DE60028022T2

DE60028022T2 - Herstellung von biologisch aktiven molekülen

Info

Publication number: DE60028022T2
Application number: DE60028022T
Authority: DE
Inventors: Menachem Rubinstein; Bianling Liu; Daniela Novick; Pierre Graber
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2020-04-14
Also published as: EP1169460A2; EP1169460B1; EE05591B1; IL129427A0; EA006825B1; UA73940C2; WO2000061768A3; US7098002B1; IL145842A0; IL145842A; WO2000061768A2; DK1169460T3; AU3985100A; AU781342B2; HK1044351A1; SI1169460T1; KR100682185B1; NO20014966D0; AR023468A1; BR0009782A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Herstellung biologisch aktiver Cytokine, die ausgewählt sind aus IL-1β und IL-18, welche als inaktive Vorläufer vorkommen und welche in vivo durch Proteasen zu reifen, biologisch aktiven Molekülen gespalten werden.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von Cytokinen, welche in vivo durch Selbstspaltung, durch Spaltung durch andere Caspasen oder durch Spaltung z.B. mit der Protease Caspase-1, die auch als Interleukin-1 Converting Enzym (ICE) bekannt ist, aus deren entsprechenden Vorläufern gespalten werden. Die Cytokine, die auf eine solche Art und Weise hergestellt werden, sind Interleukin-1β und Interleukin-18.
Hintergrund der Erfindung
Caspasen stellen eine Familie von Cysteinproteasen dar, die ihr Zielprotein nach einem Asp-Rest spalten. Von den elf veröffentlichten bekannten Caspasen scheint Caspase-1 und wahrscheinlich die Caspasen-4, -5 und -11 hauptsächlich an der Prozessierung von proinflammatorischen Cytokinen beteiligt zu sein, wohingegen die anderen eine entscheidende Rolle bei der Auslösung und Ausführung von Apoptose oder programmiertem Zelltod spielen. Caspasen teilen verschiedene gemeinsame Merkmale, unter anderem, dass sie als katalytisch inaktive Zymogene synthetisiert werden, die im Allgemeinen durch Spaltung nach spezifischen internen Asp-Resten, die in Linkern zwischen den Domänen vorkommen, und durch die Fähigkeit, ihre Substrate nach Asp-Resten zu spalten, aktiviert werden. Als Ergebnis können bestimmte reife aktive Caspasen, insbesondere diejenigen, die sich aus den Caspasen mit der langen Prodomäne ableiten, ihre eigenen und andere inaktiven Caspasezymogene prozessieren und aktivieren. Auf Grundlage der Primärstruktur können proapoptotische Caspasen in zwei Klassen, Klasse I einschließlich Caspase-2, -8, -9 und -10, die eine lange amino-terminale Prodomäne enthalten, und Klasse II, wie zum Beispiel Caspase- 3, -6 und -7 mit einer kurzen Prodomäne oder ohne Prodomäne, eingeteilt werden. In vitro Spaltungsexperimente deuten darauf hin, dass Klasse II-Caspasen für deren proteolytische Prozessierung aktivierte Klasse I-Caspasen benötigen.
Eine weitere Einteilung von Caspasen wird anhand der Spezifität der Spaltstelle vorgenommen (13). Hier weisen Gruppe I-Caspasen die Konsensussequenz WEHD (Caspasen-1, -4 und -5), Gruppe II-Caspasen die Konsensussequenz DExD (Caspasen-2, -3 und -7) und Gruppe III-Caspasen die Konsensussequenz (IVL)ExD (Caspasen-6, -8 und -9) auf. Die optimale Caspase-8-Stelle ist LETD (14).
Interleukin 18 (IL-18), ursprünglich als ein Interferon-γ- (IFN-γ) induzierender Faktor beschrieben, ist ein kürzlich charakterisiertes Cytokin, das strukturelle Eigenschaften mit der IL-1-Proteinfamilie teilt (1–4). IL-18 wurde zunächst gereinigt und anschließend aus der Leber von Mäusen, die mit Hitze-inaktiviertem Propionbakterium acnes (P. acnes) und anschließend durch Lipopolysaccharid (LPS) behandelt wurden, kloniert wurde (2, 5). Das Klonieren von humanem IL-18 ist auch kürzlich beschrieben worden (3).
Ebenso wie IL-12 wird IL-18 durch aktivierte Makrophagen, wie zum Beispiel Leberkupfferzellen und anderen residenten Makrophagen hergestellt (3). IL-18 ist ein früher Auslöser der Th1-Antwort, welche die Costimulation der Herstellung von IFN-γ sowie TNF-γ, des Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors und IL-2 darstellt (6). Darüber hinaus verstärkt es die anti-CD3-induzierte T-Zellproliferation und erhöht die Cytotoxizität gegenüber natürlichen Killerzellen durch Steigern der Expression des Fas-Liganden (6, 7).
Im Gegensatz zu den meisten anderen Cytokinen, welche eine so genannte Four-Helix-Bundle-Struktur aufweisen, haben IL-18 und IL-1β eine vollständige β-Faltblattstruktur (7). Ähnlich wie IL-1β wird IL-18 als biologisch inaktiver Vorläufer (proIL-18), der kein Signalpeptid aufweist, synthetisiert (3). Die IL-1β- und IL-18-Vorläufer werden durch Caspase 1 (IL-1β-Converting-Enzym oder ICE) gespalten, das nach einem Asparaginsäurerest in der P1-Position spaltet. Die sich ergebenden reifen Cytokine werden unmittelbar aus der Zelle freigesetzt (8, 9). Untersuchungen mit Caspase-1-defizienten Mäusen bewiesen die wesentliche Rolle von reifem IL-18 als Auslöser von IFN-β- und Th1-Reaktionen. Die Injektion solcher Mäuse mit P. acnes und LPS führte im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen zu niedrigen Spiegeln an zirkulierendem IFN-γ (8, 9). Die Injektion von IL-18 stellte den LPS-induzierten IFN-γ-Spiegel in den Caspase-1-defizienten Mäusen wieder her (9), was weiter die Hypothese unterstützt, dass Caspase-1 an der Herstellung von aktivem IL-18 beteiligt ist. Andere Caspasen und insbesondere diejenigen, die intrazelluläre Proteine spalten, die mit Apoptose in Zusammenhang stehen, waren mindestens 100 Mal weniger aktiv als Caspase-1 (9). Ähnliche Untersuchungen mit IL-18-defizienten Mäusen machten seine Rolle bei der NK-Zellaktivität und bei der Cytokininduktion deutlich (10).
Rekombinantes, in E. coli exprimiertes IL-1β und IL-18 der Maus kann zur Herstellung eines vollständig aktiven Cytokins neu gefaltet werden. Versuche zur Expression der reifen Form von humanem IL-18 in E. coli und anderen Wirten stellte kein vollständig aktives Cytokin bereit. Aufgrund seiner möglichen therapeutischen Verwendungen, z.B. in Malignomen oder in einem beliebigen Zustand, bei welchem die Induktion der Interferon-γ-Herstellung gewünscht ist, ist es wünschenswert, ein effizientes Expressionssystem für die Herstellung von reifem biologisch aktiven humanem IL-18 bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung von Molekülen, welche in ihrem natürlichen Bildungsprozess in einer biologisch inaktiven Vorläuferform hergestellt werden, und die nach Spaltung ihres Vorläufers aktiv werden. Dies kann in vitro nicht leicht erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Cytokins aus seinem biologisch inaktiven Vorläufer durch Mutation seiner natürlichen Spaltstelle zu einer Stelle, die empfindlich gegenüber Spaltung durch eine übliche Protease empfindlich ist, und durch Spalten des Moleküls, um ein biologisch aktives Molekül zu ergeben, bereit, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus IL-1β und IL-18.
