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DE60217152T2 - Knochen-morphogene proteine (bmp), bmp-rezeptoren und bmp-bindungsproteine und ihre verwendung bei der diagnose und behandlung des glaukoms - Google Patents

Knochen-morphogene proteine (bmp), bmp-rezeptoren und bmp-bindungsproteine und ihre verwendung bei der diagnose und behandlung des glaukoms Download PDF

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DE60217152T2
DE60217152T2 DE60217152T DE60217152T DE60217152T2 DE 60217152 T2 DE60217152 T2 DE 60217152T2 DE 60217152 T DE60217152 T DE 60217152T DE 60217152 T DE60217152 T DE 60217152T DE 60217152 T2 DE60217152 T2 DE 60217152T2
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bmp
seq
cells
glaucoma
human
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DE60217152T
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F. Abbot Arlington CLARK
J. Robert Euless WORDINGER
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Alcon Inc
University of North Texas Health Science Center
University of North Texas
Original Assignee
Alcon Inc
University of North Texas Health Science Center
University of North Texas
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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart Verfahren und Reagenzien zum Diagnostizieren und Behandeln von Glaukom und verwandten Krankheiten.
  • 2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik
  • „Glaukome" sind eine Gruppe von schwächenden Augenkrankheiten, die die Hauptursache von irreversibler Blindheit in den Vereinigten Staaten und anderen entwickelten Nationen sind. Primäres Weitwinkelglaukom („POAG"), die häufigste Form von Glaukom, wird durch die Degenerierung des Trabekelnetzwerks gekennzeichnet, was zu einer Behinderung der normalen Fähigkeit von wäßriger Flüssigkeit führt, das Auge ohne Schließen des Raums (z.B. des „Winkels") zwischen der Iris und Cornea zu verlassen (Vaughan, D. et al., (1992)). Eine Eigenschaft einer solchen Behinderung bei dieser Krankheit ist ein erhöhter Augeninnendruck („IOP"), was zu einem fortschreitenden Sichtverlust und Blindheit führt, wenn dies nicht in geeigneter Weise und rechtzeitig behandelt wird. Es wird geschätzt, daß die Krankheit zwischen 0,4% und 3,3% aller Erwachsenen über 40 Jahre betrifft (Leske, M. C. et al. (1986); Bengtsson, B. (1989); Strong, N. P. (1992)). Darüberhinaus nimmt das Auftreten der Krankheit mit dem Alter auf über 6% bei 75-Jährigen oder Älteren zu (Strong, N. P., (1992).
  • Da ein erhöhter IOP eine leicht meßbare Eigenschaft von Glaukom ist, wird die Diagnose der Krankheit häufig erstellt, indem der Augeninnendruck gemessen wird (Tonometrie) (Strong, N. P. (1992); Greve, M. et al. (1993)). Leider sind, da glaukomatöse und normale Druckbereiche überlappen, solche Verfahren von beschränktem Wert, sofern nicht mehrere Meßwerte erhalten werden (Hitchings, R. A., (1993); Tuck, M. W. et al. (1993); Vaughan, D. et al., (1992); Vernon, S. A., (1993)). Aus diesem Grund werden häufig zusätzliche Verfahren durchgeführt, wie etwa direkte Untersuchung der Sehnervenscheibe und Bestimmung des Ausmaßes des Sichtfeld-Verlustes eines Patienten, um die Genauigkeit der Diagnose zu verbessern (Greve, M. et al., (1993)).
  • Glaukom betrifft drei getrennte Gewebe im Auge. Der erhöhte IOP, der mit POAG assoziiert ist, beruht auf morphologischen und biochemischen Veränderungen in dem Trabekelnetzwerk (TM), einem Gewebe, das sich an dem Winkel zwischen der Cornea und Iris befindet. Ein Hauptteil der wäßrigen Nährflüssigkeit tritt am vorderen Segment des Auges durch das TM aus. Der fortschreitende Verlust an TM-Zellen und der Aufbau von extrazellulären Trümmern in dem TM von glaukomatösen Augen führt zu einem erhöhten Widerstand gegenüber einem wäßrigen Ausfluß (Lutjen-Drecoll und Rohen 1996; Rohen 1983; Rohen et al. 1993; Grierson and Calthorpe 1988), wodurch der IOP erhöht wird. Ein erhöhter IOP, ebenso wie andere Faktoren, wie Ischämie, verursachen degenerative Veränderungen im Sehnervenkopf (ONH) was zu einem fortschreitenden „Deckeln" („cupping") des ONH (Varma and Minckler 1996; Hernandez and Gong 1996; Hernandez et al. 1990; Hernandez and Pena 1997; Morrison et al. 1990) und Verlust an Netzhaut-Ganglionzellen (Quigley et al. 2000; Quigley 1999; Quigley et al. 1995; Kerrigan et al. 1997) und Axonen führt. Die detaillierten molekularen Mechanismen, die für den glaukomatösen Schaden an dem TM, ONH und den Netzhaut-Ganglionzellen verantwortlich sind, sind nicht bekannt.
  • Die gegenwärtige Glaukomtherapie ist auf ein Senken des IOP gerichtet, einem Hauptrisikofaktor für die Entwicklung und das Fortschreiten von Glaukom. Diese Therapien senken IOP, aber sie sprechen nicht direkt die pathogenen Mechanismen an, und die Krankheit schreitet fort. Wenigstens die Hälfte der Patienten mit Glaukom werden nicht diagnostiziert, und zu dem Zeitpunkt, zu dem die Patienten mit Glaukom diagnostiziert werden, haben sie bereits näherungsweise 40% ihrer Netzhautganglienzellen verloren. Deshalb werden Verfahren zum früheren Nachweis der Diagnose von Glaukom benötigt.
  • Im Hinblick auf die Wichtigkeit von Glaukom und die wenigstens teilweisen Unzulänglichkeiten von früheren Diagnoseverfahren wäre es wünschenswert, ein verbessertes, genaueres Verfahren zum Diagnostizieren von Glaukom in seinen frühen Stadien zu erhalten. Zusätzlich wäre es wünschenswert, neue therapeutische Mittel zu haben, die glaukomatöse pathogene Mechanismen ansprechen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung überwindet diese und andere Nachteile des Stands der Technik durch Bereitstellen von Verfahren zur Frühdiagnose von Glaukom.
  • In bestimmten spezifischen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren von Glaukom in einer von einer Zelle oder Körperflüssigkeit erhaltenen Probe bereit durch Nachweisen der veränderten Expression eines Gen-Mitglieds der Knochenmorphogenen Familie. Ein solches Verfahren wird in Anspruch 1 bereitgestellt. Vorteilhafte Ausführungsformen werden in den abhängigen Ansprüchen bereitgestellt.
  • Im allgemeinen können die Verfahren der Erfindung den Erhalt einer Probe aus einem Individuum und das Extrahieren von DNA aus der Probe beinhalten. Ausgewählte PCR-Primer für spezifische Mitglieder der BMP-Genfamilie werden dann verwendet, um relevante Regionen des extrahierten Gens zu amplifizieren, um ein PCR-Produkt zu erhalten. Das PCR-Produkt wird mit einer Technik aufgelöst, die in effektiver Weise DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen der normalen und mutierten Form des spezifischen BMP-Familien-Gens, das bewertet wird (die extrahierte DNA), identifiziert. Identifizierte Unterschiede zwischen den Sequenzen weise auf Glaukom hin.
  • Das Gewebe oder die Flüssigprobe zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung können Blut oder bukkale Zellen sein.
  • Typischerweise werden die Primersequenzen eine Länge von zwischen ungefähr 10, 15 oder 18 Nukleotiden bis zu ungefähr 20 oder bis zu ungefähr 30 Nukleotide haben. Längere Sequenzen, z.B. 40, 50, 80, 90, 95, 100, sogar bis zur vollen Länge, werden für bestimmte Ausführungsformen sogar noch stärker bevorzugt. Längen von Oligonukleotiden von wenigstens ungefähr 18 bis 20 Nukleotiden werden von Fachleuten auf dem Gebiet als ausreichend akzeptiert, um eine hinreichend spezifische Hybridisierung zu ermöglichen, um als eine molekulare Sonde nützlich zu sein, wie von Lathe (1985) beschrieben, einer Literaturangabe, die spezifisch durch Bezugnahme zu diesem Zwecke hierin aufgenommen wird. Bevorzugt wird die Nukleotidsequenz aus von 20 bis 100 zusammenhängenden Nukleotiden von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 oder SEQ ID NO: 53 bestehen. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, daß die Primer-Sequenzen aus Sequenzen von wenigstens 10, 15 oder 18 zusammenhängenden Nukleotiden aus den Sequenzen von BMP-Rezeptor-Genen und von BMP-assoziierten Proteinen bestehen können, deren Sequenzen bekannt sind.
