DE60115863T2

DE60115863T2 - Beta 1, 2-xylosyltransferase gen aus arabidopsis

Info

Publication number: DE60115863T2
Application number: DE60115863T
Authority: DE
Inventors: Josef Glössl; Richard Strasser; Jan Mucha; Lukas Mach; Friedrich Altmann; B. Iain WILSON; Herta Steinkellner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2021-03-03
Also published as: EP1621633A2; AU4649501A; ES2252208T3; US20040121325A1; DK1621633T3; ES2460672T3; AU781010B2; US20070186311A1; JP2013116113A; DE60115863D1; CA2402015A1; ATE312931T1; AT409381B; KR20070058018A; PT1621633E; KR20090101981A; KR20100119005A; KR101185123B1; KR20030030987A; JP5279976B2

Description

Die Erfindung betrifft Polynukleotide, die für eine β1,2-Xylosyltransferase codieren. Weiters betrifft die Erfindung Vektoren mit diesen Polynukleotiden, rekombinante Wirtszellen, Pflanzen und Insekten, die mit den Polynukleotiden bzw. davon abstammender DNA transfektiert sind sowie in diesen Systemen produzierte Glykoproteine.
Glykoproteine weisen eine Vielfalt und Komplexität von Kohlehydrat-Einheiten auf, wobei die Zusammensetzung und Anordnung der Kohlehydrate für unterschiedliche Organismen charakteristisch ist. Die Oligosaccharid-Einheiten der Glykoproteine haben eine Reihe von Aufgaben, so sind sie z.B. wichtig in der Stoffwechselregulation, sie sind an der Vermittlung von Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligt, sie bestimmen die Zirkulationszeiten von Proteinen im Blutkreislauf und sie sind ausschlaggebend für die Erkennung von Epitopen in Antigen-Antikörper-Reaktionen.
Die Glykosylierung von Glykoproteinen beginnt im endoplasmatischen Retikulum (ER), wo die Oligosaccharide entweder durch Nglykosidische Bindungen an Asparagin-Seitenketten oder durch O-glykosidische Bindungen an Serin- oder Threonin-Seitenketten gebunden werden. Die N-gebundenen Oligosaccharide enthalten einen gemeinsamen Kern aus einer Pentasaccharid-Einheit, die aus drei Mannose- und zwei N-Acetylglucosaminresten besteht. Zur weiteren Modifikation der Kohlehydrat-Einheiten werden die Proteine vom ER zum Golgi-Komplex transportiert. Die Struktur der N-gebundenen Oligosaccharideinheiten von Glykoproteinen wird von ihrer Konformation und der Zusammensetzung der Glykosyltransferasen der Golgi-Kompartimente bestimmt, in denen sie prozessiert werden.
Es wurde gezeigt, dass die zentrale Pentasaccharideinheit der N-Glykane einiger Pflanzen durch β1,2-gebundene Xylose und α1,3-gebundene Fucose substituiert wird (Lerouge et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al., 1998, J. Exp. Bot. 49, 1463-1472). Das Heptasaccharid "MMXF³" stellt den Hauptoligosaccharid-Typ in Pflanzen dar (Kurosaka et al., 1991, J. Biol. Chem., 266, 4168-4172; Wilson und Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070). Diese Strukturen werden auch komplexe N-Glykane bzw. Mannose-defiziente oder trunkierte N-Glykane genannt. Die α-Manno sylreste können weiters durch GlcNAc ersetzt werden, an die Galaktose und Fucose gebunden sind, so dass eine Struktur hergestellt wird, die dem humanen Lewis a-Epitop entspricht (Melo et al., 1997, FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12, 1411-1417).
Weder die β1,2-Xylose noch die α1,3-gebundene Fucose kommen bei Glykoproteinen in Säugetieren vor. Es stellte sich heraus, dass die β1,2-Xylose zusammen mit α1,3-Fucose eine wichtige Rolle in der Epitoperkennung von Antikörpern spielt, die gegen pflanzliche N-gebundene Oligosaccharide gerichtet sind und dadurch Immunreaktionen im menschlichen oder tierischen Körper gegen diese Oligosaccharide auslösen (Faye et al., 1993, Anal. Biochem. 209, 104-108). Die N-Glykane enthaltende β1,2-Xylose- und/oder α1,3-Fucose scheint weiters eine der Hauptursachen für die weit verbreitete allergische Kreuzreaktivität zwischen verschiedenen pflanzlichen und Insekten-Allergenen zu sein und wird auch "kreuzreaktive Kohlehydrat Determinante" (CCD) genannt. Die CCDs verschleiern weiters durch das häufige Auftreten von immunologischen Kreuzreaktionen Allergie-Diagnosen.
Die immunologischen Reaktionen, die von pflanzlichen Proteinen im menschlichen Körper ausgelöst werden, sind das Hauptproblem bei der medizinischen Verwendung von in Pflanzen produzierten, rekombinanten menschlichen Proteinen. Um dieses Problem zu umgehen, müsste die β1,2-Xylosylierung zusammen mit der α1,3-Fucosylierung verhindert werden. Gemäß einer Studie wurde eine Mutante der Pflanze Arabidopsis thaliana isoliert, bei der die Aktivität von N-Acetyl-Glucosaminyl-Transferase I, dem ersten Enzym in der Biosynthese von komplexen Glykanen, fehlt. Die Biosynthese der komplexen Glykoproteine in dieser Mutante ist damit gestört. Dennoch sind diese mutierten Pflanzen in der Lage, sich unter bestimmten Bedingungen normal zu entwickeln (A. Schaewen et al., 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118).
Um den Transfer der β1,2-Xylose in ein Oligosaccharid gezielt zu unterbinden, ohne auch in andere Glykosylierungsschritte einzugreifen, müsste nur das Enzym inaktiviert werden, das direkt für diese spezifische Glykosylierung verantwortlich ist, nämlich die β1,2-Xylosyltransferase. Diese Transferase, die nur in Pflanzen und in einigen nicht-vertebraten Tierspezies, z.B. bei Schistosoma sp. (Khoo et al., 1997, Glycobiology 7, 663-677) und Schnecken (z.B. Mulder et al., 1995, Eur. J. Biochem., 232, 272-283), jedoch nicht beim Menschen oder bei anderen Vertebraten vorkommt, müsste gezielt inaktiviert oder unterdrückt werden, so dass menschliche Proteine, die in Pflanzen bzw. in pflanzlichen Zellen hergestellt werden, dieses Immunreaktionen auslösende Epitop nicht mehr wie bisher aufweisen.
β1,2-Xylosyltransferase transferiert die D-Xylose von UDP-Xylose zur beta-gebundenen Mannose von pflanzlichen N-gebundenen Oligosacchariden.
Dieses Enzym wurde aus Sojabohnen-Mikrosomen im Jahr 1997 gereinigt (Zeug et al.: J. Biol. Chem., 272, 31340-31347, 1997). Diesem Artikel gemäß war der beste Akzeptor für den Xylose-Transfer GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-T, doch war auch GlcNAc₁Man₃GlcNAc₂ mit dem GLcNAc auf dem 3-Zweig, ein guter Akzeptor. Weiters waren eine Anzahl anderer N-gebundener Oligosaccharide schlechte Akzeptoren, insbesondere jene mit Galaktose-Einheiten an den nicht-reduzierenden Termini.
Im Artikel von Rayon et al. (Plant Physiology, 1999, 119, 725-733) ist erwähnt, dass Arabidopsis-Proteine durch N-Glykane vom Typ mit hoher Mannose und durch Xylose- und Fucose-hältige Oli- gosaccharide N-glykosyliert werden. TEZUKA et al. (Eur. J. Biochem. 203, 401-413 (1992)) maßen die Aktivitäten verschiedener Enzyme, beispielsweise von β1,2-Xylosyltransferase in der Golgi-Fraktion in Suspension gezüchteter Zellen der Platane/Sycamore. Sie wiesen nach, dass Xylose durch β1,2-Xylosyltransferase auf die innere Mannose transferiert wurde. Weiters erwähnten sie, dass Xylose enthaltende Oligosaccharide im ganzen Pflanzenreich weit verbreitet sind, obwohl man Xylose enthaltende, N-gebundene Oligosaccharide auch in Glykoproteinen aus Gastropoden und Chlorophyceae fand.
Für die gezielte Unterdrückung oder Inaktivierung von Proteinen ist es am besten, diese auf der Ebene des Transkriptions- bzw. Translationsschrittes durchzuführen. Dazu ist es notwendig, die Nukleotidsequenz, die für das aktive Protein codiert, zu iso lieren und sequenzieren.
Wie zuvor erwähnt, wurde die Sojabohnen-β1,2-Xylosyltransferase im Jahre 1997 isoliert und gereinigt. Es wurde nur ein Teil der Xylosyltransferase-cDNA isoliert (s. WO99/29835 A1; SEQ ID NR. 6 und 7), die gesamte cDNA, die für das aktive Protein codiert, konnte jedoch bisher nicht isoliert und charakterisiert werden. Der Grund dafür, dass die Nukleotidsequenz bisher noch nicht identifiziert wurde, könnte darin liegen, dass es größere Verfahrensprobleme gibt, weil die mRNA, die für die Xylosyltransferase in den Organismen, wie beispielsweise Sojabohnen, codiert, nur in sehr geringen Mengen vorkommt. Obwohl mehrere Gruppen bisher versuchten, die gesamte Nukleotidsequenz. dieses Gens, üblicherweise aus Sojabohnen, zu identifizieren, ist es nicht möglich gewesen, eine cDNA der gesamten Länge, die der Xylosyltransferase-mRNA entspricht, mit Hilfe herkömmlicher Methoden, die in normalen Fällen als wirksam bekannt sind, beispielsweise mit Hilfe der RACE-Amplifikation (rapid amplification of cDNA ends), zu erzeugen. Mit dieser Methode werden unbekannte Sequenzen mit Hilfe spezifischer Amplifikations-Primer amplifiziert. Mögliche Gründe für erfolglose 5'RACE-Versuche können eine inadäquate Wahl spezifischer PCR-Primer sowie das Vorhandensein von Reverse-Transkriptase-inhibierenden Komponenten während der cDNA-Synthese sein.
