DE69324345T2

DE69324345T2 - Expression von osteogenem faktor op-1 in mit rekombinantem baculovirus infizierten spodoptera frugiperda-zellen

Info

Publication number: DE69324345T2
Application number: DE69324345T
Authority: DE
Inventors: Lanfranco Callegaro; Alessandro Negro; Ombretta Stanchi
Original assignee: Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST)
Current assignee: Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST)
Priority date: 1992-01-27
Filing date: 1993-01-27
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2013-01-28
Also published as: ATE178651T1; ITPD920007A0; IT1259042B; EP0625198B1; WO1993015197A2; ES2134254T3; DE69324345D1; ITPD920007A1; WO1993015197A3; EP0625198A1; US5641649A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt des menschlichen osteogenen Proteins OP-1 über DNA-Rekombinationstechniken. Dieses Verfahren wird anhand der Infektion von Spodoptera frugiperda-Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus zur Erzeugung der reifen, biologisch aktiven OP-1-Form erläutert.

Beschreibung des Standes der Technik

A. OSTEOGENER FAKTOR OP-1

Der osteogene Faktor OP-1 gehört wegen seiner biologischen Aktivität zur Familie der Knochenmorphogenese-Proteine (BMPs), bei denen es sich um Faktoren handelt, die für die Knorpel- und Knochen-Induzierung verantwortlich sind.
BMPs bilden einen Teil der großen TGF-β (Transformierender Wachstumsfaktor β)-Superfamilie, einer Familie, die embryonale Morphogene, Hormonfunktions-Regulatoren, Regulatoren mit großem Wirkungsspektrum und spezifische Zellproliferations- und Zelldifferenzierungs-Regulatoren umfaßt.
TGF-β ist ein Prototyp dieser Familie. Es ist ein Dimer aus zwei identischen Ketten von 112 Aminosäuren, die durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Jede Kette wird ausgehend von einem längeren Präkursor von etwa 390 Aminosäuren synthetisiert, der die Merkmale eines sekretorischen Polypeptids aufweist, das im N-terminalen Bereich eine hydrophobe Sequenz zeigt, die als Sekretionspeptid zur Sekretion des Moleküls fungieren sollte. Durch eine Spaltung mittels einer spezifischen Peptidase, die unmittelbar vor der biologisch aktiven Domäne vier basische Aminosäuren abspaltet, wird der Präkursor dann zu seiner reifen Form prozessiert. Der Präkursor-Bereich spielt bei der korrekten Faltung des reifen Proteins in vivo eine solch entscheidende Rolle, daß bis heute keine reifen, biologisch aktiven Peptide bekannt sind, die mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken in Escherichia coli produziert worden sind.
Diese Faktoren sind in verschiedenen Tierarten von Drosophila bis zum Menschen bekannt, wobei ihre Sequenzen die ganze Evolution hindurch in großem Maße erhalten worden sind. Die Sequenzhomologie unter den verschiedenen Polypeptiden ist sehr hoch und liegt hauptsächlich im Cterminalen Bereich. Unter den verschiedenen Vertretern der Familie schwankt das Ausmaß der Sequenzidentität zwischen 25% und 90%. In diesem Bereich sind 7 bis 9 Cystein-Reste bei allen Faktoren konserviert. Diese sind an der Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Aminosäureketten beteiligt.
BMPs induzieren chemotaktische, proliferative und Differenzierungs- Reaktionen, die mit der vorübergehenden Knorpelbildung enden, der sich die Akkumulation von hämotopoetischem Knochenmark im Knochen anschließt. Die Aktivität von BMPs ist so charakterisiert worden, daß sie mit der demineralisierten Knochenmatrix stark verbunden ist und sich mit Denaturierungsmitteln extrahieren läßt. Tatsächlich sind sie aus verschiedenen Arten einschließlich des Menschen, Affen, Rindern, Ratten und Mäusen extrahiert worden (Sampath, T. K., Reddi, A. H., PNAS, 80 (1983), 6591- 6595; Urist, M. D. et al., PNAS, 76 (1979), 1828-1832). Die meisten Untersuchungen wurden an BMPs durchgeführt, die von Rinderknochen stammen, einer häufig vorkommenden und leicht erhältlichen Quelle.
1988 gewannen Wozney et al. (Wozney, J. M. et al., Science, 242 (1988), 1528- 1534) aus Rinderknochen eine biologisch aktive Protein-Fraktion von etwa 30 kD, die mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen nachgewiesen werden konnte. Nach Reduktion der Disulfidbrücken mit Hilfe chemischer Verfahren wurden Polypeptide von 30 kD, 18 kD und 16 kD erhalten (Wang, E. A. et al., PNAS, 85 (1988), 9484-9488). Diese Protein-Fraktion wurde mit Trypsin gespalten und die erhaltenen Peptide wurden mittels HPLC getrennt und sequenziert. Diese Information wurde zur Synthese von DNA-Sonden verwendet, die zur Identifizierung der die verschiedenen Faktoren codierenden Rinder-Genomsequenzen verwendet wurden. Unter Verwendung von Abschnitten dieser Sequenzen als Sonden wurden die menschlichen Sequenzen erhalten, die die homologen Faktoren codieren.
Über diese Faktoren ist heutzutage sehr viel bekannt (Wozney, J. M. et al., J. Cell Sci., Suppl. 13 (1990), 149-156; Wozney, J. M. et al., Progress in Growth Factor Research, 1 (1989), 267-280). Einige wurden über DNA-Rekombinationstechniken erhalten. Einige Beispiele für Patente über Wachstumsfaktoren, die zu den vorstehend erwähnten Klassen gehören und mittels DNA- Rekombinationstechniken erhalten wurden, umfassen EP 409472, WO 9011366, WO 8800205, EP 212474, WO 9105863 und das US-Patent Nr. 4,743,679.
Wie alle anderen Mitglieder der TGF-β-Superfamilie besteht OP-1 aus einer Präkursorsequenz, die fast viermal länger ist als das reife Protein, das nur im C- terminalen Bereich liegt. Die Nucleotidsequenz der menschlichen cDNA von 1294 Basenpaaren ist veröffentlicht worden (Ozkaynak, E. et al., EMBO J., 9 (1990), 2085-2093).
Die Aminosäuresequenz von OP-1 besteht aus 431 Aminosäuren, während der reife Teil etwa 300 Aminosäuren enthält. Es gibt vier potentielle N- Glycosylierungsstellen, wobei drei davon im reifen Bereich vorkommen. In diesem Bereich kommen sieben Cystein-Reste vor, die für die ganze Superfamilie charakteristisch sind und die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Monomeren erlauben. Das Molekulargewicht des Dimers beträgt etwa 30 kD. Nach chemischer Reduktion und Elektrophorese führt das Dimer zu zwei glycosylierten Banden von 16 kD-18 kD (Sampath, T. K. et al., JBC, 265 (1990), 13198-13205). Unter Verwendung eines Induktionsmodells bei einer ektopischen Stelle bei der Ratte wurde nachgewiesen, daß das reife Protein in vivo Knochen-induzierende Aktivität besitzt. Dieser Test, der die Reparations- Kaskade einer Fraktur nachahmt, ermöglicht die histologische Kontrolle der Knorpel- und Knochen-Bildung und die Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase während dieses Prozesses (Sampath, T. K. et al., 1990, vorstehend zitiert).