  • Nukleinsäuremoleküle mit Bereichen von 10, 18, 20, 30, 50, 60, 65 oder sogar bis zu und einschließlich 100 Nukleotiden oder ähnlich, komplementär zu einer aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 oder SEQ ID NO: 53, haben einen Nutzen als Hybridisierungssonden. Primer oder Sonden mit einer Nukleotidlänge von ungefähr 18 Nukleotiden werden von Fachleuten anerkannt, daß sie hochspezifische Hybridisierung an eine Zielsequenz bereitstellen. Die Gesamtgröße des Fragments ebenso wie die Größe der komplementären Abschnitte wird letztendlich von der beabsichtigten Verwendung des individuellen Nukleinsäuresegments abhängen. Kleinere Fragmente werden im allgemeinen ihre Verwendung bei Hybridisierungsausführungsformen finden, wobei die Länge der komplementären Region variiert werden kann, wie etwa zwischen ungefähr 10, 18, 20 oder 30 und ungefähr 50, 60, 70, 80, 80 oder 100 Nukleotiden oder sogar die volle Länge entsprechend den komplementären Sequenzen, die man nachzuweisen wünscht.
  • In spezifisch bevorzugten Ausführungsformen werden die Primer aus zusammenhängenden Sequenzen aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 oder SEQ ID NO: 53 bestehen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die Primer aus zusammenhängenden Sequenzen von BMP-Rezeptor-Genen bestehen (offenbart in ten Dijke et al. 1993; Astrom et al. 1999; Nohno et al. 1995, die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden) oder von BMP-assoziierten Genen, wie etwa Chordin (NCBI NM_029130), Gremlin (Murphy et al. 1999; McMahon et al. 2000), Follistatin (NCBI NM_003892) oder Bambi (NCBI NM_005791).
  • Am bevorzugtesten werden die Primer aus einer zusammenhängenden Sequenz von SEQ ID NO: 3 bestehen. In bestimmten Aspekten können wenigstens einige der Primer weiterhin eine nachweisbare Markierung enthalten.
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln von Glaukom durch Verabreichen einer Zusammensetzung an einen dafür bedürftigen Patienten bereit, wobei die Zusammensetzung eine Sequenz umfaßt, bestehend aus wenigstens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem BMP2-Agonisten, einem BMP4-Agonisten, einem BMP5-Agonisten, einem BMP7-Agonisten, einem Smad-1/5-Agonisten, einem Chordin-Antagonisten, einem Gremlin-Antagonisten und einem Follistatin-Antagonisten.
  • In zusätzlichen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines therapeutischen Mittels für die Behandlung von Glaukom bereit. Therapeutische Mittel können zum Beispiel identifiziert werden durch:
    • a) Erhalten einer ersten Zusammensetzung, umfassend eine Population von rekombinanten Zellen, die BMP-2A, BMP4, BMP-5 oder BMP7 exprimieren;
    • b) Erhalten einer Kandidatensubstanz;
    • c) Inkubieren der Zusammensetzung und der Kandidatensubstanz;
  • Testen der Zusammensetzung auf ihre Fähigkeit, BMP-induzierte Smad-Signalwege und/oder BMP-regulierte Genexpression anzuschalten; und Identifizieren einer Kandidatensubstanz, die diese Stromab-Effekte („downstream effect") von BMP inhibiert oder stimuliert.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind diagnostische Kits, enthaltend Sequenzen der vorliegenden Erfindung und geeignete Reagenzien, wie etwa eine nachweisbare Markierung, die mit einem Protein, Peptid oder dem Antikörper selbst verknüpft ist. Alternativ kann die nachweisbare Markierung mit einer zweiten Sequenz verknüpft sein, die selektiv an eine Sequenz der Erfindung hybridisiert.
  • Verwandte Ausführungsformen schließen therapeutische Kits ein, die pharmazeutisch akzeptable Formulierungen von entweder den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen oder Peptid- oder Proteinsequenzen einschließen. Solche Kits sind zum Nachweis einer veränderten Expression der BMP-Gene und Proteine in klinischen Proben für die Diagnose von Glaukom nützlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sind enthalten, um darüberhinaus bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen verstanden werden, die hierein präsentiert werden.
  • 1. Nukleotid- und Aminosäuresequenz von BMP2A.
  • 2. Nukleotid- und Aminosäuresequenz von BMP4.
  • 3. Nukleotid- und Aminosäuresequenz von BMP5.
  • 4. Nukleotid- und Aminosäuresequenz von BMP7.
  • 5. Knochen-morphogener Protein-Signalweg. Knochen-morphogenes Protein (BMP)-Dimere binden an einen Membrankomplex, zusammengesetzt aus BMP-Rezeptoren 1 und 2, die Serin/Threonin-Kinasen sind. Die regulatorischen Smads (Smad1/Smad5) werden phosphoryliert und assoziieren mit einem co-Smad (Smad4). Dieser resultierende Smad-Komplex tritt in den Kern ein, wo er mit Transkriptionsfaktoren (TF) assoziiert und die Genexpression reguliert. BMP-assoziierte Proteine wirken als BMP-Antagonisten, indem sie BMPs binden und eine BMP-Wechselwirkung mit BMP-Rezeptoren verhindern.
  • 6. BMP-Expression in humanen TM-Zellen und Geweben. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von BMP-PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt von einer RT-PCR-Analyse der BMP-Expression in humanen TM-Zellen (Spuren 1-5) und Geweben (Spuren 6-7). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-interne Kontrolle verwendet.
  • 7. BMP-Rezeptorexpression in humanen TM-Zellen und Geweben. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt von einer RT-PCR-Analyse der BMP-Rezeptorexpression in humanen TM-Zellen (Spuren 1-5) und Geweben (Spuren 6-7). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-interne Kontrolle verwendet.
  • 8. BMP-Expression in humanen ONH-Astrocyten, ONH-Geweben und humanen Gehirn-Astrocyten. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt aus einer RT-PCR-Analyse der BMP-Expression in humanen ONH-Astrocyten (Spuren 1-5), ONH-Gewebe (Spur 6) und humanen Gehirn-Astrocyten (Spur 7). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-interne Kontrolle verwendet.
  • 9. BMP-Expression in humanen Lamina-Cribrosa-Zellinien. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt aus einer RT-PCR-Analyse von humanen Lamina Cribrosa-Zellen (Spuren 1-9). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-interne Kontrolle verwendet.
  • 10. BMP-Rezeptor-Expression in humanen ONH-Astrocyten, ONH-Geweben und humanen Gehirn-Astrocyten. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt aus einer RT-PCR-Analyse der BMP-Rezeptorexpression in humanen Sehnervenkopf-Astrocyten (ONA)(Spuren 1-5), ONH-Gewebe (Spur 6) und humanen Gehirn-Astrocyten (Spur 7). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-Kontrolle verwendet.
  • 11. BMP-Rezeptor-Expression in humanen Lamina-Cribrosa-Zellinien. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt aus einer RT-PCR-Analyse von humanen Lamina-Cribrosa-Zellen (Spuren 1-9). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-Kontrolle verwendet.
  • 12. Western-Immunoblot von BMP- und BMP-Rezeptorexpression in kultivierten humanen TM-Zellen, Sehnerv-Kopf-Astrocyten (ONA) und Lamina cribrosa-Zellen. Chemilumineszenznachweis von BMP-Protein und BMP-Rezeptoren in humanen Trabekelnetzwerkzellen (Spuren 1-2), ONH-Astrocyten (Spuren 3-4) und Lamina cribrosa-Zellen (Spuren 5-6). Proteingröße angezeigt in kDa.
  • 13. BMP-assoziierte Protein-mRNA-Expressio in humanen TM-Zellen. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt aus RT-PCR-Analyse von humanen TM-Zellen (Spuren 1-5). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-interne Kontrolle verwendet.
  • 14. BMP-assoziierte Protein-mRNA-Expression in humanen Lamina-Cribrosazellen und ONH-Astrocyten. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von PCR-Produkten aus cDNA-Proben, erzeugt aus einer RT-PCR-Analyse von Lamina Cribrosa (LC)-Zellen (Spuren 1-7) und ONH-Astrocyten (ONA) (Spuren 8-11). L = Basenpaarenmarker. C = negative PCR-Kontrollspur. β-Actin wurde als eine positive RT-PCR-interne Kontrolle verwendet.
