MXPA01010487A - Preparacion de moleculas biologicamente activas. - Google Patents
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Abstract
Se producen moleculas biologicamente activas a partir de sus precursores biologicamente inactivos mediante mutacion de su sitio de desdoblamiento nativo a un sitio el cual es capaz de ser desdoblado por una proteasa, y desdoblamiento de la molecula mutada para producir una molecula biologicamente activa.
Description
PREPARACIÓN DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en general a la producción de moléculas biológicamente activas que ocurren como precursores inactivos, y las cuales son desdobladas (escindidas) in vivo por proteasas en moléculas maduras biológicamente activas. Más específicamente, la invención se refiere a la producción de caspasas y citocinas, las cuales son producidas in vivo a partir de sus precursores correspondientes mediante autodesdoblamiento (autoescisión), desdoblamiento (escisión) por otras caspasas o mediante desdoblamiento, como por ejemplo, con la proteasa caspasa-1 , conocida también como enzima de conversión de interleucina-1 (ICE). Ejemplos de citocinas producidas de dicha manera son la interleucina-1 ß y la interleucina-18.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las caspasas son una familia de cisteína proteasas que desdoblan (escinden) su proteína objetivo después de un residuo de Asp. De las 11 caspasas conocidas publicadas, la caspasa-1 , y probablemente las caspasas -4, -5 y -11 , parecen intervenir principalmente en el procesamiento de citocinas proinflamatorias, mientras que otras desempeñan funciones
Í-»'fr#f - r,-.l, I — ..-..-.^. AA.i.-.- cruciales en el inicio y la ejecución de apoptosis o muerte celular programada. Las caspasas comparten varias características comunes entre ellas, es decir, son sintetizadas como cimógenos catalíticamente inactivos que son activados generalmente mediante desdoblamiento después de residuos de Asp internos específicos presentes en enlazadores interdominio, y la capacidad para desdoblar (escindir) sus substratos después de los residuos de Asp. Como resultado, ciertas caspasas activas maduras, en particular aquellas que se derivan de las caspasas de prodominio largo, pueden procesar y activar sus propios cimógenos y otros cimógenos de caspasa inactivos. Con base en su estructura primaria, las caspasas proapoptóticas se pueden dividir en dos clases, la clase I que incluye las caspasas -2, -8, -9 y -10 que contienen un prodominio largo amino-terminal, y la clase II que incluye las caspasas -3, -6 y -7 con un prodominio corto o ausente. Los experimentos de desdoblamiento in vitro sugieren que las caspasas de clase II requieren caspasas activadas de clase I para su procesamiento proteolítico (12). Otra clasificación de las caspasas es mediante el carácter específico del sitio de desdoblamiento (13). Aquí, las caspasas del grupo I tienen la secuencia concenso WEHD (caspasas -1 , -4 y -5), las caspasas del grupo II la secuencia concenso DexD (caspasas -2, -3 y -7), y las caspasas del grupo lll la secuencia concenso (ILV)ExD (caspasas -6, -8 y -9). El sitio óptimo de la caspasa-8 es LETD (14). La ¡nterleucina 18 (I L-18), descrita inicialmente como factor inductor de interferón-? (IFN-?), es una citocina recientemente caracterizada
?..i~**?*?*tr i? , ., I . ..-_ , , . . m** ítrr-" fff que comparte características estructurales con la familia de proteínas de I L-1 (1-4). La IL-18 fue purificada inicialmente y clonada subsecuentemente del hígado de ratones tratados con Propionbacterium acnés (P. acnés) inactivado con calor, seguido de lipopolisacárido (LPS) (2,5). La clonación de IL-18 de humano se ha descrito también recientemente (3). Al igual que la IL-12, la IL-18 es producida por macrófagos activados, tales como las células de Kupffer del hígado y otros macrófagos residentes (3). La IL-18 es un inductor temprano de la respuesta de Th1 , coestimulando la producción de IFN-?, así como también del FNT-?, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos e IL-2 (6). Además, potencia la proliferación de células T inducida por anti-CD3 y aumenta la citotoxicidad natural de células asesinas aumentando la expresión del ligando Fas (6,7). A diferencia de la mayoría de las otras citocinas, las cuales exhiben una estructura de haz de cuatro hélices, la IL-18 y la IL-1 ß tienen una estructura de lámina ß plegada (7). En forma similar a la IL-1 ß, la IL-18 es sintetizada como un precursor biológicamente inactivo (pro IL-18), que carece de un péptido señal (3). Los precursores de IL-1 ß e IL-18 son desdoblados por la caspasa-1 (enzima de conversión de IL-1 ß, o ICE), que realiza su función de desdoblamiento después de un residuo de ácido aspártico en la posición P1. Las citocinas maduras resultantes son liberadas fácilmente de la célula (8,9). Estudios con ratones deficientes en caspasa-1 , demostraron la función importante de la IL-18 madura como un inductor de IFN-? y de
- -_^_ 1 ^^^^^^^^^ respuestas de Th1. La inyección de dichos ratones con P. acnés y LPS, dio como resultado bajos niveles de IFN-? circulante, comparativamente con ratones de tipo silvestre (8,9). La inyección de IL-18 restauró el nivel de IFN-? inducido por LPS en ratones deficientes en caspasa-1 (9), apoyando además el concepto de que la caspasa-1 interviene en la producción de IL-18 activa.
Otras caspasas y particularmente aquellas que desdoblan proteínas intracelulares asociadas con apoptosis, fueron por lo menos 100 veces menos activas que la caspasa -1 (9). Estudios similares con ratones deficientes en
IL-18, revelaron su función en la actividad de células NK y en la inducción de citocinas (10). La IL-1 ß recombinante y la IL-18 de ratón expresadas en E. coli, pueden ser replegadas para producir una citocina totalmente activa. Los intentos por expresar la forma madura de IL-18 de humano en E. coli u otros hospederos, no proveyeron una citocina totalmente activa. Debido a sus usos terapéuticos potenciales, por ejemplo, en malignidades, o en cualquier condición en la cual se desee inducir de producción de interferón-?, se desea establecer un sistema de expresión eficiente para la producción de IL-18 madura de humano biológicamente activa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención permite la producción de moléculas que, en su proceso de formación natural, se producen en una forma precursora biológicamente inactiva y que se vuelven activas después del desdoblamiento de su precursor. Esto no se puede lograr fácilmente in vitro. La presente invención provee de esta manera un método para la producción de una molécula biológicamente activa a partir de su precursor • 5 biológicamente inactivo mediante mutación de su sitio de desdoblamiento natural a un sitio susceptible de sufrir desdoblamiento por una proteasa común, y desdoblando (escindiendo) la molécula mutada para producir una molécula biológicamente activa. De preferencia, la molécula biológicamente activa es una 10 caspasa o un citocina, más preferiblemente seleccionada de ¡L-1 ß e IL-18. • En dichas citocinas, el sitio de desdoblamiento natural preferido es un sitio de desdoblamiento por la caspasa-1. La proteasa común que se utiliza para el desdoblamiento se puede seleccionar de trombina, enterocinasa, subtilisina, genenase™ (New 15 England Biolabs. Beverly MA, USA), la proteasa 3C de rinovirus de humano y la proteasa factor Xa. Cuando se utiliza una caspasa para el desdoblamiento, se prefiere la caspasa-8. • En una modalidad preferida de la presente invención, el método comprende transfectar un hospedero con un vector que comprende un ADNc 20 que codifica para un precursor de una molécula biológicamente activa mutada en su sitio de desdoblamiento, cultivar el hospedero transfectado, expresar el precursor y aislar la molécula biológicamente activa después de tratamiento con una proteasa.