In der EMBL Database Hinterlegungsnummer AB 015479 (Nakamura et al.) werden Sequenzen des A. thaliana Chromosoms 5 geoffenbart. Die EP 1 033 405 A2 offenbart A. thaliana DNA and damit codierte Polypeptide.
Ein Problem der isolierten Sojabohnen-β1,2-Xylosyltransferase ist, dass ihre Löslichkeit und Aktivität vom Vorhandensein von Detergentien abhängt.
Zusätzlich zum Problem der extrem geringen Konzentration der β1,2-Xylosyltransferase-mRNA gibt es weiters das Problem, dass die sekundäre Struktur am 5'-Ende der RNA die Amplifikation dieses Bereichs zu behindern scheint. In diesen Fällen führt die RACE-Amplifikation, die selbst ein empfindliches Verfahren ist, nicht zur richtigen und vollständigen Xylosyltransferase-cDNA- Sequenz.
Es ist natürlich auch sehr wahrscheinlich, dass die mRNA und die davon abstammende cDNA, außer, dass sie nur in sehr geringen Konzentrationen vorliegt, sich im Verlauf verschiedener Manipulationen sehr leicht rekombiniert und mutiert. Aus diesen und anderen potentiellen Gründen war das Klonieren und die Expression dieses spezifischen Gens bisher unmöglich.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, das ganze Gen, das für eine pflanzliche β1,2-Xylosyltransferase codiert, zu klonen und zu sequenzieren, und Vektoren, die dieses Gen, oder eine geänderte DNA oder davon abgeleitete DNA umfassen, herzustellen, Pflanzen sowie Zellen davon mit einem dieser Vektoren zu transfektieren, Glykoproteine herzustellen, die die normalerweise vorkommende β1,2-Xylose nicht umfassen, sowie entsprechende Verfahren zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel ist die Herstellung großer Mengen von gereinigtem, rekombinantem Enzym, um eine in vitro-Synthese von homogenen N-Glykanen oder Glykokonjugaten enthaltend β1,2-Xylose zu ermöglichen. Dies wird dabei behilflich sein, die Rolle der β1,2-Xylose bei der Immunogenität und Allergenität pflanzlicher Glykoproteine weiter zu klären.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein isoliertes DNA-Molekül gelöst, welches für ein Protein mit β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität codiert und eine Sequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

– einer Sequenz SEQ ID NR: 8 mit einem offenen Leserahmen vom Basenpaar 227 bis Basenpaar 1831 (Sequenz A),
– einer Sequenz, die zumindest zu 50% mit der genannten Sequenz A identisch ist,
– einer Sequenz, die mit der genannten Sequenz A unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
– einer Sequenz, die aufgrund des genetischen Codes zu genannter Sequenz A degeneriert ist, oder
– einer Sequenz, die zu einer der oben genannten Sequenzen komplementär ist;

EP 1 033 405 A2

Bei einer Suche in GenBank+EMBL+DDBJ+pDB-Datenbanken unter Verwendung der von Sojabohnen-Xylosyltransferase stammenden Peptide, wie oben erwähnt, fand man mehrere Polypeptidsequenzen (von Arabidopsis und Drosophila) mit signifikanten Homologien. Diese Sequenzen waren jedoch ansonsten weder miteinander noch mit der letztlich identifizierten β1,2-Xylosyltransferase-Sequenz verwandt. Das erfolgreiche Auffinden der Anwärter-Sequenz für β1,2-Xylosyltransferase war nur durch das richtige Zusammenfügen dreier von Sojabohnen-β1,2-Xylosyltransferase stammender Peptidsequenzen zu einer einzigen Sequenz möglich. Alle von uns verwendeten Suchstrategien gemäß dem Stand der Technik (d.h. indem die Peptidsequenzen einzeln oder in Kombination miteinander verwendet wurden) führten nicht zum erfolgreichen Auffinden der richtigen Sequenz für β1,2-Xylosyltransferase.
Die Isolierung und Reinigung dieses Gens wurde durch eine Suche in den DDBJ+GenBank+EMBL+pDB-Datenbanken entsprechend den Sequenzen dreier bekannter Peptide (die als zusammengesetzte Peptide verwendet wurden) der Sojabohnen-Xylosyltransferase (Patent WO 99/29835 A1, SEQ ID Nr:3 und 5) erreicht. Es zeigte sich, dass eine DNA-Sequenz von Arabidopsis thaliana, die bisher noch keinem Protein zugeschrieben wurde, eine Homologie mit zweien der drei Peptide aufwies. Mit Hilfe des GenFinderprogramms wurde eine vorausgesagte Proteinsequenz gefunden, gemäß welcher Sequenz spezifische Primer für eine RT-PCR entworfen wurden. Es war möglich, eine Erststrang-cDNA gemäß der mRNA des A. thaliana-Xylosyltransferase-Gens herzustellen, wonach die Erststrang-cDNR einer PCR unter Verwendung der gezielt entworfenen Primer unterzogen wurde. Der Grund für die erfolgreiche Herstellung einer A. thaliana-Xylosyltransferase-cDNA kann einerseits darin liegen, dass die Xylosyltransferase-mRNA von A. thaliana weniger problematisch im Vergleich zu anderen Pflanzen-Spezies ist, und andererseits wurde die PCR mit optimal entworfenen, Genspezifischen Primern durchgeführt.
Der offene Leserahmen der SEQ ID Nr: 8 codiert für ein Protein mit 534 Aminosäuren und mit einem theoretischen Molekulargewicht von 60,2 kDa, wobei im Bereich zwischen Ile11 und Phe29 vermutlich ein transmembranes Stück vorliegt. Der errechnete pI-Wert des codierten Proteins der Sequenz gemäß der SEQ ID Nr: 9 beträgt 7,52.
Die Aktivität der pflanzlichen β1,2-Xylosyltransferase wird durch ein Verfahren nachgewiesen und gemessen, wobei die Xylosyltransferase zu einer Probe enthaltend UDP-Xylose und einen markierten Akzeptor (z.B. ein Glykopeptid oder ein markiertes Oligosaccharid) zugesetzt wird. Nach der Reaktionszeit wird der Gehalt an gebundener Xylose gemessen. Die Aktivität der Xylosyltransferase wird dabei als positiv angesehen, wenn die Aktivitätsmessung zumindest um 10 bis 20%, insbesondere zumindest um 30 bis 50% höher liegt als die Aktivitätsmessung der Negativkontrolle. Die Struktur des Oligosaccharids kann zusätzlich mittels HPLC verifiziert werden. Solche Protokolle sind Stand der Technik (Staudacher et al. 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751). Ob die Xylose an das Akzeptorsubstrat gebunden ist oder nicht kann weiters durch Messen der Produktmasse mittels Massenspektrometrie bestimmt werden.
Die Paarung von zwei DNA-Molekülen kann durch die Wahl der Temperatur und Ionenstärke der Probe verändert werden. Unter stringenten Bedingungen werden erfindungsgemäß Bedingungen verstanden, die eine exakte, stringente Bindung ermöglichen. Z.B. werden die DNA-Moleküle in 7% Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, pH 7,0, 1 mM EDTA bei 50°C hybridisiert und mit 1% SDS bei 42°C gewaschen.
Ob Sequenzen eine zumindest 50% Homologie zu SEQ ID Nr: 8 aufweisen, kann z.B. mit dem Programm FastDB der EMBL oder der SWISSPROT Datenbank ermittelt werden.
Es existieren mehrere relevante Unterschiede zwischen der rekombinanten β1,2-Xylosyltransferase, die vom DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung codiert ist und dem entsprechenden Enzym aus Sojabohnen wie in der WO 99/29835 A1 beschrieben:

1. Das rekombinante Enzym ist ohne Detergentien löslich (z.B. Triton X-100), wohingegen die Löslichkeit des Enzyms aus Sojabohne vom Vorhandensein von Detergentien abhängig ist.
2. Das rekombinante Enzym ist in der Abwesenheit von Detergentien vollständig aktiv (z.B. Triton X-100).
3. Das rekombinante Enzym is N-glykosyliert, wohingegen das Enzym aus Sojabohne als nicht glykosyliert beschrieben wird.
4. Das Enzym aus A. thaliana weist volle enzymatische Aktivität auch in trunkierter Form auf, bei der die 32 N-terminalen Aminosäuren fehlen.
5. Im Gegensatz zu dem Enzym aus Sojabohne hat das Enzym aus A. thaliana ein breites pH-Optimum und zeigt starke Aktivität zwischen einem pH-Wert von 6-8.
6. Die für das Sojabohnen-Enzym codierende cDNA-Sequenz entspricht nur den Aminosäuren AS 199-469 des A. thaliana Proteins, siehe 11.
7. Die für die A. thaliana Xylosyltransferase codierende cDNA-Sequenz enthält verglichen mit der Teilsequenz des Sojabohnen-Enzyms zwei Insertionen (entsprechend AS 375-382 und AS 425-429 der vorausgesagten Protein-Sequenz), siehe 11.
8. Keines der fünf aus dem Sojabohnen-Enzym isolierten Peptide (siehe 4 in der WO 99/29835 A1) ist mit den entsprechenden Regionen des Enzyms aus A. thaliana identisch: Peptid SEQ ID NR. 1: homolog zu AS 411-422 des A. thaliana Enzyms Peptid SEQ ID NR. 2: homolog zu AS 192-205 des A. thaliana Enzyms Peptid SEQ ID NR. 3: homolog zu AS 451-477 des A. thaliana Enzyms Peptid SEQ ID NR. 4: homolog zu AS 191-205 des A. thaliana Enzyms Peptid SEQ ID NR. 5: homolog zu AS 503-512 des A. thaliana Enzyms (Anmerkung: die cDNA-Sequenz aufgelistet in der WO 99/29835 A1 enthält keine Codier-Sequenz für Peptid 5)
Deshalb ist das DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfingung besonders vorteilhaft, da es für ein aktives, rekombinantes Enzym codiert, welches überraschend günstige Charakteristika und Effekte gegenüber dem bekannten, gereinigten Enzym aufweist.