  • 15. illustriert die erhöhte Expression des BMP-Antagonisten Gremlin (CKTSF1B1) in glaukomatösen TM-Zellen. Die Genexpression wurde unter Verwendung von Affymetrix-Genarrays beurteilt (Affymetrix Genchip U133A).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es ist vorgeschlagen worden, daß das Trabekelnetzwerk eine wichtige Rolle bei dem normalen Fluß der wäßrigen Flüssigkeit spielt, und es ist angenommen worden, daß es die Hauptstelle des Widerstandes gegen einen Ausfluß in glaukomatösen Augen ist. Humane Trabekelnetzwerk (HTM)-Zellen sind spezialisierte Zellen, die die Ausflußkanäle auskleiden, durch die wäßrige Flüssigkeit aus dem Auge austritt. Eine veränderte synthetische Funktion der Zellen kann bei der Pathogenese von POAG, Steroid-Glaukom und anderen Typen von Glaukom beteiligt sein.
  • Trotz Jahre intensiver Forschung sind die genauen molekularen Mechanismen, die für eine glaukomatöse Schädigung am Auge verantwortlich sind, nicht bekannt. Jüngere Forschung hat nahegelegt, daß Wachstumsfaktoren beim Aufrechterhalten einer normalen Homöostase in den Augengeweben, die mit Glaukom assoziiert sind, wichtig sein können, und Veränderungen bei Wachstumsfaktor/Wachstumsaktor-Rezeptoren können eine Rolle bei der Glaukom-Pathogenese spielen. Wachstumsfaktoren sind eine sehr große Familie von Polypeptiden, die das Zellwachstum und Differenzierung steuern. Diese Moleküle haben eine Vielzahl von zellspezifischen Effekten auf die Genexpression, extrazelluläre Matrixzusammensetzung und Ablagerung, Cytoskelettorganisation und Regulation von Zellfunktionen. Das TM exprimiert eine große Vielzahl von Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren (Tripathi et al. 1993a; Tripathi et al. 1993b; Tripathi et al. 1994a; Tripathi et al. 1994b; Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999) ebenso wie Neurotrophin/neurotrophe Faktoren und ihre Rezeptoren (Liu et al. 2001; Wordinger et al. 2000). ONH-Astrocyten und Lamina Cribrosa-Zellen, zwei Zelltypen des Sehnervkopfs, exprimieren Wachstumsfaktoren, Neurotrophine und ihre Rezeptoren (Lambert et al. 2001; Pena et al. 1999). Die wäßrige Flüssigkeit enthält ebenfalls eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren, einschließlich FGF2, EGF, TGFβ, HGF (Tripathi et al. 1996; Tripathi et al. 1991; Tripathi et al. 1992; Hu and Ritch 2001) ebenso wie Neurotrophine (Chundru et al. 2000). Es ist über erhöhte Konzentrationen an TGFβ-2 und HGF in wäßriger Flüssigkeit in POAG-Patienten berichtet worden (Tripathi et al. 1994c; Inatani et al. 2001; Picht et al. 2001). Wachstumsfaktoren können bei Glaukom beteiligt sein, indem die normale Entwicklung und/oder Funktion des TM und ONH verändert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stammt teilweise aus der Erkenntnis, daß Knochen-morphogene Proteine (BMPs) nicht nur Knochen- und Knorpelbildung induzieren, sondern multifunktionelle Cytokine mit vielen verschiedenen Effekten auf zahlreiche Zelltypen sind (Hogan 1996; Reddi 1997) und von sowohl humanem Trabekelnetzwerk (HTM) als auch Sehnervkopf (ONH)-Zellen exprimiert werden (Wordinger et al. 2002). BMPs sind Mitglieder der TGFβ-Superfamilie, und es gibt näherungsweise 15-20 BMPs-Gene beim Menschen, 3 BMP-Rezeptoren und eine Anzahl von BMP-assoziierten Proteinen, die als BMP-Antagonisten funktionieren (Yamashita et al.). BMPs geben Signale über einen Rezeptorkomplex ab, bestehend aus BMPR-I und BMPR-II. Es ist berichtet worden, daß Superfamilie-Mitglieder TGFβ und TGFβR (Agarwal et al. 1997; Lambert et al. 1997) und GDNF und GDNFR (Wordinger et al. 1999; Liu et al. 1999) von sowohl HTM- als auch ONH-Zellen exprimiert werden.
  • BMPs und BMP-Rezeptoren werden in Geweben des Auges exprimiert (Obata et al. 1999; You et al. 1999), aber frühere Berichte haben sich auf die Augen-Entwicklung konzentriert. Die Funktion von BMPs ist bei der Augen-Entwicklung wichtig, da eine gezielte Zerstörung von Genen, die für BMPs kodieren, in Mäusen zu schweren Entwicklungsdefekten in der Retina und der Linse führt (Jena et al. 1997; Luo et al. 1995; Dudley et al. 1995). BMP-2, BMP-4 und BMP-7 sind bei der Entwicklung der Linse und Retina beteiligt (Jena et al. 1997; Furuta and Hogan 1998; Reddi 2000; Trousse et al. 2001). BMP-6 und BMP-7 scheinen auch eine Rolle beim Schutz von Neuronen vor hypoglykämischem oder ischämischem Schaden zu spielen (Nonner et al. 2001; Liu et al. 2001), und es ist gezeigt worden, daß BMP-2 die Ganglion-Zellen-Neurotrophin-Expression verstärkt (Zhang et al. 1998). Heterozygote Knockout-Mäuse, die für Bmp4 haploinsuffizient sind, haben Augen-Phänotypen, einschließlich Dysgenese des vorderen Segments, erhöhter IOP und Sehnerv-Abnormitäten (Chang et al. 2001). Es hat sehr beschränkte veröffentlichte Informationen, betreffend die Rolle von BMPs im humanen postnatalen Auge gegeben.
  • Mohan und Kollegen (1998) berichteten, daß BMP-2 und BMP-4 und BMP-Rezeptoren in Zellen der erwachsenen Cornea exprimiert werden, und schlugen vor, daß die BMP-Funktion eine Cornea-Keratocyten-Proliferation und Apoptose einschließen könnte. You und Kollegen (1999) verifizierten diese Studie und berichteten ebenfalls über die Expression von BMP-3, BMP-5 und BMP-7 in ex-vivo- und kultivierten Cornea-Epithel- und Stroma-Zellen. Sie berichteten, daß das Niveau der BMP-Transkription im Stroma höher war, während das Niveau für Rezeptoren in kultivierten Cornea-Epithelzellen höher war.
  • Unter Verwendung von RT-PCR entdeckten die jetzigen Erfinder mRNAs für BMPs, BMP-Rezeptoren BMPR-IA, BMPR-IB und BMPR-II, ebenso wie BMP-bindende Proteine Gremlin, Chordin, Follistatin und Bambi in HTM, Lamina cribosa (LC) und ONH-Astrocyten-Zelllinien und Geweben (Wordinger et al. 2002). Die jetzigen Erfinder entdeckten weiterhin, daß HTM- und ONH-Zellen Proteine BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-7 exprimieren.
  • Glaukom wird durch eine Charakterisierung von genetischen Veränderungen in den Genen der Mitgliedern der BMP-Signalfamilie diagnostiziert. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Wendungen „Gen-Mitglied der Knochen-morphogenen Familie" und „BMP-Signal-Familie" auf alle BMPs, BMP-Rezeptoren und assoziierte Proteine. Der Begriff „genetische Veränderungen" ist bei Fachleuten gut bekannt. Es gibt zahlreiche Beispiele für Krankheiten, die mit genetischen Veränderungen in spezifischen Genen assoziiert sind (sieh z.B. Cummings 1997; Strachan, et al. 1996; Jorde, et al. 1999). Genetische Veränderungen in einem spezifischen Gen (z.B. BMP) können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken bestimmt werden, die Fachleuten gut bekannt sind, wie etwa: SSCP, DGGE, ASO, RFLP, Heteroduplex-Analyse, CCM, PTT und RNAase-Spaltung (siehe Birren, et al. 1998).
  • Glaukom kann durch eine veränderte Expression von einem oder mehreren BMP-Familien-Genen im Auge verursacht werden, was zu einem erhöhten IOP und/oder einer glaukomatösen Seh-Neuropathie führt. Eine „veränderte BMP-Genexpression" bedeutet eine Expression dieses Genprodukts, die vom Normalzustand verschieden ist. Der Begriff kann sich auf Veränderungen in der Sequenz des Gens oder Proteins beziehen. Das normale BMP-Gen ist gut charakterisiert worden (siehe oben), und es ist über die Expression von BMP in einer Vielzahl von Geweben berichtet worden, einschließlich dem TM und ONH. Genetische Veränderungen in der kodierenden Region von BMP-Familien-Genen kann die Funktion dieser Proteine verändern. Genetische Veränderungen außerhalb der kodierenden Region können auch zu Glaukom führen.