In solchen Cytokinen stellt die natürliche Spaltstelle eine Caspase-1-Spaltstelle dar.
Die übliche, zur Spaltung verwendete Protease kann ausgewählt sein aus Thrombin, Enterokinase, Subtilisin, Genenase^TM (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), der humanen Rhinovirus-3C-Protease und Faktor-Xa-Protease. Wenn eine Caspase zur Spaltung eingesetzt wird, ist Caspase-8 bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren das Transfizieren eines Wirtes mit einem Vektor, der eine cDNA umfasst, die für einen Vorläufer eines biologisch aktiven Cytokins kodiert, ausgewählt aus IL-1β und IL-18, das an seiner Spaltstelle mutiert ist, wobei die natürliche Spaltstelle des biologisch aktiven Vorläufers eine Caspase-1-Spaltstelle darstellt, Kultivieren des transfizierten Wirtes, Exprimieren des Vorläufers und Isolieren des biologisch aktiven Cytokins nach Behandlung mit einer Protease.
Gegebenenfalls kann dies dadurch erreicht werden, dass die cDNA im Leserahmen nach einer Glutathion-S-Transferase (GST) kodierenden Sequenz fusioniert ist und dass das exprimierte Fusionsmolekül vor der Behandlung mit der Protease an Glutathion-Agarose-Beads gebunden wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine cDNA bereit, die für einen mutierten Vorläufer eines biologisch aktiven Cytokins kodiert, welches ausgewählt ist aus IL-1β und IL-18, wobei die cDNA mit einer GST-kodierenden Sequenz fusioniert ist, wobei die natürliche Caspase-1-Spaltstelle des biologisch inaktiven Vorläufers zu einer Protease-Spaltstelle mutiert worden ist.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung und/oder Reinigung eines rekombinanten Hybridpolypeptids oder Fusionsproteins bereitgestellt. Insbesondere wird ein DNA-Fragment, das für ein Proteinmolekül kodiert, mit einem DNA-Fragment, das für ein Bindeprotein kodiert, fusioniert, wobei die DNA als Linker-Sequenz verwendet wird, welche für eine Peptidsequenz kodiert, die durch eine Caspase erkannt und geschnitten wird. Die fusionierte DNA wird in einen Klonierungsvektor eingebracht, welcher zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet wird. Bei der Expression wird das Hybridpolypeptid durch Inkontaktbringen mit einem Liganden oder einem Substrat, zu welchem das Bindeprotein eine spezifische Affinität aufweist, gereinigt, z.B. durch Affinitätschromatografie.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Bindeprotein GST und die Spaltstelle ist die Caspase-8-Spaltstelle.
Die Erfindung betrifft auch biologisch aktives Cytokin, das ausgewählt ist aus IL-1β und IL-18, welche mit dem obigen Verfahren hergestellt werden.
Die Expression von reifem IL-18 in E. coli führt zu einem Protein, das keine biologische Aktivität aufweist. Versuche zur korrekten neuen Faltung des IL-18-Polypeptidrückgrats von IL-18, welches in E. coli exprimiert wurde, waren bisher erfolglos. Humanes IL-18 und humanes IL-1β werden in vivo als proIL-18- und proIL-1β-Vorläufer exprimiert, welche durch Caspase-1 gespalten werden, um jeweils biologisch aktives reifes IL-18 und IL-1β zu ergeben. Caspase-1 ist jedoch kommerziell nicht erhältlich. Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Moleküls, bevorzugt eines Cytokins und stärker bevorzugt von humanem IL-18 in E. coli dar. Zu diesem Zweck wurde eine für humanes proIL-18 kodierende cDNA konstruiert, in welcher die Caspase-1-Spaltstelle zu der Spaltstelle einer kommerziell erhältlichen Protease, z.B. Faktor Xa, mutiert wurde. Zur leichteren Manipulation wurde die mutierte proIL-18 cDNA mit einer für Glutathion-S-Transferase (GST) kodierenden Sequenz fusioniert. Das sich ergebende GST-proIL-18-Fusionsprotein mit einer Faktor Xa-Spaltstelle wurde in E. coli exprimiert und an Glutathion-Agarose-Beads gebunden. Reifes humanes IL-18, welches eine hohe biologische Aktivität aufweist, wurde von den Beads durch Spaltung mit Faktor Xa freigesetzt.
Auf ähnliche Art und Weise wurde die für die Caspase-1-Spaltstelle von humanem IL-1β kodierende DNA-Sequenz zu einer Faktor Xa-Spaltstelle mutiert. Zur leichteren Manipulation wurde die mutierte proIL-1β-cDNA im Leserahmen mit einer für eine Glutathion-S-Transferase (GST) kodierenden Sequenz fusioniert. Das sich ergebende GST-proIL-1β-Fusionsprotein, welches eine Faktor Xa-Spaltstelle aufweist, wird in E. coli exprimiert und an Glutathion-Agarose-Beads gebunden. Reifes humanes IL-1β wird von den Beads durch Spaltung mit Faktor Xa freigesetzt.
Wenn die Caspase-8 zur Spaltung eingesetzt wird, wird eine ähnliche Methode ausgeführt, wobei der Unterschied darin besteht, dass die Caspase-1-Spaltstelle von humanem IL-18 oder von humanem IL-1β zu einer Spaltstelle von Caspase-8 mutiert wird. Anschließend wird eine Fusion mit einer für GST kodierenden Sequenz und weitere Verfahrensschritte wie oben beschrieben ausgeführt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 beschreibt das Klonieren von cDNA, die für eine humane proIL-18-Mutante kodiert (proIL-18_IEGR). Diese cDNA wurde durch drei PCR-Schritte unter Verwendung eines Verfahrens mit überlappenden Primern kloniert. Die Spuren sind: M, DNA-Größenmarker, die auf der linken Seite angegeben sind; 1, eine durch die erste PCR hergestellte 498 bp-DNA; 2, eine durch die zweite PCR hergestellte 551 bp-DNA; 3, eine durch die dritte PCR hergestellte 600 bp-DNA, die für humanes proIL-18_IEGR kodiert.
2 zeigt die Struktur des Expressionsplasmids pGEX-proIL-18_IEGR. (a) Angrenzende Nukleinsäuresequenzen der 600 bp BamH I/EcoR I-cDNA, die für humanes proIL-18_IEGR kodiert. Restriktionsschnittstellen für BamH I und EcoR I und die Zielstelle für Faktor Xa sind durch Klammern angegeben. Eine nicht ausgefüllter Pfeil zeigt die Faktor Xa-Spaltstelle an. (b) Schematische Darstellung von pGEX-2TK. Die Restriktionsschnittstellen sind auch gezeigt. Der ausgefüllte Pfeil zeigt die BamH I/EcoR I-Ligationsstelle des Inserts an.
