viele Zellen durch verschiedene Mechanismen verloren (wegen akuten und chronischen Belastungen und Schäden sowie als Ergebnis des programmierten Zelltods aus anderen Gründen). Diese verloren gegangenen Zellen werden im Allgemeinen durch die regulierte Proliferation und Differenzierung ihrer Vorgänger, das heißt den Vorläufer- und Stammzellen ersetzt. Die menschliche Haut weist im Vergleich zu vielen inneren Geweben eine vergleichsweise höhere Empfindlichkeit gegenüber Umweltbelastungen (z.B. physischem Trauma) auf, ist aber gut an die Umstände angepasst und weist ein kontinuierliches Verlieren und Ersetzen ihrer äußersten Schicht auf. Die aus der obersten Schicht der Epidermis abgestoßenen toten Zellen werden normalerweise durch die Proliferation der Basalschichtzellen der obersten Epidermisschicht und die Differenzierung dieser Zellen zur Bildung der suprabasalen Schichten ersetzt. Abnormalitäten dieses Differenzierungsprozesses als Folge von Umweltgründen und/oder genetischen Gründen führen zu verschiedenen Krankheiten, deren Hautausprägungen im Allgemeinen leicht detektiert werden können. Hautkrankheiten, die Differenzierungsstörungen von nicht-epidermalen Hautzellen beinhalten, sind von vielgestaltiger Natur. Die Unterschiede in den zugrunde liegenden Ursachen dieser Krankheiten führen zu unterschiedlichen Ausprägungen und klinischen Bildern, wobei aber Abnormalitäten in der zellulären Differenzierung ein gemeinsames Merkmal all dieser Krankheiten darstellen. Nicht-beschränkende Beispiele von Hautkrankheiten, von denen bekannt ist, dass sie Abnormalitäten bei der zellulären Differenzierung aufweisen, beinhalten die Ichthyosis vulgaris, die lammellare Ichthyosis, die palmoplantare Keratodermas, die Pityriasis Rubra Pilaris, die Darier-Krankheit und verschiedene Typen von Hauttumoren. Die Ursachen dieser Hautkrankheiten sind im Allgemeinen wenig bekannt. Die Komplexität der Regulierung der zellulären Differenzierung und das Vorhandensein von vielfältigen regulatorischen Faktoren bedeuten jedoch, dass Abnormalitäten der Differenzierung manchmal sekundär zu Abnormalitäten sein können, die in erster Linie andere Prozesse betreffen. Solange ein klares Verständnis der Ursachen und Mechanismen nicht gegeben ist, sind die zur Verfügung stehenden Behandlungsstrategien für diese Krankheiten in der Regel nur wenig effizient (Braun-Falco O. et al. (2000) Dermatology, 2. Ausgabe, Springer-Verlag, Berlin).
• Cyclopamin ist ein Steroidalkaloid, das natürlicherweise in Veratrum-Pflanzen vorkommt. Die Teratogenizität dieser Pflanzen für weidende schwangere Tiere führte zu der Identifizierung von Cyclopamin als Wirkstoff (Keeler R.F. (1969) Phytochemistry 8: 223–225). Eine mögliche Erklärung für die Teratogenizität von Cyclopamin ergab sich aus der Beobachtung, dass Cyclopamin ein Inhibitor des hedgehog/smoothened Signaltransduktionswegs ist (Incardona J.P. et al. (1998) Development 125: 3553–3562; Cooper M.K. et al. (1998) Science 280: 1603–1607). Es wurde gezeigt, dass das sonic hedgehog Protein die Differenzierung der Vorläufer von ventralen Zellen im sich entwickelnden zentralen Nervensystem induziert (Goodrich L.V. et al. (1998) Neuron 21: 1243–1257). WO 00/41 545, WO 99/52 534 und WO 00/74 706 beschreiben Cyclopamin als einen Inhibitor des hedgehog Signalwegs und Psoriasis wird als eine der Krankheiten erwähnt, die mit diesen Inhibitor behandelt werden kann. Die Inhibition des hedgehog/smoothened Signaltransduktions-Pathways durch Cyclopamin in sich entwickelnden Huhngehirnen wurde mit der Verhinderung der Bildung von ventralen Zellen und damit mit der Holopresencephalie in Verbindung gebracht (Incardona J.P. et al. (1998) Development 125: 3553–3562; Cooper M.K. et al. (1998) Science 280: 1603–1607). Es ist bekannt, dass die Holopresencephalie eine übliche Fehlbildung in Lämmern ist, die Veratrum abweiden (Binns W. et al. (1963) Am. J. Vet. Res. 24: 1164–1175). Es ist für Cyclopamin gezeigt worden, dass es die zelluläre Differenzierung in anderen Systemen gleichermaßen inhibiert, einschließlich der Differenzierung von Knochenmarkzellen in erythroide Zellen (Detmer K. et al. (2000) Dev. Biol. 222: 242) und der Differenzierung des urogenitalen Sinus in die Prostata (Berman D.M. et al. (2000) J. Urol. 163: 204).
