DE3907162C2

DE3907162C2 -

Info

Publication number: DE3907162C2
Application number: DE19893907162
Authority: DE
Inventors: Zsolt Pallai; Laszlo Budapest Hu Bali
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-03-04
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1992-05-21
Also published as: AT391480B; DE3907162A1; HU204081B; HUT50210A; JPH01269491A; ATA48089A; JPH0663B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Enzymes Myeloperoxydase durch Reinigen und Aktivieren von menschlichen Leukozyten, Aufschließen und Extrahieren des erhaltenen Materiales und Reinigung des Enzymes.

Das Enzym Myeloperoxydase kann als Diagnosticum in Infarktfällen verwendet werden, die Größe des Infarktes ist dem Myeloperoxydase-Spiegel im Gewebe proportional (Journal of Cardiovascular Pharmacology 7 [1985], 1154 bis 1160). Auch zwischen entzündlichen Erkrankungen und dem Myeloperoxydase-Spiegel besteht ein Zusammenhang (Blood, Vol. 60, No. 3, September 1982). Auch ein Herstellungsverfahren für Myeloperoxydase ist im Schrifttum beschrieben (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 245 [1986], No. 1, 167 bis 173 und Biochemistry, Vol. 3, No. 9 [1964], 1234 bis 1238), bei dem jedoch nicht aktiviert wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfacheres und besseres Verfahren zur Herstellung des Enzymes Myeloperoxydase, bei welchem von einem bereits vor ihm verwendeten Ausgangsstoff ausgegangen wird, zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Enzymes Myeloperoxydase durch Reinigen und Aktivieren von menschlichen Leukozyten, Aufschließen und Extrahieren des erhaltenen Materiales und Reinigen des Enzymes, welches dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsstoff eine bereits zur Herstellung von unter anderen Interferon oder Interleucin verwendete aus menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Blutfraktion verwendet wird, als Aktivierungsmittel Sendai-Viren, Concanavalin A, Phytohämagglutinin, Lensculinaris Lectin oder Ca⁺⁺-Ionophor eingesetzt wird und bei der Reinigung des Enzymes der chromatographische Reinigungsschritt an einer mit carboxymethyliertem "Controlled pore-glass" gefüllten Säule und anschließend an einer ULTRAGEL AcA 54 enthaltenden Säule durchgeführt wird.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird also zur Herstellung der zur Induktion der Myeoloperoxydase erforderlichen Leukozytensuspension als Ausgangsstoff eine bereits zur Herstellung von unter anderen Interferon oder Interleucin 2 verwendete, aus menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Blutfraktion [buffy coat] verwendet.

Die Herstellung des menschlichen Leukozyteninterferons ist in der ungarischen Patentschrift 1 82 209 beschrieben.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 a) Reinigen der Leukozyten

Als Ausgangsstoff wurde eine leukozytenreiche Fraktion, die bei der Auftrennung des von nativem Blut anfällt, das sogenannte "buffy coat" verwendet. Eine Einheit dieser Blutfraktion enthielt 1,4×10⁹ Leukozyten und hatte ein Volumen von etwa 40 ml. Eine konzentrierte Variante einer solchen ist handelsüblich, diese hat ein Volumen von 10 ml. Die aus menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Blutfraktion, das "buffy coat" enthält neben Leukozyten auch Erythrozyten und Blutplasma. Bei der Reinigung müssen diese Stoffe entfernt werden.

Zu 100 Einheiten aus menschlichem Blut stammender, leukozytenreicher Blutfraktion ["buffy coat"] (4000 ml bzw. 1000 ml) wurde die 3fache Menge einer auf 0±4°C gekühlten 0,83 gew.-%igen wäßrigen Ammoniumchloridlösung zugegeben und der Ansatz wurde 10 Minuten mit Eis gekühlt. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren (1400 U min^-1, 20 Minuten lang) aus der Suspension absetzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen und die Zellmasse in etwa 400 ml einer salzhaltigen Phosphatpufferlösung [PBS] suspendiert.