B. DNA-REKOMBINATIONSTECHNIKEN

DNA-Rekombinationstechniken erlauben die Konstruktion von Vektoren, die Proteine von Interesse in großen Mengen exprimieren können.
DNA-Rekombinationstechniken erlauben dem Molekularbiologen das Zusammensetzen von DNA-Sequenzen mit dem Ziel, Hybridmoleküle zu erzeugen, die Moleküle von Interesse produzieren können. Das Verfahren umfaßt verschiedene Umsetzungen, wie das Schneiden mit Restriktionsenzymen, das Verbinden der so erhaltenen Fragmente mit Hilfe von Ligasen, die chemische Synthese der Oligonucleotide, die zusammengesetzt werden sollen, und verschiedene andere Verfahren (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
Um eine hohe Expression zu erhalten, müssen die DNA-Elemente, die zusammengesetzt werden sollen, bestimmte essentielle Informationsträger enthalten. Diese umfassen beispielsweise einen Replikationsstartpunkt, eine Antibiotika-Resistenz, einen Expressionspromotor, Transkriptions-Aktivatoren für das Gen von Interesse und andere dem Fachmann bekannte Elemente.
Durch eine geeignete Kombination dieser Elemente wird ein Vektor hergestellt und wenn das Gen von Interesse in Bezug auf die regulatorischen Transkriptions- und Translationssequenzen funktionell insertiert wird, wird der erhaltene Vektor als Expressionsvektor bezeichnet. Dieses Plasmid oder dieser Expressionsvektor kann in Wirtszellen das Protein von Interesse exprimieren. Danach kann das Protein mit Hilfe verschiedener Verfahren extrahiert werden.
Die Elemente (Promotoren), die natürlicherweise die Expression vieler Gene, wie die von Wachstumsfaktoren, kontrollieren, sind nicht sehr stark und werden nur unter geeigneten natürlichen Bedingungen aktiviert, die oft unbekannt sind. Um dieses Hindernis zu überwinden, werden Promotoren mit bekannter Aktivität, wie der des Polyhedrin-Gens vom Baculovirus, oder andere Promotorsequenzen verwendet. Die für eine hohe Expression verwendeten Elemente stellen daher eine Kombination von DNAs unterschiedlichen Ursprungs (Eukaryonten, Bakterien, Viren, usw.) dar, die zum Schluß zur Bildung eines Hybridmoleküls verbunden werden. Die Transkription und Translation eines Gens hängen davon ab, ob es zwischen den Regulationssequenzen und den codierenden Sequenzen einen geeigneten Abstand gibt.
Auf der Basis dieser Voraussetzung besteht einer der besten Wege für das Funktionieren der Regulationssequenzen darin, daß das eingeführte Gen in die gleiche Position wie das natürliche Gen insertiert wird. Bei einem verwendeten System umfassen die Regulationssequenzen auch einige Aminosäuren der codierenden Sequenzen. Ein Zusammenschluß mit dem eingeführten Gen führt zu einem Fusionsprotein. Wenn der fusionierte Teil danach entfernt wird, besteht die Möglichkeit, eine höhere biologische Aktivität zu erhalten. Wenn das Fusionsprotein-Verfahren nicht verwendet wird, hängen herkömmliche Verfahren zum Erhalt von sehr nahe bei Regulationssequenzen liegenden Genen davon ab, ob es geeignete Restriktionsstellen gibt, die ihre Clonierung erlauben. Wenn es in der Nähe keine kompatiblen Stellen gibt, besteht die Möglichkeit, die Abschnitte durch Synthese eines die gewünschte Restriktionsstelle enthaltenden Oligonucleotids oder Linkers zu verbinden. Wenn es in der Nähe keine Restriktionssstellen gibt, die die Verwendung von Linkem erlauben, besteht die Möglichkeit, ein DNA-Deletionsverfahren mit den Enzymen Bal31 oder S1 anzuwenden. Diese Möglichkeit erlaubt keine genaue Deletion und jedes Mal müssen verschiedene Clone sequenziert werden, um festzustellen, welcher der geeignetste ist. Diese Systeme sind für den Molekularbiologen sehr beschränkend und demzufolge wurden alternative Strategien entwickelt, die auf neuartigen Verfahren, wie der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science, 239 (1988), 487; Scharf, S. J., Science, 233 (1986), 1076), beruhen.
Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, einen Genabschnitt bis zum millionenfachen zu amplifizieren. Das Prinzip basiert auf der Verwendung von zwei Oligonucleotiden, die gepaart werden können, indem sich jeweils einer an jeden Strang der zu amplifizierenden DNA anlagert. Die Länge des erzeugten Moleküls wird durch der Abstand zwischen den beiden Oligonucleotiden und der fraglichen Gensequenz bestimmt. Diese beiden Oligonucleotide werden so konstruiert, daß es eine Restriktionsstelle innerhalb ihrer Sequenz gibt, die eine anschließende Clonierung ermöglicht. Diese Restriktionsstelle ist entweder natürlich vorhanden oder wird zu diesem Zweck konstruiert, indem eine Mindestanzahl von Basen degeneriert wird. Diese als ortsgerichtete Mutagenese bezeichnete Verfahrensweise erlaubt die Konstruktion von Restriktionsstellen an der Position, für die sich der Molekularbiologe vorher entschieden hat. Die Konstruktion von Stellen, die mit anderen Genabschnitten kompatibel sind, erlaubt einerseits eine leichte Clonierung, ermöglicht aber andererseits, was wichtiger ist, die genauere Verbindung verschiedener Genfragmente. Dieses Verfahren kann als direkte Mutagenese-Clonierung definiert werden. Mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken ist es in der Praxis möglich, komplette heterologe Polypeptide direkt zu exprimieren oder in einer anderen Ausführungsform das an einen Teil der Aminosäuresequenz eines analogen Polypeptids fusionierte heterologe Polypeptid zu exprimieren. Im allgemeinen sind Produkte, die auf letzterem Weg erhalten wurden, biologisch nicht aktiv (Britische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 2007676A; Wenzel; American Scientist, 68 (1980), 664).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Möglichkeit, das einen Knochen-induzierenden Faktor codierende menschliche Gen zu isolieren, erleichtert das Verständnis von Knochenerkrankungen und orthopädischen Problemen, wie Osteoporose, Osteoarthritis und langsam heilende Knochenbrüche, bei denen sich die Suche nach einer Lösung oder nach Präventivmaßnahmen als mühselige Aufgabe erwiesen hat. OP-1 kann bei all den Zuständen verwendet werden, bei denen es wichtig ist, die Bildung, Wiederherstellung und Regeneration von Knochen und/oder Knorpeln zu induzieren und/oder zu fördern.
Unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken ist es möglich, eine ausreichende Proteinmenge zu erhalten, um den Wirkungsmechanismus eines beliebigen Faktors oder einer Faktoren-Kombination beispielsweise zur Erhöhung der Knochenmasse zu klären. Solche Faktoren könnten mit einem biologischen Material als kontrolliertes Freisetzungssystem oder als Füllstoff assoziiert werden.
Von den verschiedenen Systemen zur Expression heterologer Proteine ist die Expression in prokaryontischen Escherichia coli-Zellen die am häufigsten verwendete, insbesondere, weil es die ökonomischste ist. Dieses System ist nicht immer praktikabel, da es, obwohl es die das Protein umfassende lineare Aminosäuresequenz genau reproduziert, keine korrekte Faltung erlaubt. Dieses System läßt sich zur Erzeugung kleiner Proteine oder Peptide (als Antigene zur Diagnose oder als Impfstoff-Bestandteile) einsetzen, deren Verwendung keine spezifische Konformation erfordert. Außerdem können rekombinanten Proteinen durch eine Expression in E. coli viele posttranslationale Modifikationen nicht verliehen werden, die für eukaryontische Proteine charakteristisch sind, wie eine Glycosylierung und die Bildung von inter- und intramolekularen Disulfidbrücken. Für OP-1 ist es wichtig, daß diese Modifikationssysteme aktiv sind, um einen biologisch aktiven, Knocheninduzierenden Faktor zu erhalten.