• Im Gegensatz zu der oben zusammengefassten Lehre des Standes der Technik, dass Cyclopamin die zelluläre Differenzierung inhibiert (Incardona J.P. et al. (1998) Development 125: 3553–3562; Cooper M.K. et al. (1998) Science 280: 1603–1607; Detmer K. et al. (2000) Dev. Biol. 222: 242; Berman D.M. et al. (2000) J. Urol. 163: 204), haben wir gefunden, dass Cyclopamin vielmehr die Differenzierung von basalen Zellkarzinomzellen, die eine Arretierung der zellulären Differenzierung aufweisen, induziert (Taş S. et al. (2001) PCT/TR 01/00 027, WO 02/078 703). Gleichermaßen ermöglicht Cyclopamin den epidermalen Zellen der psoriatischen geschädigten Epidermis wieder die normale Differenzierung aufzunehmen (Taş S. et al. (2002) PCT/TR 02/00 017, WO 02/078 704). Angesichts früherer Berichte, dass Cyclopamin keinen negativen Einfluss auf die Viabilität von transformierten Zellen hat (Taipale J. et al. (2000) Nature 406: 1005–1009), haben wir wiederum unerwarteterweise gefunden, dass die Cyclopamin-induzierte Differenzierung der basalen Zellkarzinomzellen mit einer massiven Apoptose dieser Zellen einhergeht (Taş S. et al. (2001) PCT/TR 01/00 027, WO 02/078 703).
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Cyclopamin bewirkt eine Differenzierung und Apoptose von Tumorzellen. Dies gilt nicht nur für basale Zellkarzinome, sondern auch für andere Hauttumore. Tumore, die aus der Haarfollikel-/Epidermiszelllinie (z.B. Trichoepithelioma) und aus Melanocyten (z.B. melanocytische Nevi) entstehen, verschwinden rasch als Folge der Behandlung mit Cyclopamin. Die Cyclopamin-induzierte Beseitigung von psoriatischen Läsionen in der Haut von Psoriasis-Patienten geht ebenfalls mit der Induzierung der zellulären Differenzierung in der läsionsgeschädigten Epidermis einher. Wir offenbaren, dass die Wirksamkeit von Cyclopamin in der Behandlung von Psoriasis durch therapeutische Zusammensetzungen, die Cyclopamin und ein Corticosteroid enthalten, und/oder durch die Vorbehandlung der Läsionen mit einem Corticosteroid signifikant zusätzlich verstärkt wird.
• KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
• 1A zeigt das Erscheinungsbild einer psoriatischen Läsion (~7 × 8 mm) in der antecubitalen Region eines 29 Jahre alten Mannes vor der Behandlung.
• 1B zeigt die gleiche Läsion wie 1B nach der Behandlung mit Cyclopamin-Creme für 24 Stunden und einer anschließenden behandlungsfreien Zeitspanne von 44 Stunden (68 Stunden seit dem Beginn der Behandlung).
• 1C zeigt eine psoriatische Läsion (~9 × 11 mm) in der deltoiden Region eines 29 Jahre alten Mannes vor der Behandlung.
• 1D zeigt die gleiche Läsion wie in 1C 68 Stunden nach Behandlungsbeginn mit einer vorgemischten Creme, die gleiche Volumina einer Cyclopamin-Creme und einer Cremepräparation von Clobetasol-l7-Propionat (0,5 mg/g) enthält.
• 1E zeigt eine psoriatische Läsion (~11 × 12 mm) in der hypochondrialen Region eines 29 Jahre alten Mannes 48 Stunden nach der Behandlung mit einem Cremepräparat, das Clobetasol-l7-Propionat (0,5 mg/g) enthält.
• 1F zeigt die gleiche Läsion wie in 1E 24 Stunden nach dem Umstellen der Behandlung mit Clobetasol-l7-Propionat (0,5 mg/g) auf die Cyclopamin-Creme.
• 1G zeigt nicht-läsionsgeschädigtes Hautgewebe mit immunohistochemisch nachgewiesenem EGFR. Die EGFR-aufweisenden Zellen der Epidermis sind auf die Basalschicht beschränkt. 200-fache Originalvergrößerung.
• 1H zeigt behandeltes psoriatisches läsionsgeschädigtes Hautgewebe mit immunohistochemisch nachgewiesenem EGFR. Suprabasale Zellen der läsionsgeschädigten Epidermis zeigen eine merkbar erhöhte EGFR-Expression. 200-fache Originalvergrößerung.
• 1I zeigt psoriatisches läsionsgeschädigtes Hautgewebe, das mit der Cyclopamin-Creme für 24 Stunden vor dem Ausschneiden und der immunohistochemischen Färbung auf EGFR behandelt wurde. Die EGFR-enthaltenden Zellen der Epidermis sind auf die Basalschicht beschränkt. 200-fache Originalvergrößerung.