  • Es ist Fachleuten gut bekannt, daß „Veränderungen außerhalb" der kodierenden Region eines spezifischen Gens bei der Regulation der Genexpression wichtig sind. Zum Beispiel ist die Region stromauf (5') von der kodierenden Region von den meisten Genen als Promoter-Region bekannt, die die Expression dieses Gens „fördert" („promotes" und reguliert. Die Promoter-Region enthält zahlreiche Nukleotidsequenzen, die von verschiedenen Transkriptionsfaktoren und DNA-bindenden Proteinen erkannt werden, die für die Aktivierung oder Repression der Genexpression verantwortlich sind. Regionen stromab (3') des Gens können eine Polyadenylierung des Genprodukts bestimmen, wodurch eine RNA-Verarbeitung und Translation des Genprodukts reguliert wird.
  • Die veränderte Expression von BMP-Genen oder Mutationen in der Sequenz der Gene, die auf Glaukom hinweist, kann unter Verwendung von Techniken nachgewiesen werden, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Zum Beispiel wird in Erwägung gezogen, daß ein Nukleinsäurefragment von beinahe jeglicher Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge bevorzugt durch die Leichtigkeit der Herstellung und Verwendung bei dem beabsichtigten Protokoll beschränkt wird. Die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen können auch eine Nützlichkeit als Sonden oder Primer bei Nukleinsäurehybridisierungsausführungsformen haben. Als solches wird in Erwägung gezogen, daß Nukleinsäuresegmente, die eine Sequenzregion umfassen, die aus wenigstens einer 14 Nukleotid-langen zusammenhängenden Sequenz besteht, die die selbe Sequenz wie eine 14 Nukleotid-lange zusammenhängende Sequenz von BMP-2A (SEQ ID NO: 1), BMP-4 (SEQ ID NO: 3), BMP-5 (SEQ ID NO: 5), BMP-7 (SEQ ID NO: 7), BMP-RIA (SEQ ID NO: 37), BMP-RIB (SEQ ID NO: 39), BMP-RII (SEQ ID NO: 41), Chordin (SEQ ID NO: 43), Gremlin (SEQ ID NO: 45), Follistatin (SEQ ID NO: 47) oder Bambi (SEQ ID NO: 53) hat oder dazu komplementär ist, eine besondere Nützlichkeit finden werden. Längere zusammenhängende identische oder komplementäre Sequenzen, z.B. diejenigen von ungefähr 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 Nukleotiden (einschließlich aller dazwischen liegenden Längen), und sogar bis zu Sequenzen voller Länge von 1547 Nukleotiden (für BMP-2A), 1946 Nukleotide (für BMP-4), 2153 Nukleotide (für BMP-5) und 1878 Nukleotide (für BMP-7), 2932 Nukleotide (für BMP-RIA), 2032 Nukleotide (für BMP-RIB), 3611 Nukleotide (für BMP-RII), 3561 Nukleotide (für Chordin), 4049 Nukleotide (für Gremlin), 1386 Nukleotide (für Follistatin) und 1523 Nukleotide (für Bambi) werden ebenfalls von Nutzen bei bestimmten Ausführungsformen sein.
  • Es wird in leichter Weise verstanden werden, daß „dazwischenliegende Längen" in diesem Kontext jegliche Länge zwischen den zitierten Bereichen bedeutet, wie etwa 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; einschließlich aller ganzen Zahlen über die 200-500-, 500-1000-, 100-2000-Bereiche bis zu und einschließlich der Sequenzen von 2001, 2002, 2050, 2051 und ähnlichem.
  • Die Fähigkeit von solchen Nukleinsäuresonden und Primern, mit BMP-kodierenden Sequenzen und Primern spezifisch zu hybridisieren, um BMP-Sequenzen spezifisch zu amplifizieren, wird es ermöglichen, daß diese von Nutzen beim Nachweis der Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe sein werden. Jedoch werden andere Verwendungen in Erwägung gezogen, einschließlich der Verwendung der Sequenzinformation für die Herstellung von mutanten Spezies-Primern oder Primern zur Verwendung beim Herstellen von anderen genetischen Konstrukten.
  • Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzregionen, bestehend aus zusammenhängenden Nukleotidabschnitten von 10, 20, 30, 50 oder sogar von 100-200 Nukleotiden oder ähnlichem, identisch oder komplementär zu BMP-2A (SEQ ID NO: 1), BMP4 (SEQ ID NO: 3), BMP-5 (SEQ ID NO: 5), BMP7 (SEQ ID NO: 7), BMP-RIA (SEQ ID NO: 37), BMP-RIB (SEQ ID NO: 39), BMP-RII (SEQ ID NO: 41), Chordin (SEQ ID NO: 43), Gremlin (SEQ ID NO: 45), Follistatin (SEQ ID NO: 47) oder Bambi (SEQ ID NO: 53), werden besonders als Hybridisierungssonden zur Verwendung bei z.B. SNP-Bewertung und Festphasenhybridisierungsassays in Erwägung gezogen, zusätzlich zu Southern- und Northern-Blotting. Dies würde die Analyse von BMP-strukturellen oder regulatorischen Genen sowohl in Geweben als auch Zellen ermöglichen. Die Gesamtfragmentgröße ebenso wie die Größe des komplementären Abschnitts (der komplementären Abschnitte) wird letztendlich von der beabsichtigten Verwendung des jeweiligen Nukleinsäuresegments abhängen. Kleinere Fragmente werden im allgemeinen eine Verwendung bei Hybridisierungsausführungsformen finden, wobei die Länge der zusammenhängenden komplementären Region variiert werden kann, wie etwa zwischen ungefähr 10 und ungefähr 100 Nukleotiden, aber größere zusammenhängende komplementäre Abschnitte von bis zu ungefähr 1547 Nukleotiden (für BMP-2A), 1946 Nukleotiden (für BMP-4), 2153 Nukleotiden (für BMP-5) und 1878 Nukleotiden (für BMP-7), 2932 Nukleotiden (für BMP-RIA), 2032 Nukleotiden (für BMP-RIB), 3611 Nukleotiden (für BMP-RII), 3561 Nukleotiden (für Chordin), 4049 Nukleotiden (für Gremlin), 1386 Nukleotiden (für Follistatin) und 1523 Nukleotiden (für Bambi) können verwendet werden, gemäß der Länge der komplementären Sequenzen, die man nachzuweisen wünscht.
  • Die Verwendung einer Hybridisierungssonde von ungefähr 10-14 Nukleotiden Länge ermöglicht die Bildung eines Duplex-Moleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle mit zusammenhängenden komplementären Sequenzen über Abschnitte größer als 10 Basen Länge werden im allgemeinen bevorzugt, obwohl man, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und das Ausmaß der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern, man im allgemeinen bevorzugen wird, Nukleinsäuremoleküle mit Gen-komplementären Abschnitten von 15-20 zusammenhängenden Nukleotiden oder bei Wunsch sogar länger zu entwerfen.
  • Hybridisierungssonden können aus jeglichem Teil von jeglicher der hierin offenbarten Sequenzen ausgewählt werden. Alles was erforderlich ist, ist es, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 oder SEQ ID NO: 53 dargestellte Sequenz durchzusehen und einen kontinuierlichen Teil der Sequenz von ungefähr 10 Nukleotiden Länge bis zu und einschließlich der Vollängensequenz auszuwählen, die man als eine Sonde oder Primer zu verwenden wünscht. Die Auswahl der Sonden- und Primer-Sequenzen kann von verschiedenen Faktoren geleitet werden, wie etwa, nur zum Beispiel, daß man Primer in Richtung der Termini der Gesamtsequenz oder von den Enden der funktionellen Domänkodierenden Sequenzen zu verwenden wünscht, um die DNA weiter zu amplifizieren.