,.......,„í t -íf--'it.-'-l , - '*,. n ? ' - ni . . . .. .. . -. . - .- - -«-..- -^ Opcionalmente, esto se puede lograr porque el ADNc es fusionado en el marco más allá de una secuencia de codificación de glutatión-S-transferasa (GTS), y la molécula de fusión expresada es capturada sobre perlas de glutatión-agarosa previo al tratamiento con la proteasa. La presente invención provee también un ADNc que codifica para un precursor mutado de una molécula biológicamente activa, fusionado opcionalmente con una secuencia de codificación de GST. En una modalidad de la presente invención, se provee un procedimiento para producir y/o purificar un polipéptido híbrido recombinante o proteína de fusión. Más específicamente, un fragmento de ADN que codifica para una molécula de proteína, es fusionado a un fragmento de ADN que codifica para una proteína de unión usando, como secuencia de enlazamiento, el ADN que codifica para una secuencia peptídica que es reconocida y cortada por una caspasa. El ADN fusionado es insertado en un vector de clonación el cual se usa para transformar un hospedero apropiado. Después de la expresión, el polipéptido híbrido es purificado poniéndolo en contacto con un ligando o substrato con el cual la proteína de unión tiene afinidad específica, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. En una modalidad preferida de la presente invención, la proteína de unión es GST, y el sitio de desdoblamiento es el sitio de desdoblamiento por la caspasa-8. La presente invención se refiere también a moléculas biológicamente activas preparadas con el método anterior.
La expresión de IL-18 madura en E. coli, produce una proteína que carece de actividad biológica. Los intentos por replegar correctamente la estructura de base del polipéptido de IL-18 expresado en E. coli, fueron hasta ahora infructuosos. La IL-18 de humano y la IL-1ß de humano se expresan in vivo como los precursores prolL-18 y prolL-1 ß, los cuales son desdoblados por la caspasa-1 para producir, respectivamente, IL-18 e IL-1 ß maduras biológicamente activas. Sin embargo, la caspasa-1 no está disponible comercialmente. La presente invención provee un procedimiento simple para la producción, en E. coli, de una molécula biológicamente activa, en particular, una citocina, y más en particular la IL-18 de humano. Para este propósito, se construyó un ADNc que codifica para prolL-18 de humano en la cual el sitio de desdoblamiento por la caspasa-1 fue mutado en el sitio de desdoblamiento de una proteasa disponible comercialmente, por ejemplo, el factor Xa. Para facilitar la manipulación, el ADNc de la prolL-18 mutada fue fusionado a una secuencia de codificación de glutatión-S-transferasa (GST). La proteína de fusión GST-prolL-18 resultante, que tiene un sitio de desdoblamiento por el factor Xa, fue expresada E. coli y capturada sobre perlas de glutatión-agarosa.
La IL-18 madura de humano, que exhibe alta actividad biológica, fue liberada de las perlas mediante desdoblamiento con el factor Xa. En forma similar, la secuencia de ADN que codifica para el sitio de desdoblamiento de la IL-1ß de humano por la caspasa-1, es mutada en un sitio de desdoblamiento por el factor Xa. Para facilitar la manipulación, el
ADNc mutado de prolL-1 ß es fusionado en el marco a una secuencia de codificación de glutatión-S-transferasa (GTS). La proteína de fusión GST-prolL-1ß resultante que tiene un sitio de desdoblamiento por el factor Xa, es expresada en E coli y capturada sobre perlas de glutatión-agarosa. La IL-1ß madura de humano es liberada de las perlas mediante desdoblamiento con el factor Xa. Cuando se utiliza la caspasa-8 para realizar el desdoblamiento, se lleva a cabo un procedimiento similar, siendo la diferencia que el sitio de desdoblamiento de la IL-18 de humano o la IL-1 ß de humano por la caspasa-1 , es mutado en un sitio de desdoblamiento por la caspasa-8. Después, la fusión a la secuencia de codificación de GST y otros pasos del método, se llevan a cabo como se describió anteriormente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 describe la clonación de ADNc que codifica para prolL-18 mutante de humano (PGOIL-18IEGR). Este ADNc fue clonado mediante tres pasos de PCR usando un método de iniciador traslapante. Los campos son: M, marcadores de tamaño de ADN, indicados en el lado izquierdo; 1 , un ADN de 498 pares de bases producido mediante la primera PCR; 2, un ADN de 551 pares de bases producido mediante la segunda PCR; 3, un ADN de 600 pares de bases producido mediante la tercera PCR, que codifica para la prolL-18iEGR de humano.
La figura 2 muestra la estructura del plásmido de expresión
pGEX-prolL-18iEGR. (a) Secuencias de ácido nucleico flanqueantes del ADNc de BamH l/EcoR I de 600 pares de bases que codifica para la prolL-18|EGR de humano. Los sitos de restricción para BamH I y EcoR I y el sitio objetivo para
5 el factor Xa, se indican mediante corchetes. Una flecha clara indica el sitio de
desdoblamiento por el factor Xa. (b) Representación esquemática de pGEX- 2TK. Se muestran también los sitios de restricción. La flecha oscura indica el sitio de ligación de BamH l/EcoR I de la inserción. La figura 3 muestra SDS-PAGE de extractos de proteína cruda
10 de E. coli que expresan la proteína de fusión GST-PGOIL-18IEGR. LOS campos
• son: 1 , células transformadas con el plásmido parental pGEX-2TK sin inducción. 2, células transformadas con el plásmido parental pGEX-2TK e inducidas con isopropiltio galactósido (IPTG) a 0.1 mM. La banda esperada de 26 kD de glutatión tiorreductasa (GST) se indica mediante una flecha del 15 lado izquierdo. Los campos 3 a 7 muestran células transformadas con el
plásmido pGEX-prolL-18iEGR y no inducidas (campo 3) o inducidas con IPTG para los tiempos indicados. La banda de 43 kD indicada por una flecha del
• lado derecho, corresponde en tamaño a la proteína de fusión GST-prolL-
18|EGR- 20 La figura 4 muestra SDS-PAGE (acrilamida a 10%) de la
proteína de fusión GST-PGOIL-18IEGR después de purificación sobre glutatión- agarosa. El sobrenadante de bacterias tratadas con sonido (véase la figura 3, campo 7), fue purificado por afinidad sobre glutatión-agarosa. Los campos son: 1 , marcadores de masa molecular (indicados por kD del lado izquierdo); 2, GST-prolL-18iEGR purificada por afinidad. El gel fue teñido con azul de Coomassie. La figura 5 muestra SDS-PAGE (acrilamida a 12%) de la IL-18 purificada de humano. Se muestra la proteína de fusión GST-prolL-18|EGR capturada sobre perlas de glutatión-agarosa, e incubada con el factor Xa, a una relación de proteasa: substrato de 1 :50 (p/p), y el sobrenadante se analizó después de 6 horas. Campo 1 , marcadores de peso molecular, indicados en kD en el lado izquierdo; campo 2, IL-18 de humano en el sobrenadante de las perlas de glutatión-agarosa. El gel fue teñido con azul de Coomassie. La figura 6 muestra un bioensayo de la IL-18 de humano. Se añadió IL-18 de humano, a las dosis indicadas, a los cultivos de células de bazo de murino no adherentes a plástico (5x106 células/cavidad) en presencia de Concanavalina A (0.125 µg/ml) y polimixina B (1 µg/ml). El sobrenadante se puso a prueba para ¡nterferón-gamma de murino mediante ELISA. El nivel de interferón-gamma inducido por IL-18 (100 ng/ml) en ausencia de Con A, fue de 160 pg/ml. La figura 7 muestra en forma esquemática el procedimiento básico para la purificación de hlL-18 usando caspasa-8. La figura 8 muestra la secuencia de GST-pro-hlL-18LETD- El cuadro indica el sitio de desdoblamiento por la caspasa-8. La secuencia subrayada es la hlL-18 madura.
