DE2440529C3

DE2440529C3 - Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta

Info

Publication number: DE2440529C3
Application number: DE2440529A
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Takatsuki Mima; Masaaki Kyoto Yamada
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-08-28
Filing date: 1974-08-23
Publication date: 1979-09-13
Also published as: JPS5413510B2; JPS5048184A; DE2440529B2; DE2440529A1; US3945889A

Description

Hyaluronidase ist eine Gruppe von Enzymen, die Hyaluronsäure spaltet. Dieses F.nzym kommt in der Natur verbreitet vor. beispielsweise in Testikeln von Säugetieren, Leber und Milz, Schlangengiften und bestimmten Bakterien. Es ist bekannt, daß dieses Enzym ■'"· insbesondere in Testes von Säugetieren in verhältnismäßig großen Mengen vorliegt, und gewöhnlich werden zu seiner Gewinnung Testes verwendet: vgl. Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie. 3. Auflage, Bd. 7 (1956). S. 402-403. '> <>

Hyaluronidase wirkt als Ausbreitungsfaktor (»spreading factor«) in Haut und Bindegewebe. Hyaluronidase wird In der Human- und Veterinärmedizin zur Erleichterung und Beschleunigung der subkutanen Infusion auch größerer Flüssigkeitsmengen (Salz- oder '>> Glucosclösungen, Plasma) verwendet. Auch andere Injektionen werden erleichtert und oft in ihrer Wirksamkeit gesteigert, z. B. bei Anaesthetica, Antibiotica. Antiseren und Röntgenkontrastmitteln. Auch die Wirkung von Aerosolen zur Inhalation wird oft durch "· Hyaluronidase/usat/. verstärkt.

Hyaliironidasc-Präparatc aus den vorgenannten Quellen können bei ihrer Vcrabfolgung durch Injektion erhebliche Nebenwirkungen infolge ihres Gehalls an heterogenen Proteinen hervorrufen.

Wbcr die Gegenwart von Hyaluronidase in menschlichem Pla/entagcwebe sowie die physiologische Bedeutung und die klinische Rolle des Enzyms isl bis jetzt noch wenig veröffentlicht worden; vgl. F. Scarpa, A-Panazzolo, M. Tanferna und P. F. Paνe11ο, Boll. Soc. hai. Biol. Spen, Bd. 45 (1969), Seiten 217 bis 220,1. P. Homenyuk, Pediatr. Akush. HinekoLBd.34 (2) (1972), Seiten 44 bis 46, und N. P. Rudyuk, Nekotorye, Vopr. Patol. Beremennosti i Rodov, Vinnitsk, Med. InsL Vinnitsa, 1960, Nr. 2, Seiten 251 bis 258. Bis jetzt sind keine Veröffentlichungen über die Isolierung oder Gewinnung von Hyaluronidase aus menschlicher Plazenta bekanntgeworden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta zu schaffen, das bei parenteraler Verabfolgung an Menschen keine störenden Nebenwirkungen infolge eines Gehaltes von heterogenen Proteinen hervorruft, insbesondere besser verträglich ist, eine verstärkte Diffusion im Gewebe und eine verringerte Schockgefahr besitzt. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß menschliche Plazenta Hyaluronidase in verhältnismäßig großen Mengen enthält und leicht aus Piazeniagewebe isoliert werden kann.

Die Erfindung betrifft somit den in den vorstehenden Patentansprüchen bezeichneten Gegenstand.

In der Praxis wird das Hyaluronidase-Präparat folgendermaßen hergestellt:

Frische oder gefrorene menschliche Plazenta wird gegebenenfalls nach dem Waschen zur Entfernung von Blut im Fleischwolf zerkleinert und mit einer wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 homogenisiert. Alle Arbeitsgänge werden vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb 5°C durchgeführt. Unlösliche Stoffe werden abfiltriert oder abgeschleudert. Man erhält einen klaren Extrakt. Durch die Extraktion mit der wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 wird die Hyaluronidase in maximaler Ausbeute gewonnen, und in diesem pH-Bereich ist das Enzym während der Extraktion stabiler als in saurem Medium.

Als Base für die wäßrig-alkalische Lösung können Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, verschiedene Salze der Borsäure und vorzugsweise alkalische Puffersubstanzen verwendet werden, die die vorgenannten basisch reagierenden Verbindungen enthalten.