3 zeigt SDS-PAGE von Rohproteinextrakten von E. coli, die das GST-proIL-18_IEGR-Fusionsprotein exprimieren. Die Spuren sind: 1. Mit dem Ausgangsplasmid pGEX-2TK ohne Induktion transformierte Zellen. 2. Mit dem Ausgangsplasmid pGEX-2TK und mit 0,1 mM Isopropylisogalactosid (IPTG) induzierte Zellen. Die erwartete 26 kD-Bande von Glutathionthioreduktase (GST) ist durch einen Pfeil auf der linken Seite angezeigt. Die Spuren 3–7 zeigen mit dem Plasmid pGEX-proIL-18_IEGR transformierte und entweder nicht induzierte (Spur 3) oder mit IPTG induzierte Zellen für die angegebenen Zeiten. Die auf der rechten Seite durch einen Pfeil angezeigte 43 kD-Bande entspricht in ihrer Größe dem GST-proIL-18_IEGR-Fusionsprotein.
4 zeigt im Anschluss an Reinigung an Glutathion-Agarose SDS-PAGE (10 Acrylamid) des GST-proIL-18_IEGR-Fusionsproteins. Der Überstand der mit Ultraschall behandelten Bakterien (siehe 3, Spur 7) wurde an Glutathion-Agarose affinitätsgereinigt. Die Spuren sind: 1. Molekülmassen-Marker (durch kD auf der linken Seite angezeigt); 2. Affinitätsgereinigtes GST-proIL-18_IEGR. Das Gel wurde mit Coomassieblau gefärbt.
5 zeigt SDS-PAGE (12 % Acrylamid) des gereinigten humanen IL-18. GST-proIL-18_IEGR-Fusionsprotein wurde an Glutathion-Agarose-Beads gebunden und mit Faktor Xa mit einem Protease zu Substrat-Verhältnis von 1:50 (w/w) inkubiert und der Überstand wurde nach 6 h untersucht. Spur 1, Molekulargewichts-Marker, die auf der linken Seite in kD angegeben sind; Spur 2, humanes IL-18 in dem Überstand der Glutathion-Agarose-Beads. Das Gel wurde mit Coomassieblau gefärbt.
6 zeigt einen Bioassay des humanen IL-18. Humanes IL-18 wurde in den angegebenen Mengen zu den Kulturen von nicht an Kunststoff haftenden, murinen Milzzellen (5 × 10⁶ Zellen/Well) in Gegenwart von Concanavalin A (0,125 μg/ml) und Polymyxin B (1 μg/ml) hinzugefügt. Der Überstand wurde mittels ELISA auf murines Interferon-gamma hin untersucht. Die durch IL-18 (100 ng/ml) ohne Con A induzierten Interferon-gamma-Mengen betrugen 160 pg/ml.
7 zeigt die Grundmethode für die Reinigung von hIL-18 unter Verwendung von Caspase-8 in schematischer Form.
8 zeigt die Sequenz von GST-prohIL-18_LETD. Der Kasten zeigt die Caspase-8-Spaltstelle an. Die unterstrichene Sequenz stellt das reife hIL-18 dar.
9 zeigt Coomassieblau gefärbtes SDS-PAGE (10 % Acrylamidgel) von GST-proIL-18_LETD-Fusionsprotein, welches an Glutathion-Agarose gereinigt wurde. Der Überstand des Zellaufschlusses von rekombinantem E. coli JM109, welches GST-proIL-18_LETD exprimiert, wurde an Glutathion-Agarose affinitätsgereinigt und durch Caspase-8 an Festphase verdaut. Der Überstand wurde nach dem Verdau angereichert und einer Molekülgrößenbestimmung an Superdex-75 unterzogen. Die Spuren sind: 1. Molekülmassen-Marker (auf der linken Seite durch kD angegeben); 2.
Überstand des Zellaufschlusses; 3. Affinitätsgereinigtes GST-proIL-18_LETD; 4. Glutathion-Agaroseharz nach Festphasenverdau von 4 h mit Caspase-8; 5. Nach 4 h angereicherter Caspase-8-Verdau; 6. Superdex-75-Pool von reinem hIL-18.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine für humanes proIL-18 kodierende cDNA, bei welcher die Caspase-1-Spaltstelle zu einer Faktor Xa-Spaltstelle mutiert wurde, hergestellt. Andere Mutationen, die für andere Proteasen geeignete Spaltstellen erzeugen, können verwendet werden.
Beispiele möglicher Spaltstellen und geeigneter Proteasen umfassen:
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 1), eine Sequenz, die durch die Protease Thrombin zwischen den Aminosäuren Arg und Gly gespalten wird.
Ile-Glu-Gly-Arg- (SEQ ID NO: 2), eine Sequenz, die durch die Protease Faktor Xa nach dem Arg-Rest gespalten wird.
Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NO: 3), eine Sequenz, die durch die Protease Enterokinase nach dem Lys-Rest gespalten wird.
His-Tyr- (SEQ ID NO: 4), eine Sequenz, die durch die Protease Subtilisin oder durch dessen Variante Genenase^TM (New England Biolabs) nach dem Tyr-Rest gespalten wird.
Tyr-His (SEQ ID NO: 5), eine Sequenz, die durch die Protease Subtilisin oder durch dessen Variante Genenase^TM (New England Biolabs) nach dem Tyr-Rest gespalten wird.
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 6), eine Sequenz, die durch die humane Rhinovirus 3C-Protease nach dem Gln-Rest gespalten wird.
Auf ähnliche Art und Weise wird eine für humanes proIL-1β kodierende cDNA, in welcher die Caspase-1-Spaltstelle zu einer Faktor Xa-Spaltstelle mutiert wird, hergestellt. Andere Mutationen, die für andere Proteasen geeignete Spaltstellen erzeugen, können verwendet werden.
Beispiele möglicher Spaltstellen und geeigneter Proteasen umfassen:
Ile-Glu-Gly-Arg- (SEQ ID NO: 2), eine Sequenz, die durch die Protease Faktor Xa nach dem Arg-Rest gespalten wird.
Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NO: 3), eine Sequenz, die durch die Protease Enterokinase nach dem Lys-Rest gespalten wird.
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 6), eine Sequenz, die durch die humane Rhinovirus 3C-Protease nach dem Gln-Rest gespalten wird.
Die Auswahl der Mutation hängt von den folgenden Parametern ab: die durch die Mutation erzeugte Spaltstelle muss sehr spezifisch sein, um unerwünschte Spaltungen an anderen Stellen innerhalb des Polypeptidrückgrats des proIL-18 oder proIL-1β zu vermeiden; die Protease muss ein hohes Maß an Spezifität für die konstruierte Spaltstelle aufweisen; die Protease muss leicht erhältlich sein, z.B. aus kommerziellen Quellen; und die Mutation sollte bevorzugt keine größere Änderung in die Sekundär- oder Tertiärstruktur des proIL-18 oder proIL-1β einführen. Die Verwendung von Faktor Xa oder Enterokinase oder Subtilisin ist gegenüber den anderen Proteasen bevorzugt, da das sich ergebende IL-18 oder IL-1β keine mutierte Aminosäure aufweist. Die Verwendung von Faktor Xa ist am meisten bevorzugt, da er die meisten konservativen Mutationen erfordert, wodurch das Risiko einer veränderten Sekundär- oder Tertiärstruktur von proIL-18 oder proIL-1β sowie das Risiko, dass keine Spaltung stattfindet, vermindert wird. Die Verwendung von Faktor Xa oder Enterokinase ist gegenüber den anderen Proteasen bevorzugt, da das sich ergebende IL-18 oder IL-1β keine mutierten Aminosäuren aufweist.