La figura 9 muestra una SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie (gel de acrilamida a 10%) de la purificación de la proteína de fusión GST-prolL-18?.ETD sobre glutatión-agarosa. El sobrenadante libre de células de la cepa JM109 de E. coli recombinante que expresa GST-prolL- 5 18LETD, fue purificado por afinidad sobre glutatión-agarosa, y digerido mediante caspasa-8 sobre fase sólida. El sobrenadante postdigerido se concentró y aplicó para dimensionamiento molecular, sobre Superdex-75. Los campos son: 1 , marcadores de masa molecular (indicados por kD del lado izquierdo); 2, sobrenadante libre de células; 3, GST-PGOIL-18 ETD purificado 10 por afinidad; 4, resina de glutatión-agarosa 4 horas postdigestión por caspasa- • 8, sobre fase sólida; 5, caspasa-8 concentrada 4 horas después de la digestión; y 6, cúmulo de hlL-18 pura sobre Superdex-75.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 15 De conformidad con la presente invención, se preparó un ADNc que codifica para prolL-18 de humano, en el cual el sitio de desdoblamiento • por la caspasa-1 fue mutado en un sitio del factor Xa. Se pueden usar otras mutaciones que generen sitios de desdoblamiento adecuados para otras 20 proteasas. Ejemplos de sitios de desdoblamiento posibles y proteasas adecuadas incluyen:
-----diiHk Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 1), una secuencia desdoblada entre los aminoácidos Arg y Gly por la proteasa trombina. Ile-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 2), una secuencia desdoblada después del residuo de Arg por la proteasa factor Xa. • 5 Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 3), una secuencia desdoblada después del residuo de Lys por la proteasa enterocinasa. His-Tyr (SEQ ID NO: 4), una secuencia desdoblada después del residuo de Tyr por la proteasa subtilisina o por su variante Genenase™ (New England Biolabs). 10 Tyr-His (SEQ ID NO: 5), una secuencia desdoblada después del
• residuo de Tyr por la proteasa subtilisina o por su variante Genenase™ (New England Biolabs). Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GIn-Gly-Pro (SEQ ID NO: 6), una secuencia desdoblada después del residuo de Gln por la proteasa 3C de 15 rinovirus de humano. En forma similar, se prepara un ADNc que codifica para prolL-1 ß de humano, en la cual el sitio de desdoblamiento por la caspasa-1 es mutado en un sitio del factor Xa. Se pueden usar otras mutaciones que generen sitios de desdoblamiento adecuados para otras proteasas. 20 Ejemplos de sitios de desdoblamiento posibles y proteasas adecuadas incluyen: lle-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 2), una secuencia desdoblada después del residuo de Arg por la proteasa factor Xa.
^g g?i^^^ l ^*^,,--*^^!^^ Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 3), una secuencia desdoblada después del residuo de Lys por la proteasa enterocinasa. Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GIn-Gly-Pro (SEQ ID NO: 6), una secuencia desdoblada después del residuo de Gln por la proteasa 3C de
• 5 rinovirus de humano. La elección de la mutación depende de los siguientes parámetros: el sitio de desdoblamiento generado por la mutación debe ser muy específico para evitar desdoblamientos no deseables en otros sitios dentro de la estructura de base del polipéptido de la prolL-18 o prolL-1ß; la 10 proteasa debe exhibir alto nivel de carácter específico por el sitio de
• desdoblamiento diseñado; la proteasa debe estar convenientemente disponible, por ejemplo, de fuentes comerciales; y de preferencia la mutación no debe introducir una alteración importante en la estructura secundaria o terciaria de la prolL-18 o prolL-1 ß. Se prefiere el uso del factor Xa o de la 15 enterocinasa o de la subtilisina sobre las otras proteasas, debido a que la IL- 18 o la IL-1 ß resultantes carecen de aminoácidos mutados. El uso del factor Xa es más favorable debido a que requiere las mutaciones más conservativas, reduciendo de esta manera el riesgo de estructura secundaria o terciaria alterada en la prolL-18 o prolL-1 ß, y el riesgo de que el desdoblamiento no 20 ocurra. Se prefiere el uso del factor Xa o de la enterocinasa sobre las otras proteasas, debido a que la IL-18 o la IL-1ß resultantes carecen de aminoácidos mutados.
». .-,. ..-..-a-fc--- -fc. to>- Para construir un ADNc que codifique para una prolL-18 mutante de humano (PGOIL-18IEGR) en la cual el sitio de desdoblamiento por la caspasa- 1 es mutado en un sitio de desdoblamiento por el factor Xa, se introdujeron las siguientes mutaciones en el ADNc de prolL-18 de humano: L33I; S35G y 5 D36R. Estas mutaciones produjeron la secuencia de reconocimiento IEGR del factor Xa. Se construyó de la siguiente manera un vector que expresa prolL-18iEGR de humano. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donador sano, fueron estimuladas por lipopolisacárido bacteriano (LPS).
10 Se extrajo ARN total de las células. El ARN fue transcrito en forma inversa, y
• el ADN resultante sirvió de molde para la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se introdujo la mutación en la secuencia usando iniciadores traslapantes en tres pasos de PCR (figura 1 ). El producto de PCR resultante de 600 pares de bases, que codifica para la prolL-18 mutada de humano, fue
15 clonado en un vector de clonación TA (pGEM-T easy, Promega), y su secuencia de ADN fue verificada mediante análisis de secuencias de ADN. El plásmido pGEM-T-prolL-18iEGR resultante fue cortado por EcoR I y BamH I, y
• el fragmento de 600 pares de bases que codifica para la PGOIL-18IEGR de humano, fue subclonado en el vector de expresión procariótico pGEX-2TK que
20 contiene la secuencia de genes de GST (Pharmacia). El vector de expresión resultante contenía la secuencia del gen de PGOIL-18IEGR de humano fusionada en el marco, al extremo 3' del gen de GST (figura 2).