  • Der Prozeß der Auswahl und des Herstellens eines Nukleinsäuresegments, das eine zusammenhängende Sequenz von innerhalb BMP-2A (SEQ ID NO: 1), BMP4 (SEQ ID NO: 3), BMP-5 (SEQ ID NO: 5), BMP7 (SEQ ID NO: 7), BMP-RIA (SEQ ID NO: 37), BMP-RIB (SEQ ID NO: 39), BMP-RII (SEQ ID NO: 41), Chordin (SEQ ID NO: 43), Gremlin (SEQ ID NO: 45), Follistatin (SEQ ID NO: 47) oder Bambi (SEQ ID NO: 53) einschließt, kann alternativ als Herstellung eines Nukleinsäurefragments beschrieben werden. Natürlich können auch Fragmente mit anderen Techniken erhalten werden, wie etwa z.B. mittels mechanischer Scherung oder mittels Restriktionsenzymverdau. Kleine Nukleinsäuresegmente oder Fragmente können in leichter Weise z.B. durch direkte Synthese des Fragments mit chemischen Mitteln hergestellt werden, wie es unter Verwendung eines automatisierten Oligonukleotidsynthesizer praktiziert wird. Ebenso können Fragmente durch Anwendung von Nukleinsäurereproduktionstechnologie, wie etwa der PCRTM-Technologie von US-Patent Nr. 4,682,202 und US-Patent Nr. 4,682,195 (jeweils hierin durch Bezugnahme aufgenommen), durch Einführen von ausgewählten Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Herstellung, und mit anderen rekombinanten DNA-Techniken erhalten werden, die im allgemeinen Fachleuten der Molekularbiologie bekannt sind.
  • Entsprechend können die Nukleotidsequenzen der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet werden, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von BMP-Genen oder cDNAs zu bilden. Abhängig von der beabsichtigten Anwendung wird man verschiedene Selektivitätsgrade der Hybridisierung zu verwenden wünschen, um verschiedene Grade an Selektivität der Sonde auf die Zielsequenz zu erzielen. Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man typischerweise relativ stringente Bedingungen verwenden wollen, um die Hybride zu bilden, z.B. wird man relativ niedrige Salz- und/oder hohe Temperaturbedingungen auswählen, wie etwa 0,02 M-0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50°C bis 70°C. Solche selektiven Zustände tolerieren wenig Fehlpaarungen zwischen der Sonde und dem Templat oder Ziel-Strang, wenn überhaupt, und wären besonders geeignet zum Untersuchen von BMP-Genen.
  • Natürlich werden für einige Anwendungen, z.B. wenn man Mutanten unter Verwendung eines mutanten Primerstranges, hybridisiert an ein darunter liegendes Templat, herzustellen oder zu identifizieren wünscht, oder wenn man BMP-kodierende Sequenzen aus verwandten Spezies, funktionelle Aquivalente oder ähnliches zu isolieren versucht, weniger stringente Hybridisierungsbedingungen typischerweise benötigt werden, um die Bildung des Heteroduplex zu ermöglichen. Unter diesen Umständen kann man wünschen, Bedingungen zu verwenden, wie etwa 0,15 M-1,0 M Salz bei Temperaturen im Bereich von 20°C bis 55°C. Kreuzhybridisierende Spezies können dadurch in leichter Weise als positiv hybridisierende Signale identifiziert werden im Hinblick auf Kontrollhybridisierungen. In jedem Fall wird im allgemeinen anerkannt, daß Zustände stringenter gemacht werden können, indem NaCl-Konzentrationen verringert werden, oder durch die Zugabe von zunehmenden Mengen an Formamid, was dazu dient, den Hybrid-Duplex auf dieselber Weise wie erhöhte Temperatur zu destabilisieren. Daher können Hybridisierungsbedingungen in leichter Weise manipuliert werden und werden daher im allgemeinen ein Verfahren der Wahl sein, abhängig von den erwünschten Ergebnissen.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel zu verwenden, wie etwa einer Markierung, zum Bestimmen der Hybridisierung. Eine große Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind auf dem Gebiet bekannt, einschließlich fluoreszierender, radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie etwa Avidin/Biotin, die in der Lage sind, ein nachweisbares Signal zu ergeben. In bevorzugten Ausführungsformen wird man wahrscheinlich eine fluoreszierende Markierung oder ein Enzym-Tag verwenden wollen, wie etwa Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstelle von radioaktiven oder anderen umweltschädlichen Reagenzien. Im Falle von Enzym-Tags sind colorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die verwendet werden können, um ein Mittel bereitzustellen, das dem menschlichen Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um spezifische Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-enthaltenden Proben zu identifizieren.
  • Im allgemeinen wird in Erwägung gezogen, daß die hierin beschriebnen Hybridisierungssonden sowohl als Reagenzien bei Lösungshybridisierung als auch in Ausführungsformen nützlich sein werden, die eine Festphase verwenden. In den Ausführungsformen, die eine Festphase verwenden, wird die Test-DNA (oder RNA) adsorbiert oder anderweitig an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche befestigt. Diese fixierte einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter erwünschten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen werden von den individuellen Umständen abhängen, basierend auf den jeweiligen Kriterien, die erforderlich sind (abhängig von z.B. dem G+C-Gehalt, dem Typ der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, die Größe der Hybridisierungssonde etc.). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um unspezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird eine spezifische Hybridisierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert mittels der Markierung.
  • Es wird auch verstanden werden, daß diese Erfindung nicht auf die individuelle Nukleinsäure- und Aminsäuresequenzen von BMP-2A (SEQ ID NO: 1), BMP4 (SEQ ID NO: 3), BMP-5 (SEQ ID NO: 5), BMP7 (SEQ ID NO: 7), BMP-RIA (SEQ ID NO: 37), BMP-RIB (SEQ ID NO: 39), BMP-RII (SEQ ID NO: 41), Chordin (SEQ ID NO: 43), Gremlin (SEQ ID NO: 45), Follistatin (SEQ ID NO: 47) oder Bambi (SEQ ID NO: 53) beschränkt ist. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Sequenzen können deshalb in variabler Weise die BMP-kodierenden Regionen selbst, Stromauf- oder Stromab-Regionen der Gene, kodierende Regionen, die ausgewählte Veränderungen oder Modifizierungen in der grundlegenden Kodierungsregion tragen, enthalten, oder sie können für größere Polypeptide kodieren, die nichtsdestotrotz BMP-kodierende Regionen einschließen, oder sie können für biologisch funktionelle äquivalente Proteine oder Polypeptide kodieren, die variierende Aminosäuresequenzen haben.
  • Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung umfassen biologisch funktionelle äquivalente BMP-Proteine und -Polypeptide. Solche Sequenzen könne als eine Konsequenz der Kodon-Redundanz und funktionellen Äquivalenz entstehen, von denen bekannt ist, daß sie natürlicherweise innerhalb von Nukleinsäuresequenzen und den so kodierten Proteinen auftreten. Alternativ können funktionell äquivalente Proteine oder Polypeptide mittels der Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie erzeugt werden, bei der Veränderungen in der Proteinstruktur konstruiert werden können, basierend auf Uberlegungen hinsichtlich der Eigenschaften der auszutauschenden Aminosäuren. Veränderungen, die vom Menschen entworfen werden, können durch die Anwendung von ortsgerichteten Mutagenesetechniken eingeführt werden, z.B. um Verbesserungen im Hinblick auf die Antigenizität des Proteins einzuführen oder um BMP-Mutanten zu testen, um die Bindungsaktivität auf dem molekularen Niveau zu untersuchen.
  • Das therapeutische Mittel zur Behandlung von Glaukom kann sein: Ein Peptid oder Protein, ein Peptid-Mimetikum, ein Oligonukleotid oder derivatisiertes Oligonukleotid oder kleines Arznei-artiges Molekül, die alle ein oder mehrere Aspekte der BMP-Wege im Auge beeinflussen. Bevorzugte therapeutische Mittel sind die folgenden: (1) BMP2-, BMP4-, BMP5- oder BMP7-Agonisten; (2) Chordin-, Gremlin-, Follistatin-, oder Bambi-Antagonisten; und/oder (3) Smad1-, Smad5- und/oder Smad4-Agonisten.
  • Das Mittel kann direkt an das Auge gegeben werden (z.B.: topische Augentropfen oder Salben; Vorrichtungen mit langsamer Freisetzung im Blindsack („cul-de-sac") oder angrenzend an die Sclera oder innerhalb des Auges implantiert; periokulare, konjunktivale, subkonjunktivale, intracamerale oder intravitreale Injektionen) oder parenteral (z.B. orale, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektionen, dermale Abgabe, etc.), unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten bekannt sind. Die folgenden sind Beispiele von möglichen Formulierungen, die durch diese Erfindung verkörpert werden.
    (a) topische Augenformulierung Gew.%
    Mittel, das die Expression von BMP-4 im Auge erhöht 0,01-2
    HPMC 0,5
    Natriumchlorid 0,8
    BAC 0,01%
    EDTA 0,01
    NaOH/HCl qs pH 7,4
    Aufgereinigtes Wasser qs 100 mL
    (b) topische Augenformulierung Gew.%
    Gremlin-Antagonist 0,01-2
    HPMC 0,5
    Natriumchlorid 0,8
    BAC 0,01
    EDTA 0,01
    NaOH/HCl qs pH 7,4
    Aufgereinigtes Wasser qs 100 mL
    (c) topische Augenformulierung Gew.%
    Smad 1/5-Agonist 0,01-2
    HPMC 0,5
    Natriumchlorid 0,8
    BAC 0,01
    EDTA 0,01
    NaOH/HCl qs pH 7,2
    Aufgereinigtes Wasser qs 100 mL
  • Es wird weiterhin in Erwägung gezogen, daß die Verbindungen der Erfindung in Vorrichtungen formuliert sein könnten zum Einführen in das Auge („intraocular insert device").