Bevorzugterweise codiert die Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls ein Protein mit einer β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität. Dieses spezifische Protein ist insbesondere zur Analyse, für Versuche und Produktionsverfahren, die sich auf die β1,2-Xylosyltransferase beziehen, geeignet.
Bevorzugterweise weist das erfindungsgemäße DNA-Molekül zumindest 70%, bevorzugt zumindest 80% und besonders bevorzugt zumindest 95%, Homologie zur Sequenz gemäß SEQ ID NR: 8 auf. Diese Sequenz codiert für eine besonders aktive β1,2-Xylosyltransferase. Die Homologie wird vorzugsweise mit einem Programm bestimmt, das Insertionen und Deletionen erkennt und diese nicht bei der Homologie-Berechnung berücksichtigt.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst das DNA-Molekül 1750 bis 1850, insbesondere 1831, Basenpaare.
Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn eines der oben genannten DNA-Moleküle kovalent mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz assoziiert ist. Als Markierungssubstanz kann jeder gebräuchliche Marker verwendet werden, so z.B. fluoreszierende, lumineszierende, radioaktive Marker, Biotin, etc, So werden Reagenzien bereitgestellt, die für den Nachweis, die Selektion und Quantifizierung von entsprechenden DNA-Molekülen in festen Gewebeproben (z.B. aus Pflanzen) oder auch in Flüssigkeitsproben durch Hybridisierungsverfahren geeignet sind.
Vorzugsweise weist das erfindungsgemäße DNA-Molekül eine Sequenz auf, die eine Deletions-, Insertions- und/oder Substitutionsmutation umfasst. Die Anzahl der mutierten Nukleotide ist variabel und reicht von einem einzigen bis zu mehreren deletierten, insertierten oder substituierten Nukleotiden. Es ist auch möglich, dass durch die Mutation der Leserahmen verschoben ist. Wichtig bei einem derartigen "Knockout-Gen" ist lediglich, dass die Expression einer β1,2-Xylosyltransferase gestört ist und die Bildung eines aktiven, funktionellen Enzyms verhindert wird. Dabei ist die Stelle der Mutation variabel, solange die Exprimierung eines enzymatisch aktiven Proteins unterbunden ist. Bevorzugt ist die Mutation im katalytischen Bereich des Enzyms, das sich im C-terminalen Bereich befindet. Die Verfahren zum Einführen von Mutationen in DNA-Sequenzen sind dem Fachmann bestens bekannt, so dass hier darauf verzichtet wird, näher auf die verschiedenen Möglichkeiten der Mutagenesen einzugehen. Es können sowohl zufällige Mutagenesen aber auch insbesondere zielgerichtete Mutagenesen, z.B. die site-directed Mutagenese, die oligonukleotidgesteuerte Mutagenese oder Mutagenesen mit Hilfe von Restriktionsenzymen hier zur Anwendung kommen.
Die Erfindung stellt weiters ein DNA-Molekül zur Verfügung, das für ein Ribozym codiert, welches zwei Sequenzteile aufweist, von welchen jedes eine Länge von jeweils mindestens 15 Basenpaaren aufweist, die zu den Sequenzteilen eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls, wie oben beschrieben, komplementär sind, so dass das Ribozym die mRNA, die durch ein natürliches β1,2-Xylosyltransferase-DNA-Molekül transkribiert wird, komplexiert und spaltet. Die Veröffentlichung von John M. Burke "Clearing the way for ribozymes" (Nature Biotechnology 15:414-415; 1997) betrifft die allgemeine Funktionsweise von Ribozymen. Das Ribozym erkennt die mRNA der β1,2-Xylosyltransferase durch komplementäre Basenpaarung mit der mRNA. Anschließend spaltet und zerstört das Ribozym die RNA in einer sequenzspezifischen Art, bevor das Enzym translatiert wird. Nach Dissoziation vom gespaltenen Substrat hybridisiert das Ribozym wiederholt mit RNA-Molekülen und wirkt als spezifische Endonuklease. Generell können Ribozyme spezi fisch zur Inaktivierung einer bestimmten mRNA hergestellt werden, selbst wenn nicht die gesamte DNA-Sequenz, die für das Protein codiert, bekannt ist. Ribozyme sind besonders effizient, wenn die Ribosomen langsam an der mRNA entlang gleiten. In diesem Fall ist es für das Ribozym leichter, eine ribosomenfreie Stelle an der mRNA zu finden. Aus diesem Grund sind langsame Ribosomen-Mutante als System für Ribozyme ebenfalls geeignet (J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415).
Eine Möglichkeit besteht auch darin, eine abgewandelte Form eines Ribozyms einzusetzen, nämlich ein Minizym. Insbesondere für das Spalten von größeren mRNA-Molekülen sind Minizyme effizient. Ein Minizym ist ein Hammerkopf-Ribozym, das anstelle der Stem/Loop II einen kurzen Oligonukleotid-Linker aufweist. Besonders effizient sind Dimer-Minizyme (Kuwabara et al. 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen biologisch funktionellen Vektor, der eines der oben genannten DNA-Moleküle umfasst. Zur Transfektion in Wirtszellen ist ein eigenständiger, vermehrungsfähiger Vektor notwendig, wobei je nach Wirtszelle, Transfektionsmechanismus, Aufgabe und Größe des DNA-Moleküls ein passender Vektor verwendet werden kann. Da eine große Zahl von verschiedenen Vektoren bekannt ist, würde eine Aufzählung den Rahmen der Anmeldung sprengen, so dass hier darauf verzichtet wird, insbesondere, da die Vektoren dem Fachmann bestens bekannt sind (bezüglich Vektoren sowie allen in dieser Beschreibung verwendeten Techniken und Begriffe, die dem Fachmann bekannt sind, siehe auch Maniatis). Idealerweise weist der Vektor eine geringe Molekülmasse auf und sollte selektierbare Gene aufweisen, um in einer Zelle zu einem leicht erkennbaren Phänotyp zu führen, so dass eine einfache Selektion von vektorhältigen und vektorfreien Wirtszellen möglich ist. Um eine hohe Ausbeute an DNA und entsprechenden Genprodukten zu erhalten, sollte der Vektor einen starken Promotor, sowie einen Enhancer, Genamplifikationssignale und Regulatorsequenzen aufweisen. Für eine autonome Replikation des Vektors ist weiters ein Replikationsursprung wichtig. Polyadenylierungsstellen sind für eine korrekte Prozessierung der mRNA und Spleißsignale für die RNA-Transkripte verantwortlich. Werden Phagen, Viren oder Viruspartikel als Vektoren verwendet, steuern Verpackungssignale die Verpackung der Vektor-DNA. Z.B. sind für die Transkription in Pflanzen Ti-Plasmide geeignet und für die Transkription in Insektenzellen Baculoviren, bzw. in Insekten Transposons, wie das P Element.
Wird der oben beschriebene erfindungsgemäße Vektor in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingebaut, so wird eine post-transkriptionelle Unterdrückung der Genexpression des endogenen β1,2-Xylosyltransferase-Gens durch Transkription eines zu diesem homologen Transgens oder Teilen davon, in Sense-Orientierung erreicht. Für diese Sense-Technik wird weiters auf die Schriften Baucombe 1996, Plant. Mol. Biol., 9:373-382 und Brigneti et al., 1998, EMBO J. 17:6739-6746 verwiesen. Diese Strategie des "Gen-Silencing" ist ein wirkungsvoller Weg, die Expression des β1,2-Xylosyltransferase-Gens zu unterdrücken, s. auch Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964.
Weiters betrifft die Erfindung einen biologisch funktionellen Vektor, der ein DNA-Molekül gemäß einer der oben beschriebenen Ausführungsformen in inverser Orientierung zum Promotor umfasst. Wird dieser Vektor in eine Wirtszelle transfektiert, wird eine "Antisense-mRNA" abgelesen, die komplementär zur mRNA der β1,2-Xylosyltransferase ist und letztere komplexiert. Diese Bindung behindert entweder die korrekte Prozessierung, den Transport, die Stabilität, oder durch Verhinderung der Ribosomenanlagerung die Translation und damit die normale Genexpression der β1,2-Xylosyltransferase.
Obwohl die gesamte Sequenz des DNA-Moleküls in den Vektor eingebaut werden könnte, können Teilsequenzen davon aufgrund ihrer geringeren Größe für bestimmte Zwecke vorteilhafter sein. Wichtig ist z.B. beim Antisense-Aspekt, dass das DNA-Molekül groß genug ist, um eine ausreichend große Antisense-mRNA zu bilden, die an die Transferase-mRNA bindet. Ein geeignetes Antisense-RNA-Molekül umfasst z.B. 50 bis 200 Nukleotide, da viele der bekannten natürlich vorkommenden Antisense-RNA-Moleküle etwa 100 Nukleotide umfassen.
Für eine besonders effektive Inhibierung der Expression einer aktiven β1,2-Xylosyltransferase ist eine Kombination der Sense- Technik und Antisense-Technik geeignet (Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964).
Vorteilhafterweise werden schnell hybridisierende RNA-Moleküle eingesetzt. Die Effizienz von Antisense-RNA-Molekülen, die eine Größe von über 50 Nukleotiden aufweisen, hängt von der Anlage – rungskinetik in vitro ab. So zeigen z.B. schnell anlagernde Antisense-RNA-Moleküle eine stärkere Inhibition der Proteinexprimierung als langsam hybridisierende RNA-Moleküle (Wagner et al., 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742; Rittner et al., 1993, Nucl. Acids Res., 21:1381-1387). Solche schnell hybridisierenden Antisense-RNA-Moleküle weisen insbesondere eine große Anzahl von externen Basen (freie Enden und Verbindungssequenzen), eine große Anzahl von strukturellen Subdomänen (Komponenten), sowie einen geringen Grad an Schleifen (Patzel et al. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68) auf. Die hypothetischen Sekundärstrukturen des Antisense-RNA-Moleküls können z.B. mit Hilfe eines Computerprogramms bestimmt werden, gemäß welchem eine geeignete Antisense-RNA DNA-Sequenz ausgesucht wird.