Se llevó a cabo entonces la expresión y purificación de GST- prolL-18iEGR- Se desarrolló una sola colonia nueva de la cepa JM109 de E. coli transformada con el plásmido pGEX-prolL-18iEGR con agitación a 37°C, hasta alcanzar una densidad OD6oo de 0.6. La expresión de la proteína fue
• 5 inducida entonces mediante isopropil-tiogalactósido (IPTG) y cultivo adicional a 37°C durante 3 horas. El análisis mediante SDS-PAGE de las proteínas bacterianas totales, reveló la inducción de una proteína de 43 kD, que corresponde en tamaño a GST-prolL-18|EGR (figura 3.). Todos los pasos hacia el extremo 3' para el aislamiento de GST-prolL-18iEGR> se llevaron a cabo a
10 4°C. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación y se
• resuspendieron en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) conteniendo inhibidores de proteasa. Las bacterias fueron usadas mediante tratamiento con sonido, se añadió Tritón X-100 hasta una concentración final de 1 %, y el producto lisado clarificado se mezcló con las perlas de glutatión- 15 agarosa (Pharmacia). Las perlas se lavaron, y una alícuota de las mismas se analizó mediante SDS-PAGE. Se encontró una sola banda de 43 kD que corresponde a la proteína de fusión GST-prolL-18|EGR (figura 4). Las perlas fueron digeridas entonces con el factor Xa, y se recogió el sobrenadante. El análisis del sobrenadante mediante SDS-PAGE, dio una banda principal de
20 aproximadamente 18 kD, lo cual está de acuerdo con la masa esperada de la IL-18 madura de humano. Se observó también una banda más débil de 19.5 kD (figura 5). El análisis de la secuencia de la proteína de las bandas de 18 kD y 19.5 kD, dio en ambos casos la secuencia N-terminal esperada de la IL-
18 madura de humano. Una banda de 43 kD, que corresponde a la proteína de fusión GST-PGOIL-18IEGR. estuvo aún presente en las perlas de glutatión- agarosa después de la digestión, indicando un desdoblamiento incompleto (no mostrado). 5 Se puso a prueba la IL-18 recombinante de humano para determinar su actividad biológica en esplenocitos de murino, con base en su capacidad para inducir la expresión de interferón-gamma. La incubación de células de bazo de ratón no adherentes con IL-18 sola de humano, mostró poca producción de IFN-gamma, sugiriendo la necesidad de un coestimulante.
10 La concanavalina A sola a 0.125 µ/ml, no pudo inducir niveles significativos de
• IFN-?. Cuando los esplenocitos no adherentes fueron incubados con concanavalina A y la IL-18 de la presente invención, se obtuvo una inducción de IFN-? dependiente de la dosis (figura 6). Para construir un ADNc que codifique para una prolL-1ß mutante
15 de humano (prolL-1 ß?EGR) en la cual el sitio de desdoblamiento por la caspasa- 1 es mutado en un sitio de desdoblamiento por el factor Xa, se introdujeron las
A siguientes mutaciones en el ADNc de prolL-1 ß de humano: Y113I, V114E,
H115G y D116R. Estas mutaciones produjeron la secuencia de reconocimiento IEGR del factor Xa. 20 Se llevaron a cabo los siguientes pasos para construir un vector que expresa prolL-1ß?EGR de humano. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donador sano, fueron estimuladas por lipopolisacárido bacteriano (LPS). Se extrajo ARN total de las células. El
t? ?- iÍ m?iM?¿? ARN fue transcrito en forma inversa, y el ADN resultante sirvió de molde para la reacción en cadena de polimerasa (PCR), con iniciadores que corresponden a la secuencia de codificación de prolL-1 ß de humano. El producto de PCR resultante fue clonado en un vector de clonación TA, por
• 5 ejemplo, pGEM-T easy de Promega, y sometido entonces a mutagénesis dirigida a sitio con un oligonucleótido adecuado. La secuencia del vector resultante, que codifica para prolL-1 ß mutada de humano, se verificó mediante análisis de secuencias. El plásmido pGEM-T-prolL-1 ß?EGR resultante fue cortado por enzimas de restricción adecuadas, y el fragmento de
FF 10 aproximadamente 820 pares de bases que codifica para la prolL-1 ß?EGR de humano, fue subclonado en el vector de expresión procariótico pGEX-2TK
. (Pharmacia). El vector de expresión resultante contiene la secuencia del gen de prolL-1 ßiEGR de humano fusionada en el marco, al extremo 3' del gen de GST. 15 Se llevó a cabo en forma similar la expresión y purificación de
GST-prolL-1 ßiEGR- Se desarrolló una sola colonia nueva de la cepa JM109 de E. coli transformada con el plásmido pGEX-prolL-1 ßiEGR con agitación a 37°C, hasta alcanzar una densidad OD6oo de 0.6. La expresión de la proteína fue inducida entonces mediante isopropil-tiogalactósido (IPTG) y cultivo adicional 20 a 37°C durante 3 horas. El análisis mediante SDS-PAGE de las proteínas bacterianas totales, reveló la inducción de una proteína de aproximadamente 52 kD, que corresponde en tamaño a GST-prolL-1 ß?EGR- Todos los pasos hacia el extremo 3' para el aislamiento de GST-prolL-1 ßiEGR. se llevaron a
«8a~i**?j?¡Ku**m ~ * . ...
cabo a 4°C. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación y se resuspendieron en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) conteniendo inhibidores de proteasa. Las bacterias fueron usadas mediante tratamiento con sonido, se añadió Tritón X-100 hasta una concentración final 5 de 1 %, y el producto lisado clarificado se mezcló con las perlas de glutatión- agarosa (Pharmacia). Las perlas se lavaron, y una alícuota de las mismas se analizó mediante SDS-PAGE para detectar la presencia de la proteína de fusión GST-IL-1 ß de aproximadamente 52 kD. Las perlas fueron digeridas entonces con el factor Xa, y se recogió el sobrenadante que contenía a la IL- 10 1 ß madura de humano. • En otra modalidad de la presente invención, la expresión y purificación de un polipéptido se obtiene produciendo una proteína de fusión que tenga el sitio de desdoblamiento por una caspasa. Un plásmido que exprese un péptido de unión fusionado a una proteína de interés puede ser 15 mutado, de modo que se introduzca un sitio de desdoblamiento por la caspasa en una posición conveniente para la purificación de un polipéptido activo. Los sitios de reconocimiento por la caspasa están formados de 4 • aminoácidos, siendo el último un ácido aspártico. Por lo general, las caspasas muestran un carácter específico mayor y diferente para los sitios de 20 desdoblamiento que las proteasas que se usan comúnmente, ofreciendo ventajas significativas hacia las proteasas descritas previamente como útiles para cortar péptidos de fusión. El procedimiento de purificación se ejemplifica en la figura 7.