Bei eukaryontischen Zellen ermöglicht eine Infektion von Insekten- Zellinien mit einem rekombinanten Baculovirus eine hohe Expression (Luckow, V. A. und Summers, M. D., Biotechnology, 6 (1988), 47-55), während dank der vorstehend erwähnten post-translationalen Modifikationen die biologische Aktivität erhalten wird. Vom industriellen Standpunkt bietet das System den Vorteil, daß eine Zellinie eingesetzt wird, die in serumfreiem Medium sehr gut wächst, was bei der Aufreinigung rekombinanter Proteine Zeit und Geld spart.
Unter Verwendung von DNA-Rekopmbinationstechniken konstruierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen Vektor zur Verwendung mit einem Baculovirus, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren. Dieser Vektor enthält eine den Knochen-induzierenden Faktor OP-1 codierende cDNA.
Zur Clonierung wurde die PCR-Technik eingesetzt und mit Hilfe dieses Verfahrens wurden Restriktionsstellen so erzeugt, daß der Abstand zwischen den Regulationssequenzen und der codierenden Sequenz so natürlich wie möglich war, was eine leichte Clonierung in dem Transfer-Vektor pVL1392 erleichterte. Eine den menschlichen Knochen-induzierenden Faktor OP-1 codierende DNA wurde unter die Kontrolle des Promotors des Baculovirus- Polyhedrin-Gens gestellt.
Danach wurde dieses Konstrukt zusammen mit dem natürlichen Baculovirus AcMNPV (multiples Nucleopolyhedrosis-Virus von Autographa californica) in Spodoptera frugiperda-Zellen cotransfiziert. Das so erhaltene rekombinante Virus, das das OP-1-Gen unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors und aller der bei seiner Synthese beteiligten Sequenzen enthält, wurde aufgereinigt und amplifiziert. Danach wurde es zur Infektion von Spodoptera frugiperda-Zellen eingesetzt, um dieses heterologe Protein zu exprimieren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht dementsprechend in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer DNA-Sequenz, die das osteogene Protein OP-1 codiert, umfassend:
(a) Amplifikation von aufeinanderfolgenden oder aufeinanderfolgendüberlappenden Fragmenten der OP-1 codierenden DNA mittels des Verfahrens der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonucleotid- Primern, die einen geeigneten Abstand aufweisen und Restriktionsendonuclease-Stellen codieren; und
(b) Zusammensetzen der Fragmente mit Hilfe von DNA- Rekombinationstechniken zur Herstellung einer das osteogene Protein OP-1 codierenden DNA-Sequenz.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines rekombinanten Baculovirus, umfassend:
a) Insertion einer OP-1 codierenden DNA-Sequenz in einen Baculovirus- Transfervektor zur Herstellung eines die DNA-Sequenz enthaltenden Transfervektors;
(b) Cotransfektion einer Insektenzelle mit dem die DNA-Sequenz von Schritt (a) enthaltenden Transfervektor und viraler DNA des Wildtyp-Autographa californica-multiple Nucleopolyhedrosis-Virus AcMNPV; und
(c) Gewinnung des rekombinanten Baculovirus, das die OP-1 codierende DNA-Sequenz enthält.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten Baculovirus, das eine das menschliche osteogene Protein OP-1 codierende DNA-Sequenz umfaßt, die mit Regulationselementen funktionell verbunden ist, die zur Expression von OP-1 in Insektenzellen, die mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert sind, erforderlich sind.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung des Transfervektors pVL-OP1.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Insektenzelle, die ein rekombinantes Baculovirus enthält, das hergestellt wurde mittels:
(a) Insertion einer OP-1 codierenden DNA-Sequenz in einen Baculovirus- Transfervektor zur Herstellung eines die DNA-Sequenz enthaltenden Transfervektors;
(b) Cotransfektion einer Insektenzelle mit dem die DNA-Sequenz enthaltenden Transfervektor von Schritt (a) und viraler DNA des Wildtyp- Autographa californica-multiple Nucleopolyhedrosis-Virus AcMNPV; und
(c) Gewinnung des rekombinanten Baculovirus, das die OP-1 codierende DNA-Sequenz enthält.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des osteogenen Proteins OP-1 mit Hilfe eines Verfahrens, umfassend:
(a) Insertion einer OP-1 codierenden DNA-Sequenz in einen Vektor;
(b) Insertion des Vektors von Schritt (a) in eine Wirtszelle;
(c) Züchtung der Wirtszelle von Schritt (b); und
(d) Gewinnung von OP-1, das während der Züchtung von Schritt (c) produziert worden ist.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion des osteogenen Proteins OP-1 mit Hilfe eines Verfahrens, umfassend:
(a) Insertion einer OP-1 codierenden DNA-Sequenz in einen Transfervektor, der die Sequenz in das Baculovirus-Genom einführen kann, wodurch ein rekombinantes Baculovirus erzeugt wird;
(b) Einführung des rekombinanten Baculovirus in eine Insektenzelle;
(c) Züchtung der das rekombinante Baculovirus enthaltenden Insektenzelle; und
(d) Gewinnung von OP-1, das während der Züchtung von Schritt (c) exprimiert worden ist.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneimittels, wobei das Arzneimittel das osteogene Protein OP-1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. OP-1 kann mit Hilfe eines der beiden vorstehend beschriebenen Verfahrens produziert werden.
Der weitere Schutzumfang der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird aus der genauen Beschreibung und den nachstehend bereitgestellten Figuren ersichtlich. Obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zeigen, sind die genaue Beschreibung und die spezifischen Beispiele j edoch selbstverständlich nur zur Veranschaulichung angegeben, da für den Fachmann verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und Schutzumfanges der Erfindung ersichtlich sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die vorstehenden und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung lassen sich anhand der folgenden genauen Beschreibungen, die in Verbindung mit den angefügten Figuren angefertigt wurden, besser verstehen, wobei sie alle nur zur Veranschaulichung angegeben sind und die vorliegende Erfindung nicht beschränken, wobei:
Fig. 1 die Nucleotidsequenz des Knochen-induzierenden Faktors OP-1 zeigt.
Fig. 2 stellt eine Karte des Vektors pVL1392 dar.
Fig. 3 ist eine Darstellung des Schemas, das zur Clonierung der cDNA des Knochen-induzierenden Faktors OP-1 in den Vektor pVL1392 zum Erhalt des Plasmids pVL OP1 eingesetzt wurde.
Fig. 4a zeigt die unter reduzierenden Bedingungen erhaltenen elektrophoretischen Muster von Proteinen, die aus Spodoptera frugiperda- Zellen erhalten wurden, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert worden waren, das eine das menschliche Protein OP-1 codierende DNA enthielt.
Fig. 4b zeigt die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Antipeptid-Antikörpers 300-320.
A: Überstand einer Kultur von Sf9-Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus (einem natürlichen Virus und dem Vektor pVL-OP1) infiziert wurden.
B: Zellpellet einer Kultur von Sf9-Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus (einem natürlichen Virus und dem Vektor pVL-OP1) infiziert wurden.
C: Zellpellet der eingefrorenen, aufgetauten und zentrifugierten Probe B.
D: Überstand von Probe C.
E: Reifer Teil von OP-1, das in Escherichia coli induziert wurde.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgende genaue Beschreibung wird zur Unterstützung des Fachmanns bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Trotzdem sollte die folgende genaue Beschreibung nicht so ausgelegt werden, daß sie die vorliegende Erfindung übermäßig beschränkt, da der Fachmann bei den in der vorliegenden Beschreibung diskutierten Ausführungsformen Modifikationen und Variationen durchführen kann, ohne vom Geist oder Schutzumfang der vorliegenden erfindungsgemäßen Entdeckung abzuweichen.
Der gesamte Inhalt der jeweiligen Literaturstellen, die in der vorliegenden Patentanmeldung zitiert sind, wird durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen.