• 2A zeigt eine Trichoepithelioma und einen in der Nähe liegenden Nevus auf der Wange eines 82 Jahre alten Mannes vor der Behandlung.
• 2B zeigt die gleiche Hautregion wie in 2A nach 24-stündiger Behandlung mit Cyclopamin.
• 2C zeigt einen Ausschnitt der ausgeschnittenen Hautregion, der in 2B gezeigt wird, mit verbliebenen Tumorzellen. H&E, 400-fache Originalvergrößerung.
• 2D zeigt ein anderes Gebiet des gleichen Gewebes wie in 2C. Zusätzlich zu den vielen apoptotischen Zellen und der Bildung von zystischen Strukturen durch deren Entfernung erkennt man, dass der Tumor durch mononukleare Zellen infiltriert wird. H&E, 400-fache Originalvergrößerung.
• 3A zeigt einen pigmentierten BCC in dem unteren Augenlid eines 59 Jahre alten Mannes vor der Behandlung.
• 3B zeigt das gleiche BCC wie in 3A am dritten Tag nach der Behandlung mit Cyclopamin.
• 3C zeigt einen Ausschnitt der behandelten Region des BCC's, der in 3B gezeigt ist. H&E, 400-fache Originalvergrößerung.
• 3D zeigt eine Nahansicht eines Gebiets der verbliebenen Tumorzellen in einem Ausschnitt der behandelten Region des BCC's der 3B. H&E, 400-fache Originalvergrößerung.
• 3E zeigt einen Ausschnitt von ausgestanztem Biopsiematerial, das aus dem BCC der 3A vor der Behandlung gewonnen wurde. H&E, 400-fache Orignialvergrößerung.
• 3F zeigt einen Ausschnitt, der einen Teil des BCC-Knotens, der mit dem Pfeil in 3A markiert ist, enthält. Das Gewebe wurde nach 3 Tagen Behandlung und 6 Tage einer sich daran anschließenden Nichtbehandlungsspanne ausgeschnitten. H&E, 400-fache Originalvergrößerung.
• FARBDRUCKE
• Farbdrucke der gleichen Abbildungen, wie auf den Seiten 14, 15 (1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1I, 2A, 2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F) werden als Seiten 14a, 15a hinzugefügt, da die immunohistochemischen Daten und Befunde am besten in Farbe und nicht in Grauschattierungen dargestellt werden können. Es wird höflich beantragt, dass die Patentbehörde diese Tatsache berücksichtigt und diese Seiten als Teil dieser Patentanmeldung betrachtet. Die Seiten 14a, 15a können jedoch von der Patentanmeldung entfernt werden, wenn dies seitens der Patentbehörde für nötig erachtet wird.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Wir offenbaren, dass Cyclopamin bei der Induktion der Differenzierung von verschiedenen Zelltypen wirksam ist und dass diese Induktion der Differenzierung mit ausreichender Selektivität in vivo unter den von uns offenbarten Bedingungen (ohne unerwünschte Nebenwirkungen) erreicht werden kann, sodass eine gute therapeutische Effektivität für eine Vielzahl von Krankheiten erzielt wird, die das gemeinsame Merkmal einer Inhibition der zellulären Differenzierung aufweisen. Es wird offenbart, dass bei Tumoren (sowohl bei gutartigen als auch bei bösartigen Tumoren) die Differenzierungsinduktion von Tumorzellen durch Cyclopamin üblicherweise mit der Apoptose (dem programmierten Zelltod) von Tumorzellen einhergeht, was die anti-tumorale therapeutische Effektivität von Cyclopamin verstärkt. Die bisher nicht übertroffene therapeutische Effektivität von Cyclopamin bei der Behandlung von Psoriasis (bereits früher in PCT/TR 02/00 0017, WO 02/078 704 offenbart) wird durch die Verwendung von therapeutischen Zusammensetzungen, die Cyclopamin und ein Corticosteroid in einem geeigneten pharmazeutischen Träger umfassen, noch weiter verstärkt.