Aus dem erhaltenen klaren Extrakt wird in an sich bekannter Weise durch Fraktionierung die Globulinfraktion gewonnen. Beispielsweise kann die Fraktionierung durch fraktionierendes Aussalzen mit Ammoniumsulfat, fraktionierende Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, durch Zinkacetat oder durch Elektrophorese erreicht werden. Auf diese Weise wird eine Trennung von H":moprotein, wie Hemoglobin, und gefärbten Proteinen erreicht. Das günstigste Fraktionierungsverfahren ist die fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat oder mit einem wasserlöslichen Alkohol. Besonders gute Ergebnisse werden mit der fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat erhalten. Bei der fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat wird der erhaltene Extrakt auf einen pH-Wert von 6,5 bis. 7,5 eingestellt und mit kristallinem Ammoniumsulfat oder einer konzentrierten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung unter kräftigem Rühren bis zu 40- bis 50prozentiger Sät'igung versetzt. Die entstandene Fällung wird durch Zentrifugieren isoliert. Diese Fällung bzw. Globulinfraktion enthält nahezu die Gesamtmenge an Hyaluronidase, die in der eingesetzten Plazenta vorhanden war. Gleichzeitig sind große Mengen an Verunreinigungen, wie Hemoprotein im ursprünglichen

Plazentagewebe, wirksam abgetrennt worden. Ferner gelingt es auf diese Weise, das große Volumen des ursprünglichen Extraktes auf ein kleines Volumen in Form einer Ausfällung zu reduzieren. Die fraktionierende Ausfällung mit Ammoniumsulfat kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da das Ammoniumsulfat auf das Enzym eine stabilisierende Wirkung und gleichzeitig eine bakteriostatische Wirkung entfaltet

Zur fraktionierenden Ausfällung mit einem wasserlöslichen Alkohol wird vorzugsweise Äthanol oder Isopropanol verwendet Bei Verwendung von Äthanol beträgt die Endkonzentration etwa 20 bis 25 Prozent und der pH-Wert 6,5 bis SJS. Obwohl die Fraktionierung mit Äthanol gewöhnlich ziemlich genaue Bedingungen hinsichtlich der Temperatur, des pH-Werts und der lonenstärke erfordert unterscheidet sich das Verfahren hinsichtlich Ausbeute und Reinheit nicht wesentlich von der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat

Die als Fällung erhaltene Globulinfraktion ist durch blutdrucksenkende faktoren, blutähnliche Substanzen, I ic-rnoproteine und andere Substanzen noch erheblich verunreinigt. Sie muß daher weiter gereinigt werden. Zur Abtrennung dieser Verunreinigungen wird die Globulinfraktion mit einem Anionenaustauscher behandelt, an dem die Hyaluronidase selektiv adsorbiert wird. Zu diesem Zweck wird die erhaltene Fällung in einer geringen Menge Wasser gelöst und das in der Lösung vorhandene Ammoniumsulfat wird durch Dialyse gegen Wasser abgetrennt. Sodann wird das Diaiysat mit einem Anionenaustauscher zusammengebracht. Die selektive Adsorption der Hyi'-jronidase wird so durchgeführt, daß man das Diaiysat mit dem Anionenaustauscher bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 in eim;r Pufferlösung verminderter MolantJM von etwa 0,005- bis 0,01 molar zusammenbringt. Das Dialysat wird also mit einem etwa 0,005- bis 0,01 molarem Puffer, wie Phosphatpuffer oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 äquilibriert und auf eine mit einem Anionenaustausch or gefüllte Säule gegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Hyaluronidase im Diaiysat wird auf diese Weise selektiv am Anionenaustauscher adsorbiert.

Als Anionenaustauscher kann in dieser Stufe beispielsweise ein Polysaccharidgel mit basischen Gruppen, wie Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-Sephadex) und Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose), ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit basischen Gruppen, wie Dowex 1, d.h. ein Styrol-Divinylbenzo I-Copolymerisat mit quartären Ammoniumgruppen, oder ein Phenol-Formaldehyd-Kondensat mit basischen Gruppen, wie Amberlite XE, verwendet werden.

Danach wird der Anionenaustauscher mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die zum Äquilibrieren verwendet wurde, um die nicht adsorbierten Verunreinigungen abzutrennen. Hierauf wird die Hyarulonidase mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die jedoch eine erhöhte Molarität besitzt, beispielsweise 0,02- bis O.lOmolar, bei gleichem oder niedrigerem pH-Wert, oder mit einer Pufferlösung mit niedrigerem pH-Wert, beispielsweise 6,5 bis 5,0.