DNA-REKOMBINATIONSTECHNIKEN

Zur Spaltung von DNA wurden Restriktionsenzyme nach den genauen Hersteller-Beschreibungen eingesetzt. Im allgemeinen wurde 1 ug Plasmid mit 1 E eines Enzyms in 20 ul Lösung gespalten. Die Temperatur und die Inkubationszeit hingen von, dem verwendeten Enzym ab, betrugen im allgemeinen jedoch 1 Stunde bei 37ºC. Nach Inkubation wurden die Plasmide und Genfragmente in LMP-Agarose (BRL, USA) oder Nu-Sieve-Agarose (FMC Marine Colloids, USA) in 40 mM Tris-HCl, 20 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA aufgereinigt und danach mit einem GenecleanTM-Kit (BIO101 Inc., La Jolla, CA, USA) von der Agarose eluiert.
Zum Wiederauffüllen der 5'-Enden wurde die DNA mit 10 E Klenow- Polymerase 15 min bei 15ºC behandelt. Die mit den Restriktionsenzymen gespaltene DNA wurde mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Promega) dephosphoryliert. Die Umsetzung wurde unter Verwendung von 1 E alkalischer Phosphatase in 20 ul 30 min bei 37ºC durchgeführt. Die Ligierungsumsetzung wurde mit T4-Ligase in einer Konzentration von 1 E pro 0,5 ug DNA in einem Umsetzungsvolumen von 20 ul 16 Stunden bei 13ºC durchgeführt.
Die erhaltenen Konstrukte wurden in E. coli HB101 transformiert und transformierte Zellen wurden auf LB (Luria-Bertani)-Agarmedium selektiert, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Plasmid-DNA der erhaltenen transformierten Zellen wurde bei kleineren Präparationen mittels alkalischer Lyse und mit einem Quiagen-Kit (DIAGEN GmbH, Düsseldorf, Deutschland) aufgereinigt. Die Expressionsvektoren wurden mit Hilfe des Quiagen- Verfahrens aus den Bakterienzellen präpariert.
DNA-Sonden wurden mittels eines Multiprime-DNA-Markierungssystem von Amersham mit radioaktivem Phosphor ³²P markiert. Das markierte Isotop wurde vom gleichen Hersteller erworben. Die Sequenz der Konstrukte wurde durch Sequenzierung der DNA mit einem Sequenase®-2,0-Kit (USB Corporation) im Hinblick auf Richtigkeit überprüft.

DNA UND PROTEINE DES MENSCHLICHEN OSTEOGENEN FAKTORS OP-1

Alle in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Nucleinsäuresequenzen und Polypeptide oder ihre biologisch funktionellen Äquivalente können jeweils erfindungsgemäß verwendet werden. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "biologisch funktionelle Äquivalente" bezeichnet Nucleinsäuresequenzen oder Polypeptide, die die gleiche oder eine ähnliche biologische Aktivität wie die nachstehend beschriebenen speziellen Nucleinsäuresequenzen oder Polypeptide zeigen.
Die in der vorliegenden Beschreibung dargestellten Nucleinsäuresequenzen können beispielsweise durch Austausche, Anlagerungen oder Deletionen, die biologisch und funktionell gleichwertige Moleküle bereitstellen, verändert werden. Bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung können aufgrund der Degeneration des genetischen Codes andere DNA-Sequenzen verwendet werden, die im wesentlichen die gleichen Aminosäuresequenzen codieren. Diese umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Nucleotidsequenzen, die die nachstehend dargestellte OP-1- cDNA insgesamt oder teilweise umfassen und die durch einen Austausch verschiedener Codons, die einen physiologisch und funktionell gleichwertigen Aminosäurerest innerhalb der Sequenz codieren, verändert werden, wodurch eine stille Veränderung erzeugt wird. Ebenso umfassen das OP-1-Protein und erfindungsgemäße Derivate davon, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, diejenigen, die alle natürlicherweise vorkommenden Aminosäuren einschließlich veränderter Sequenzen umfassen, bei denen Reste innerhalb der Sequenz gegen funktionell gleichwertige Aminosäurereste ausgetauscht werden, was zu einer stillen Veränderung führt. Beispielsweise können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz gegen eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität ausgetauscht werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt, was zu einer stillen Veränderung führt. Austausch- Aminosäuren für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Vertretern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren umfassen beispielsweise Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Die erfindungsgemäßen, rekombinantes OP-1 codierenden Nucleinsäuresequenzen können so verändert werden, daß die Frozessierung oder Expression von OP-1 modifiziert wird. Ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, kann beispielsweise eine Signalsequenz stromaufwärts der OP-1 codierenden Sequenzen insertiert werden, um die Sekretion von OP-1 zu ermöglichen, wodurch die Ernte oder die biologische Verfügbarkeit erleichtert wird. Außerdem kann OP-1 in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu erzeugen und/oder zu zerstören oder um Veränderungen in codierenden Bereichen zu erzeugen und/oder neue Restriktionsendonuclease-Stellen zu bilden oder vorher existierende zu zerstören, um eine weitere in vitro-Modifikation zu ermöglichen. Alle auf dem Fachgebiet bekannten Mutationsverfahren können verwendet werden, zu denen die ortsgerichtete Mutagenese in vitro (Hutchinson et al., J. Biol. Chem., 253 (1978), 6551), die Verwendung von TAB®- Linkern (Pharmacia), etc., gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

EXPRESSIONSVEKTOREN FÜR MENSCHLiCHES OP-1

Vektoren, deren Verwendung in der vorliegenden Erfindung erwogen wird, umfassen diejenigen, in die, wie nachstehend diskutiert, eine DNA- Sequenz zusammen mit beliebigen erforderlichen funktionellen Elementen insertiert werden kann. Solche Vektoren können dann anschließend in eine Wirtszelle überführt und darin repliziert werden. Bevorzugte Vektoren sind solche, deren Restriktionsstellen gut belegt sind und die die funktionellen Elemente enthalten, die zur Transkription der DNA-Sequenz bevorzugt oder benötigt werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Vektoren eingesetzt, die eine oder mehrere der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen DNA-Sequenzen enthalten. Vorzugsweise weisen alle dieser Vektoren einige oder alle der folgenden Merkmale auf: (1) sie besitzen eine Mindestanzahl von Sequenzen des Wirtsorganismus; (2) sie können im gewünschten Wirt stabil erhalten und vermehrt werden; (3) sie können im gewünschten Wirt in einer hohen Kopienzahl vorkommen; (4) sie besitzen einen regulierbaren Promotor, der so gelegen ist, daß die Transkription der DNA von Interesse gefördert wird; (5) sie weisen mindestens eine Marker-DNA- Sequenz auf, die eine selektierbare Eigenschaft codiert und die auf einem Teil des Plasmids vorkommt, der von dem getrennt ist, in den die DNA-Sequenz insertiert wird; und (6) sie enthalten eine DNA-Sequenz, die die Transkription beenden kann.
Clonierungsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen exprimieren können, enthalten verschiedene funktionelle Elemente. Diese "funktionellen Elemente" können mindestens einen Promotor, mindestens eine Shine-Dalgarno-Sequenz und ein Initiationscodon und mindestens ein Terminationscodon umfassen. Diese "funktionellen Elemente" können auch eines oder mehrere der folgenden Elemente umfassen: mindestens einen Operator, mindestens eine Leader-Sequenz für Proteine, die aus dem intrazellulären Raum transportiert werden sollen, mindestens ein Gen für ein Regulator-Protein und beliebige andere DNA-Sequenzen, die für eine geeignete Transkription und anschließende Translation der clonierten OP-1-DNA erforderlich oder bevorzugt sind.
In den erfindungsgemäßen bevorzugten Vektoren können bestimmte dieser funktionellen Elemente vorhanden sein. Es ist in Betracht zu ziehen, daß beliebige zusätzliche funktionelle Elemente, die erforderlich sein können, identifiziert und unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, wie den von Sambrook et al., vorstehend, beschriebenen, an diese Vektoren angelagert werden können.