• Cyclopamin kann in Ethanol oder anderen geeigneten Lösungsmitteln gelöst und mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger in Abhängigkeit von der erwünschten Verabreichungsweise gemischt werden. Für topische Anwendungen kann Cyclopamin in Ethanol oder anderen geeigneten Lösungsmitteln gelöst und mit einer geeigneten Basiscreme, Salbe oder Gel gemischt werden. Cyclopamin kann auch in Hydrogelen oder anderen pharmazeutischen Formen eingeschlossen werden, die eine kontrollierte Freisetzung gewährleisten. Es kann auch auf Pflaster adsorbiert werden. Die in den Abbildungen 1A bis 1I und 2A bis 2D und 3A bis 3F gezeigten Effekte sind mit Cremepräparaten erzielt worden, die durch Mischen der ethanolischen Cyclopaminlösung mit einer Basiscreme erhalten wurden, die die angezeigten Endkonzentrationen an Cyclopamin enthielten. Die verwendete Basiscreme besteht hauptsächlich aus schwerem Paraffinöl (10% w/w), Vaseline (10% w/w), Stearylalkohol (8% w/w), Polyoxylsteareth-40 (3% w/w) und Wasser (68% w/w). Andere in geeigneter Weise formulierte Basiscremen können jedoch auch verwendet werden. Ähnlichkeiten der Lösungseigenschaften in Fett versus Wasser und bei den molekularen Strukturen von Cyclopamin und Corticosteroiden (bei denen es sich jeweils um steroidale Moleküle handelt) erleichtern das Mischen in dem gleichen pharmazeutischen Träger. Optimale Cyclopamin- und Corticosteroidkonzentrationen in pharmazeutischen Formen sowie die optimale Dosierung und Anwendungsschemata können offensichtlich durch Faktoren, wie die spezielle pharmazeutische Form, das spezifische Corticosteroid und die Lokalisation, sowie Eigenschaften der zu behandelnden Läsionen beeinflusst sein. Diese Faktoren können jedoch unter Verwendung von wohlbekannten, publizierten Optimierungsverfahren bestimmt werden. Bei den für die in den Abbildungen 1C und 1D erzielten Effekten verwendeten Corticosteroiden handelte es sich um Clobetasol-l7-Propionat in einer Endkonzentration von 0,55 mM in einer Basiscreme (die Konzentration von Cyclopamin in der gleichen Creme betrug ~9 mM). Bei dem zur Vorbehandlung der in 1E gezeigten Läsion verwendeten Corticosteroid handelte es sich um Clobetasol-l7- Propionat in einer Endkonzentration von ~1,1 mM in einer Basiscreme. Ähnliche Corticosteroidwirkungen werden erzielt, indem Clobetasol-l7-Propionat in einer solchen Creme durch ~50 mM Hydrocortison ersetzt wird. Andere aus dem Stand der Technik wohlbekannte Corticosteroidmoleküle werden ebenfalls als geeignet und fähig angesehen, um die oben erwähnten Corticosteroidmoleküle bei geeigneten Konzentrationen zu ersetzen (die geeigneten Konzentrationsbereiche für ein bestimmtes Corticosteroid sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt).
• Die 1A zeigt einen psoriatischen Plaque auf dem antecubitalen Bereich eines 29 Jahre alten Mannes vor der Behandlung. Etwa 20 μl der Cyclopamin-Creme (18 mM Cyclopamin in der oben beschriebenen Basiscreme) wurden auf diese Läsion über einen Zeitraum von 24 Stunden alle 4 Stunden aufgebracht. Die Behandlung wurde dann ausgesetzt und die Läsion weiter beobachtet. Nach 8 Stunden Behandlung zeigte die Läsion einen Erythemabfall. Diese Regression setzte sich während der sich anschließenden Nichtbehandlungsphase fort, bis der in 1B gezeigte Status am dritten Tag erreicht wurde. Die Läsion war am vierten Tag nicht mehr nachweisbar.
• Die 1C zeigt einen anderen psoriatischen Plaque, der in dem deltoiden Hautbereich des gleichen Patienten vor der Behandlung lokalisiert war. Etwa 20 μl eines Cremepräparats, das ~9 mM Cyclopamin und 0,55 mM Clobetasol-l7-Propionat (in der Basiscreme) enthielten, wurden auf diese Läsion alle 4 Stunden aufgebracht. Nach 8 Stunden Behandlungsdauer zeigte diese Läsion ebenfalls einen Erythemabfall. Sie war am Tag 3 der Behandlung nicht mehr nachweisbar (1D zeigt das Erscheinungsbild der Läsion nach 68 Stunden). Andere psoriatische Läsionen des gleichen Patienten, die mit einem Cremepräparat, das ~1,1 mM Clobetasol-l7-Propionat (aber kein Cyclopamin) alle 4 oder 8 Stunden behandelt wurden, zeigten keine erkennbare Veränderung während der gleichen Beobachtungsperiode (das heißt, dass die Läsionen am dritten Tag noch vorhanden waren). Die verstärkte therapeutische Antwort bei Behandlung mit Cyclopamin, selbst wenn nur die Hälfte der Konzentration wie bei anderen Läsionen des selben Patienten verwendet wurde, veranlasste uns, eine weitere Evaluation der therapeutischen Zusammensetzungen, die Cyclopamin und ein Corticosteroid enthielten, vorzunehmen. Wir evaluierten daher zusätzlich die Vorbehandlung der psoriatischen Läsionen mit einem topischen Corticosteroid, dem sich die Behandlung mit einer Cyclopamin-Creme (18 mM Cyclopamin in der Basiscreme) anschloss. 1E zeigt einen psoriatischen Plaque in dem hypochondrialen Bereich des gleichen Patienten vor den Cyclopaminanwendungen. Diese Läsion wurde zunächst mit der Corticosteroidcreme alleine für 48 Stunden behandelt. Das Corticosteroid wurde dann abgesetzt und die Behandlung auf die Anwendung von ~20 μl Cyclopamin-Creme (18 mM Cyclopamin in der Basiscreme) alle 4 Stunden umgestellt. Die 1F zeigt die Läsionen nach 24 Stunden Behandlung mit der Cyclopamin-Creme und zeigt ein beinahe komplettes Verschwinden der Läsion zu diesem Zeitpunkt.