Zusammensetzung der salzhaltigen Phosphatpufferlösung:

NaCl
8800 mg/l
KCl	220 mg/l
Na₂HPO₄ · 12 H₂O	3500 mg/l
NaH₂PO₄ · H₂O	224 mg/l
pH-Wert:	7,2 bis 7,4

Die Zellsuspension hatte ein Volumen von etwa 500 ml, die Konzentration der Zellen betrug 3 bis 4×10⁸ Zellen/ml.

Die Behandlung mit Ammoniumchlorid wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß zu 1 Vol.-Teil Zellsuspension 9 Vol.-Teile 0,83 gew.-%ige Ammoniumchloridlösung zugegeben werden.

Die nach dem Zentrifugieren erhaltene Zellmasse wurde in 400 ml salzhaltiger Phosphatpufferlösung erneut suspendiert, das Volumen der Suspension betrug etwa 500 ml.

b) Aktivieren

Das Aktivieren diente dazu, die Leukozyten zur Erzeugung von Myeloperoxydase anzuregen. 500 ml Leukozytensuspension, die etwa 1,4×10¹¹ Zellen enthielt, wurden in 10 000 ml Nährflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung eingebracht:

CaCl₂
200 mg/l
Fe(NO₃)₃ · 9 H₂O	0,1 mg/l
KCl	400 mg/l
MgSO₄ · 7 H₂O	200 mg/l
NaCl	6400 mg/l
NaHCO₃	2000 mg/l
NaH₂PO₄ · H₂O	120 mg/l
Glucose	4500 mg/l
Phenolrot	10 mg/l
Agamma-Serum	1000 mg/l

Zum Aktivieren wurden 15 ml einer Sendai-Virensuspension mit einem Titer von 100 HA [Hämagglutinin]/ml verwendet. Das Gemisch wurde 15 bis 20 Stunden lang bei 37°C gerührt. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren (2000 g, 30 Minuten) aus der Nährlösung entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, die Zellen wurden in so viel salzhaltiger Phosphatpufferlösung suspendiert, daß das Endvolumen der Suspension 500 ml betrug.

c) Aufschließen der Leukozyten

Um das Enzym Myeloperoxydase freizusetzen, müssen die Leukozyten aufgebrochen werden. Zu diesem Zweck wurde die Zellsuspension 7mal gefrieren gelassen und wieder aufgetaut. Das Gefrierenlassen erfolgte bei -70°C, das Auftauen bei Raumtemperatur. Bei dieser Behandlung zerfielen die Zellen und das Enzym ging in Lösung. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren (20 000 g, 60 Minuten) von der enzymhaltigen Lösung abgetrennt.

d) Reinigen der Myeloperoxydase

Die niedermolekularen Verunreinigungen wurden durch Ultrafiltration entfernt. Die Extrakte wurden mit einem Ultrafilter AMICON® DC-4 unter Verwendung eines "Hohlfaser"-Einsatzes mit dem "Cut off"-Wert von 100 000 diafiltriert. Dieser Einsatz hält Moleküle mit einer Molmasse über 100 000 Dalton zurück und läßt Moleküle mit einer unter 100 000 Dalton liegenden Molmasse durch. Die Enzymaktivität befindet sich in der Fraktion mit mehr als 100 000 Dalton Molmasse. Das Volumen der erhaltenen enzymhaltigen Fraktion wurde auf etwa 200 ml eingestellt.

Die Verunreinigungen wurden durch Verändern des pH-Wertes gefällt. Zur enzymhaltigen Fraktion (200 ml) wurden 200 ml einer 0,1 m Kaliumcitratlösung (pH-Wert = 4) zugegeben, wodurch 400 ml Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5 erhalten wurden. Durch das Verändern des pH-Wertes fiel ein Teil der verunreinigten Eiweiße aus. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren (7000 g, 30 Minuten) entfernt. Die überstehende Flüssigkeit (etwa 350 ml) enthielt das Enzym.

Chromatographie an einer carboxymethylierten "Controlled pore-glass"-Säule [CM-CPG-Säule]

A) Adsorption: Die 350 ml enzymhaltige Fraktion (pH-Wert 4,5) wurden mit einer Volumgeschwindigkeit von 100 ml/h auf eine Chromatographiersäule C 16/20, die 20 ml CM-CPG enthielt, gedrückt. Die unten an der Säule ausgetretene Flüssigkeit wurde im Kreislauf zurückgeführt, wodurch eine wirksamere Adsorption erreicht wurde. So wurde eine Nacht lang bei 0 bis 4°C adsorbiert.