Regulatoren

Regulatoren dienen dazu, die Expression der DNA-Sequenz in Gegenwart bestimmter Umweltbedingungen zu verhindern, und erlauben die Transkription und anschließende Expression des von den OP-1-DNA-Sequenzen codierten Proteins, wenn andere Umweltbedingungen vorliegen. Regulationsabschnitte können so in den Vektor insertiert werden, daß in Abwesenheit eines Induktors eine Expression der DNA-Sequenz nicht oder in einem stark verringerten Ausmaß erfolgt.

Promotoren

Expressionsvektoren können Promotoren enthalten, die vom Wirtsorganismus zur Expression seiner eigenen Proteine genutzt werden können.

Transkriptions-Terminatoren

Transkriptions-Terminatoren dienen zur Stabilisierung des Vektors. Solche Sequenzen sind von Rosenberg et al., Ann. Rev. Genet., 13 (1979), 319-353, beschrieben worden.

Nicht-translatierte Sequenzen

Manchmal ist es wünschenswert, das 3'- oder 5'-Ende des codierenden Bereiches so zu konstruieren, daß ein Einbau von 3'- oder 5'-nichttranslatierten Sequenzen in das Gentranskript möglich ist. Zu diesen nichttranslatierten Sequenzen gehören diejenigen, die mRNA stabilisieren, wie von Schmeissner et al., J. Mol. Biol., 176 (1984), 39-53, offenbart.

Ribosomen-Bindungsstellen

Die mikrobielle Expression von Fremdproteinen erfordert funktionelle Elemente, die Ribosomen-Bindungsstellen umfassen. Eine Ribosomen- Bindungsstelle ist eine Sequenz, die bei der Initiation der Proteinsynthese ein Ribosom erkennt und daran bindet, wie von Gold et al., Ann. Rev. Microbiol., 35, 557-580, und Marquis et al., Gene, 42 (1986), 175-183, dargelegt. Eine bevorzugte Ribosomen-Bindungsstelle ist GAGGCGCAAAAA(ATG).

Leader-Seguenzen und Translations-Koppler

Wenn das Protein aus dem Wirts-Cytoplasma ausgeschieden werden soll, ist · es außerdem manchmal bevorzugt, daß am 5'-Ende der DNA-Sequenz eine eine geeignete Sekretions-Leader (Signal)-Sequenz codierende DNA vorhanden ist, wie von Watson, M. E. in Nucleic Acids Res., 12, 5145-5163, dargelegt. Die DNA für die Leader-Sequenz muß sich an einer Position befinden, die die Erzeugung eines Fusionsproteins erlaubt, bei dem sich die Leader-Sequenz unmittelbar neben OP-1 befindet und kovalent damit verbunden ist, d. h. zwischen den beiden codierenden DNA-Sequenzen dürfen sich keine Transkriptions- oder Translationssignale befinden.
Bei einigen Arten von Wirts-Mikroorganismen ermöglicht das Vorliegen einer geeigneten Leader-Sequenz den Transport des fertiggestellten Proteins in den periplasmatischen Raum, wie im Fall einiger E. coli-Stämme. Im Fall von bestimmten E. coli-Stämmen, Saccharomyces sowie Bacillus- und Pseudomonas- Stämmen ermöglicht die passende Leader-Sequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran in das extrazelluläre Medium. In diesem Fall kann das Protein aus extrazellulärem Protein aufgereinigt werden.
Eine weitere DNA-Sequenz kann sich unmittelbar vor der DNA-Sequenz befinden, die das Protein von Interesse codiert. Die zusätzliche DNA-Sequenz kann als ein Translations-Koppler fungieren, d. h. es handelt sich um eine DNA- Sequenz, die eine RNA codiert, die zur Positionierung von Ribosomen unmittelbar neben der Ribosomenstelle der Inhibitor-RNA dient, mit der sie benachbart ist. Der Translations-Koppler kann unter Verwendung der DNA- Sequenz TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTA- AATG und von Verfahren erhalten werden, die derzeit dem Fachmann bekannt sind und im Zusammenhang mit Translations-Kopplern stehen.

Translations-Terminatoren

Translations-Terminatoren dienen zur Beendigung der Translation von mRNA. Sie können entweder natürlich sein, wie von Kohli, J., Mol. Gen. Genet., 182, 430-439, beschrieben, oder synthetisch, wie von Petterson, R F., Gene 24 (1983), 15-27, beschrieben.

Selektierbare Marker

Vorzugsweise enthalten Clonierungsvektoren außerdem einen selektierbaren Marker, wie einen Arzneimittelresistenz-Marker, oder einen anderen Marker, der die Expression einer selektierbaren Eigenschaft durch den Wirtsorganismus bewirkt. Der Vektor kann das Gen für Ampicillin- Resistenz umfassen. Andere Plasmiden können das Gen für Tetracyclin- Resistenz oder das Gen für Chloramphenicol-Resistenz umfassen.
Eine solche Arzneimittelresistenz oder ein anderer selektierbarer Marker erleichtert die Selektion von Transformanten. Außerdem kann sich das Vorliegen eines solchen selektierbaren Markers in einem Clonierungsvektor dazu eignen, eine Vermehrung kontaminierender Organismen im Kulturmedium zu verhindern.
Die in der vorliegenden Beschreibung diskutierten funktionellen Elemente werden vom Fachmann anhand der im Stand der Technik beschriebenen Literatur und der darin enthaltenen Lehren routinemäßig ausgewählt.
Allgemeine Beispiele für diese funktionellen Elemente sind von B. Lewin in Genes, (1983), Wiley & Sons, New York, dargelegt. Verschiedene Beispiele für geeignete funktionelle Elemente lassen sich bei den vorstehend diskutierten Vektoren finden und können durch eine Überprüfung den Veröffentlichungen entnommen werden, die die grundlegenden Merkmale der vorstehend erwähnten Vektoren diskutieren.
Nach Synthese und Isolierung aller erforderlichen und gewünschten Einzelteile kann der Vektor mit Hilfe von Verfahren zusammengesetzt werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Das Zusammensetzen solcher Vektoren gehört zum allgemeinen Fachwissen und kann als solches ohne übermäßigen experimentellen Aufwand durchgeführt werden.
In jeden Vektor können mehrere Kopien der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen und ihrer angefügten funktionellen Elemente insertiert werden. In einem solchen Fall produziert der Wirtsorganismus größere Mengen des gewünschten Proteins pro Vektor. Die Anzahl mehrerer DNA-Sequenzkopien, die in den Vektor insertiert werden kann, wird nur dadurch beschränkt, ob der erhaltene Vektor aufgrund seiner Größe in eine geeignete Wirtszelle überführt und dort repliziert und transkribiert werden kann.