• Die Schwere der psoriatischen Läsionen kann durch eine semi-quantitative Skala erfasst werden, indem verschiedene Punktwerte für Erythema, Erhebung und Skalierung einer Läsion vergeben werden. Diese Punktwerte werden dann aufaddiert, um einen als EES-Punktwert bezeichneten Wert für diese Läsion zu erhalten (Bowman P.H. et al. (2002) J. Am. Acad. Dermatol. 46: 907–913). Die Tabelle I zeigt Vergleiche der therapeutischen Antworten auf verschiedene Behandlungsformen, die mittels des EES-Punkteverfahrens evaluiert wurden. Es wurde beobachtet, dass die therapeutische Wirksamkeit bei Verwendung von therapeutischen Zusammensetzungen, die Cyclopamin und ein Corticosteroid enthielten, bei der Behandlung von psoriatischen Läsionen im Vergleich zu der Verwendung einer Zusammensetzung, die nur Cyclopamin als den aktiven Wirkstoff enthält, signifikant verstärkt wurde. Die Vorbehandlung der Läsionen mit einem Corticosteroid für einen Zeitraum von 1 Tag, dem sich dann eine Behandlung mit Cyclopamin-Creme (18 mM Cyclopamin in der Basiscreme) anschloss, verstärkte die therapeutische Effektivität in ähnlicher Weise. Die Tabelle I zeigt, dass psoriatische Läsionen, die für 1 Tag mit einer Zusammensetzung behandelt wurden, die Cyclopamin enthielt, und dann ohne jede Behandlung weiter beobachtet wurden, ebenfalls zurückgingen, allerdings mit einer vergleichsweise geringeren Geschwindigkeit. Während der letztgenannte Effekt von gewisser klinischer Nützlichkeit sein könnte, dürfte davon ausgegangen werden, dass die meisten Patienten das schnellere Verschwinden der Läsionen bevorzugen werden.
• Die Cyclopamin-Creme alleine bewirkte eine sehr viel schnellere Regression und Verschwinden der psoriatischen Läsionen, als bei Einsatz der bereits früher und hier beschriebenen konventionellen Behandlungsverfahren (PCT/TR 02/00 017, WO 02/078 704) erzielt wurde. Eine weitere Verstärkung der therapeutischen Wirksamkeit war jedoch möglich, wenn Cyclopamin entweder zusammen mit oder nach einer kurzen Vorbehandlung mit Corticosteroiden eingesetzt wurde. Dieses Verhalten erhöht die klinische Nützlichkeit einer Cyclopaminbehandlung und hängt möglicherweise zum Teil mit den entzündungshemmenden Effekten von Corticosteroiden zusammen. Die Beiträge von Entzündungszellen und Cytokinen bei der Entwicklung von psoriatischen Läsionen sind allgemein bekannt (Krueger J.G. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 94: 1355–1405). Es ist bekannt, dass die Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (englisch: epidermal growth factor receptor) (EGFR) und mindestens eines seiner Liganden (z.B. transformierender Wachstumsfaktor alpha (englisch: transforming growth factor alpha)) in durch psoriatische Läsionen charakterisierten Epidermis erhöht ist. Diese Faktoren können möglicherweise eine autokrine Stimulationsschleife in Gang setzen, zu der die durch die Entzündung verursachten Anstiege von epidermalem EGFR zusätzlich beitragen wird (Krueger J.G. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 94: 1355–1405). Die ungewöhnlich schnelle therapeutische Antwort auf die Cyclopamin-Creme alleine (aber nicht auf das Corticosteroid alleine) und die kontinuierliche Regression der psoriatischen Läsionen nach dem Absetzen der Cyclopaminanwendungen sind jedoch mit einer effektiven Intervention mit Schlüssel/proximalen pathogenen Ereignissen durch Cyclopamin (aber nicht durch Corticosteroide) konsistent. Da die EGFR-Überexpression in den suprabasalen Schichten der durch psoriatische Läsionen gekennzeichneten Epidermis eine autokrine Stimulationsschleife möglicherweise in Gang setzen kann und da der Rückgang der EGFR-Expression in der Epidermisbasalschicht als eine der ersten Anzeichen für eine wirksame Behandlung der Psoriasis durch verschiedene Modalitäten angesehen wird (King L.E. Jr. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 95: 10S–12S), wurde die Antwort des EGFR-Expressionsmusters als Folge der Cyclopaminbehandlung evaluiert. Zu diesem Zweck wurde der monoklonale Mausantikörper EGFR. 113 (Novocastra Labs. Ltd., U.K.) gegen Human-EGFR als primärer Antikörper eingesetzt. Der immunohistochemische Assay wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die 1I zeigt, dass die Anwendung der Cyclopamin-Creme bei psoriatischen Läsionen eine schnelle Normalisierung des EGFR-Expressionsmusters bewirkten, und der immunohistochemisch nachgewiesene EGFR 24 Stunden nach der Behandlung größtenteils auf die epidermale Basalschicht beschränkt war (1I). Das EGFR-Expressionsmuster infolge der Cyclopaminbehandlung der Läsion (1I) unterschied sich nicht von nicht durch Läsionen charakterisierte Haut (1G). Durch psoriatische Läsionen gekennzeichnete Haut, die mit einer Plazebocreme behandelt wurde (das heißt einer Creme, die kein Cyclopamin enthält), zeigte andererseits ein anhaltendes erheblich kontrastierendes pathologisches Muster und eine EGFR-Überexpression in der epidermalen suprabasalen Schicht (1H). Dies bedeutet, dass die Cyclopaminbehandlung einen raschen therapeutischen Effekt bei psoriatischen Läsionen zeigt, auch wenn das Kriterium der EGFR-Expression zugrundegelegt wird (King L.E. Jr. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 95: 10S–12S).