Um eine cDNA zu konstruieren, die für eine humane proIL-18-Mutante (proIL-18_IEGR) kodiert, in welcher die Caspase-1-Spaltstelle zu einer Faktor Xa-Spaltstelle mutiert ist, wurden die folgenden Mutationen in die humane proIL-18-cDNA eingeführt: L33I; S35G und D36R. Diese Mutationen ergaben die Faktor Xa-Erkennungssequenz IEGR.
Ein Vektor, der humanes proIL-18_IEGR exprimiert, wurde auf die folgende Art und Weise konstruiert. Periphere einkernige Blutzellen (PBMC) eines gesunden Spenders wurden durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. Gesamt-RNA wurde aus den Zellen extrahiert. Die RNA wurde revers transkribiert und die sich ergebende cDNA diente als Matrize für die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Mutation in der Sequenz wurde in den drei Schritten der PCR unter Verwendung überlappender Primer eingeführt (1). Das sich ergebende 600 bp PCR-Produkt, das für mutiertes humanes proIL-18 kodiert, wurde in einen TA-Klonierungsvektor (pGEM-T easy, Promega) kloniert und dessen DNA-Sequenz wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Das sich ergebende pGEM-T-proIL-18_IEGR-Plasmid wurde durch EcoR I und BamH I geschnitten und das 600 bp-Fragment, das für humanes proIL-18_IEGR kodiert, wurde in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-2TK, der die GST-Gensequenz (Pharmacia) enthält, subkloniert. Der sich ergebende Expressionsvektor enthielt die Sequenz des humanen proIL-18_IEGR-Gens, welches im Leserahmen mit dem 3'-Ende des GST-Gens fusioniert wurde (2)
Anschließend wurde Expression und Reinigung des GST-proIL-18_IEGR durchgeführt. Eine frische einzelne Kolonie von E. coli JM109, die mit dem Plasmid pGEX-proIL-18_IEGR transformiert wurde, wurde unter Schütteln bei 37 °C aufgezogen, bis sie eine Dichte von 0,6 OD₆₀₀ erreichte. Die Proteinexpression wurde anschließend durch Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert und weiter bei 37 °C für 3 h kultiviert. SDS-PAGE des Gesamtbakterienproteins zeigte die Induktion eines 34 kD-Proteins, welches in seiner Größe dem GST-proIL-18_IEGR entsprach (3). Alle nachfolgenden Schritte zur Isolierung des GST-proIL-18_IEGR wurden bei 4 °C ausgeführt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Proteaseinhibitoren enthielt, resuspendiert. Die Bakterien wurden durch Sonikation lysiert, Triton X-100 wurde zu einer Endkonzentration von 1 % hinzugefügt und das geklärte Lysat wurde mit Glutathion-Agarose-Beads (Pharmacia) gemischt. Die Beads wurden gewaschen und eine Teilmenge der Beads wurde durch SDS-PAGE untersucht. Eine einzelne 43 kD-Bande, die dem GST-proIL-18_IEGR-Fusionsprotein entspricht, wurde nachgewiesen (4). Die Beads wurden anschließend mit Faktor Xa verdaut und der Überstand wurde gesammelt. SDS-PAGE des Überstandes ergab eine Hauptbande von etwa 18 kD, die in Übereinstimmung mit der erwarteten Masse des reifen humanen IL-18 steht. Eine zusätzliche schwächere Bande von 19,5 kD wurde auch beobachtet (5). Proteinsequenzanalyse der 18 kD- und der 19,5 kD-Bande ergab in beiden Fällen die erwartete N-terminale Sequenz des reifen humanen IL-18. Eine 43 kD-Bande, die dem GST-proIL-18_IEGR-Fusionsprotein entspricht, war in den Glutathion-Agarose-Beads im Anschluß an den Verdau noch vorhanden, was darauf hindeutet, dass die Spaltung unvollständig war (nicht gezeigt).
Das rekombinante humane IL-18 wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit, die Expression von Interferon-gamma zu induzieren, in murinen Milzzellen untersucht. Die Inkubation von nicht haftenden Milzzellen der Maus mit humanem IL-18 alleine zeigte nur eine geringe IFN-gamma-Herstellung, wodurch das Erfordernis eines Costimulans nahegelegt ist. Con A alleine mit 0,125 μg/ml konnte keine signifikanten IFN-gamma-Mengen induzieren. Bei Inkubation nicht haftender Milzzellen mit Con A und IL-18 der vorliegenden Erfindung wurde eine Mengen-abhängige Induktion von IFN-γ erhalten (6).
Zur Konstruktion einer cDNA, die für eine humane pro-IL-1β-Mutante (proIL-1β_IEGR) kodiert, wobei die Caspase-1-Spaltstelle zu einer Faktor Xa-Spaltstelle mutiert ist, wurden die folgenden Mutationen in die humane proIL-1β-cDNA eingeführt: Y113I, V114E, H115G und D116R. Diese Mutationen ergaben die Faktor Xa-Erkennungssequenz IEGR.
Die folgenden Schritte wurden zur Konstruktion eines Vektors, der humanes proIL-1β_IEGR exprimiert, unternommen. Periphere einkernige Blutzellen (PBMC) eines gesunden Spenders werden durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. Gesamt-RNA wird aus den Zellen extrahiert. Die RNA wird revers transkribiert und die sich ergebende cDNA dient als Matrize für die Polymerasekettenreaktion (PCR), wobei Primer verwendet werden, die der kodierenden Sequenz von humanem proIL-1β entsprechen. Das sich ergebende PCR-Produkt wird in einen TA-Klonierungsvektor, z.B. PGEM-T easy von Promega kloniert und anschließend mit einem geeigneten Oligonukleotid ortsspezifischer Mutagenese unterzogen. Die Sequenz des sich ergebenden Vektors, die für mutiertes humanes proIL-1β kodiert, wird durch Sequenzanalyse bestätigt. Das sich ergebende pGEM-T-proIL-1β_IEGR-Plasmid wird durch passende Restriktionsenzyme geschnitten und das 820 bp-Fragment, das für humanes proIL-1β_IEGR kodiert, wird in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia) subkloniert. Der sich ergebende Expressionsvektor enthält die Sequenz des humanen proIL-1β_IEGR-Gens, das im Leserahmen mit dem 3'-Ende des GST-Gens fusioniert ist.