-. •**• Los sitios de desdoblamiento preferidos para cada caspasa se describen en la literatura (Ann Rev. Biochem, 1999 68:383-424). Todos ellos tienen en común el residuo Asp en la posición P1. El plásmido descrito anteriormente, pGEX-prolL-18iEGR. fue • 5 modificado para obtener una prolL-18 mutante de humano diferente (prolL- 18LETD. véase figura 8), en la cual el sitio de desdoblamiento por el factor Xa es mutado en un sitio de desdoblamiento por la caspasa-8. Esto permite el uso de la caspasa-8 para el desdoblamiento. Otra ventaja de usar una caspasa es su alta eficiencia, en 10 términos de rendimiento de digestión y tiempo de digestión. Se encontró que • cuando se compara la proteína IL-18 obtenida de pGEX-prolL-18|EGR y pGEX- prolL-18?_ETD- se reducen la cantidad de enzima y el tiempo que se requiere para obtener 1 mg de hlL-18. El procedimiento lleva a la producción de una proteína de bioactividad y tamaño esperados (figura 9). 15 La caspasa-8 no es la única caspasa adecuada y, de acuerdo a la presencia o ausencia de un sitio de desdoblamiento específico por la caspasa en una proteína de interés por purificar o cualquier otro criterio, se • pueden usar las mutaciones que correspondan al sitio de desdoblamiento de cualquier otra caspasa. 20 La caspasa se puede remover de la proteína de interés usando métodos de purificación estándar tales como, por ejemplo, filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico.
.-^---t*^- iaMÉküa En conclusión, el método descrito en la presente provee proteínas humanas purificadas biológicamente activas tales como IL-18 e IL- 1ß de E. coli. Parece ser que el plegamiento correcto de estas citocinas requiere primero la expresión como precursor, y entonces desdoblamiento • 5 hasta su forma madura. La IL-18 de humano difiere a este respecto de la IL-18 de murino, la cual puede ser expresada en células hospederas como una citocina madura biológicamente activa. La invención se describirá ahora mediante los siguientes 10 ejemplos no limitativos: •
EJEMPLO 1 Construcción de un plásmido que codifica para prolL-18 de humano, con un sitio del factor Xa 15 Se obtuvieron PBMC de sangre periférica de un voluntario sano, mediante separación por gradiente de densidad Ficoll-Paque PLUS • (Pharmacia). Los PBMC se lavaron dos veces con PBS enfriada en hielo conteniendo FBS a 2%, y se resuspendieron en 2.5 x 106 células/ml en medio 20 RPMI-1640 complementado con suero de bovino fetal (FBS), L-glutamina a 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina (RPMI-10). El cultivo fue estimulado con LPS (1 µg/ml, 3 h, 37°C). Se extrajo ARN total de las células con el reactivo de aislamiento TriPure™ (Boehringer Mannheim).
iaaiiiaHÜiüi Se usó 1 µg de ARN total para RT-PCR con el equipo para RT-PCR Titán de un tubo (Boehringer Mannheim) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se construyo ADNc de PGOIL-18IEGR mediante una PCR de tres pasos, usando el método del iniciador traslapante. Se diseñaron los
• 5 diferentes iniciadores con base en el ADNc de prolL-18 de humano (número de acceso del banco de genes, D49950 (3)). Para la primera PCR, el iniciador delantero fue: 5'- AACATCGAAGGTCGTTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' (SEQ ID NO: 7), y el iniciador inverso fue 5'-CGCGAATTCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGT-3' (SEQ
10 ID NO: 8). Se incluyó un sitio Eco Rl en el iniciador inverso. El molde fue un
• ARN celular total transcrito en forma inversa, aislado de los PBMC estimulados con LPS. Las condiciones de la termociclización fueron: 10 ciclos de 94°C, 30 seg; 55°C, 30 seg y 68°C, 2 min seguido de 25 ciclos de 94°C, 30 seg; 55°C, 30 seg y 68°C, 125 seg/ciclo. El producto de PCR resultante de
15 498 pares de bases, fue amplificado en el segundo paso de PCR usando el iniciador delantero traslapante: 5'- TGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATG • AAAACATCGAAGGTCGTTACTTTG-3' (SEQ ID NO: 9), así como el iniciador inverso del paso anterior. Las condiciones de la termociclización fueron: 30
20 ciclos de 94°C, 30 seg; 56°C, 30 seg y 72°C, 1 min. El producto resultante de 551 pares de bases fue amplificado en el tercer paso usando el iniciador delantero traslapante: 5'- CGTGGATCCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGT GGCAATGAAATTTATTGAC-3' (SEQ ID NO: 10), así como el iniciador inverso de los pasos anteriores. Se incluyó un sitio BamH I en el iniciador delantero. Las condiciones de termociclización fueron las mismas a las del paso anterior. El producto de PCR resultante de 0.6 kb (figura 1 ), fue
• 5 purificado usando un equipo de purificación de productos de PCR High Puré™ (Boehringer Mannheim) y ligado en el vector pGEM-T Easy, para producir el plasmido pGEM-prolL-18iEGR. Los productos de ligación fueron transformados en células JM109 competentes (Promega Corporation). Se usaron protocolos de clonación estándar (11 ). 10 Se verificó el plásmido pGEM-prolL-18iEGR de una sola colonia para detectar la presencia de una inserción correcta mediante digestión por enzima de restricción y secuenciación de ADN. El plásmido fue digerido con BamH I y EcoR I. El ADN de BamH l/EcoR I resultante que codifica para prolL-18iEGR de humano se resolvió mediante electrofóresis en agarosa a
15 1.0%, y la banda de 0.6 kb se aisló del gel mediante un equipo de extracción en gel QIAquick (DIAGEN, Alemania). Este ADN fue ligado en el vector de expresión pGEX-2TK (Pharmacia), el cual fue linealizado con BamH I y EcoR I. El plásmido recombinante resultante pGEX-prolL-18iEGR (figura 2) fue transformado en la cepa JM109 de E. coli, y el vector resultante fue
20 confirmado mediante digestión por enzima de restricción y secuenciación de ácido nucleico.
-A^at???h^.*^^ EJEMPLO 2 Expresión y purificación de la proteína de fusión GST-prolL-18?ggg
Un cultivo de la noche anterior de 50 ml de una nueva colonia de
• 5 la cepa JM109 de E. coli transformada con el plásmido pGEX-prolL-18|EGR> fue diluido en 450 ml de medio de LB conteniendo 100 U/ml de ampicilina y desarrollado con agitación a 37°C, hasta que alcanzara una densidad OD6oo de 0.6. La expresión de la proteína fue inducida entonces añadiendo IPTG hasta una concentración final de 0.1 mM y cultivo adicional a 37°C durante 3
10 horas. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación (5,000 x g, 5 min, 4°C), y se resuspendieron rápidamente en un volumen de partida de 1 :100 de solución salina regulada en su pH con fosfato enfriada en hielo (PBS; NaCI a 150 mM, Na2HP04 a 16 mM, NaH2P04 a 4 mM, pH 7.3), que contenía los inhibidores de proteasa (1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A, 2
15 µg/ml de aprotinina, PMSF a 0.2 mM y EDTA a 5 mM). Las células fueron usadas sobre hielo mediante tratamiento suave con sonido (ráfagas de 4 x 15 seg). Se añadió Tritón X-100 hasta una concentración final de 1%, y la
• mezcla se mantuvo sobre hielo durante 5 minutos. El lisado clarificado (14,000 x g, 15 min, 4°C) se mezcló con una suspensión a 50% de perlas de glutatión- 20 agarosa (2 ml, Pharmacia), y la mezcla se incubó con agitación suave a 4°C durante 3 horas. Las perlas fueron transformadas a pellas mediante centrifugación (500 x g, 5 min), se lavaron dos veces con 10 volúmenes de regulador de pH de lisis (Tritón X-100 a 1 % en PBS), dos veces con 10
*mu ua** m¡ **?? volúmenes de Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, dos veces con 10 volúmenes de Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, NaCI a 150 mM, y dos veces con 10 volúmenes de Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, NaCI a 150 mM y CaCI2 a 2.0 mM (regulador de pH de desdoblamiento). Todos los pasos se llevaron a cabo a 4°C.