• Wir haben in der Vergangenheit gefunden, dass die Verursachung der Differenzierung von basalen Zellkarzinomzelllinien durch Cyclopamin mit deren Apoptose einhergeht (programmierter Zelltod)(PCT/TR 01/00 027, WO 02/078 703). Die Abbildungen 2A bis 2D zeigen, dass solche Effekte von Cyclopamin nicht auf Basalzellkarzinome beschränkt sind. Trichoepithelioma ist ein Tumor, der mit genetischen Veränderungen einhergeht, die eine erhöhte Aktivität des hedgehog-smoothened Signaltransduktionswegs bewirken (Vorechovsky I. et al. (1997) Cancer Res. 57: 4677–4681; Nilsson M. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3438–3443). Die 2A zeigt einen Trichoepithelioma auf der Wange eines 82 Jahre alten Mannes vor der Behandlung. Die 2B zeigt den gleichen Hautbereich nach nur 24 Stunden Behandlung mit einer Cyclopamin-Creme (18 mM Cyclopamin in der Basiscreme; ~25 μl Creme wurden alle 3 Stunden direkt auf den Tumor aufgebracht). Wegen der schnellen Regression wurde die Behandlung nach 24 Stunden abgesetzt und das gesamte Hautgebiet, das dem ursprünglichen Tumor entsprach, zu Beobachtungszwecken ausgeschnitten. Die 2C und 2D zeigen den Gewebebereich, der verbleibende Tumorzellen nach 24 Stunden Behandlung enthielten. Die Abbildungen zeigen eine merkliche apoptotische Aktivität innerhalb dieser verbliebenen Tumorzellen. Zusätzlich werden cystische Leerräume, die aus der apoptotischen Entfernung von Tumorzellen (2C, 2D) resultieren, sowie eine mononukleare zelluläre Infiltration des Tumors (2D) beobachtet. Ein weiterer bemerkenswerter Befund in diesem Patienten war die reduzierte Größe und Pigmentation eines Muttermals, das in der Nähe des behandelten Tumors nach 24-stündiger Behandlung vorhanden war (2B versus 2A). Da Cyclopamin aus den nah beieinanderliegenden Anwendungsgebieten diffundiert sein könnte, scheint das Muttermal (ein gutartiger melanocytischer Tumor) gegenüber vergleichsweise geringen Cyclopaminkonzentrationen sensitiv zu sein. Die Behandlung von melanocytischen Nevi mit Cyclopamin-Creme (18 mM Cyclopamin in der Basiscreme) bei einem anderen Freiwilligen bewirkte ebenfalls eine ähnlich schnelle Depigmentation und Verschwinden der Nevi (Daten nicht gezeigt).