Auf ähnliche Art und Weise wurde Expression und Reinigung von GST-proIL-1β_IEGR durchgeführt. Eine frische einzelne Kolonie von E. coli JM109, die mit dem Plasmid pGEX-proIL-1β_IEGR transformiert ist, wird unter Schütteln bei 37 °C aufgezogen, bis eine Dichte von 0,6 OD₆₀₀ erreicht wird. Anschließend wird Proteinexpression durch Isopropylthiogalactosid (IPTG) und weiteres Kultivieren bei 37 °C für 3 h durchgeführt. SDS-PAGE von Gesamtbakterienproteinen zeigt die Induktion eines ~52 kD-Proteins, das in seiner Größe dem GST-proIL-1β_IEGR entspricht. Alle nachfolgenden Schritte zur Isolierung des GST-proIL-1β_IEGR werden bei 4 °C ausgeführt. Die Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Proteaseinhibitoren enthält, resuspendiert. Die Bakterien werden durch Sonikation lysiert, Triton X-100 wird auf eine Endkonzentration von 1 % hinzugefügt und das geklärte Lysat wird mit Glutathion-Agarose-Beads (Pharmacia) gemischt. Die Beads werden gewaschen und eine Teilmenge der Beads wird durch SDS-PAGE auf Anwesenheit des ~52 kD GST-proIL-1β-Fusionsproteins untersucht. Die Beads werden anschließend mit Faktor Xa verdaut und der Überstand, der reifes humanes IL-1β enthält, wird gesammelt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Expression und Reinigung eines Polypeptids durch Herstellung eines Fusionsproteins erhalten, welches die Spaltstelle für eine Caspase aufweist. Ein Plasmid, das ein Bindepeptid exprimiert, welches mit einem Protein von Interesse fusioniert ist, kann so mutiert sein, dass eine Caspase-Spaltstelle in eine Position eingeführt wird, die für die Reinigung eines aktiven Polypeptids geeignet ist.
Caspase-Erkennungsspaltstellen bestehen aus 4 Aminosäuren, wobei die letzte Aminosäure Asparaginsäure ist. Im Allgemeinen zeigen Caspasen eine höhere und unterschiedliche Spezifität für die Spaltstellen als herkömmlich verwendete Proteasen, wodurch sie wesentliche Vorteile gegenüber Proteasen bieten, die kürzlich als für das Schneiden von Fusionsproteinen geeignet beschrieben wurden. Die Reinigungsmethode ist in 7 beispielhaft erläutert.
Bevorzugte Spaltstellen sind für jede Caspase in der Literatur beschrieben (Ann Rev. Biochem., 1999, 68:383–424). Sie weisen alle gemeinsam den Rest Asp in der P1-Position auf.
Das oben beschriebene Plasmid pGEX-proIL-1β_IEGR wurde modifiziert, um eine unterschiedliche humane proIL-18-Mutante (proIL-18_LETD, siehe 8) zu erhalten, in welcher die Faktor Xa-Spaltstelle zu einer Caspase-8-Spaltstelle mutiert ist. Dies ermöglicht die Verwendung von Caspase-8 zur Spaltung.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung einer Caspase ist deren hohe Effizienz im Hinblick auf die Ausbeute des Verdaus sowie die Dauer des Verdaus. Man hat herausgefunden, dass bei Vergleich des IL-18-Proteins, welches aus pGEX-proIL-18_IEGR erhalten wurde, mit dem IL-18-Protein, welches aus pGEX-proIL-18_LETD erhalten wurde, die Enzymmenge und die benötige Zeit, um 1 mg hIL-18 zu erhalten, vermindert ist. Die Methode führte zur Herstellung eines Proteins der erwarteten Größe (9) und Bioaktivität.
Caspase-8 ist nicht die einzige geeignete Caspase und entsprechend der An- oder Abwesenheit einer spezifischen Caspase-Spaltstelle in einem Protein von Interesse zur Reinigung oder aus anderen beliebigen Gesichtspunkten können die Mutationen, die der Spaltstelle einer beliebigen anderen Caspase entsprechen, verwendet werden.
Die Caspase kann aus dem Protein von Interesse unter Verwendung von Standardreinigungsverfahren, wie z.B. Gelfiltration oder Ionenaustausch-Chromatographie, entfernt werden.
Schließlich stellt das hier beschriebene Verfahren gereinigte, biologisch aktive humane Proteine IL-18 und IL-1β aus E. coli bereit. Es scheint, dass die korrekte Faltung dieser Cytokine zunächst die Expression als einen Vorläufer und anschließend die Spaltung zu seiner reifen Form erfordert.
Humanes IL-18 unterscheidet sich in dieser Hinsicht von murinem IL-18, welches in Wirtszellen als ein reifes, biologisch aktives Cytokin exprimiert werden kann.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht:
BEISPIEL 1: Konstruktion eines Plasmids, das für humanes prolL-18 mit einer Faktor Xa-Spaltstelle kodiert
PBMC wurde aus peripherem Blut eines gesunden Freiwilligen durch Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia) Dichtegradiententrennung erhalten. Die PBMC wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, welches 2 % FBS enthielt, und mit 2,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI-1640-Medium resuspendiert, mit fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin (RPMI-10) supplementiert. Die Kultur wurde mit LPS (1 μg/ml, 3 h, 37 °C) stimuliert. Gesamt-RNA wurde mit dem TriPure^TM-Isolationsreagenz (Boehringer Mannheim) aus den Zellen extrahiert. Ein μg Gesamt-RNA wurde für die RT-PCR mit dem Titan One Tube RT-PCR-Kit (Boehringer Mannheim) gemäß den Herstellerangaben verwendet.
ProIL-18_IEGR-cDNA wurde durch eine Drei-Schritt-PCR unter Verwendung des Verfahrens mit überlappenden Primern konstruiert. Die verschiedenen Primer wurden auf Grundlage der humanen proIL-18-cDNA (GenBank Accession Nr. D49950, ⁽³⁾) entworfen.
Für die erste PCR war der Vorwärtsprimer:
5'-AACATCGAAGGTCGTTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' (SEQ ID NO: 7) und der Rückwärtsprimer war 5'-CGCGAATTCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGT-3' (SEQ ID NO: 8). In den Rückwärtsprimer wurde eine Eco RI-Schnittstelle eingefügt. Die Matrize war eine revers transkribierte zelluläre Gesamt-RNA, die aus den LPS-stimulierten PBMC isoliert wurde. Die Bedingungen des Thermozyklisierens waren: 10 Zyklen bei 94 °C, 30 sec; 55 °C, 30 sec und 68 °C, 2 min und anschließend 25 Zyklen bei 94 °C, 30 sec; 55 °C, 30 sec und 68 °C, 125 sec/Zyklus. Das sich ergebende 498 bp PCR-Produkt wurde in dem zweiten PCR-Schritt unter Verwendung des überlappenden Vorwärtsprimers:
5'-TGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACATCGAAGGTCGTTACTTTG-3' (SEQ ID NO: 9) und des Rückwärtsprimers des vorherigen Schrittes amplifiziert. Die Bedingungen des Thermozyklisierens waren: 30 Zyklen bei 94 °C, 30 sec; 56 °C, 30 sec und 72 °C, 1 min. Das sich ergebende 551 bp-Produkt wurde in dem dritten Schritt unter Verwendung des überlappenden Vorwärtsprimers:
5'-CGTGGATCCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATTTATTGAC-3' (SEQ ID NO: 10) und des Rückwärtsprimers der vorherigen Schritte amplifiziert. Eine BamH I-Schnittstelle wurde in den Vorwärtsprimer eingefügt. Die Thermozyklisierungsbedingungen waren dieselben wie diejenigen des vorherigen Schrittes. Das sich ergebende 0,6 kb PCR-Produkt (1) wurde durch einen High Pure^TM Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) gereinigt und in den pGEM-T Easy Vektor ligiert, um das Plasmid pGEM-proIL-18_IEGR zu ergeben. Die Ligationsprodukte wurden in JM109 kompetente Zellen (Promega Corporation) transformiert. Es wurden durchweg Standardklonierungsprotokolle verwendet ⁽¹¹⁾.