  • A. Assay für therapeutische Mittel
  • Diese Erfindung ist ebenfalls zur Entdeckung von neuen Anti-Glaukom-therapeutischen Mitteln nützlich, die an dem BMP-Signalweg beteiligt sind (siehe 5). Selektive BMP-Liganden binden an BMP-Typ-I- und Typ-II-Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren (BMP-RI und BMP-RII) und transduzieren Signale über Smad-Proteine. Das BMP-Signal wird durch Smads über Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen weitergeleitet (Attisano und Tuen Lee-Hoeflich 2001). Regulatorisches Smad 1 und Smad werden aktiviert (über Phosphorylierung) mittels Liganden-gebundener BMP-Rezeptoren (von Bubnoff und Cho 2001). Diese regulatorischen Smads wechselwirken dann mit Smad 4, um einen heteromeren Komplex zu bilden, der in den Kern translociert. Dieser Komplex ist in der Lage, die Transkription von selektiven Genen zu aktivieren oder zu unterdrücken, die diesen Transkriptionskomplex erkennen, abhängig davon, welche Kern-Cofaktoren vorhanden sind.
  • Der BMP-Smad-Signalweg wird negativ reguliert über mehrere Mechanismen. Bestimmte BMP-bindende Proteine (wie etwa Gremlin, BAMBI oder Follistatin) binden BMPs und inhibieren ihre Wechselwirkung mit BMP-Rezeptoren. Zusätzlich gibt es inhibitorische Smad-Proteine (z. B. Smad 6 und Smad), die BMP-Rezeptoren binden und inaktivieren. (Kowabata et al. 1998; Itoh et al. 2000; Miyazono 2000). Die jetzigen Erfinder haben entdeckt, daß humane TM-Zellen, ONH-Astrocyten und Lamina Cribrosa-Zellen Botschaft und Protein für den BMP-Rezeptorkomplex exprimieren. Daher könnten diese Zellen auf endogene BMP-Liganden reagieren.
  • Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um neue therapeutische Anti-Glaukom-Mittel zu entdecken, und diese Techniken sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Zum Beispiel können Peptid- oder Peptid-mimetische Mittel, die als Agonisten oder Inhibitoren von BMPs agieren, durch molekulares Modellieren von BMP/BMP-Rezeptorstrukturen entdeckt werden (Nickel et al. 2001). Die BMP-Signaltransduktion beinhaltet ausgewählte Sätze an Smad-Proteinen (Kawabata et al. 1998; Itoh et al. 2000; Attiseno et al. 2000). Ausgewählte BMP-Agonisten und Smad-Agonisten können unter Verwendung von Zell-basierenden Assays entdeckt werden. Die Testzelle sollte den geeigneten BMP-Rezeptor (die geeigneten BMP-Rezeptoren) exprimieren und den passenden BMP-Signalweg besitzen. Da einer der Haupteffekte der BMP-Signalgebung die Veränderung der Genexpression ist, können BMP-Agonisten und Smad-Agonisten durch Screenen auf BMP-induzierte Gene entdeckt werden. Die Induktion von BMP-regulierten Genen kann auch durch Quantifizieren von Konzentrationen von mRNA unter Verwendung von quantitativer RT-PCR (Wang et al. 2001), DNA-Microarrays oder Reporter-Gen-Konstrukten getestet werden. Es gibt natürliche Inhibitoren der BMP-Signalgebung, die BMP-bindenden Proteine (auch als BMP-assoziierte Proteine bekannt), wie etwa Chordin, Gremlin und Follistatin. Antagonisten der Protein-Inhibitoren können unter Verwendung von Ligandenbindungsassays entdeckt werden. Zum Beispiel können Testmittel zu rekombinantem aufgereinigtem Gremlin zugegeben werden, und diejenigen Mittel, die an Gremlin binden, werden unter Verwendung einer Vielzahl an Techniken, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert. Um zu bestimmen, ob diese Mittel Gremlin-Antagonisten sind, wird ein Zell-basierender Assay, ähnlich dem oben beschriebenen, verwendet.
  • Es wird in Erwägung gezogen, daß jedes bekannte in-vitro- und in-vivo-Screeningmodel zusammen mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um neue Glaukom-Therapien zu identifizieren, die auf die BMP-Genfamilie gerichtet sind. Solche Modelle sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und ihre Ausübung ist Routine geworden. Kleine Peptide oder Peptid-Mimetika können auf der Grundlage der Kenntnis über Struktur/Funktion der BMP, BMPR und/oder BMP-bindenden Protein-Genprodukten entworfen werden. Ligandenbindungsassays können verwendet werden, um kleine Moleküle nachzuweisen, die an BMPs, BMPRs oder BMP-bindende Proteine binden. Mit Zell-basierenden Assays kann man sich die Effekte von verschiedenen Mitteln auf BMP-Signalwege ansehen. Knock-in-Zellinien, enthaltend BMP-Genfamilien-Promoter, gekoppelt an ein Reportergen, können erzeugt werden, um nach Mitteln zu suchen, die die Expression eines Gen-Mitglieds der BMP-Familie verändern. Diese Assays können verwendet werden, um sowohl Agonisten als auch Antagonisten-Moleküle zu identifizieren. Ex-vivo-Assays, wie etwa Perfusions-kultivierte vordere Segmente aus humanen Augen (Clark et al. 1995a; Pang et al. 2000), könnten verwendet werden, um die Effekte von Mitteln auf IOP und auf BMP-Signalgebung in TM-Gewebe zu untersuchen. Nagetiermodelle von Glaukom können erzeugt werden unter Verwendung von gut bekannten Techniken, um stabile transgene BMP-Familien-Mitglied, Knock-out- oder Knock-in-Stämme von Mäusen und Ratten zu erzeugen. Diese Nagetiermodelle können verwendet werden, um auf Mittel zu screenen, die den (die) Glaukom-artigen Phänotyp(en) verändern (z. B. Tonometrie, um die Effekte auf IOP zu bewerten, Histologie, um die Effekte auf die glaukomatöse Seh-Neurologie zu bewerten).
  • B. Kits
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zum frühen Nachweis von Glaukom bereit. Die Kits können ein Nukleinsäuresegment enthalten, das für ein BMP-Polypeptid oder Protein kodiert. Das Kit kann weiterhin Reagenzien zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einer Probe und einer Nukleinsäure oder Peptid der vorliegenden Erfindung enthalten. Das bereitgestellte Reagenz kann radioaktiv, fluoreszierend oder enzymatisch markiert sein. Das Kit kann ein bekanntes radioaktiv markiertes Mittel enthalten, das in der Lage ist, an eine Nukleinsäure oder Peptid oder Protein der vorliegenden Erfindung zu binden oder damit wechselzuwirken.
  • Das Reagenz des Kit kann als eine flüssige Lösung bereitgestellt werden, angehängt an einen festen Träger oder als ein getrocknetes Pulver. Bevorzugt ist, wenn das Reagenz in einer flüssigen Lösung bereitgestellt wird, die flüssige Lösung eine wäßrige Lösung. Bevorzugt kann, wenn das bereitgestellte Reagenz an einen festen Träger angehängt ist, der feste Träger ein Chromatographie-Medium, eine Testplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder ein Mikroskop-Objektträger sein. Wenn das bereitgestellte Reagenz ein trockenes Pulver ist, kann das Pulver durch die Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels rekonstituiert werden, das bereitgestellt werden kann.
  • In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Verfahren und assoziierte Kits zur Diagnose von Glaukom. Es wird vorgeschlagen, daß die BMP-assoziierten Peptide und Nukleinsäuren der Erfindung verwendet werden können, um Polymorphismen oder Mutationen in den BMP-Nukleinsäuren aus Patientenproben nachzuweisen. Im allgemeinen werden diese Verfahren zuerst den Erhalt einer Probe einschließen, von der angenommen wird, daß sie einen solchen Polymorphismus oder Mutation enthält, In-Kontaktbringen der Probe mit einem Peptid oder einer Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, abhängig von dem jeweiligen Fall, unter Bedingungen, die wirksam sind, um die Bildung eines Komplexes zu ermöglichen, und dann Nachweisen der Anwesenheit des Komplexes.