Es können unterschiedliche Sequenzregionen des DNA-Moleküls in den Vektor eingebaut werden. Eine Möglichkeit besteht z.B. darin, nur den Teil, der für die Ribosomenanlagerung verantwortlich ist, in den Vektor einzubauen. Eine Blockierung in dieser Region der mRNA reicht aus, um die gesamte Translation zu stoppen. Eine besonders hohe Effizienz der Antisense-Moleküle ergibt sich auch für die 5'- und 3'-untranslatierten Regionen des Gens.
Die Erfindung betrifft auch einen biologisch funktionellen Vektor, der eines der beiden zuletzt erwähnten DNA-Moleküle (Mutations- oder Ribozym-DNA-Molekül) aufweist. Was voranstehend bezüglich der Vektoren gesagt wurde, gilt auch in diesem Fall.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA umfassend das erfindungsgemäße DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, wobei RNA aus einer pflanzlichen Zelle, insbesondere aus Blattzellen, isoliert wird, mit der nach Zusetzen einer reversen Transkriptase und Primern eine reverse Transkription durchgeführt wird. Die einzelnen Schritte dieses Verfahrens werden nach Protokollen wie an sich bekannt durchgeführt. Für die reverse Transkription besteht einerseits die Möglichkeit, mit Hilfe von Oligo(dT)-Primern die cDNA der gesamten mRNA herzustellen und erst anschließend mit ausgewählten Primern eine PCR durchzuführen, um DNA-Moleküle umfassend das β1,2-Xylosyltransferase-Gen herzustellen. Andererseits können die ausgewählten Primer direkt für die reverse Transkription eingesetzt werden, um eine kurze, spezifische cDNA zu erhalten. Die geeigneten Primer können z.B. synthetisch nach dem Muster von cDNA-Sequenzen der Transferase hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zum Klonieren einer β1,2-Xylosyltransferase, dadurch gekennzeichnet, dass das erfindungsgemäße DNA-Molekül in einen Vektor kloniert wird, der anschließend in eine Wirtszelle bzw. einen Wirt transfektiert wird, wobei durch Selektion und Amplifikation von transfektierten Wirtszellen Zelllinien erhalten werden, die die aktive β1,2-Xylosyltransferase exprimieren. Das DNA-Molekül wird beispielsweise mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen in den Vektor eingebaut. Für den Vektor gilt das oben bereits Angeführte. Wichtig ist bei diesem Verfahren, dass ein effizientes Wirt-Vektor System gewählt wird. Um ein aktives Enzym zu erhalten, sind eukaryotische Wirtszellen besonders geeignet. Eine Möglichkeit besteht darin, den Vektor in Insektenzellen zu transfektieren. Dabei wäre insbesondere ein Insekten-Virus als Vektor zu verwenden, so z.B. Baculovirus.
Selbstverständlich können Pflanzen oder Pflanzenzellen, menschliche oder anderer Wirbeltier-Zellen ebenfalls transfektiert werden, in welchem Falle letzere ein ihnen fremdes Enzym exprimieren würden.
Bevorzugterweise wird ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Wirtszellen, insbesondere Pflanzenzellen bzw. Pflanzen mit einer unterdrückten bzw. vollständig unterbundenen β1,2-Xylosyltransferase-Produktion zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest einer der erfindungsgemäßen Vektoren, nämlich der umfassend das erfindungsgemäße DNA-Molekül, das mutierte DNA-Molekül oder das DNA-Molekül, das für Ribozyme codiert oder der umfassend das DNA-Molekül in inverser Orientierung zum Promotor, in die Wirtszelle bzw. Pflanze einge schleust wird. Hier gilt ebenfalls das oben für die Transfektion bereits Beschriebene.
Als Wirtszellen können z.B. Pflanzenzellen verwendet werden, wobei hier beispielsweise das Ti-Plasmid mit dem Agrobacterium-System in Frage kommt. Es ist mit dem Agrobacterium-System möglich, direkt eine Pflanze zu transfektieren: Agrobakterien verursachen bei Pflanzen Wurzelhalsgallen. Wenn Agrobakterien eine verletzte Pflanze infizieren, gelangen die Bakterien selbst nicht in die Pflanze, sondern sie schleusen den rekombinanten DNA-Abschnitt, die sogenannte T-DNA aus dem ringförmigen, extrachromosomalen, tumor-induzierenden Ti-Plasmid in die Pflanzenzellen ein. Die T-DNA, und damit auch das darin eingefügte DNA-Molekül, wird stabil in die chromosomale DNA der Zelle eingebaut, so dass die Gene der T-DNA in der Pflanze exprimiert werden.
Es gibt zahlreiche bekannte, effiziente Transfektionsmechanismen für verschiedene Wirtssysteme. Einige Beispiele sind Elektroporation, die Calciumphosphatmethode, Mikroinjektion, Liposomenmethode.
Die transfektierten Zellen werden anschließend selektiert, z.B. aufgrund von Antibiotika-Resistenzen, für die der Vektor Gene aufweist, oder anderer Markergene. Danach werden die transfektierten Zelllinien amplifiziert, entweder in kleinen Mengen, z.B. in Petrischalen, oder in großen Mengen, etwa in Fermentoren. Weiters weisen Pflanzen eine besondere Eigenschaft auf, sie sind nämlich in der Lage sich aus einer (transfektierten) Zelle bzw. aus einem Protoplasten wieder zu einer vollständigen Pflanze zu entwickeln, die gezüchtet werden kann.
Je nach eingesetztem Vektor kommt es zu Vorgängen im Wirt, so dass die Enzym-Expression unterdrückt oder vollständig unterbunden wird:
Wird der Vektor umfassend das DNA-Molekül mit der Deletions-Insertions- oder Substitutionsmutation transfektiert, so kommt es zu einer homologen Rekombination: Das mutierte DNA-Molekül erkennt trotz Mutation die identische Sequenz im Genom der Wirts zelle und wird an genau der Stelle eingebaut, so dass ein "Knockout-Gen" entsteht. Auf diese Weise wird in das Gen für die β1,2-Xylosyltransferase eine Mutation eingebracht, die die einwandfreie Expression der β1,2-Xylosyltransferase inhibieren kann. Wie oben dargelegt ist es bei dieser Technik wichtig, dass die Mutation ausreicht, um die Expression des aktiven Proteins zu unterbinden. Nach Selektion und Amplifikation kann als zusätzliche Überprüfung das Gen sequenziert werden, um den Erfolg der homologen Rekombination bzw. den Grad der Mutation festzustellen.
Wird der Vektor umfassend das DNA-Molekül, das für ein Ribozym codiert, transfektiert, so wird in der Wirtszelle das aktive Ribozym exprimiert. Das Ribozym komplexiert die komplementäre mRNA-Sequenz der β1,2-Xylosyltransferase zumindest an einer bestimmten Stelle, spaltet diese Stelle und kann auf diese Weise die Translation des Enzyms inhibieren. In dieser Wirtszelle sowie in den von ihr abstammenden Zelllinien bzw. gegebenenfalls Pflanze wird keine β1,2-Xylosyltransferase exprimiert.
Wenn der Vektor das erfindungsgemäße DNA-Molekül in Sense- oder inverser Richtung zum Promotor umfasst, wird in der transfektierten Zelle (bzw. Pflanze) eine Sense- oder Antisense-mRNA exprimiert. Die Antisense-mRNA ist komplementär zu zumindest einem Teil der mRNA-Sequenz der β1,2-Xylosyltransferase und kann ebenfalls die Translation des Enzyms inhibieren. Als Beispiel für ein Verfahren zur Unterdrückung der Expression eines Gens durch Antisense-Technik wird auf die Veröffentlichung von Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 224:477-481 verwiesen, wobei in dieser Veröffentlichung die Expression eines Gens, das im Reifungsprozess bei Tomaten involviert ist, inhibiert wird. Es zeigte sich kürzlich, dass doppelsträngige RNA (dsRNA) bei einer großen Vielfalt von Organismen, einschließlich Nematoden, Pflanzen, Trypanosomen, Fruchtfliegen und Planarien ein Sequenzspezifisches Gen-Silencing auslöst; es hat sich gezeigt, dass ein bisher noch nicht charakterisierter RNA-Auslöser in mehreren verschiedenen Pflanzensystemen eine DNA-Methylierung auslöst, die zu einer selektiven Störung der Genfunktion führt (vgl. Übersichtsartikel von Fire A., 1999, Trends Genet 15 (9): 358-363).
In allen Systemen wird die Expression der β1,2-Xylosyltransferase zumindest unterdrückt, vorzugsweise sogar vollständig unterbunden. Der Grad der Störung der Genexpression hängt vom Grad der Komplexierung, homologen Rekombination, von eventuellen anschließenden zufälligen Mutationen, und sonstigen Vorgängen im Bereich des Genoms ab. Die transfektierten Zellen werden auf β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität überprüft und selektiert.
Es besteht weiters die Möglichkeit, die oben beschriebene Unterdrückung der Expression der β1,2-Xylosyltransferase noch weiter zu verstärken, indem zusätzlich zur Einschleusung eines oben beschriebenen Vektors, ein Vektor umfassend ein Gen, das für ein Säugetier-Protein, z.B. β1,4-Galaktosyltransferase, codiert, in den Wirt eingeschleust wird. Die Xylosylierung kann durch die Wirkung anderer Säugetier-Enzyme vermindert werden, wobei die Kombination der Inhibierung der Exprimierung einer aktiven β1,2-Xylosyltransferase mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Vektors und mit Hilfe eines Säugetier-Enzym-Vektors besonders effizient ist.