B) Waschen I: Die Füllung wurde mit 60 ml einer 0,1 m Kaliumcitratlösung (pH-Wert = 4) gewaschen. Die Waschlösung zeigte keine Enzymaktivität, sie wurde verworfen.

C) Waschen II: Die Säule wurde mit 60 ml der salzhaltigen Phosphatpufferlösung der im Abschnitt a) angegebenen Zusammensetzung gewaschen, die Waschlösung wurde verworfen.

D) Eluieren: Die Myeloperoxydase wurde mit einer Lösung, die 1,5 Mol NaCl und 0,5 Mol tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan [TRIS] enthielt und einen pH-Wert von 8,2 hatte, von der Säule gewaschen. Die Enzymaktivität erschien in einer einzigen scharfen Fraktion, die ein Volumen von etwa 20 ml hatte.

Chromatographie an Ultragel AcA 54

Die an der CM-CPG-Säule gewonnene enzymhaltige Fraktion (20 ml) wurde auf eine 1800 ml ULTRAGEL AcA 54 enthaltende Säule vom Typ K 50/100 aufgebracht und mit 2 Mol NaCl/salzhaltige Phosphatpufferlösung der im Abschnitt a) angegebenen Zusammensetzung eluiert. In der Fraktion der Molmasse von 6040 bis 8040 war die Myeloperoxydase rein erhältlich. Zur Auswahl der entsprechenden Fraktionen wurde die Säule vorher mit Hilfe von Molmasse-Normen kalibriert.

Die Gesamtaktivität des erhaltenen Produktes betrug durchschnittlich 2000 E und die ein Maß für die Reinheit des Produktes darstellende spezifische Aktivität lag bei 70 bis 100 E/mg Protein. Die Konzentration betrug 50 E/ml.

Bestimmung der Myeloperoxydaseenzymmenge

Die Menge von Enzymen wird üblicherweise in auf Grund der Aktivität bestimmten Enzymeinheiten angegeben. Definitionsgemäß ist 1 Einheit diejenige Enzymmenge, welche innerhalb 1 Minute bei 25°C in einem Medium mit einem pH-Wert von 6,00 1 µM H₂O₂ zersetzt. Die Geschwindigkeit der Zersetzung des H₂O₂ kann spektrophotometrisch verfolgt werden. Genaue Beschreibung der Verfahrensweise: G. Allan, P. Phattacherjee, C. D. Brook, N. G. Read, A. S. Parke: J. Cardiovasc. Pharm. 7 [1985], 1154 bis 1160.

Beispiel 2

Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendai-Virus Concanavalin A in einer Konzentration von 15 µg/ml verwendet.

Beispiel 3

Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendai-Virus Phytohämagglutinin in einer Konzentration von 10 µg/ml verwendet.

Beispiel 4

Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendai-Virus Lensculinaris Lectin in einer Konzentration von 30 µg/ml verwendet.

Beispiel 5

Es wurde in der im Beispiel 1, Abschnitt b) beschriebenen Weise vorgegangen, jedoch zum Aktivieren an Stelle des Sendai-Virus Ca⁺⁺-Ionophor mit der Bezeichnung A 23 187 in einer Konzentration von 0,15 µg/ml verwendet.

Claims

Verfahren zur Herstellung des Enzymes Myeloperoxydase durch Reinigen und Aktivieren von menschlichen Leukozyten, Aufschließen und Extrahieren des erhaltenen Materiales und Reinigen des Enzymes, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff eine bereits zur Herstellung von unter anderen Interferon oder Interleucin verwendete, aus menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Blutfraktion verwendet, als Aktivierungsmittel Sendai-Viren, Concanavalin A, Phytohämagglutinin, Lensculinaris Lectin oder Ca⁺⁺-Ionophor einsetzt und bei der Reinigung des Enzymes den chromatographischen Reinigungsschritt an einer mit carboxymethyliertem "controlled pore-glass" gefüllten Säule und anschließend an einer ULTRAGEL AcA 54 enthaltenden Säule durchführt.