  • Im allgemeinen ist der Nachweis der Komplexbildung ziemlich gut bekannt auf dem Gebiet und kann durch die Anwendung von zahlreichen Vorgehensweisen erzielt werden. Zum Beispiel zieht die vorliegende Erfindung die Anwendung von ELISA, RIA, indirekten Fluoreszenztechniken und ähnliches in Erwägung. Im allgemeinen wird die Komplexbildung durch die Verwendung einer Markierung nachgewiesen, wie etwa einer radioaktiven Markierung oder eines Enzym-Tag (wie etwa alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase oder ähnlichem). Natürlich kann man zusätzliche Vorteile durch die Verwendung eines sekundären Bindungsliganden finden.
  • Die folgenden Beispiele sind für die Techniken repräsentativ, die von den Erfindern beim Ausüben von Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es sollte berücksich tigt werden, daß, während diese Techniken für bevorzugte Ausführungsformen zum Ausüben der Erfindung beispielhaft sind, Fachleute im Lichte der vorliegenden Offenbarung erkennen werden, daß zahlreiche Modifizierungen gemacht werden könnten, ohne vom Geist oder dem beabsichtigten Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • Beispiel 1
  • Zellkultur: Humane TM-Zellen und ONH-Zellen wurden aus Spenderaugen erzeugt, wie beschrieben (Steely et al. 1992; Steely et al. 2000; Wilson et al. 1993; Clark et al. 1994; Clark et al. 1995b; Clark et al. 1995c; Clark et al. 1996; Clark et al. 2001a; Clark et al. 2001b; Dickerson et al. 1998; Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999; Wordinger et al. 2000; Wordinger et al. 2002; Lambert et al. 2001; Agarwal et al. 1999; Liu et al. 2001). TM-Zellen wurden aus TM-Explantaten von Spendern im Altersbereich von 6 Tagen bis 90 Jahren wachsengelassen. Humane Sehnerv-Kopf-Astrocyten und Lamina Cribrosa (LC)-Zellen wurden aus sorgfältig sezierten Sehnerv-Köpfen erzeugt (Spender im Alter von 2 Tagen bis 90 Jahren) und gemäß früheren Berichten charakterisiert (Lambert et al. 2001; Clark et al. 1995a). Die Zellen wurden bis zur Konfluenz in den folgenden Medien wachsengelassen.: Ham's F10-Medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS), enthaltend 10% fötales Rinderserum (HyClone, Logan, UT) und Antibiotika (Gibco BRL-Life Technologies, Grand Island, NY) für TM-Zellen; Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, HyClone), enthaltend 10% FBS für LC-Zellen; und Astrocyten-Wachstumsmedium (AGM, Clonetics, San Diego, CA), enthaltend 5% FBS für ONH-Astrocyten.
  • RT-PCR: Humanes TM und ONH-Gewebe wurden auch aus Spenderaugen seziert (Wordinger et al. 1998; Wang et al. 2001). Gesamt-RNA wurde aus den TM- und ONH-Zellen und -Geweben unter Verwendung von TRIzol-Extraktion extrahiert (Gibco BRL-Life Technologies), und die cDNA wurde mittels reverser Transkription unter Verwendung von Standardprozeduren hergestellt (Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999; Wordinger et al. 2000; Wordinger et al. 2002). PCR-Primer wurden unter Verwendung des Oligos4.0-Softwareprogramm konstruiert (siehe Primerpaare in Tabelle 1). Alle Primerpaare wurden so konstruiert, daß die Amplifizierung von potentiell kontaminierten genomischen DNA-Sequenzen mRNA-PCR-Produkten erzeugen würde, die wesentlich größer als erwartet sein würden, da Intron-Sequenzen, die während der RNA-Verarbeitung ausgeschnitten wurden, in der genomischen DNA eingeschlossen wären. Die β-Actin-PCR-Primer, AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC (stromauf) und GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC (stromab) mit einer Annealing-Temperatur von 55°C ergaben ein PCR-Produkt von 30 bp.
  • PCR-Reaktionen wurden laufengelassen wie beschrieben (Wordinger et al. 1998; Wordinger et al. 1999; Wordinger et al. 2000; Lambert et al. 2001; Wordinger et al. 2002) unter Verwendung von Taq-Start-Antikörper-Hot-Start mit den folgenden Cycle-Bedingungen: 2 Minuten bei 94°C, 2 Minuten bei 92°C und 40 Zyklen von 30 Sekunden bei der optimalen Annealingtemperatur, Verlängerung für 90 Sekunden bei 72°C und Denaturierung für 45 Sekunden bei 92°C. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden mittels horizontaler Elektrophorese in 1,5% Agarosegelen untersucht. Um eine Spezifizität der RT-PCR-Produkte sicherzustellen, wurde eine Southern Blot-Analyse mit Sonden durchgeführt, die unter Verwendung von Oligo 4.0 konstruiert worden waren, die an eine Region innerhalb des amplifizierten PCR-Produktes hybridisierten. PCR-Produkte wurden sequenziert, um die Spezifizität der PCR-Reaktion zu verifizieren. Tabelle 2 führt in einer Liste die Mitglieder der BMP-Familie auf, die in dem humanen TM und ONH exprimiert werden. Tabelle 1. PCR Primer Paare, Annealing Temperatur und Amplimer-Größe von BMPs
    Figure 00230001
    Tabelle 2. BMP-Familienmitglieder, exprimiert in humanen TM und ONH
    Figure 00240001
  • Western-Immunblotting: Protein wurde aus kultivierten Zellen unter Verwendung von Lyse-Puffer extrahiert, und Proteine wurden durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese vor einem elektrophoretischen Übertrag auf Nitrocellulose-Membranen getrennt (Lambert et al. 2001). Die Membranen wurden mit 5% Milch (für BMPs) oder 3% Gelatine (für BMPRs) blockiert und mit den folgenden primären Antikörpern inkubiert: BMP2, BMP4, BMP5, BMP7 (alle von Santa Cruz, Santa Cruz, CA), oder BMP-RIA, BMP-RIB, BMP-RII (von Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Die Membranen wurden gewaschen, mit sekundären Antikörpern inkubiert (Ziegen-Anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase für BMPs, Santa Cruz; Esel-Anti-Ziege-Meerrettichchperoxidase für BMP-Rezeptoren, Jackson Immuno Research), und unter Verwendung des WesternBreeze-Chemilumineszenz-Immunnachweissystem entwickelt (Invitrogen, Carlsbad, CA).
  • Expression von BMPs, BMPRs-mRNA in humanen TM-Zellen und Geweben: Amplifikationsprodukte, die für BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-7 Primer-Paaren in humanen TM- Zellen erwartet wurden, und Gewebe werden in 6 gezeigt. Southern Blots unter Verwendung von spezifischen Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Alle humanen TM-Zellinien und Gewebe exprimierten Botschaft („message") für BMP-2, BMP-4 und BMP-7. Jedoch war die Botschaft für BMP-5 niedrig bis nicht-nachweisbar in humanen TM-Gewebeproben (6, Spuren 6 und 7). Kontrollreaktionen ohne cDNA fürten nicht zu Amplifikationsprodukten, was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer von DNA- oder RNA-Kontaminierung frei waren (6, Spur C).
  • 7 zeigt die Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe für BMP-RIA, BMP-RIB und BMP-RII-Primerpaare in humanen TM-Zellen und Geweben. Alle humanen TM-Zellen und Gewebe exprimierten eine Botschaft für die BMP-Rezeptorkomplexe. Southern-Blots unter Verwendung von spezifischen Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Ein alternatives Amplifikationsprodukt (350 bp) wurde in der BMP-RII-PCR-Reaktion nachgewiesen. Das alternative Amplifikationsprodukt war in allen humanen TM-Zellen und Geweben vorhanden. Diese alternative Bande wird gegenwärtig identifiziert, um zu bestimmen, ob es eine alternativ gespleisste Form des Rezeptors ist. Kontrollreaktionen ohne cDNA führten nicht zu Amplifikationsprodukten. (7, Spur C), was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer frei von DNA- oder RNA-Kontaminierung waren.
  • Expression von BMP und BMP-Rezeptor-mRNA in humanen ONH-Zellen und -Geweben: Amplifikationsprodukte mit der erwarteten Größe für BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-7-Primerpaaren in humanen ONH-Astrocyten und ONH-Geweben werden in 8 gezeigt. Alle ONH-Astrocyten und ONH-Gewebe exprimierten Botschaft für das jeweilige BMP. Humane Gehirn-Astrocyten wurden als eine positive Kontrollzellinie verwendet. Southern-Blots unter Verwendung spezifischer Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Mit der Ausnahme von BMP-2 wurden alle anderen BMP von humanen Gehirn-Astrocyten exprimiert (8, Spur 7). Kontrollreaktionen ohne cDNA führten nicht zu Amplifikationsprodukten (8, Spur C), was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer frei von DNA- oder RNA-Kontaminierung waren.