Wirtszellen

Auf dem Fachgebiet werden auch Vektoren routinemäßig verwendet, die zur Verwendung in verschiedenen Mikroorganismen und Säuger- und Insektenzellen geeignet sind. Solche Mikroorganismen umfassen beispielsweise Bacillus, Pseudomonas und Hefe. Auch die Expression von interessierenden Proteinen in Säugerzellen, z. B. in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Zur Expression in Bacillus sollten bevorzugte Vektoren einen regulierten. Promotor, wie den alpha-Amylase-Promotor, den Subtilisin-Promotor, den P-43- Promotor oder den spac-126-Promotor, umfassen. Geeignete Transkriptions- Terminatoren umfassen rrn und rrn BT. T. Transkriptions-Startstellen und Leader-Peptide können unter denjenigen ausgewählt werden, die von der neutralen Protease von B. amyloliquefaciens, der alpha-Amylase von B. amyloliquefaciens und Subtilisin von B. subtilis stammen. Geeignete Antibiotika-Marker sind Kanr und Camr. Ribosomen-Bindungsstellen können von den Genen für die neutrale Protease von B. amyloliquefaciens und die alpha-Amylase von B. amyloliquefaciens erhalten werden. Ein bevorzugtes Expressionssystem in Wirten der Gattung Bacillus umfaßt die Verwendung des Plasmids pUB110 als Clonierungsvehikel.
Zur Expression in Pseudomonas können Promotoren aus Trp, Lac und Tac ausgewählt werden. Geeignete Transkriptions-Startstellen und Leader-Peptide können von den Genen für Phospholipase C und Exotoxin A erhalten werden. Geeignete Antibiotika-Marker sind diejenigen für Sulfonamide und Streptomycine. Eine geeignete Ribosomen-Bindungsstelle kann aus dem Trp- Promotor von E. coli erhalten werden. Für besonders bevorzugte Vektoren werden das Plasmid RSF1010 und Abkömmlinge davon eingesetzt.
Im Fall von Hefe umfassen geeignete Promotoren Gal 1 und 10, Adh 1 und 11 sowie Pho 5. Transkriptions-Terminatoren können aus Cyc, Una, Alpha-Faktor und Sac 2 ausgewählt werden. Transkriptions-Startstellen und Leader-Peptide können von den Genen für Invertase, saure Phosphatase und Alpha-Faktor erhalten werden. Geeignete Selektionsmarker sind Ura 3, Leu 2, His 3 und Tap 1.
Im Fall einer Expression in Säugerzellen sollte schließlich die das interessierende Protein codierende DNA eine Sequenz aufweisen, die zur Bindung von Ribosomen fähig ist. Eine solche Sequenz ist von Kozak in Nucleic Acids Research, 15 (1987), 8125-8132, beschrieben. Das Protein codierende Fragment kann in einen Expressionsvektor insertiert werden, der einen Transkriptions-Promotor und einen Transkriptions-Enhancer enthält, wie von Guarente in. Cell, 52 (1988), 303-305, und Kadonaga et al. in Cell, 51 (1987), 1079- 1090, beschrieben. Falls erforderlich oder gewünscht, kann wie in dem Pharmacia-Plasmid pMSG ein regulierbarer Promotor verwendet werden. Der Vektor sollte auch ein vollständiges Polyadenylierungssignal besitzen, wie von Ausubel et al. in Current Protocols in Molecular Biology, (1987), Wiley, beschrieben, so daß vom Vektor transkribierte mRNA richtig prozessiert wird. Schließlich kann der Vektor auch den Replikationsstartpunkt und mindestens einen Antibiotikaresistenz-Marker von einem Plasmid wie pBR322 enthalten, um eine Replikation und Selektion in E. coli zu ermöglichen.
Zur Selektion einer das interessierende Protein produzierenden stabilen Zellinie kann der Expressionsvektor das Gen für einen selektierbaren Marker, wie einen Arneimittelresistenz-Marker, oder ein komplementäres Gen für eine Zellinie mit einem Mangel tragen, wie ein Gen für Dihydrofolat-Reduktase (dhfr) zur Transformation einer dhfr&supmin;-Zellinie, wie von Ausubel et al., vorstehend, beschrieben. In einer anderen Ausführungsform kann ein separates Plasmid, das den selektierbaren Marker trägt, zusammen mit dem Expressionsvektor cotransformiert werden.
Vektoren für Säugerzellen können mit Hilfe mehrerer Verfahren einschließlich einer Calciumphosphat-DNA-Copräzipitation, Elektroporation oder Protoplastenfusion in diese eingeführt werden. Das bevorzugte Verfahren ist die von Ausubel et al., vorstehend, beschriebene Copräzipitation mit Calciumphosphat.
Bevorzugte Vektoren umfassen beispielsweise das eukaryontische Expressionsplasmid PSVT7.

BEISPIEL 1

Clonierung einer den Faktor OP-1 codierenden cDNA in dem Transfervektor für Baculovirus