• Die 3A zeigt ein pigmentiertes basales Zellkarzinom (englisch: basal cell carcinoma) (BCC) des unteren Augenlides eines 59 Jahre alten Mannes vor der Behandlung. Dieser Patient wurde mit Cyclopamin-Creme (18 mM Cyclopamin in der Basiscreme) behandelt. Dafür wurden alle Knötchen mit Ausnahme des durch den Pfeil markierten Knötchens behandelt. Dieser Knoten, der, wenn überhaupt, Cyclopamin nur durch Diffusion aus den anliegenden behandelten Bereichen ausgesetzt sein könnte, wäre einer vergleichsweise geringeren Cyclopaminkonzentration ausgesetzt. Da die pigmentierte Natur dieses Tumors eine klinische Beobachtung erleichtert, wurde die Behandlung (Anwendung von ~20 μl Cyclopamin-Creme alle 4 Stunden) am dritten Tag ausgesetzt, das heißt zu einem Zeitpunkt, als der Tumor in der behandelten Region bereits größtenteils zurückgegangen war, aber immer noch sichtbare Teile enthielt (3B). Der Tumor wurde dann ohne Behandlung weiterverfolgt, um mögliche spät auftretende Effekte zu beobachten. Eine klare weitere klinische Regression wurde in Abwesenheit einer Behandlung nicht beobachtet, und das Hautgebiet, das dem ursprünglichen Tumor entsprach, wurde nach 6 Tagen weiterer Beobachtung (9. Tag seit Beginn der Behandlung) ausgeschnitten. Mit Hematoxylen-Eosin gefärbte Schnitte der behandelten Tumorregion zeigten viele cystische Leerräume, die keine Tumorzellen enthielten (3C). Die Abwesenheit eines diese Zysten auskleidenen Epitheliums (3C) ist damit konsistent, dass diese Zysten Gewebebereiche darstellen, die vorher durch Tumorzellen besetzt waren. Zu diesem Zeitpunkt (dem 6. Tag der Beobachtungsspanne ohne Behandlung) zeigten die Gewebeschnitte einen relativen Mangel an apoptotischen Zellen (3C), was mit der bekannten Entfernungsgeschwindigkeit von apoptotischen Zellen aus lebenden Geweben konsistent ist. Auf der anderen Seite zeigten die verbliebenen Tumorzellen, insbesondere in der Nähe der Zysten, ein ungewöhnlich häufiges Auftreten von Zellen, die Anzeichen einer spinösen Differenzierung zeigten (z.B. der Bereich im unteren linken Ausschnitt von 3C; dies wird deutlicher nach höherer Vergrößerung, wie sie für einen anderen Bereich in 3D exemplifiziert ist). Ähnliche Differenzierungsbereiche oder Zysten wurden nicht in den ausgestanzten Biopsiematerialien gefunden, die aus dem gleichen Tumor vor Behandlungsbeginn isoliert wurden (3E). Das Tumorknötchen, das mit einer vergleichsweise geringeren Cyclopaminkonzentration konfrontiert war (durch den Pfeil in 3A markiert), zeigte ein großes zystisches Zentrum am 6. Tag des Beobachtungszeitraums (3F). Die verbliebene Peripherie des Knötchens enthielt jedoch weiterhin Zellen mit einer typischen BCC-Morphologie, obwohl die Häufigkeit der Zellen mit Anzeichen für eine Differenzierung (z.B. ein vergrößertes und eosinophileres Cytoplasma) erneut erhöht war, und kleinere Zysten innerhalb dieser Peripherie existierten (3F). Während also die Tumorantwort auf optimale Cyclopaminkonzentrationen relativ schnell war, verließ die Behandlung mit suboptimalen Konzentrationen Tumorzellen, die während der Weiterbeobachtungsperiode weiter existierten.
• Diese Beispiele zeigen weiterhin die Effektivität der beschriebenen Behandlung bei der Induktion der Tumorzelldifferenzierung und -apoptose, und bei dem Erzielen einer schnellen klinischen Regression von Tumoren, die eine erhöhte hedgehog-smoothened Signaltransduktionsaktivität aufwiesen. Die Effektivität bei verschiedenen Tumoren in nicht miteinander verwandten Patienten mit unterschiedlichen Genotypen ist konsistent mit einer allgemeinen Anwendbarkeit der beschriebenen Behandlung. Die Behandlung mit Cyclopamin unter den oben dargestellten Bedingungen zeigt, wie wir bereits auch früher gezeigt haben (PCT/TR 01/00 027, WO 02/078 704) angesichts histologischer/immunohistochemischer Kristerien, keine unerwünschten Nebenwirkungen in Komponenten des normalen Gewebes (einschließlich möglicher Stammzellen). Zusätzlich zeigen Hautstellen einer früheren Cyclopaminbehandlung, die zum Zeitpunkt dieser Anmeldung für mehr als 2 Jahre beobachtet wurden, eine gesund aussehende normale Haut sowie gleichermaßen Haare, was die funktionale Erhaltung der Stammzellen und die Langzeitsicherheit dieser Behandlung nahelegt.