Für die Transfektion kann jegliche Pflanzensorte eingesetzt werden, beispielsweise die Mungobohne, Tabakpflanze, Tomaten-und/oder Kartoffelpflanze.
Ein anderes, vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Wirtszellen, insbesondere Pflanzenzellen bzw. Pflanzen, besteht darin, dass das DNA-Molekül umfassend die Mutation in das Genom der Wirtszelle bzw. Pflanze an der Stelle der nichtmutierten, homologen Sequenz eingeschleust wird (Schaefer et al. 1997, Plant J.; 11(6):1195-1206). Dieses Verfahren funktioniert demnach nicht mit einem Vektor, sondern mit einem reinen DNA-Molekül. Das DNA-Molekül wird. z.B. durch Genbombardement, Mikroinjektion oder Elektroporation, um nur drei Beispiele zu nennen, in den Wirt eingeschleust. Wie bereits dargelegt, bindet das DNA-Molekül an die homologe Sequenz im Genom des Wirts an, so dass es zu einer homologen Rekombination und damit zur Aufnahme der Deletions-, Insertions- bzw. Substitutionsmutation im Genom kommt: Die Exprimierung der β1,2-Xylosyltransferase kann unterdrückt bzw. vollständig unterbunden werden.
Vorzugsweise sind rekombinante Pflanzen bzw. Pflanzenzellen vorgesehen, die mittels eines der oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden sind, wobei ihre β1,2-Xylosyltransferase-Produktion unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist. Vorzugsweise ist ihre β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität weniger als 50%, insbesondere weniger als 20%, besonders bevorzugt 0%, der in natürlichen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen vorkommenden β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität. Der Vorteil dieser Pflanzen bzw. Pflanzenzellen liegt darin, dass die Glykoproteine, die von ihnen produziert werden, keine bzw. kaum β1,2-gebundene Xylose aufweisen. Werden nun Produkte dieser Pflanzen vom menschlichen oder Wirbeltier-Körper aufgenommen, kommt es zu keiner Immunreaktion infolge des β1,2-Xylose-Epitops.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein PNA-Molekül, das eine Basensequenz umfasst, die komplementär zur Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls ist. PNA (Peptid Nukleinsäure) ist eine DNA ähnliche Sequenz, wobei die Nukleobasen an ein Pseudopeptidrückgrat gebunden sind. PNA hybridisiert im Allgemeinen mit komplementären DNA-, RNA- oder PNA-Oligomeren durch Watson-Crick Basenpaarung und Helixformation. Das Peptidrückgrat gewährleistet eine größere Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau. Das PNA-Molekül stellt dadurch ein verbessertes Antisense-Agens dar.
Weder Nukleasen noch Proteasen sind in der Lage, ein PNA-Molekül anzugreifen. Die Stabilität des PNA-Moleküls, wenn es an eine komplementäre Sequenz gebunden ist, weist eine ausreichende sterische Blockierung von DNA und RNA Polymerasen, der reversen Transkriptase, Telomerase und der Ribosome auf. Die Veröffentlichung von Pooga et al., "Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo" (Nature Biotechnology 16:857-861; 1998) bezieht sich auf PNA-Moleküle im Allgemeinen und insbesondere auf ein PNA-Molekül, welches zur Human-Galanin-Rezeptor Typ 1-mRNA komplementär ist.
Weist das PNA-Molekül die oben genannte Sequenz auf, so bindet sie an die DNA bzw. an eine Stelle der DNA, die für β1,2-Xylosyltransferase codiert, und kann auf diese Weise die Transkription dieses Enzyms inhibieren. Das PNA-Molekül wird, da es weder transkribiert noch translatiert wird, synthetisch hergestellt, z.B. mit Hilfe der t-Boc-Technik.
Vorteilhafterweise wird ein PNA-Molekül beschrieben, das eine Basensequenz umfasst, die der Sequenz des erfindungsgemäßen DNR-Moleküls entspricht. Dieses PNA-Molekül komplexiert die mRNA oder eine Stelle der mRNA der β1,2-Xylosyltransferase, so dass die Translation des Enzyms inhibiert ist. Hier trifft Ähnliches wie für die Antisense-RNA zu. So ist z.B. ein besonders effizienter Komplexierungsbereich die Translationsstart-Region oder auch die 5'-nichttranslatierten Regionen der mRNA.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, insbesondere Pflanzenzellen, die eine blockierte Expression der β1,2-Xylosyltransferase auf der Ebene der Transkription bzw. Translation aufweisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass erfindungsgemäße PNA-Moleküle in die Zellen eingeschleust werden. Um das PNA-Molekül bzw. die PNA-Moleküle in die Zelle einzuschleusen, werden wiederum die herkömmlichen Methoden, wie z.B. Elektroporation oder Mikroinjektion angewandt. Besonders effizient ist das Einschleusen, wenn die PNA-Oligomere an Zellen-Penetrationspeptide, z.B. Transportan oder pAntp, gebunden sind (Pooga et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 857-861).
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Glykoproteinen zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die erfindungsgemäßen, rekombinanten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, deren β1,2-Xylosyltransferase-Produktion unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist, oder Pflanzen bzw, Zellen, in die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren PNA-Moleküle eingeschleust worden sind, mit dem Gen, das das Glykoprotein exprimiert, transfektiert sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden. Dabei werden, wie oben schon beschrieben, Vektoren umfassend Gene für die gewünschten Proteine in den Wirt bzw. Wirtszellen wie ebenfalls oben schon beschrieben transfektiert. Die transfektierten Pflanzenzellen exprimieren die gewünschten Proteine, wobei sie keine oder kaum β1,2-gebundene Xylose aufweisen. Dadurch lösen sie die oben bereits erwähnten Immunreaktionen im menschlichen oder Wirbeltier-Körper nicht aus. Es können jegliche Proteine in diesen Systemen produziert werden.
Bei einem solchen Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Glykoproteinen werden die rekombinanten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, deren β1,2-Xylosyltransferaseproduktion unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist, oder Pflanzen bzw. Zellen, in welche PNA-Moleküle eingeschleust wurden, mit dem Gen transfektiert, das das Glykoprotein exprimiert, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden. Durch dieses Verfahren wird es möglich, menschliche Proteine in Pflanzen (Pflanzenzellen) zu produzieren, die, wenn sie durch den menschlichen Körper aufgenommen sind, keine gegen β1,2-gebundene Xylosereste gerichtete Immunreaktion auslösen. Dabei besteht die Möglichkeit, Pflanzensorten zur Produktion der rekombinanten Glykoproteine einzusetzen, die als Nahrungsmittel dienen, z.B. Banane, Kartoffel und/oder Tomate. Die Gewebe dieser Pflanze umfassen das rekombinante Glykoprotein, so dass z.B. durch Extraktion des rekombinanten Glykoproteins aus dem Gewebe und anschließende Verabreichung bzw. direkt durch den Verzehr des pflanzlichen Gewebes das rekombinante Glykoprotein in den menschlichen Körper aufgenommen wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten humanen Glykoproteinen zur medizinischen Verwendung ist beschrieben, worin die erfindungsgemäßen, rekombinanten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, deren β1,2-Xylosyltransferase-Produktion unterdrückt bzw. vollständig unterbunden ist, oder Pflanzen bzw. Zellen, in die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren PNA-Moleküle eingeschleust worden sind, mit dem Gen, das das Glykoprotein exprimiert, transfektiert sind, so dass die rekombinanten Glykoproteine exprimiert werden. Hierbei kommt jegliches Protein in Frage, das medizinisch von Interesse ist.
Weiters können rekombinante Glykoproteine in pflanzlichen Systemen hergestellt werden, wobei ihre Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der β1,2-gebundenen Xylose-Reste aufweist, welche in Proteinen vorkommen, die in nicht Xylosyltransferase reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert sind. Naturgemäß sind auch Glykoproteine, die keine β1,2-gebundenen Xylose-Reste aufweisen, beschrieben. Die Menge an β1,2-gebundener Xylose ist vom Grad der oben beschriebenen Unterdrückung der β1,2-Xylosyltransferase abhängig.
Weiters betrifft die Erfindung rekombinante humane Glykoproteine, die in pflanzlichen Systemen gemäß einem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, und deren Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der β1,2-gebundenen Xylose-Reste aufweist, welche in den Proteinen vorkommen, die in nicht Xylosyltransferase reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert sind.
Rekombinante humane Glykoproteine zur medizinischen Verwendung, können gemäß einem oben beschriebenen Verfahren in pflanzlichen Systemen hergestellt werden, deren Peptidsequenz unter 50%, insbesondere unter 20%, besonders bevorzugt 0%, der β1,2-gebundenen Xylose-Reste aufweist, welche in den Proteinen vorkommen, die in nicht Xylosyltransferase reduzierten pflanzlichen Systemen exprimiert sind.