EJEMPLO 3 Desdoblamiento de la proteína de fusión y purificación de IL-18 madura de humano
10 Las perlas de glutatión-agarosa con la proteína de fusión GST- • prolL-18iEGR unida, fueron incubadas (6 h, 23°C) con el factor Xa (New England Biolabs) en 1 ml de regulador de pH de desdoblamiento, usando una relación de proteasa: substrato de 1 :50 (p/p), con mezclado constante en una rueda giratoria. Este paso libera la IL-18 madura de humano. Las perlas
15 fueron transformadas a pellas mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos a 4°C, y se lavaron 5 veces con 2 ml de PBS enfriada en hielo. El sobrenadante y todos los volúmenes de lavado se combinaron, se clarificaron
• mediante centrifugación (14,000 x g, 15 min, 4°C) y se concentraron mediante ultrafiltración (Centricon-10, Amicon). Las alícuotas de la proteína, así como
20 también las perlas antes y después de la digestión, se resolvieron mediante electrofóresis en gel de poliacrilamida a 12%-SDS a 0.1%, seguido de tinción con azul de Coomassie. Se obtuvo en el sobrenadante una banda principal de aproximadamente 18 kD, lo cual concuerda con la masa esperada de la IL-
--.-~-^.--~-M-a------E> ^-.«-» - - ' 18 madura de humano. Se observó también una banda menor de 19.5 kD. El análisis de la secuencia N-terminal de las dos bandas de la proteína dio la secuencia YFGK...., que concuerda con la de la IL-18 madura de humano. La proteína purificada fue esterilizada a través de un filtro de 0.2 mieras, y 5 almacenada a -70°C.
EJEMPLO 4 Bioensayo de I L-18 de humano
10 Se evaluó la actividad de la IL-18 de humano según se describe
• (2). Én resumen, bazos de ratones C3H/HcJ normales fueron extirpados, desmenuzados y expuestos a regulador de pH de Gey (NH4CI a 0.144 M en Tris-HCl a 0.017 M, pH 7.2), para romper los eritrocitos. Los glóbulos blancos fueron lavados dos veces con RPMI-5, y resuspendidos entonces en RPMI- 15 10. Para la preparación de células no adherentes a plástico, se incubaron suspensiones de células (60 min, 37°C) en placas de plástico de 100 mm (Becton Dickinson Ltd., Reino Unido). Las células no adherentes fueron
• cuidadosamente recolectadas, centrifugadas y resuspendidas en RPMI-10. Se hizo el conteo de las células viables mediante la prueba de exclusión del
20 colorante azul trípano, y la concentración de células se ajustó hasta 5x106 células/ml. La mayoría de las células positivas a esterasa no específicas, fue removida mediante estos procedimientos. Las suspensiones de células no adherentes a plástico (0.15 ml), fueron colocadas en placas de cultivo de
*-~*.-J*? *. -— ^^^^^^^ microtítulo de fondo plano de 96 cavidades (NUNCLON™, Dinamarca). Se añadieron varias concentraciones de IL-18, polimixina (1 µg/ml) y Con A (0.125 µg/ml) a las cavidades en 50 µl de RPMI-10. Las placas se incubaron durante 24 ó 48 h a 37°C en C02 a 5%. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes, y se determinaron los títulos de IFN-? de murino mediante ELISA. La incubación de células de bazo no adherentes de ratón con IL-18 de humano sola, mostró poca producción de IFN-?, sugiriendo la necesidad de un coestimulante. La Con A sola a 0.125 µg/ml no pudo inducir niveles significativos de IFN-?. Cuando los esplenocitos no adherentes fueron incubados con concanavalina A y la IL-18 de humano de la presente invención, se obtuvo una inducción de IFN-? dependiente de la dosis (figura 6).
EJEMPLO 5 Construcción de un plásmido que codifica para prolL-1ß de humano, con un sitio del factor Xa
Se obtuvieron PBMC de sangre periférica de un voluntario sano, mediante separación por gradiente de densidad Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia). Los PBMC se lavaron dos veces con PBS enfriada en hielo conteniendo FBS a 2%, y se resuspendieron en 2.5 x 106 células/ml en medio RPMI-1640 complementado con suero de bovino fetal (FBS), L-glutamina a 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina (RPMI-10). El cultivo fue estimulado con LPS (1 µg/ml, 3 h, 37°C). Se extrajo ARN total de las células con el reactivo de aislamiento TriPure™ (Boehringer Mannheim). Se usó 1 µg de ARN total para RT-PCR con el equipo para RT-PCR Titán de un tubo (Boehringer Mannheim) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 5 Se clona ADNc de prolL-1ß mediante PCR con iniciadores sentido e inverso diseñados con base en el ADNc de prolL-1ß de humano (número de acceso del banco de genes, M 15330). El iniciador sentido i corresponde a los nucleótidos 87-107 de la secuencia M 15330, precedida por una secuencia de desdoblamiento de BamH I. El iniciador inverso
A 10 corresponde a los nucleótidos 896-876 de la secuencia M15330, precedida por un sitio Eco Rl. El molde es un ARN celular total transcrito en forma inversa, aislado de los PBMC estimulados con LPS. Las condiciones de la termociclización son: 10 ciclos de 94°C, 30 seg; 55°C, 30 seg y 68°C, 2 min seguido de 25 ciclos de 94°C, 30 seg; 55°C, 30 seg y 68°C, 125 seg/ciclo. El 15 producto de PCR resultante de 830 pares de bases, es purificado usando un equipo de purificación de productos de PCR High Puré™ (Boehringer Mannheim), y ligado en el vector pGEM-T Easy, para producir el plásmido pGEM-prolL-1 ß. El plásmido se somete a mutagénesis dirigida a sitio con el oligonucleótido 20 ACATGGGATAACGAGGCTATTGAAGGCCGGGCACCTGTACGA (SEQ ID NO: 11 ), que corresponde a los nucleótidos 405-452 de ARN mensajero de IL- 1ß de humano, y que tiene las mutaciones Y1131, V114E, H115G y D116R.