• Die meisten der biologischen und therapeutischen durch Cyclopamin bewirkten Effekte, die hier und bereits früher (WO 021078 703, WO 02/078 704) offenbart werden, haben das gemeinsame Merkmal, dass sie die Verursachung der zellulären Differenzierung betreffen. Es wird daher insbesondere in Betracht gezogen, dass andere Moleküle aus Cyclopamin abgeleitet werden oder derart synthetisiert werden können, dass sie ähnliche Rezeptorbindende Eigenschaften und biologische sowie therapeutische Effekte wie Cyclopamin aufweisen. Solche Moleküle werden im Folgenden als „Cyclopaminderivate" bezeichnet. Der Begriff „Cyclopaminderivat", wie er im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird wie folgt definiert: Ein Molekül, das einen Bereich des Cyclopaminmoleküls enthält, der in die Bindung von Cyclopamin an seine biologische Zielstruktur involviert ist, das aber zusätzlich Modifikationen des Elterncyclopaminmoleküls enthält, die dergestalt sind, das die neu abgeleiteten Moleküle weiterhin in der Lage sind, an das gleiche biologische Zielmolekül (das heißt das smoothened Protein) zu binden, um die biologischen Effekte von Cyclopamin, die in dieser Erfindung sowie in WO 02/078 703 und WO 02/078 704 offenbart sind, zu bewirken. Solche Cyclopaminmodifikationen können mindestens eine erlaubte Ersetzung oder Deletion einer molekularen Gruppe im Cyclopaminmolekül oder die Addition einer molekularen Gruppe (insbesondere einer kleinen molekularen Gruppe, wie der Methylgruppe) an das Cyclopaminmolekül beinhalten, vorausgesetzt, dass das resultierende Molekül stabil ist, die Fähigkeit der spezifischen Bindung an das gleiche biologische Zielmolekül wie Cyclopamin besitzt, um die biologischen Effekte von Cyclopamin, wie sie in dieser Erfindung, in WO 02/078 703 und WO 021078 704 beschrieben sind, zu bewirken. Die Derivatisierung solcher neuen Moleküle aus Cyclopamin kann in einfacher Weise durch den Fachmann erreicht werden. Ob die biologischen Effekte von Cyclopamin in dem neuen abgeleiteten Molekül beibehalten werden oder verlorengehen, kann ebenfalls durch den Fachmann in üblicher Weise bestimmt werden, indem z.B. die in dieser Anmeldung, in WO 02/078 703 und WO 02/078 704 offenbarten biologischen Effekte überprüft werden.
• Tabelle I Semi-quantitative Evaluierung der Reaktion von psoriatischen Läsionen auf verschiedene Behandlungstypen

  
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• * Summe der Erythema, Erhebungs- und Skalierungspunkte (jeder auf einer 0 bis 4 Skala mit 0,5 Unterteilung, wie von Bowman P.H. et al. (2002) J. Am. Acad. Dermatol. 46: 907–913 beschrieben). Bei den „nur 1 Tag" Behandlungen wurde die Behandlung mit Cyclopamin nur für 1 Tag fortgesetzt. Die Läsionen wurden dann ohne Behandlung weiter beobachtet und die EES-Punktzahlen bestimmt. Die Anzahl an Läsionen, die bei jeder Behandlungskategorie ermittelt wurde, sind dargestellt. Die Punktzahlen der Läsionen, die vor dem 4. Tag für histopathologische/immunohistochemische Analysen ausgeschnitten wurden, sind bei dieser Evaluation und bei diesen Berechnungen nicht enthalten. (Cyclopamin + CS)-Creme bezieht sich auf die Behandlung mit einem Cremepräparat, das ~9 mM Cyclopamin und 0,55 mM Clobetasol-l7-Propionat enthält, oder eine Behandlung mit einem Cremepräparat, das ~18 mM Cyclopamin nach 1 Tag Vorbehandlung mit einem Cremepräparat, das ~1,1 mM Clobetasol-l7-Propionat enthält. Die Ergebnisse dieser zwei Arten der Behandlung sind gleich und wurden daher als eine einzelne Gruppe behandelt.

Claims (10)

1. Verwendung von Cyclopamin oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Derivates davon, sowie eines Corticosteroids, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Hautläsionen verbunden mit beeinträchtigter Differenzierung epidermaler Zellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Corticosteroid Clobetasol-l7-Propionat oder Hydrocortison ist.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Hautläsionen psoriatisch sind.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Cyclopamin oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Derivat davon, sowie ein Corticosteroid.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Corticosteroid Clobetasol-l7-Propionat oder Hydrocortison ist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei die Zusammensetzung in Form einer Creme, Salbe, eines Gels, Hydrogels, einer pharmazeutischen Form mit kontrollierter Freisetzung, oder einer Lösung in Ethanol oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel vorliegt oder auf einem Pflaster für die Haut adsorbiert ist.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, umfassend Cyclopamin oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Derivat davon in einer Konzentration von 10 mM bis 20 mM sowie Clobetasol-l7-Propionat in einer Konzentration von 0,5 mg/g bis 1,0 mg/g oder Hydrocortison in einer Konzentration von 10 mM bis 50 mM.
8. Verwendung von Cyclopamin oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Derivats davon, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Hautkrankheiten die mit beeinträchtigter zellulärer Differenzierung verbunden sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Melanocyten-Tumoren, Ichthyosis Vulgaris, Lamellarichthyosis, palmoplantare Keratodermas, Pityriasis Rubra Pilaris, und Morbus Darier.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Melanocyten-Tumor ein Nevus ist.
10. Verwendung von Cyclopamin oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Derivats davon, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Anwendung bei Patienten mit Hautkrankheiten die mit erhöhter Pigmentierung verbunden sind.