Diese Glykoproteine können andere gebundene Oligosaccharid-Einheiten, die für Pflanzen spezifisch sind, aufweisen, wodurch sie sich – im Falle von humanen Glykoproteinen – von diesen natürlichen Glykoproteinen unterscheiden. Nichtsdestotrotz wird durch diese Glykoproteine eine geringere bzw. gar keine Immunreaktion im menschlichen Körper ausgelöst, da, wie in der Beschreibungseinleitung schon dargestellt, die β1,2-gebundenen Xylose-Reste zusammen mit den α1,3-Fucose-Resten, die Hauptursache der Immunreaktionen bzw. Kreuz-Immunreaktion gegen pflanzliche Glykoproteine sind.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Glykoproteinen kann eine pharmazeutische Zusammensetzung weitere, für solche Zusammensetzungen übliche Zusätze umfassen. Dies sind z.B. geeignete Verdünnungsmittel verschiedenen Puffergehalts (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Ionenstärke, Zusatzmittel, wie etwa Tenside und Lösungsvermittler (z.B. Tween 80, Polysorbate 80), Konservierungsmittel (z.B. Thimerosal, Benzylalkohol), Adjuvantien, Antioxidationsmittel (z.B. Ascorbinsäure, Natriummetabi sulfit), Emulgatoren, Füllstoffe (z.B. Lactose, Mannit), kovalente Bindungen von Polymeren, wie etwa Polyethylenglykol, an das Protein, Einbau des Materials in teilchenförmige Zusammensetzungen von polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglykolsäure, etc. oder in Liposome, Hilfsstoffe und/oder Trägersubstanzen, die bei der jeweiligen Behandlung nützlich sind. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in -vivo Freisetzung und die Geschwindigkeit der in-vivo Ausscheidung dieser Glykoproteine beeinflussen.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Selektieren von DNA-Molekülen zur Verfügung, die für eine β1,2-Xylosyltransferase codieren, in einer Probe, wobei die erfindungsgemäßen, markierten DNA-Moleküle oder Teilsequenzen davon zur Probe zugesetzt werden, die an die DNA-Moleküle, die für eine β1,2-Xylosyltransferase codieren, binden. Die hybridisierten DNA-Moleküle können detektiert, quantifiziert und selektiert werden. Damit die Probe Einzelstrang-DNA aufweist, mit der die markierten DNA-Moleküle hybridisieren können, wird die Probe, z.B. durch Erwärmen, denaturiert.
Eine Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende DNA, gegebenenfalls nach Zusetzen von Endonukleasen, durch Gelelektrophorese auf einem Agarosegel abzutrennen. Nach Transferieren auf eine Membran aus Nitrozellulose werden die erfindungsgemäßen markierten DNA-Moleküle zugesetzt, die an das entsprechende homologe DNA-Molekül hybridisieren ("Southern Blotting").
Eine andere Möglichkeit besteht darin, homologe Gene aus anderen Spezies durch PCR-abhängige Verfahren unter Verwendung von spezifischen und/oder degenerierten Primern, die aus der Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls stammen, aufzufinden.
Vorteilhaft werden die markierten DNA-Moleküle der Erfindung oder Teilsequenzen derselben auf Träger-Matrizen immobilisiert. Die Verwendung von DNA-Mikroarrays ("Gen-Chips") ist eine weitere Möglichkeit, homologe Gene zu finden oder die Expressionsmenge homologer Gene zu untersuchen. Zu diesem Zweck wird DNA, die entweder die gesamte Genom-Gensequenz, die cDNA- Sequenz der gesamten Länge, Teile dieser Sequenzen oder irgendeine Kombination von Teilsequenzen darstellt, auf Träger-Matrizen immobilisiert, damit homologe Gene nach Zugabe der Probe zu den Träger-Matrizen mit den markierten DNA-Molekülen hybridisieren (für Beispiele, vgl. beispielsweise Ferea T.L. & Brown, P.O., 1999, Current Opinion in Genetics & Development 9:715-722, und hierin zitierte Literaturstellen).
Vorzugsweise umfasst die Probe für das obengenannte erfinderische Verfahren genomische DNR eines pflanzlichen Organismus. Durch dieses Verfahren wird auf sehr schnelle und effiziente Weise eine große Anzahl von Pflanzen oder anderen Spezies auf das Vorhandensein des β1,2-Xylosyltransferase-Gens untersucht. Auf diese Weise können Pflanzen oder Individuen anderer Spezies, die dieses Gen nicht aufweisen, selektiert werden bzw. kann in solchen Pflanzen oder anderen Organismen, die dieses Gen aufweisen, durch ein oben beschriebenes, erfindungsgemäßes Verfahren die Exprimierung der β1,2-Xylosyltransferase unterdrückt bzw. vollständig unterbunden werden, so dass sie anschließend zur Transfektion und Produktion von (humanen) Glykoproteinen eingesetzt werden können.
DNA-Moleküle, die für eine β1,2-Xylosyltransferase codieren, können nach den drei zuletzt genannten Verfahren selektiert und anschließend aus der Probe isoliert werden. Diese Moleküle können für weitere Untersuchungen eingesetzt werden. Sie können sequenziert und ihrerseits auch als DNA-Sonden zum Auffinden von β1,2-Xylosyltransferasen verwendet werden. Diese – markierten – DNA-Moleküle werden für Organismen, die den Organismen, aus denen sie isoliert wurden, verwandt sind, effizienter als Sonden fungieren, als die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Präparation von erfindungsgemäß klonierter β1,2-Xylosyltransferase, die Isoformen mit pI-Werten zwischen 6,0 und 9,0, insbesondere zwischen 7,50 und 8,00, aufweist. Der pI-Wert eines Proteins ist derjenige pH-Wert, bei dem seine Nettoladung Null beträgt und ist abhängig von der Aminosäuresequenz, dem Glykosylierungsmuster als auch von der räumlichen Struktur des Proteins. Die β1,2-Xylosyltransferase kann mehrere Isoformen aufweisen, die einen pI-Wert in diesem Bereich haben. Der Grund für die verschiedenen Isoformen der Transferase sind z.B. unterschiedliche Glykosylierungen sowie limitierte Proteolyse. Der pI-Wert eines Proteins kann durch isoelektrische Fokussierung, die dem Fachmann bekannt ist, festgestellt werden.
Die Haupt-Isoform des Enzyms weist ein apparentes Molekulargewicht von 60,2 kDa auf.
Insbesondere weist die erfindungsgemäße Präparation eine Isoform mit einem pI-Wert von 7,52 auf.
Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Herstellung von "verpflanzlichten" Kohlehydrat-Einheiten von menschlichen und anderen Wirbeltier-Glykoproteinen oder anderen Glykokonjugaten, wobei zu einer Probe, die eine Kohlehydrat-Einheit bzw. ein Glykoprotein aufweist, UDP-Xylose sowie β1,2-Xylosyltransferase, codiert durch ein oben beschriebenes DNA-Molekül, zugesetzt werden, so dass Xylose in β1,2-Stellung durch die β1,2-Xylosyltransferase an die Kohlehydrat-Einheit bzw. an das Glykoprotein gebunden wird. Durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Klonierung von β1,2-Xylosyltransferase ist es möglich, große Mengen an gereinigtem Enzym herzustellen. Um eine voll aktive Transferase zu erhalten, werden geeignete Reaktionsbedingungen vorgesehen.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt sein soll, weiter erläutert werden. Im Einzelnen zeigen in der Zeichnung:
1 die Aminosäuresequenz des Sojabohnen-Peptids 2 und 3 (Patent WO99/29835; SEQ ID NO: 3 und 5), die Homologie zwischen diesen Peptiden und einer A. thaliana-Sequenz, sowie die DNA-Sequenz von vier Primern 1-4;
2 die cDNA-Sequenz von β1,2-Xylosyltransferase einschließlich 226 nt des 5'-nicht-translatierten Bereichs;
3 die Aminosäuresequenz von β1,2-Xylosyltransferase, die davon stammt;
4a, 4b und 4c die Ausrichtung von A. thaliana β1,2-Xylosyltransferase-cDNAs, einer genomischen DNA und einer EST-Sequenz;
5 die Ausrichtung von Aminosäuresequenzen von β1,2-Xylosyltransferase, die von den cDNAs, von einer genomischen DNA und von einer EST-Sequenz stammt;
6 eine schematische Darstellung der β1,2-Xylosyltransferase sowie der PCR-Produkte und der Hydrophobizität der Aminosäurereste;
7 einen Vergleich der β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität von Insektenzellen, die mit dem β1,2-Xylosyltransferase-Gen transfektiert sind, mit jener einer Negativkontrolle;
8a und 8b die Struktur des Akzeptor-Substrats und -Produkts der β1,2-Xylosyltransferase;
9 Massenspektren;
10 die Analyse des β1,2-Xylosyltransferase-Produkts mittels Reverse-Phasen-HPLC; und
11 zeigt die Ausrichtung der vorhergesagten Aminosäuresequenz, welche von der cDNA der vorliegenden Anmeldung abstammt, mit der Aminosäuresequenz der aus Sojabohne gereinigten β1,2-Xylosyltransferase.
Beispiel 1
RT-PCR und cDNA-Klonierung
Primer für die Amplifizierung der putativen β1,2-Xylosyltransferase-cDNA mittels RT-PCR wurden, wie folgt, entworfen: Eine BLRSTP-Suche in der DDBJ-Datenbank unter Verwendung von zwei Sojabohnen-Peptiden (SEQ ID NR: 1 und 2; entsprechend SEQ ID NR: 3 und 5 in 4 in Patent WO99/29835 A1; die C-terminalen Aminosäuren LG wurden jedoch von SEQ ID NR: 5 weggelassen) (vgl. 1) zeigte eine Proteinsequenz, die von einer Arabidopsis thalia na-Genom-DNA-Sequenz (Akz. Nr. AB015479) stammte, mit mehr als 80%iger Homologie (SEQ ID NR: 3). Die Primer 3 (SEQ ID NR: 4) und 4 (SEQ ID NR: 5) basierten auf der A. thaliana-Sequenz, die homolog zu den Sojabohnen-Peptiden 2 und 3 ist. Die Analyse der homologen Genom-DNA-Sequenz unter Verwendung des "Gen-Finder" am BCM Search Launcher ergab ein vorhergesagtes Protein. Primer 1 (SEQ ID NR: 6) wurde so entworfen, dass er das Start-Codon des vorhergesagten Proteins inkludiert, wogegen Primer 2 (SEQ ID NR: 7) das Stop-Codon des vorhergesagten Proteins enthält.
Die gesamte RNA wurde aus jungen Blättern von Arabidopsis thaliana var Columbia unter Verwendung des TRIzol-Reagens (Life Technologies) isoliert. Die RNA wurde mit DNAse (Promega, RQl RNase Free DNase) behandelt, um Spuren der genomischen DNA zu entfernen. Erststrang-cDNA wurde aus 1 μg der gesamten RNA bei 42°C unter Verwendung von Oligo(dT)-Primern (Sigma) und AMV-Reverse-Transkriptase (Promega) synthetisiert.