Se verifica el plásmido pGEM-prolL-1 ßiEGR de una sola colonia para detectar la presencia de una inserción correcta mediante digestión por enzima de restricción y secuenciación de ADN. El plásmido es digerido con f BamH I y EcoR I. El ADN de BamH l/EcoR I resultante que codifica para
5 prolL-l ßiEGR de humano se resuelve mediante electrofóresis en agarosa a 1.0%, y la banda de 0.82 kb se aisla del gel mediante un equipo de extracción en gel QIAquick (DIAGEN, Alemania). Este ADN es ligado en el vector de expresión pGEX-2TK (Pharmacia), el cual es linealizado con BamH I y EcoR I. El plásmido recombinante resultante pGEX-prolL-1ß?EGR (figura 2) es 10 transformado en la cepa JM109 de E. coli, y el vector resultante es confirmado mediante digestión por enzima de restricción y secuenciación de ácido nucleico.
EJEMPLO 6 15 Expresión y purificación de la proteína de fusión GST-prolL-lßiFgg
Un cultivo de la noche anterior de 50 ml de una nueva colonia de la cepa JM109 de E. coli transformada con el plásmido pGEX-prolL-1 ßiEGR, fue diluido en 450 ml de medio de LB conteniendo 100 U/ml de ampicilina y 20 desarrollado con agitación a 37°C, hasta que alcanzara una densidad OD6oo de 0.6. La expresión de la proteína fue inducida entonces añadiendo IPTG hasta una concentración final de 0.1 mM y cultivo adicional a 37°C durante 3 horas. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación (5,000 x g, 5 min, 4°C), y se resuspendieron rápidamente en un volumen de partida de 1 :100 de solución salina regulada en su pH con fosfato enfriada en hielo (PBS; NaCI a 150 mM, Na2HP04 a 16 mM, NaH2P04 a 4 mM, pH 7.3), que contenía los inhibidores de proteasa (1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A, 2
• 5 µg/ml de aprotinina, PMSF a 0.2 mM y EDTA a 5 mM). Las células fueron usadas sobre hielo mediante tratamiento suave con sonido (ráfagas de 4 x 15 seg). Se añadió Tritón X-100 hasta una concentración final de 1 %, y la mezcla se mantuvo sobre hielo durante 5 minutos. El lisado clarificado (14,000 x g, 15 min, 4°C) se mezcló con una suspensión a 50% de perlas de glutatión- 10 agarosa (2 ml, Pharmacia), y la mezcla se incubó con agitación suave a 4°C durante 3 horas. Las perlas fueron transformadas a pellas mediante centrifugación (500 x g, 5 min), se lavaron dos veces con 10 volúmenes de regulador de pH de lisis (Tritón X-100 a 1 % en PBS), dos veces con 10 volúmenes de Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, dos veces con 10 volúmenes de
15 Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, NaCI a 150 mM, y dos veces con 10 volúmenes de Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, NaCI a 150 mM y CaCI2 a 2.0 mM (regulador de pH de desdoblamiento). Todos los pasos se llevaron a cabo a 4°C. •
20
..A- ^AM^ EJEMPLO 7 Desdoblamiento de la proteína de fusión y purificación de IL-1 ß madura de humano
Las perlas de glutatión-agarosa con la proteína de fusión GST-prolL-1ßiEGR unida, fueron incubadas (6 h, 23°C) con el factor Xa (New England Biolabs) en 1 ml de regulador de pH de desdoblamiento, usando una relación de proteasa: substrato de 1 :50 (p/p), con mezclado constante en una rueda giratoria. Este paso libera la IL-1 ß madura de humano. Las perlas fueron transformadas a pellas mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos a 4°C, y se lavaron 5 veces con 2 ml de PBS enfriada en hielo. El sobrenadante y todos los volúmenes de lavado se combinaron, se clarificaron mediante centrifugación (14,000 x g, 15 min, 4°C) y se concentraron mediante ultrafiltración (Centricon-10, Amicon). Las alícuotas de la proteína, así como también las perlas antes y después de la digestión, se resolvieron mediante electrofóresis en gel de poliacrilamida a 12%-SDS a 0.1 %, seguido de tinción con azul de Coomassie. Se obtuvo en el sobrenadante una banda principal de aproximadamente 17 kD, lo cual concuerda con la masa esperada de la IL-1 ß madura de humano. La proteína purificada fue esterilizada a través de un filtro de 0.2 mieras, y almacenada a -70°C.
- - -*-'""•-- EJEMPLO 8 Construcción de un plásmido que codifica para IL-18 de humano con un sitio de desdoblamiento por caspasa-8
^ 5 El plásmido recombinante pGEX-prolL-18iEGR del ejemplo 1 , fue modificado insertando un fragmento de ADN amplificado mediante PCR con el sitio de desdoblamiento por la caspasa-8 (LETD). En resumen, el plásmido pGEX-prolL-18i£GR fue digerido con las enzimas de restricción BAM H I en la posición 951 y Hind lll en la posición 1074, cortando la porción de ADN que
f 10 contiene al prodominio, el sitio de desdoblamiento por el factor Xa (I EGR) y los tres aminoácidos del N-terminal de hlL-18. Se usó el mismo plásmido como molde para la amplificación mediante PCR, introduciendo el sitio mutado LETD en el iniciador hacia el extremo 3': atgcAAG CTT GCC AAA GTA GTC GGT TTC CAG GTT TTC ATC
15 ATC TTC AGC TAT AA (SEQ ID NO: 12). El fragmento de PCR fue purificado usando el equipo de "alta purificación de productos puros" (Boehringer Mannheim), y cortado entonces en forma similar con BAM Hl y Hind lll, f generando una inserción de 123 pares de bases. El vector abierto y la inserción fueron separados sobre gel de agarosa y extraídos usando el equipo
20 comercial "Jet Sorb" (Genomed). La ligación se llevó a cabo durante la noche usando una T4 Ligasa (New England BioLabs, Beverly MA, USA), y los productos de ligación fueron transformados en células competentes DH5a de E. coli. Varias colonias fueron aisladas, subcultivadas y preparadas en minipreparaciones con el equipo "Qiagen". La amplificación mediante PCR
(Perkin Elmer, Gene Amp- AmpliTaq DNA polymerase) se llevó a cabo en
todas las minipreparaciones para secuenciar la parte esencial del plásmido
recombinante. La transformación final se llevó a cabo en bacterias
• competentes JM109 de E. coli, siguiendo el método TSS (Chung, C. T. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175).