Da Baculovirus-DNA sehr umfangreich ist (125 Kb), ist es zum Erhalt eines rekombinanten Baculovirus erforderlich, eine Rekombination zwischen dem das interessierende Gen enthaltenden Transferkonstrukt und der viralen DNA zu erreichen. Es wurde der Transfervektor pVL1392 (Invitrogen Corporation, Fig. 2) verwendet, der die Polyhedrin-Regulationsbereiche stromaufwärts und stromabwärts von einem Polylinker enthält, der verschiedene Restriktionsstellen enthält. Zur Clonierung wurden die XbaI- und BamHI- Stellen verwendet.
Für diese Clonierung wurde auch das PCR-Verfahren verwendet. Geeignete Oligonucleotide wurden mit einer Festphasen-Synthesevorrichtung mittels des Phosphoramidit-Verfahrens nach dem Standardverfahren für eine 330B-DNA- Synthesevorrichtung (Applied Biosystems, USA) synthetisiert. Diese Oligonucloetide wurden 12 Stunden bei 55ºC in Ammoniak behandelt und dann in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Sie wurden in 2,5 M Ammoniumacetat resuspendiert und danach mit 3 Volumina kaltem Ethanol (-20ºC) präzipitiert. Sie wurden erneut mit 80%-igem kaltem Ethanol gewaschen und in Wasser resuspendiert. Die Oligonucleotid-Konzentration wurde spektrophotometrisch bestimmt.
Das Amplifikationsverfahren wurde auf einer thermischen Zyklen · unterworfenen DNA-Amplifikationsvorrichtung von Perkin Elmer Cetus durchgeführt und bei den verwendeten Reagenzien handelte es sich um die in dem GenAmp®-Kit (Perkin Eimer Cetus) enthaltenen.
Kurz gesagt, wurde ein Gemisch aus jeweils 200 uM eines Oligonucleotids, jeweils 0,5 uM der Nucleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,1 ug DNA und Umsetzungspuffer in einem Gesamtvolumen von 100 ul mit 0,5 E Taq- Polymerase hergestellt und mit Öl bedeckt, um eine Verdunstung zu verhindern. Die Umsetzung wurde durchgeführt, indem das Gerät auf 30 Zyklen eingestellt wurde. Jeder Zyklus war wie folgt: 1 min bei 94ºC, 2 min bei 50ºC, 3 min bei 72ºC. Die amplifizierten Fragmente wurden dann unter Verwendung eines GenecleanTM-Kits in LMP- oder NuSieve-Agarose aufgereinigt.
Zunächst wurden zwei Oligonucleotide konstruiert: OP-PstI, zwischen den Basen 780 und 750, und OP-NcoI, zwischen den Basen 250-270, mit den folgenden Sequenzen:
OP-PStI: 5'-TTGATGCTCTGCCCATCCAGCGT-3'
Op-NCoI: 5'-CATGCTGGACCTGTACAACGCCAT-3'
Aus einer Genbank von menschlicher Plazenta-cDNA in Xgtll (Clontech) wurde ein Fragment von etwa 470 bp amplifiziert. Dieses Fragment wurde in den Vektor pGEM®-52 insertiert, wobei der Vektor pGOPNco/Pst (Fig. 3) erhalten wurde. Die DNA-Sequenz wurde überprüft und danach wurde das Fragment als Sonde verwendet, um das Gen von Interesse innerhalb der Genbank selbst zu finden. Die Genbank wurde ausplattiert und die DNA von 500 000 unabhängigen Plaques wurde auf Nitrocellulose-Filter übertragen. Daran schloß sich eine Hybridisierung mit der markierten Sonde an und die positiven Phagenplaques, die zumindest das 470 bp-Fragment enthielten, wurden weiter analysiert.
Für diesen Zweck wurden die nachstehend gezeigten Oligonucleotide konstruiert:
OP-PS tII: 5'-GTGGTCAATCCGCGGCACAACCTG-3 '
OP-Bam: 5'-AGGATCCAGCTAGTGGCAGCCACAGG-3'
Das erste Oligonucleotid liegt neben OP-PstI, wobei die Amplifikation in die entgegengesetzte Richtung erfolgt. Das zweite Oligonucleotid liefert eine BamHI-Stelle zur Clonierung nach dem Stoppcodon des Gens. Das Oligonucleotid
OP-1 : 5'-AATCTAGAATGCACGTGCGCTCCAC-3'
erzeugt am Genstart eine XbaI-Stelle.
Die Amplifikationsumsetzung zwischen OP-1 und OP-PstI führte zu keinen Ergebnissen, was nahelegte, daß der erste Teil des Gens fehlte, während der terminale Teil vorhanden war. Danach wurde ein Fragment zwischen PstI und BamHI aus dem Phagen λ in den Vektor pGEM®-3Z subcloniert, wobei der Vektor pGOPPst/Bam (Fig. 3) erhalten wurde.
Unter Verwendung des Oligonucleotids OP-PstI und eines im Handel erhältlichen Oligonucleotids, das auf dem Phagen λ liegt (Lambda gt11-Primer (Vorwärts), #1218, 5'-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3', New England Bio Labs) wurde ein neuer Genabschnitt amplifiziert. Dieses amplifizierte Fragment wurde am 5'-Ende phosphoryliert und danach als SmaI/PstI-Fragment im Vektor pGEM®-3Z cloniert, wobei der Vektor pGOPSma/Pst (Fig. 3) erzeugt wurde. Dann wurde die Sequenz des Konstrukts analysiert, wobei sich zeigte, daß die ersten 121 Nucleotide des Gens fehlten.
Danach wurden ein langes Oligonucleotid von 108 Basen (in der in Fig. 1 gezeigten Gensequenz unterstrichen) und zwei Primer hergestellt, wobei einer auf das S'-Ende gerichtet war und der andere in Richtung auf das 3'-Ende um Position 11 herum lag, die eine XhoI-Stelle darstellt:
OP-XhoI: 5'-CACTCGAGCTTCATCCACCGGCGCC-3 '
OP-XhoII: 5'-AGCTCGAGTGCACCTCGTTGTCCAGGCTGAA-3 '.
Danach wurde ein anderes Oligonucleotid konstruiert:
OP-NCoII: 5'-TTGTAGGGGTAGGAGAAGCCCTG-3 ',
das neben OP-NcoI liegt, jedoch in die entgegengesetzte Richtung amplifiziert. Unter Verwendung des Primers OP-XhoII und des Primers OP-1 wurde auf dem Fragment von 108 Nucleotiden ein XbaI/XhoI-Fragment amplifiziert, das seinerseits im Vektor pGEM®-7Z subcloniert wurde (Fig. 3). Bei dem so erhaltenen Vektor handelte es sich um pGOPXba/Xho (Fig. 3).
Durch Amplifikation des zuvor im Vektor pGEM®-3Z clonierten SmaI/PstI- Fragmentes mit den Primern OP-XhoI und OP-NcoII wurde ein anderes XhoI/NcoI-Fragment erzeugt, das später zur letzten Clonierung verwendet werden sollte.
Sobald die Fragmente überprüft worden waren, wurde die letzte Clonierung im Vektor pGEM®-7Z durchgeführt. Daraus wurde das ganze Fragment in den Vektor pVL1392 (Invitrogen) überführt. Der erhaltene endgültige Vektor wurde als pVL OP1 bezeichnet (Fig. 3).
Die Positionen der verschiedenen Primer entlang des Gens können wie folgt zusammengefaßt werden:

BEISPIEL 2

Insektenzellkulturen

Die Verfahren zur Züchtung dieser Zellen sind dem Fachmann für diese Techniken wohlbekannt. Verfahren für ihre Züchtung sind in Summers, M. D. et aL, EP-Veröffentlichung Nr. 127 839, (1987), und in Smith, G. E., US-Patent Nr. 4,745,051 offenbart.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wurden Sf9-Zellen von Spodoptera frugiperda eingesetzt, die als einzellige Schichten oder in Suspension gezüchtet werden können. Auch Sf21-Zellen von Spodoptera frugiperda können eingesetzt werden.
Einzellige Schichten wurden bei 27ºC inkubiert und zwei- oder dreimal pro Woche geteilt, wenn sie Konfluenz erreichten. Die bei Suspensionskulturen erforderlichen Bedingungen hängen von dem Kulturmedium und dem Kulturvolumen ab. In Fermentern werden etwa zwei Millionen Zellen pro ml gezüchtet. Das Kulturmedium wird mit Pluronic F68 angereichert, einem Schutzmittel zur Verhinderung von Zellschäden beim Schütteln.
Bei den verwendeten Kulturmedien handelte es sich um TNM-FH nach Bink (J. R. H. Biosciences) + 10% fötales Kälberserum oder EXCELL401 (J. R. H. Biosciences).

BEISPIEL 3

Herstellung und Isolierung des rekombinanten Virus

Einzelheiten des zur Isolierung des rekombinanten Virus eingesetzten Verfahrens sind in dem Europäischen Patent Nr. 0 127 839 beschrieben. Im allgemeinen wurde eine einzellige Schicht von Spodoptera frugiperda-Zellen mit 2 ug DNA des Transfervektors, der die OP-1 codierende DNA trägt, und 1 ug viraler AcMNPV-DNA cotransfiziert. Die Zellen zeigen nach 3-4 Tagen virale Einschlüsse und 10%-50% der Zellen sind infiziert. Das Virus wird mit einem Titer von etwa 107-108 in das Medium ausgeschieden, wobei 0,1%-0,5% davon rekombinante Viren sind. Sobald der Überstand gewonnen worden ist, kann mit der Aufreinigung des rekombinanten Virus begonnen werden. Das Verfahren besteht aus einer Grenzverdünnung und einer anschließenden Dot-Blot- Hybridisierung.
Die Zellen werden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 2 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung überimpft. Danach werden sie mit in Verdünnungsreihen hergestellten Überstandsverdünnungen von 10&supmin;¹ bis 10&supmin;&sup8; infiziert. Die Platten werden bei 27ºC inkubiert und die Infektion wird kontrolliert. Nach 8-10 Tagen wird der Überstand auf eine andere Platte überführt und die Zellen werden lysiert. Die DNA aus jeder Vertiefung wird unter Verwendung einer Dot-Blot-Vorrichtung auf eine Nylon-Membran (Hybond-N) übertragen und dann unter Verwendung von UV-Licht 3 Minuten fixiert. Sobald die Fixierung erfolgt ist, wird das 470 bp große NcoI/PstI- Fragment von OP-1 nach herkömmlichen Verfahren unter Verwendung einer ³²P-markierten Sonde hybridisiert.
Ein einem positivem Clon entsprechender Virus-Überstand wird diesem Verfahren noch einmal unterworfen. Normalerweise wird durch drei Zyklen dieser Behandlung ein reines rekombinantes Virus hergestellt, das keine Polyhedrin-Moleküle mehr produziert, sondern nur rekombinante Protein- Moleküle.
Sobald ein rekombinantes Virus erhalten worden ist, das den Knocheninduzierenden Faktor OP-1 codierende DNA enthält, wird es amplifiziert und die Produktion wird begonnen.