  • 9 zeigt die Amplifikationsprodukte der erwarteten Größen für BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-7-Primerpaaren in kultivierten humanen LC-Zellen. Alle LC-Zellinien exprimierten Botschaft für jedes BMP. Southern-Blots unter Verwendung spezifischer Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Kontrollreaktionen ohne cDNA führten nicht zu Amplifikationsprodukten (9, Spur C), was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer frei von DNA- oder RNA-Kontaminierung waren.
  • Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe für BMP-RIA, BMP-RIB und BMP-RII-Primerpaaren in humanen ONH-Astrocyten und ONH-Geweben werden in 10 gezeigt. Alle ONH-Astrocyten-Zellinien und -Gewebe exprimierten Botschaft für BMP-RIA und BMP-RIB. Southern-Blots unter Verwendung spezifischer Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Mit der Ausnahme von ONH-Gewebe (10, Spur 6), wurde BMP-RII von allen ONH-Astrocyten-Zellinien exprimiert. Eine Botschaft für alle BMP-Rezeptoren (10, Spur 7) wurde von einer humanen Gehirn-Astrocyten-Zellinie exprimiert, die als eine positive Kontrolle diente. Es scheint eine Diskrepanz in der Expression von BMP-RII in ONH-Gewebe und ONH-Zellinien zu geben. Die reduzierte Expression in ONH-Gewebe kann ein niedriges Expressionsniveau widerspiegeln. Kontrollreaktionen ohne cDNA führte nicht zu Amplifikationsprodukten (5, Spur C), was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer frei von DNA- oder RNA-Kontaminierung waren.
  • 11 zeigt die Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe für BMP-RIA, BMP-RIB, und BMP-RII-Primerpaaren in kultivierten humanen LC-Zellen. Alle LC-Zellinien exprimierten Botschaft für jeden BMP-Rezeptor. Southern-Blots unter Verwendung spezifischer Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Kontrollreaktionen ohne cDNA führten nicht zu Amplifikationsprodukten (11, Spur C), was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer frei von DNA- oder RNA-Kontaminierung waren.
  • Die Expression von BMP-Proteinen und BMP-Rezeptorproteinen in humanen TM- und ONH-Zellen und -Geweben: 12 stellt einen chemilumineszierenden Immunblot-Nachweis von BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-7, BMP-RIA, BMP-RIB und BMP-RII-Proteinen in humanen TM- und ONH-Zellen und -Geweben dar. Alle untersuchten Zellinien exprimierten die jeweiligen BMP-Proteine. Die BMP-Proteine wurden in Zellinien mit den folgenden Molekulargewichten nachgewiesen: 54-56 kDa für BMP-2, 25-27 kDa für BMP-4, 55-57 kDa für BMP-5 und 77 kDa für BMP-7. Mehrere Banden wurden für BMP-2 und BMP-4 nachgewiesen, was am wahrscheinlichsten glycosylierte und teilweise glycosylierte Formen dieser BMPs darstellt, wie in anderen Studien beobachtet. Jedoch führten wir keine Glycosylierungsstudien durch, da diese über den Umfang dieser Studie hinausgingen. Die BMP-Rezeptorproteine wurden in Zellinien mit den Molekulargewichten nachgewiesen: 38 kDa für BMP-RIA, 64 kDa für BMP-RIB und 57 kDa für BMP-RII. Mehrere Banden wurden für BMP-RIB und BMP-RII in den TM-Zellen nachgewiesen, die am wahrscheinlichsten glycosylierte und teilweise glycosylierte Formen darstellen, wie in anderen Studien beobachtet. Die Expressionsniveaus von Proteinen für die BMP-Rezeptoren schienen in den TM-Zellen im Vergleich mit den ONH-Zellen niedriger zu sein. Zum Beispiel wurde BMP-RII nicht in TM-Zelle nachgewiesen und BMP-RIB war in starkem Maße reduziert.
  • Expression von BMP-assoziierten Protein-mRNAs in kultivierten humanen TM-Zellen und in humanen ONH-Zellen: Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe für BMP-assoziierte Protein-Primerpaare in humanen TM-Zellinien werden in 13 gezeigt. Humane TM-Zellinien exprimierten Botschaft für DRM (Gremlin), Chordin, Follistatin und NMA (BAMBI). Southern-Blots unter Verwendung spezifischer Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Es gab keinen offensichtlichen Unterschied in der Botschaftsexpression zwischen den Zellinien. Alle untersuchten humanen TM-Zellen vermochten es nicht, mRNA für die BMP-assoziierten Proteine Noggin und Cer-1 zu exprimieren. Kontrollreaktionen ohne cDNA führten nicht zu Amplifikationsprodukten, was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer frei von DNA- oder RNA-Kontaminierung waren.
  • Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe für BMP-assoziierte Protein-Primerpaare in ONH-Astrocyten und LC-Zellinien werden in 14 gezeigt. Alle ONH-Astrocyten und LC-Zellinien exprimierten Botschaft für DRM (Gremlin), Follistatin und NMA (BAMBI). Southern-Blots unter Verwendung spezifischer Sonden verifizierten, daß diese die erwarteten PCR-Produkte waren. Der Hauptteil der LC-Zellen und ONH-Astrocyten exprimierten Botschaft für Chordin. Alle humanen ONH-Astrocyten und LC-Zellinien, die untersucht wurden, vermochten es nicht, mRNA für die BMP-assoziierten Proteine Noggin und Cer-1 zu exprimieren. Kontrollreaktionen ohne cDNA führten zu keinen Amplifikationsprodukten, was darauf hinweist, daß Reagenzien und Primer frei von DNA- oder RNA-Kontaminierung waren.
  • 15 zeigt eine erhöhte Expression des BMP-Antagonisten Gremlin (CKTSF1B1) in glaukomatösen TM-Zellen. Die Genexpression wurde unter Verwendung von Affymetrix-Gen-Arrays (Affymetrix-Gen-Chip U133A) beurteilt.
  • Alle hierin offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und/oder Verfahren können ohne übermäßige Experimentierung im Lichte der vorliegenden Offenbarung gemacht und durchgeführt werden. Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung hinsichtlich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden sind, wird es Fachleuten offensichtlich sein, daß Variationen auf die Zusammensetzungen und/oder Verfahren und bei den Schritten oder in der Abfolge der Schritte des hierin beschriebenen Verfahrens angewendet werden können, ohne vom Konzept und Umfang der Erfindung abzuweichen. Genauer wird es offensichtlich sein, daß bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch strukturell verwandt sind, für die hierin beschriebenen Mittel ausgetauscht werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen. Alle solche Substitutionen und Modifikationen, die Fachleuten offensichtlich sind, sollen innerhalb des Umfangs und des Konzepts der Erfindung liegen, die in den angehängten Ansprüchen definiert ist.
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Claims (5)

  1. Verfahren zum Diagnostizieren von Glaukom in einer von einer Zelle oder Körperflüssigkeit erhaltenen Probe durch Nachweisen der veränderten Expression eines Gen-Mitglieds der Knochen-morphogenen Familie, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Extrahieren von DNA aus einer Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe, erhalten von einem Patienten, von dem angenommen wird, daß er Glaukom hat; b) Erhalten einer Vielzahl von PCR-Primern, wobei jeder der Primer eine Sequenz umfaßt, bestehend aus 18 bis 1547 zusammenhängenden Nukleotiden aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 oder SEQ ID NO: 53; c) Amplifizieren von Regionen der extrahierten DNA unter Verwendung von Primern, um ein PCR-Produkt zu erhalten; d) Auflösendes Analysieren („resolving") des PCR-Produkts; und e) Identifizieren von Unterschieden zwischen der Sequenz der amplifizierten extrahierten DNA und der Sequenz des Primers; wobei ein Unterschied zwischen der amplifizierten Sequenz und dem Primer eine Diagnose für Glaukom darstellt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe Blut oder bukkale Zellen ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Primer Sequenzen umfassen, bestehend aus von 20 bis 100 zusammenhängenden Nukleotiden von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ NO: 7, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 oder SEQ ID NO: 53.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Primer Sequenzen umfassen, bestehend aus von 20 bis 50 zusammenhängenden Nukleotiden von SEQ ID NO: 3.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das PCR-Produkt mittels SSCP, DGGE, ASO oder RFLP auflösend analysiert („resolved") wird.
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