Die Erststrang-cDNA wurde einer PCR unterzogen, wobei verschiedene Kombinationen von Sense- und Antisense-Primer verwendet wurden (in 6 veranschaulicht): Das Produkt von Primer 3 und Primer 4 war ein DNA-Fragment mit einer Länge von 174 by (P1), das Produkt von Primer 1 und Primer 2 war ein 1605 by (P2)-DNA-Fragment, das Produkt von Primer 1 und Primer 4 war ein DNA-Fragment mit einer Länge von 1525 by (P3), und Primer 3 und Primer 4 erzeugten eine DNA von 254 by (P4). Zur Amplifikation des putativen offenen Leserahmens wurden Primer 1 und Primer 2 verwendet. Eine PCR-Reaktionsmischung enthielt in einem Gesamtvolumen von 50 μl 0,2 μmol von jedem Primer, 0,05 mM dNTPs, 2 mM MgSO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 8,2 bei 25°C), 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 5 μg Nuklease-freies BSA und 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase von Promega. Nach einem ersten, 2 min langen Denaturierungsschritt bei 94°C wurden 30 Zyklen von 1 min bei 92°C, 40 s bei 53°C und 3 min und 30 s bei 72°C durchgeführt. Der letzte Verlängerungsschritt wurde 8 min lang bei 72°C durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in einem mit SmaI linearisierten und entphosphorylierten puc19-Vektor subkloniert und sequenziert: Die Sequenzen der subklonierten Fragmente wurden mittels des Didesoxynukleotid-Verfahrens (ABI PRISM Dye Termination Cycle Sequencing Ready reaction Kit und ABI PRISM 310 Genetic Analyzer von Perkin Elmer) erhalten. Als Ergebnis der RT-PCR wurden drei etwas verschiedene cDNA-Sequenzen erhalten. Die Sequenz der cDNA6, die eine Größe von 1605 by (xt-Ath6; SEQ ID NR: 8) hat und für ein Protein mit 534 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 60,2 kDA und mit einem theoretischen pI-Wert von 7,52 (vgl. 3) kodiert, ist mit der Nukleotidsequenz, die aus dem genomischen Klon nach Entfernen der beiden Introns (xt-Athgen.seq) stammt, identisch. Die cDNA 9 weist 4 Basenpaar-Veränderungen im Vergleich zur cDNA 6 auf, wogegen die cDNA 16 6 Basenpaar-Veränderungen im Vergleich zur cDNA 6 aufweist (in den 4a, 4b und 4c veranschaulicht). Daher weist die von der cDNA 9 stammende Aminosäuresequenz Veränderungen auf im Vergleich zur Aminosäure-Sequenz, die von der cDNA 6 stammt (SEQ ID NR: 8), und die Aminosäure-Sequenz der cDNA 16 weist vier veränderte Reste auf (in 5 veranschaulicht).
3 zeigt die von cDNA stammende Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NR: 9) der β1,2-Xylosyltransferase (xt-Ath6; SEQ ID NR: 8). Potentielle Stellen für die Asparagin-gebundene Glykosylierung sind bei Asn51, Rsn301 und Asn479.
Die 4a, 4b und 4c zeigen die Ausrichtung der β1,2-Xylosyltransferase-Nukleotidsequenzen aus der A. thaliana-cDNA 6 (xt-Ath6; SEQ ID NR: 8), der A. thaliana-cDNA 9 (xt-Ath9), der A. thaliana-cDNA 16 (xt-Athl6), der A. thaliana Genom-DNA-Sequenz nach Entfernen der beiden Introns (xt-Athgen), und von einer A. thaliana-EST-Sequenz (xtAthEST). Die punktierte Linie steht für die Consensus-Sequenz; die strichlierte Linie für eine Lücke.
Die Genom-Sequenz (xt-Athgen; Akz. Nr. AB015479, Start-Codon an Position 58185-58187, Stop-Codon an Position 60214-60216 der Genom-DNA) ergibt sich aus dem Entfernen der beiden putativen Introns (Intron 1: von Position 58881 bis 59116 der Genom-DNA; Intron 2: von Position 59268 bis 59458 der Genom-DNA) unter Verwendung des Spleiss-Stellenvorhersage-Servers NetPlantGene. Die A. thaliana-EST-Sequenz (xtAthEST; Akz. Nr. AI994524) ist das Ergebnis einer Datenbank-Abfrage unter Verwendung von BLASTN.
5 zeigt die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von β1,2- Xylosyltransferase, die aus A. thaliana-cDNA 6 (xt-Ath6; SEQ ID NR: 9), aus A. thaliana-cDNA 9 (xt-Ath9), aus A. thaliana-cDNA 16 (xt-Ath16), aus der genomischen A. thaliana-Sequenz (xt-Athgen) und aus einer A. thaliana-EST-Sequenz (xt-AthEST) stammt. Die punktierte Linie steht für eine Consensus-Sequenz; die strichlierte Linie steht für eine Lücke.
In 6 sind das schematisch vorhergesagte β1,2-Xylosyltransferase-Protein (oben) und der unter Verwendung von ProtScale erhaltene Hydrophobizitätsindex des codierten Proteins (unten) veranschaulicht, wobei ein positiver Hydrophobizitätsindex eine erhöhte Hydrophobizität bedeutet. Dazwischen sind die Größen der vier oben angegebenen PCR-Produkte (P1-P4) im Verhältnis zur cDNA gezeigt. "C" codiert für den postulierten zytoplasmatischen Bereich, "T" für den postulierten Transmembranbereich und "G" für den postulierten Golgi-Lumen-katalytischen Bereich der Transferase. Die Analyse der Proteinsequenz durch "TMpred" (von EMBnet) ergab einen angenommenen Transmembranbereich von Ile11 bis Phe29. Der C-terminale Bereich des Enzyms umfasst vermutlich den katalytischen Bereich und sollte folglich in den Lumen des Golgi-Apparats zeigen. Demgemäß scheint diese Transferase ein Typ II-Transmembran-Protein wie alle bisher analysierten Glykosyltransferasen zu sein, die bei der Glykoprotein-Biosynthese (Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277) involviert sind. Die grauen Bereiche repräsentieren die Position der beiden Peptide, die Hexagone stellen die potentiellen N-Glykosylierungsstellen dar. Eine BLAST-Suche in Datenbanken, zugänglich über NCBI, zeigte nur eine hohe Homologie mit einer anderen Pflanzensequenz (aspen-Hybrid, Akz. Nr. AI62640).
Beispiel 2
Expression der rekombinanten β1,2-Xylosyltransferase in Insektenzellen
Die gesamte codierende Region der vermutlichen β1,2 Xylosyltransferase samt cytoplasmatischer und transmembraner Region wurde vom puc19-Vektor durch BamHI- und EcoRI-Verdau entfernt und in mit BamHI/EcoRI-verdauten und entphosphorylierten Baculovirus-Transfer-Vektor pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA) subkloniert. Die korrekte Klonierung wurde durch Sequenzierung unter Verwendung des pVL1393-Vorwärts-Primers 5'-AACCATCTCGCAAA-TAAATAAGTA-3' (SEQ ID NR: 10) und des pVL1393-Rückwärts-Primers 5'-GTCGGGTTTAACATTACGGATTTC-3' (SEQ ID NR: 11) bestätigt. Um eine homologe Rekombination zu gewährleisten, wurde 1 μg des Transfer-Vektors mit 200 ng linearer Baculo-Gold viraler DNA (PharMingen, San Diego, CA) in 1 × 10⁶ Sf-9-Zellen in IPL-41 Medium unter Verwendung von Lipofectin (Life Technologies) gemäß den Vorschriften des Herstellers co-transfektiert. Nach einer Inkubation von 5 Tagen bei 27°C wurden verschiedene Volumina des Überstandes mit dem rekombinanten Virus zur Infektion der Sf21-Insektenzellen verwendet. Die Zellen wurden 4 Tage lang bei 27°C in IPL-41-Medium, das mit 5% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum ergänzt worden war, inkubiert, dann geerntet und 2x mit Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden im folgenden Puffer (1 ml pro 10'-Zellen) resuspendiert und homogenisiert: 100 mM MES-Puffer, pH 7,0, mit 1% Triton X-100, 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 5 μg/ml Leupeptin (Sigma), 5 μg/ml E-64 (Serva) und 30 min lang auf Eis inkubiert.
Beispiel 3
Assay für die β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität Die Zellhomogenate wurden auf β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität getestet. Negativkontrollen wurden mit der selben Anzahl nichtinfizierter Zellen durchgeführt. Die Testmischungen enthielten – bei einem Gesamtvolumen von 20 μl-13 μl homogenisierter Zellen, 2 nmol dabsyliertes GnGn-Hexapeptid oder GnGn-Pyridylamin als Akzeptor-Substrat (8a), 1 mM UDP-Xylose als Donor-Substrat, 10 mM ATP, 20 mM MnCl₂, und 1 mM 2-Acetamido-1,2-didesoxynojirimycin wurde inkludiert, um einen Abbau des Produktes durch N-Acetylhexosaminidase zu verhindern. Die Proben wurden 1 h lang bei 37°C inkubiert und mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
7 zeigt die gemessene Enzymaktivität der rekombinanten (β1,2-Xylosyltransferase sowie der Negativkontrolle. Graue Balken zeigen die Aktivität, wenn GnGn-Hexapeptid als Substrat verwendet wurde, wogegen schwarze Balken die Verwendung von GnGnPyridylamin als Substrat anzeigen. Die Enzymaktivität der cotransfektierten Zellen war 30x höher als jene der Negativkon trollen.
Die Struktur des Akzeptor-Substrats von β1,2-Xylosyltransferase ist in 8a gezeigt, und das postulierte Produkt in 8b, worin R entweder einen Pyridylamin- oder einen dabsylierten Hexapeptid-Rest darstellt.