Das Plasmid pGEM-proIL-18_IEGR wurde aus einer einzelnen Kolonie zur Bestätigung des Vorliegens eines korrekten Inserts mittels Restriktionsenzymverdau und DNA-Sequenzieren untersucht. Das Plasmid wurde mit BamH I und EcoR I verdaut. Die sich ergebende BamH I/EcoR I-DNA, die für humanes proIL-18_IEGR kodiert, wurde durch Elektrophorese in 1,0 % Agarose aufgetrennt und die 0,6 kb-Bande wurde aus dem Gel durch einen QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Deutschland) isoliert. Diese DNA wurde in den pGEX-2TK-Expressionsvektor (Pharmacia) ligiert, welcher mit BamH I und EcoR I linearisiert wurde. Das sich ergebende rekombinante Plasmid pGEX-proIL-18_IEGR (2) wurde in den E. coli JM109-Stamm transformiert und der sich ergebende Vektor wurde durch Restriktionsenzymverdau und Nukleinsäuresequenzieren bestätigt.
Beispiel 2: Expression und Reinigung des GST-proIL-18_IEGR-Fusionsproteins
50 ml einer Nachtkultur aus einer frischen einzelnen Kolonie von E. coli JM109, welche mit dem Plasmid pGEX-proIL-18_IEGR transformiert wurde, wurde in 450 ml LB-Medium, das 100 U/ml Ampicillin enthielt, verdünnt und unter Schütteln bei 37 °C aufgezogen, bis eine Dichte von 0,6 OD₆₀₀ erreicht wurde. Anschließend wurde die Proteinexpression durch Hinzufügen von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM und weiterem Kultivieren bei 37 °C für 3 h induziert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (5000 × g, 5 min, 4 °C) geerntet und unverzüglich in einem 1:100 Ausgangsvolumen von eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 150 mM NaCl, 16 mM Na₂HPO₄, 4 mM NaH₂PO₄, pH 7,3) resuspendiert, welche die Proteaseinhibitoren (Leupeptin 1 μg/ml, Pepstatin A 1 μg/ml, Aprotinin 2 μg/ml, PMSF 0,2 mM und EDTA 5 mM) enthielt. Die Zellen wurden leichte Sonikation (4 × 15 sec Impulse) auf Eis lysiert. Triton X-100 wurde zu einer Endkonzentration von 1 hinzugefügt und das Gemisch wurde für 5 min auf Eis gelassen. Das geklärte Lysat (14000 × g, 15 min, 4 °C) wurde mit einer 50 % Suspension von Glutathion-Agarose-Beads (2 ml, Pharmacia) gemischt und das Gemisch wurde unter leichtem Schütteln bei 4 °C für 3 h inkubiert. Die Beads wurden durch Zentrifugation pelletiert (500 × g, 5 min), zweimal mit dem 10-fachen Volumen Lysepuffer (1 % Triton X-100 inPBS), zweimal mit dem 10-fachen Volumen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, zweimal mit dem 10-fachen Volumen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl und zweimal mit dem 10-fachen Volumen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2,0 mM CaCl₂ (Cleavage Buffer) gewaschen. Alle Schritte wurden bei 4 °C ausgeführt.
Beispiel 3: Spaltung des Fusionsproteins und Reinigung von reifem humanen IL-18
Die Glutathion-Agarose-Beads mit gebundenem GST-proIL-18_IEGR-Fusionsprotein wurden mit Faktor Xa (New England Biolabs) in 1 ml Cleavage Buffer unter Verwendung eines Protease zu Substrat-Verhältnisses von 1:50 (w/w) unter stetigem Mischen auf einem Drehrad inkubiert (6 h, 23 °C). Dieser Schritt setzt das reife humane IL-18 frei. Die Beads wurden durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C pelletiert und 5 Mal mit 2 ml eiskaltem PBS gewaschen. Der Überstand und das gesamte Waschvolumen wurde vereinigt, durch Zentrifugation (14000 × g, 15 min., 4 °C) geklärt und durch Ultrafiltration (Centricon-10, Amicon) angereichert. Teilmengen des Proteins sowie Beads wurden vor und nach dem Verdau mit 0,1 % SDS-12 Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließender Coomassieblau-Färbung aufgetrennt. Eine Hauptbande von etwa 18 kD, die in Übereinstimmung mit der erwarteten Masse von reifem humanen IL-18 stand, wurde in dem Überstand erhalten. Eine kleinere Bande von 19,5 kD wurde auch beobachtet (5). N-terminale Proteinsequenzanalyse der zwei Banden ergab die Sequenz YFGK ...., die in Übereinstimmung derjenigen des reifen humanen IL-18 steht. Das gereinigte Protein wurde durch einen 0,2 μ-Filter sterilisiert und bei –70 °C gelagert.
Beispiel 4: Bioassay von humanem IL-18
Humane IL-18-Aktivität wurde wie beschrieben bestimmt ⁽²⁾. Zusammenfassend wurde die Milz von normalen C3H/HeJ-Mäusen herausgeschnitten, zerkleinert und Gey-Puffer (0,144 M NH₄Cl in 0,017 M Tris-HCl pH 7,2) ausgesetzt, um Erythrocyten aufzubrechen. Die weißen Blutkörperchen wurden zweimal mit RPMI-5 gewaschen und anschließend in RPMI-10 resuspendiert. Für die Herstellung von nicht an Kunststoff haftenden Zellen wurden Zellsuspensionen in 100 mm Kunststoffplatten (Becton Dickinson Ltd., UK) inkubiert (60 min., 37 °C). Nichthaftende Zellen wurden vorsichtig geerntet, zentrifugiert und in RPMI-10 resuspendiert. Lebensfähige Zellen wurden mit dem Tryptanblau-Farbstoff-Ausschlusstest gezählt und die Zellkonzentration wurde auf 5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Die meisten der unspezifischen Esterase-positiven Zellen wurden durch diese Methoden entfernt. Die Suspensionen von nicht an Kunststoff haftenden Zellen (0,15 ml) wurden in 96 Well-Mikrotiterkulturplatten mit ebenem Boden (NUNCLON^TM, Dänemark) positioniert. Verschiedene Konzentrationen von IL-18, Polymyxin (1 μg/ml) und Con A (0,125 μg/ml) wurden zu den Wells in 50 μl RPMI-10 hinzugefügt. Die Platten wurden für 24 oder 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Überstände gesammelt und murine IFN-γ-Titer wurden mittels ELISA bestimmt. Die Inkubation von nichthaftenden Milzzellen der Maus mit humanem IL-18 alleine zeigte nur eine geringe IFN-γ-Herstellung, was das Erfordernis eines Costimulans nahelegt. Con A alleine induzierte bei 0,125 μg/ml keine signifikanten Mengen an IFN-γ. Bei Inkubation der nicht haftenden Milzzellen mit Con A und dem humanen IL-18 der vorliegenden Erfindung wurde eine mengenabhängige Induktion von IFN-γ erhalten (6).