BEISPIEL 4

Proteinanalyse

Das aus infizierten Zellen erhaltene Protein wurde mittels einer Elektrophorese in Polyacrylamid-Gelen und eines Western-Blot-Verfahrens unter Verwendung polyclonaler Antikörper, die Aminosäuresequenzen innerhalb der OP-1-Sequenz erkenhen, analysiert.
Es wurden zwei Antikörper gegen zwei synthetische Peptide hergestellt, die mittels einer 9050-Pepsynthesizer®-Vorrichtung hergestellt worden waren, wobei sich die Position des ersten zwischen den Aminosäuren 300-320 befand und die des zweiten zwischen den Aminosäuren 290-310. Unter Verwendung eines Proteinfragmentes, das dem reifen Teil des in E. coli exprimierten Proteins entsprach, als Antigen wurde ein dritter Antikörper hergestellt. Dieses Polypeptid kann verwendet werden, um zu kontrollieren, ob der Faktor OP-1 in Spodoptera frugiperda-Zellen tatsächlich prozessiert worden ist.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese eines ersten Insektenzell-Präparates von Faktor OP-1 unter reduzierenden Bedingungen und einer Western-Blot-Analyse davon mit dem Antipeptid- Antikörper 300-320. Anhand dieser Figur ist es möglich, auf dem Gel die durch Pfeile gezeigten Positionen von Polypeptid OP-1 mit unterschiedlichem Glycosylierungsausmaß festzustellen.

BEISPIEL 5

Arzneimittel

Das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte osteogene Protein OP-1 kann zur Herstellung von Arzneimitteln eingesetzt werden, die herkömmliche pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen. OP-1 kann in solchen Arzneimitteln in einer Menge von 0,1 Gew.-% bis 99 Gew.-%, vorzugsweise von 5 Gew.-% bis 80 Gew.-% und bevorzugter von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, vorhanden sein.
Solche Arzneimittel lassen sich bei der Behandlung von Knochenschäden zur Bildung und Regeneration von Knochen und Knorpeln, zur Behandlung von Knochenerkrankungen und orthopädischen Krankheiten, zur Behandlung von Osteoporose und Osteoarthritis und zur Knochenwiederherstellung nach einem durch eine Fraktur entstandenen Trauma einsetzen.
Der Nutzen von OP-1 in solchen Arzneimitteln kann der Tatsache zugeschrieben werden, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestelltes OP-1 die biologische Aktivität von natürlich vorkommendem OP-1 besitzt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sind die ersten gewesen, die erfolgreich biologisch aktives OP-1 mittels Rekombinationstechniken unter Verwendung von Baculovirus infizierten Insektenzellen hergestellt haben.
OP-1 ist ein komplexes Protein und seine Produktion in einer biologisch aktiven Form ist mit Schwierigkeiten verbunden gewesen.
U. a. sollte erwähnt werden, daß OP-1 ein komplexes Protein ist, das in Form eines Präkursors translatiert wird. Eine weitere Prozessierung des Präkursors erfordert, den NH&sub2;-terminalen Bereich anzugreifen. Zur Gewinnung eines biologisch aktiven Proteins scheint der Prä-Pro-Bereich essentiell zu sein. Darüberhinaus wird der Prä-Pro-Bereich glycosyliert und diese Glycosylierung ist zur Gewinnung von biologisch aktivem OP-1 wichtig. Schließlich wird OP- 1 mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens in das Kulturmedium sezerniert.
Daher stellt dies den ersten Nachweis einer erfolgreichen Produktion von biologisch aktivem OP-1 unter Verwendung des Baculovirus- Expressionssystems dar.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Baqulovirus, das fähig ist zur Expression von osteogenem Protein, OP1, in Insektenzellen, umfassend:

(a) Insertieren einer DNA-Sequenz, die das OP-1 codiert, in einen Baculovirustransfervektor, um einen Transfervektor, der die DNA-Sequenz enthält, zu produzieren,

(b) Cotransfizieren einer Insektenzelle mit dem Transfervektor, der die DNA-Sequenz vom Schritt (a) und virale DNA vom Wildtyp-Autographa californica-"multiple nuclear polyhedrosis"-Virus, AcMNPV, enthält und

(c) Gewinnen des rekombinanten Baculovirus, das die OP-1 codierende DNA-Sequenz enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die OP-1 codiert, eine menschliche cDNA-Sequenz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die cDNA-Sequenz, die OP-1 codiert, hergestellt ist durch ein Verfahren, das umfaßt:

(a) das Amplifizieren durch die Polymerasekettenreaktionstechnik von aufeinanderfolgenden oder aufeinanderfolgend-überlappenden Fragmenten von DNA, die OP-1 codiert, unter Verwendung von passend getrennten Oligonucleotidprimern, die Restriktionsendonucleasestellen codieren; und

(b) Zusammensetzen der Fragmente durch rekombinante DNA- Techniken, um eine DNA-Sequenz herzustellen, die osteogenes Protein, OP-1, codiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Oligonucleotidprimer von Schritt (a) ausgewählt sind aus:

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe von Fragmenten, die aus SmaI-PstI, NcoI-PstI, PstI-BamHI, XhoI-NcoI, und XbaI-XhoI besteht.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Baculovirustransfervektor pVL1392 ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Transfervektor, der die DNA-Sequenz enthält, ein pVL-OP1, wie in Fig. 3 gezeigt, ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Insektenzelle ausgewählt ist aus einer Spodoptera frugiperda Sf9-Zelle und einer Spodoptera frugiperda Sf21-Zelle.

9. Rekombinantes Baculovirus, wobei das Baculovirus eine DNA- Sequenz umfaßt, die menschliches osteogenes Protein, OP-1, codiert, die funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden ist, die nötig sind zur Expression von OP-1 in den Insektenzellen, die mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert sind.

10. Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 9, wobei die DNA- Sequenz, die das humane osteogene Protein, OP-1, codiert, funktionell mit dem Promotor des Polyhedringenes von Baculovirus verbunden ist.

11. Rekombinantes Baculovirus, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

12. Insektenzelle, die das rekombinante Baculovirus, das gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hergestellt ist, beinhaltet.

13. Insektenzelle nach Anspruch 12, wobei die Insektenzelle ausgewählt ist aus einer Zelle von Spodoptera frugiperda Sf9 und einer Zelle von Spodoptera frugiperda Sf21.

14. Verfahren zur Herstellung von osteogenem Protein, OP-1, umfassend:

(a) Insertieren einer DNA-Sequenz, die das OP-1 codiert, in einen Transfervektor, der fähig ist zur Einführung der Sequenz in das Genom von Baculovirus und somit rekombinantes Baculovirus herstellt;

(b) Einführen des rekombinanten Baculovirus in eine Insektenzelle;

(c) Züchten der Insektenzelle, die das rekombinante Baculovirus beinhaltet; und

(d) Gewinnen von OP-1, das während der Züchtung von Schritt (c) exprimiert wird.

15. Transfervektor pVL-OP1, konstruiert durch Clonierung der cDNA des osteoinduktiven Faktors OP-1 in Vektor pVL1392, wie in Fig. 3 gezeigt, mit der in dieser Figur gezeigten Struktur.