Beispiel 4
Massenspektrometrie des Xylosyltransferase-Produkts
Die Massenspektrometrie wurde auf einem DYNAMO (BioAnalysis, Santa Fe, NM) durchgeführt, einem MALDITOF MS, welches zu einer dynamischen Extraktion fähig ist (Synonym für späte Extraktion). Zwei Typen von Proben-Matrix-Präparaten wurden verwendet: dabsylierte Glykopeptide wurden in 5%iger Ameisensäure gelöst, und Aliquots wurden an das Target angelegt, luftgetrocknet, und mit 1%iger alpha-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure bedeckt. Pyridyl-aminierte Glykane wurden mit Wasser verdünnt, auf das Target aufgetragen und luftgetrocknet. Nach Zugabe von 2%iger 2,5-Dihydroxybenzoesäure wurden die Proben sofort durch Anlegen von Vakuum getrocknet.
9 zeigt das Massenspektrum dieser Proben, wobei (A) die Negativkontrolle ist: Der Haupt-Peak (S) zeigt das Dabsyl-Val-Gly-Glu-(GlcNAc₄Man₃)Asn-Arg-Thr-Substrat, wobei der berechnete [M+H]⁺-Wert 2262,3 ist. Dieses Substrat scheint auch als Natriumadditionsprodukt und als kleineres Ion auf, das durch Fragmentierung der Azo-Funktion der Dabsyl-Gruppe, bei (S*), gebildet worden ist. Der Peak bei m/z = 2424,4 zeigt die unvoll-ständige Ent-Galaktosylierung des Substrats. Das Massenspektrum (B) zeigt die Probe mit rekombinanter β1,2- Xylosyltransferase nach 1h Inkubation bei 37°C. Der Haupt-Peak (P) mit einem [M+H]⁺-Wert von 2393,4 stellt das xylosylierte Produkt dar.
Beispiel 5
HPLC-Analyse des Xylosyltransferase-Produkts
Xylosyltransferase-Assays wurden, wie oben unter Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 10 nmol GnGn-Pyridylamin als Akzeptor-Substrat verwendet wurden. Nach 4 h Inkubation wurde die Probe sowohl mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie als auch mittels Reverse-Phasen-HPLC analysiert, um die Struktur des Produkts zu verifizieren. Der vermutete Produkt-Peak, der kurz vor dem Substrat GnGn-PA eluiert, wurde gesammelt. Mittels MALDI-TOF MS wurde festgestellt, dass die Masse des Produkts 1550,9 ist, was gut damit übereinstimmte, dass es GnGnX-PA sei. Nach Verdau mit β-N-Acetylglukosaminidase aus Rinderniere (in 50 mM Natriumzitrat-Puffer, pH 5,0, 20 h lang bei 37°C mit 25 mE des Enzyms) eluierte das Glykan mit etwa der Retention von MM. Dies stimmt mit den veröffentlichten Daten über die Retention von MM-PA und MMX-PA überein (Wilson & Altmann, 1998, Gycoconj. J. 15, 1055-1070). Weiterer Verdau mit al-pha-Mannosidase aus Canavalia ensiformis ("jack beans") unter den gewählten Bedingungen (20 h bei 37°C mit 50 mE des Enzyms) führte zum Auftreten zweier neuer Peaks. Da die alpha-1,3-gebundene Mannose beträchtlich empfindlicher gegenüber Mannosidase ist als die alpha-1,6-gebundene Mannose, werden die Peaks 00X und M0X (in der Reihenfolge der Elution) zugeordnet. Tatsächlich koeluierte M0X-Pyridylamin, das aus Bromelain durch Entfucosylierung mit Säure hergestellt wurde, mit dem vermuteten M0X, das aus dem Xylosyltransferase-Produkt stammte. Die relativ starke Verschiebung der Elutionszeit infolge des Entfernens des alpha-1,3-gebundenen Mannoserestes ist ein starkes Anzeichen dafür, dass die β-Mannose durch Xylose ersetzt ist (Wilson & Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070; Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 79-82).
10 zeigt die Analyse des Xylosyltransferase-Produkts mittels Reverse-Phasen-HPLC. (A) Transferaseinkubationsmischung; (B) isoliertes Xylosyltransferase-Produkt; (C) isoliertes Xylosyltransferase-Produkt nach Verdau mit β-N-Acetylglucosaminidase; (D) isoliertes Xylosyltransferase-Produkt nach weiterem Verdau mit alpha-Mannosidase. Die Zuordnung der Peaks ist wie folgt: 1: GnGn-PA; 2: GnGnX-PA; 3: MMX-PA; 4: M0X-PA; 5: 00X-PAA; 6: M0-PA (aus einer Spur von Substrat im isolierten Produkt). Bezüglich Abkürzungen von N-Glykan-Strukturen, vgl. Wilson I.B.H. und Altmann, F., 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070.
11 zeigt die Ausrichtung der vorhergesagten Aminosäuresequenz gemäß der WO 99/29835 A1. Diese Ausrichtung zeigt, dass die Aminosäuresequenz des gereinigten Sojabohnen-Enzyms lediglich den Aminosäuren 199-469 der von der erfindungsgemäßen cDNA abstammenden Sequenz entspricht. Weiters enthält die von der erfindungsgemäßen cDNA abstammende vorhergesagte Aminosäuresequenz verglichen mit der Sequenz des gereinigten Sojabohnen-Enzyms zwei Insertionen (entsprechend AS 375-382 und AS 425-429 der vorhergesagten Sequenz).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Protein mit (β1,2-Xylosyltransferase-Aktivität codiert und dass es eine Sequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus – einer Sequenz SEQ ID NR: 8 mit einem offenen Leserahmen von Basenpaar 227 bis Basenpaar 1831 (Sequenz A), – einer Sequenz, die zumindest zu 50% identisch mit der genannten Sequenz A ist, – einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der genannten Sequenz A hybridisiert, – einer Sequenz, die infolge des genetischen Codes zur genannten Sequenz A degeneriert ist, oder – einer Sequenz, die zu einer der obgenannten Sequenzen komplementär ist; mit der Maßgabe, dass eine DNA-Sequenz, wie in EP 1 033 405 A2 unter SEQ ID NR: 77276 geoffenbart, translatiert zu einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 77277 von EP 1 033 405 A2 , ausgenommen ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest zu 70% identisch mit der Sequenz gemäß SEQ ID NR: 8 ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest zu 80%, insbesondere zumindest zu 95%, identisch mit der SEQ ID NR: 8 ist.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es 1780 bis 1880, insbesondere 1831 Basenpaare umfasst.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, dass es mit einer detektierbaren Marker-Substanz kovalent verbunden ist.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte DNA-Sequenz eine Deletions-, Insertions- und/oder Substitutions-Mutation aufweist.
DNA-Molekül, das für ein Ribozym codiert, dadurch gekennzeichnet, dass es zwei Sequenzabschnitte hat, von welchen jeder eine Länge von mindestens 15 Basenpaaren hat und die komplementär zu den Sequenzabschnitten eines DNA-Moleküls gemäß SEQ ID NR: 8 sind, so dass das genannte Ribozym die von einem natürlichen β1,2-Xylosyltransferase-DNA-Molekül transkribierte mRNR komplexiert und schneidet.
Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst, mit inverser Orientierung in Bezug auf den Promotor.
Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder 7 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer cDNA umfassend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass RNA aus pflanzlichen Zellen, insbesondere aus Blattzellen, isoliert wird und mit dieser RNA nach Zusetzen einer reversen Transkriptase und Primern, hergestellt gemäß SEQ ID NR: 8, eine reverse Transkription durchgeführt wird.
Verfahren zum Klonieren einer β1,2-Xylosyltransferase, dadurch gekennzeichnet, dass ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in einen Vektor kloniert wird, der anschließend in eine Wirtszelle bzw. einen Wirt transfektiert wird, wobei durch Selektion und Amplifikation von transfektierten Wirtszellen Zelllinien erhalten werden, die die aktive β1,2-Xylosyltransferase exprimieren.
Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Wirtszellen, insbesondere Pflanzenzellen oder Pflanzen, wobei die Produktion von β1,2-Xylosyltransferase unterdrückt oder vollständig unterbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der Vektoren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 in die Wirtszelle bzw. Pflanze eingeschleust wird.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Wirtszellen, insbesondere Pflanzenzellen bzw. Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Molekül nach Anspruch 6 in das Genom der genannten Wirtszelle bzw. Pflanze an der Stelle der nicht-mutierten, homologen Sequenz eingeschleust wird.
Rekombinante Pflanzen oder Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 hergestellt sind und dass ihre β1,2-Xylosyltransferase-Produktion unterdrückt oder vollständig unterbunden ist.
Verfahren zum Selektieren von DNA-Molekülen, die für eine β1,2-Xylosyltransferase codieren, in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-Moleküle nach Anspruch 5 zur genannten Probe zugesetzt werden, welche Moleküle an die DNA-Moleküle, die für eine β1,2-Xylosyltransferase codieren, binden.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Probe genomische DNA eines Pflanzen- oder Nicht-Vertebraten-Tier-Organismus umfasst.
Herstellung von β1,2-Xylosyltransferase, die gemäß einem Verfahren nach Anspruch 12 kloniert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass sie Isoformen mit pI-Werten zwischen 6,0 und 9,0, insbesondere zwischen 7,50 und 8,00, aufweist.
Herstellung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Isoform mit einem pI-Wert von 7,52 aufweist.
Verfahren zur Herstellung von verpflanzlichten Kohlehydrat-Einheiten von menschlichen und anderen Vertebraten-Glykoproteinen, dadurch gekennzeichnet, dass zu einer Probe umfassend eine Kohlehydrat-Einheit oder ein Glykokonjugat bzw. Glykoprote in, UDP-Xylose und β1,2-Xylosyltransferase, die von einem DNA-Mo-lekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert worden ist, zugegeben werden, so dass Xylose in β1,2-Stellung durch die genannte β1,2-Xylosyltransferase an die genannte Kohlehydrat-Einheit oder das Glykokonjugat bzw. das genannte Glykoprotein gebunden wird.