EJEMPLO 9
Expresión y purificación de la proteína de fusión GST-prolL-18^rtn
10 • Usando el plásmido construido de acuerdo al ejemplo 8 anterior, se logró la expresión de la proteína GST-Pro-?_ETD-hlL18 en frascos con agitación y fermentadores de 5 litros, esencialmente como se describió en el ejemplo 2 anterior. 15 EJEMPLO 10
Desdoblamiento de la proteína de fusión usando caspasa-8. y • purificación de la IL-18 madura de humano
20 Las perlas de glutatión-agarosa con la proteína de fusión GST-
PGOIL-18LETD unida, fueron incubadas (4 h, 23°C) con caspasa-8 (Calbiochem) en regulador de pH de desdoblamiento (definido en el ejemplo 6), usando una relación de proteasa: substrato de 1 :1200 (p/p), con mezclado constante en una rueda o rodillo giratorios. Las perlas fueron transformadas a pellas mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos a 4°C, y se lavaron 5 veces con 2 ml de PBS enfriada en hielo. El sobrenadante y todos los volúmenes de lavado se combinaron, se clarificaron mediante centrifugación 5 (14,000 x g, 15 min, 4°C) y se concentraron mediante centrifugación (Centricon-10, Amicon). El producto digerido concentrado fue sometido entonces a dimensionamiento molecular sobre Superdex-75 (Pharmacia), para separar la hlL-18 (18 kDa) de los productos de desdoblamiento de peso molecular mayor y de la enzima proteolítica residual (caspasa-8: heterodímero 10 de 29 kDa y heterotetrámeros de 58 kDa). Se puso a prueba la actividad enzimática de la caspasa-8 en las diferentes fracciones de Superdex-75 usando el equipo para prueba de caspasa-8 y el substrato fluorógeno Ac-IETD-AMC (BIOMOL), y se observó en fracciones que corresponden a una masa molecular de 55 kD (que 15 corresponde al heterotetrámero de caspasa-8), mostrando por lo tanto que se separa muy bien de las fracciones que contienen hlL-18 (17 kD). Las fracciones de hlL-18 de 18 kDa altamente puras obtenidas
• mediante filtración en gel, fueron agrupadas, concentradas sobre Centricon-10 (Amicon) y esterilizadas finalmente a través de un filtro de 0.22 µm, y 20 almacenadas a -80°C. Las alícuotas de la proteína, así como también las perlas antes y después de la digestión, fueron resueltas mediante electrofóresis en gel de poliacrilamida a 12%-SDS a 0.1 %, seguido de tinción con azul de Coomassie
-*» * -aA»to' --«^ (figura 9). Se observó en la fracción del sobrenadante una banda de 18 kD que concuerda con la masa esperada de la IL-18 madura de humano. El análisis de la fracción de perlas mostró que el desdoblamiento no es completo, puesto que la proteína precursora permanece unida a las perlas.
• 5 Además, cierta cantidad de proteína IL-18 desdoblada permanece en la fracción de perlas.
EJEMPLO 11 Bioensayo de I L-18 de humano generada mediante desdoblamiento por 10 caspasa-8 •
Se evaluó la actividad de IL-18 de humano, según se describió (10). En resumen, se mantuvo a células KG-1 en DMEM conteniendo FBS a 20%. Para la prueba de IL-18, células KG-1 fueron suspendidas a 1.2 x 106
15 células/ml (250 µl/cavidad, placa de 48 cavidades), y estimuladas con mFNTa (Innogenetics), junto con varias concentraciones de hlL-18 (diluciones en serie, partiendo de 80 ng/ml). La placa se incubó 24 horas a 37°C en C02 a
• 5%. Después de la incubación, los sobrenadantes se recogieron, y el contenido de IFN-? de murino se determinó mediante ELISA (hlFN-? y anti- 20 hlFN-? de R & D Systems). La IL-18 de humano indujo una producción de IFN-? dependiente de la dosis, con actividad idéntica a la hlL-18 obtenida de la construcción del sitio de desdoblamiento por el factor Xa.
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<210> 7 <211> 35 <212> ADN <213> Homo sapiens 20 <400> 7 aacatcgaag gtcgttactt tggcaagctt gaatc 35
<210 > 8 <2 11 > 30
*^**'*»****-.--.-*--'- • - -. -- - •• - <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 cgcgaattcc tagtcttcgt tttgaacagt 30 <210> 9 • <211> 75 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 9 tggcaatgaa atttattgac aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacatcg 60 aaggtcgtta ctttg 75 <210> 10 <211> 69 <212> ADN <213> Homo sapiens 10 <400> 10 cgtggatcca tggctgctga accagtagaa gacaattgca tcaactttgt ggcaatgaaa 60 tttattgac 69 <210> 11 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens
15 <400> 11 acatgggata acgaggctat tgaaggccgg gcacctgtac ga 42 <210> 12 <211> 54 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 12 atgcaagctt gccaaagtag tcggtttcca ggttttcatc atcttcagct ataa 54
20 <210> 13 <211> 582 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 13 atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60 aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aaaccgacta ctttggcaag 120
cttgaatcta aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 180 ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa tgcaccccgg 240 accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta gaggtatggc tgtaactatc 300 tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag 360 gaaatgaatc ctcctgataa catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga 420 agtgtcccag gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 480 ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga ggatgaattg 540 ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagact ag 582 <210> 14 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 14 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys lie Asn Phe Val Ala Met 1 5 10 15 Lys Phe lie Asp Asn Thr Leu Tyr Phe lie Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30 Leu Glu Thr Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie 35 40 45 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe lie Asp Gln Gly Asn Arg Pro 50 55 60 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 65 70 75 80 Thr lie Phe He He Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 85 90 95 Ala Val Thr He Ser Val Lys Cys Glu Lys He Ser Thr Leu Ser Cys 100 105 110 Glu Asn Lys He He Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn He 115 120 125 Lys Asp Thr Lys Ser Asp He He Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 130 135 140 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 145 150 155 160 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu He Leu Lys Lys 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser He Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 180 185 190 Asp
... . . k ... . .. . — . . -,-.. _ - -a -. - -»-.--j.
Claims (5)
- NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Un método para la producción de una molécula biológicamente activa a partir de su precursor biológicamente inactivo, caracterizado porque comprende mutar el sitio de desdoblamiento natural a un sitio el cual es capaz de ser desdoblado por una proteasa, y desdoblar la molécula mutada para producir una molécula biológicamente activa. 10 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la molécula biológicamente activa es una caspasa o una citocina. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la citocina se selecciona de IL-1ß e IL-18. 15 4.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sitio de desdoblamiento natural es un sitio de desdoblamiento por la caspasa-1. 5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la proteasa se 20 selecciona de trombina, enterocinasa, subtilisina, genenase™, la proteasa 3C de rinovirus de humano, la proteasa factor Xa y una caspasa, de preferencia caspasa-8. — *-****" -—">* - • "*-- •**-- 6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende transfectar un hospedero con un vector que comprende un ADNc que codifica para un precursor de una molécula biológicamente activa mutada en su sitio 5 de desdoblamiento, cultivar el hospedero transfectado y aislar la molécula biológicamente activa después de tratamiento con una proteasa. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el ADNc es fusionado en el marco a una secuencia de codificación de GST, y la molécula de fusión expresada es 10 capturada sobre perlas de glutatión-agarosa, antes del tratamiento con la proteasa. 8.- Un ADNc que codifica para un precursor mutado de una molécula biológicamente activa, fusionado opcionalmente a una secuencia de codificación de GST. 15 9.- El ADNc de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la molécula biológicamente activa es una caspasa o una citocina. 10.- El ADNc de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la citocina se selecciona de IL-1ß e IL-18. 20 11.- Una molécula biológicamente activa preparada mediante el método que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores. -—íl ttif- n -^r • • • T ,p ir 1! ------------------ ^.^— ^L— ^^É^MI
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