Beispiel 5: Konstruktion eines Plasmids, welches für humanes proIL-1β mit einer Faktor Xa-Spaltstelle kodiert
PBMC werden aus peripherem Blut eines gesunden Freiwilligen durch Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia) Dichtegradiententrennung erhalten. Die PBMC werden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, das 2 % SDS enthält, und bei 2,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI-1640-Medium resuspendiert, welches mit fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin (RPMI-10) supplementiert ist. Die Kultur wird mit LPS (1 μg/ml, 3 h, 37 °C) stimuliert. Die Gesamt-RNA wird mit dem TriPur^eTM-Isolation Reagent (Boehringer Mannheim) aus den Zellen extrahiert. Ein μg Gesamt-RNA wird für die RT-PCR mit dem Titan One Tube RT-PCR-Kit (Boehringer Mannheim) gemäß den Herstellerangaben verwendet.
ProIL-1-β-cDNA wird mit Sense- und Rückwärtsprimern, die auf Grundlage der humanen proIL-1-β-cDNA (GenBank Accession Nr. M15330) entworfen wurden, kloniert. Der Sense-Primer entspricht den Nukleotiden 87–107 der Sequenz M15330, denen eine BamH1-Schnittstelle vorangeht. Der Rückwärtsprimer entspricht den Nukleotiden 896–876 der Sequenz M15330, denen eine Eco RI-Schnittstelle vorangeht. Die Matrize ist eine revers transkribierte zelluläre Gesamt-RNA, die aus dem LPS-stimulierten PBMC isoliert wurde. Die Bedingungen des Thermozyklisierens sind: 10 Zyklen bei 94 °C, 30 sec; 55 °C, 30 sec und 68 °C, 2 min und anschließend 25 Zyklen bei 94 °C, 30 sec; 55 °C, 30 sec und 68 °C, 125 sec/Zyklus. Das sich ergebende 830 bp PCR-Produkt wird durch einen High Pure^TM Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) gereinigt und in den pGEM-T Easy Vektor ligiert, um das Plasmid pGEM-proIL-1β zu ergeben. Das Plasmid wird mit dem Oligonukleotid ACATGGGATAACGAGGCTATTGAAGGCCGGGCACCTGTACCGA (SEQ ID NO. 11), welches den Nukleotiden 405–452 der humanen IL-1β-mRNA entspricht und die Mutationen Y113I, V114E, H115G und D116R aufweist, ortsspezifischer Mutagenese unterzogen.
Das sich ergebende Plasmid pGEM-proIL-1β_IEGR wird aus einer einzelnen Kolonie zur Bestätigung des Vorliegens eines korrekten Inserts mittels Restriktionsenzymverdau und DNA-Sequenzieren untersucht. Das Plasmid wird mit BamH I und EcoR I verdaut. Die sich ergebende BamH I/EcoR I-DNA, die für humanes proIL-1β_IEGR kodiert, wird durch Elektrophorese in 1,0 % Agarose aufgetrennt und die 0,82 kb-Bande wird aus dem Gel durch einen QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Deutschland) isoliert. Diese DNA wird in den pGEX-2TK-Expressionsvektor (Pharmacia) ligiert, welcher mit BamH I und EcoR I linearisiert wurde. Das sich ergebende rekombinante Plasmid pGEX-proIL-1β_IEGR wird in den E. coli JM109-Stamm transformiert und der sich ergebende Vektor wird durch Restriktionsenzymverdau und Nukleinsäuresequenzieren bestätigt.
Beispiel 6: Expression und Reinigung des GST-proIL-1β_IEGR-Fusionsproteins
Eine 50 ml Nachtkultur aus einer frischen einzelnen Kolonie von E. coli JM109, die mit dem Plasmid pGEX-proIL-1β_IEGR transformiert wurde, wird in 450 ml LB-Medium, das 100 U/ml Ampicillin enthält, verdünnt und unter Schütteln bei 37 °C aufgezogen, bis eine Dichte von 0,6 OD₆₀₀ erhalten wird. Anschließend wird die Proteinexpression durch Hinzufügen von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM und durch weiteres Kultivieren bei 37 °C für 3 h induziert. Die Bakterien werden durch Zentrifugation (5000 × g, 5 min, 4 °C) geerntet und unverzüglich in einem 1:100 Ausgangsvolumen an eisgekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 150 mM NaCl, 16 mM Na₂HPO₄, 4 mM NaH₂PO₄, pH 7,3) resuspendiert, welche die Proteaseinhibitoren (Leupeptin 1 μg/ml, Pepstatin A 1 μg/ml, Aprotinin 2 μg/ml, PMSF 0,2 mM und EDTA 5 mM) enthält. Die Zellen werden durch leichte Sonikation (4 × 15 sec Impulse) auf Eis lysiert. Triton X-100 wird bis zu einer Endkonzentration von 1 % hinzugefügt und das Gemisch wird für 5 min auf Eis gelassen. Das geklärte Lysat (14000 × g, 15 min, 4 °C) wird mit einer 50 % Suspension von Glutathion-Agarose-Beads (2 ml, Pharmacia) gemischt und das Gemisch wird unter leichtem Schütteln bei 4 °C für 3 h inkubiert. Die Beads werden durch Zentrifugation pelletiert (500 × g, 5 min), zweimal mit dem 10-fachen Volumen Lysepuffer (1 % Triton X-100 in PBS), zweimal mit dem 10-fachen Volumen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, zweimal mit dem 10-fachen Volumen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl und zweimal mit dem 10-fachen Volumen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2,0 mM CaCl₂ (Cleavage Buffer) gewaschen. Alle Schritte werden bei 4 °C ausgeführt.
Beispiel 7: Spaltung des Fusionsproteins und Reinigung von reifem humanen IL-1β
Die Glutathion-Agarose-Beads mit gebundenem GST-proIL-1β_IEGR-Fusionsprotein werden mit Faktor Xa (New England Biolabs) in 1 ml Cleavage Buffer unter Verwendung eines Protease zu Substrat-Verhältnisses von 1:50 (w/w) unter stetigem Mischen auf einem Drehrad inkubiert (6 h, 23 °C). Dieser Schritt setzt das reife humane IL-1β frei. Die Beads werden durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C pelletiert und 5 Mal mit 2 ml eiskalter PBS gewaschen. Der Überstand und die gesamten Waschungen werden vereinigt, durch Zentrifugation (14000 × g, 15 min., 4 °C) geklärt und durch Ultrafiltration (Centricon-10, Amicon) angereichert. Eine Teilmenge des Proteins sowie Beads werden vor und nach dem Verdau durch 0,1 % SDS-12 Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließender Coomassieblau-Färbung aufgetrennt. Eine Hauptbande von etwa 17 kD, die in Übereinstimmung mit der erwarteten Masse des reifen humanen IL-1β steht, wird in dem Überstand erhalten. Das gereinigte Protein wurde durch einen 0,2 μ-Filter sterilisiert und bei –70 °C gelagert.
Beispiel 8: Konstruktion eines Plasmids, das für humanes proIL-18 mit einer Caspase-8-Spaltstelle kodiert
Das rekombinante Plasmid pGEX-proIL-18_IEGR von Beispiel 1 wurde durch Insertieren eines PCR-amplifizierten DNA-Fragments, welches die Caspase-8-Spaltstelle (LETD) aufweist, modifiziert. Zusammenfassend wurde pGEX-proIL-18_IEGR mit den Restriktionsenzymen BAM H1 an Pos 951 und Hind III an Pos 1074 verdaut, wobei der DNA-Abschnitt, der die Pro-Domäne, die Faktor Xa-Spaltstelle (IEGR) und die drei Aminosäuren aus dem N-Terminus von hIL-18 enthält, herausgeschnitten wurde.
Dasselbe Plasmid wurde durch Einführen der mutierten Spaltstelle LETD auf dem stromabwärts gelegenen Primer als Matrize für die PCR-Amplifikation verwendet: atgcAAG CTT GCC AAA GTA GTC GGT TTC CAG GTT TTC ATC ATC TTC AGC TAT AA (SEQ ID NO: 12). Das PCR-Fragment wurde unter Verwendung des „High Pure Product Purification" Kit (Boehringer Mannheim) gereinigt, anschließend in ähnlicher Weise mit BAM HI und Hind III unter Erzeugung eines 123 bp-Inserts geschnitten. Der offene Vektor und das Insert wurden auf Agarosegel aufgetrennt und unter Verwendung des kommerziellen Kits „Jet Sorb" (Genomed) extrahiert. Ligation wurde unter Verwendung einer T4-Ligase (New England BioLabs, Beverly MA, USA) über Nacht durchgeführt und die Ligationsprodukte wurden in E. coli DH5α-kompetente Zellen transformiert. Verschiedene Kolonien wurden isoliert, subkultiviert und mit dem Miniprep „Qiagen"-Kit zubereitet. Die PCR-Amplifikation (Perkin Elmer Gene Amp-AmpliTaq DNA-Polymerase) wurde bei allen Minipreps durchgeführt, um den wesentlichen Abschnitt des rekombinanten Plasmids zu sequenzieren. Die abschließende Transformation wurde in den kompetenten Bakterien E. coli JM109 im Anschluss an das TSS-Verfahren (Chung, C.T. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172–2175) durchgeführt.
Beispiel 9: Expression und Reinigung von GST-proIL-18_LETD-Fusionsprotein
Unter Verwendung des Plasmids, das gemäß Beispiel 8 oben konstruiert wurde, wurde GST-Pro_LETD-hIL18-Proteinexpression in Schüttelkolben und 5 Liter Fermentatoren, wie im Wesentlichen in Beispiel 2 oben beschrieben, erreicht.
Beispiel 10: Spaltung des Fusionsproteins unter Verwendung von Caspase-8 und Reinigung von reifem humanen IL-18
Die Glutathion-Agarose-Beads mit gebundenem GST-proIL-18_LETD-Fusionsprotein wurden mit Caspase-8 (Calbiochem) in Cleavage Buffer (in Beispiel 6 definiert) unter Verwendung eines Protease:Substrat-Verhältnisses von 1:1200 (w/w) unter konstantem Mischen auf einem Drehrad oder einer -trommel inkubiert (4 h, 23 °C). Die Beads wurden durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C pelletiert und 5 Mal mit 2 ml eiskaltem PBS gewaschen. Der Überstand und die gesamten Waschvolumina wurden vereinigt, durch Zentrifugation (14000 × g, 15 min., 4 °C) geklärt und durch Zentrifugation (Centricon-10, Amicon) angereichert. Der angereicherte Verdau wurde anschließend Molekülgrößenbestimmung an Superdex-75 (Pharmacia) unterworfen, um das hIL-18 (18 kDa) von Spaltprodukten mit höherem Molekulargewicht und von dem restlichen proteolytischen Enzym (Caspase-8-Heterodimer, 29 kDa und Hetero-Tetramere, 58 kDa) abzutrennen.
Enzymatische Caspase-8-Aktivität wurde in den verschiedenen Superdex-75-Fraktionen unter Verwendung des Caspase-8-Assaykits und des fluorogenen Ac-IETD-AMC-Substrats (BIOMOL) bestimmt und in Fraktionen, die einer Molekülmasse von 55 kD entsprechen (entsprechend dem Caspase-8-Hetero-Tetramer) beobachtet, wodurch gezeigt ist, dass sie sehr gut von den Fraktionen, die hIL-18 (17 kD) enthalten, abgetrennt sind.
Die hochreinen 18 kDa hIL-18-Gelfiltrationsfraktionen wurden zusammengefasst, an Centricon-10 (Amicon) angereichert und schließlich durch einen 0,22 μm Filter sterilisiert und bei –80 °C gelagert.
Teilmengen des Proteins sowie Beads vor und nach dem Verdau wurden durch 0,1 SDS-12 % Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließender Coomassieblau-Färbung aufgetrennt (9). Eine Bande von 18 kD, die in Übereinstimmung mit der erwarteten Masse von reifem humanen IL-18 steht, wurde in der Überstandsfraktion beobachtet. Die Analyse der Beadsfraktion zeigte, dass die Spaltung nicht vollständig ist, da das Vorläuferprotein an den Beads gebunden bleibt. Darüber hinaus verbleibt etwas von dem gespaltenen IL-18-Protein in der Beadsfraktion.
Beispiel 11: Bioassay vom humanem IL-18, welches durch Caspase-8-Spaltung erzeugt wurde
Humane IL-18-Aktivität wurde wie beschrieben bestimmt ⁽¹⁰⁾. Zusammenfassend wurden KG-1-Zellen in DMEM, das 20 % FBS enthielt, gehalten. Für den IL-18-Assay wurden KG-1-Zellen bei 1,2 × 10⁶ Zellen/ml (250 μl/Well, 48 Well-Platte) suspendiert und mit mTNFα (Innogenetics) zusammen mit verschiedenen Konzentrationen an hIL-18 (serielle Verdünnungen, ausgehend von 80 ng/ml) stimuliert. Die Platte wurde 24 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Überstände gesammelt und muriner IFN-γ-Gehalt wurde durch ELISA (rec. HIFN-γ und anti-hIFN-γ von R & D Systems) bestimmt.
Humanes IL-18 induzierte mit einer Aktivität, die mit dem hIL-18, das aus dem Konstrukt mit der Faktor Xa-Spaltstelle erhalten wurde, identisch ist, eine mengenabhängige Herstellung von IFN-γ.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Cytokins aus seinem biologisch inaktiven Vorläufer, umfassend das Mutieren seiner natürlichen Spaltstelle zu einer Stelle, welche durch eine Protease gespalten werden kann, und Spalten des mutierten inaktiven Vorläufers, um ein biologisch aktives Cytokin zu ergeben, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus IL-1β und IL-18, und wobei die natürliche Spaltstelle eine Caspase-1-Spaltstelle darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Protease ausgewählt ist aus Thrombin, Enterokinase, Subtilisin, der humanen Rhinovirus-3C-Protease, Faktor-Xa-Protease und einer Caspase, bevorzugt Caspase-8.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend das Transfizieren eines Wirtes mit einem Vektor, der eine cDNA umfasst, die für. den Vorläufer des biologisch aktiven Cytokins kodiert, welches an seiner Spaltstelle mutiert ist, Kultivieren des transfizierten Wirtes und Isolieren des biologisch aktiven Cytokins nach Behandlung mit einer Protease.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die cDNA im Leserahmen mit einer GST-kodierenden Sequenz fusioniert ist und wobei das exprimierte Fusionsmolekül vor der Behandlung mit der Protease an Glutathion-Agarose-Beads gebunden wird.
cDNA, die für einen mutierten Vorläufer eines biologisch aktiven Cytokins kodiert, welche gegebenenfalls mit einer GST-kodierenden Sequenz fusioniert ist, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus IL-1β und IL-18, und wobei die natürliche Caspase-1-Spaltstelle des biologisch inaktiven Vorläufers zu einer Protease-Spaltstelle mutiert worden ist.