Die eluierte Hyaluronidase-Fraktion wird sodann der Gelfiltration an einem stark vernetzten Polysaccharidgel-Molekularsieb, wie Sephadex G-150 oder G-200(ein vernetztes Dextran), oder Sepharose6-B (Agarosegel) oder einem Polyacrylamidgel-Molekularsieb, wie Biogel P-IOO oder P-150, oder einem Acrylamid-Methylenbisacrylamid-Copolymerisat. unterworfen. Das Filtrat kann lyophilisiert werden. Man erhält ein Hyaluronidase-Präparat in Form eines weißen Pulvers.

Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird ein Hyaluronidase-Präparat mit befriedigenden Eigenschäften erhalten. Ein Präparat mit höherer Aktivität kann dadurch hergestellt werden, daß man die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst entweder mit einem Kationenaustauscher, der mit einer etwa 0.01 bis 0,05molaren Pufferlösung bei einem pH-Wert von

ίο etwa 5 bis 7 äquilibriert worden ist oder mit einem Anionenaustauscher, der der gleiche sein kann, wie er in dem vorstehend geschilderten Verfahren verwendet wurde und der mit einer etwa 0,1- bis 0,2molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 7,0 .iquilibriert worden ist, behandelt, um zunächst unerwünschte Verunreinigungen selektiv zu adsorbieren und dadurch abzutrennen.

Als Kationenaustauscher kann beispielsweise ein Polysaccharidgel, wie Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), Carboxymethyldextran (CM-Sephadex), oder ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolyrnerisat, wie Amberlite IRC-50, verwendet werden. Die selektive Adsorption wird in an sich bekannter Weise durchgeführt.

2¹) In beiden Fällen wird die Pufferlösung, die durch den jeweiligen Ionenaustauscher geleitet wird, und die weiter gereinigte Hyaljronidase enthält, mit dem Anionenaustauscher unter den vorgenannten Bedingungen zusammengebracht. Es wird eine besser gereinigte

jo Hyaluronidase-Fraktion erhalten, die anschließend der Gelfiltration unterworfen wird.

Die in der Globulinfraktion enthaltenen Verunreinigungen können auch mittels weniger vernetzter Molekularsiebe und unspezifischer Adsorptionsmittel

r> abgetrennt werden, um die wesentlichen Stufen zu erleichtern, d. h. das Zusammenbringen mit dem Anionenaustauscher und die Gelfiltration. Zu diesem Zweck wird die Globulinfraktion durch ein Molekularsieb, wie Sephadex G-100 oder G-150, geleitet, und in

■»o drei Fraktionen fraktioniert, d. h. eine Fraktion, die Substanzen mit höherem Molekulargewicht enthält, die Produktfraktion, die Substanzen mit einem Molekulargewicht von 50 000 bis 100 000 enthält, sowie eine Substanzen mit niedrigerem Molekulargewicht enthal-

■r> tende Fraktion. Die Produktfraktion kann mit einem unspezifischen Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, Kaolin oder Hydroxylapatit, zusammengebracht werden. Die auf diese Weise erhaltene partiell gereinigte Fraktion kann sodann mit dem Kationenaustauscher

'.» oder Anionenaustauscher nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren und anschließend nach dem eingargs beschriebenen Verfahren mit dem Anionenaustauscher behandelt und der Gelfiltration unterworfen werden.

.ι Überraschenderweise zeigt das Hyaluronidase-Präparat der Erfindung keine Nebenwirkungen, wenn es dem Menschen injiziert wird.

Das Hyaluronidase-Präparat der Erfindung hat folgende Eigenschaften:

Das Molekulargewicht (bestimmt durch Gelfiltration) beträgt etwa 70 000, der isoelektrische Punkt (bestimmt durch Elektrofocussierung) liegt bei 5,2 und das pH-Optimum bei 3,6 bis 4,0, bestimmt mit Hyaluronsäure aus menschlicher Nabelschnur als Substrat. Das Enzym ist sehr stabil, wenn es unterhalb 30" C in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 6 bis 7 aufbewahrt wird.

Zur Bestimmung des Molekulargewichts von Hyalu-

ronidase aus menschlicher Plazenta wurde ein Gelfiltrationsverfahren entsprechend Biochem. J_n Bd. 91 (1964), S. 222—233 angewendet. Als Gel diente Sephadex G-200. Die Säulenabmessungen betrugen 15 χ 260 mm. Als Lösungsmittel wurde 0,1 n-Kochsalzlösung verwendet. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 0,23 ml/Min. Folgende Substanzen bekannten Molekulargewichts wurden als Eichsubstanzen verwendet:

Rinder-Cytochrom C
Rinder-Hämoglobin
Menschliches Transferrin
Menschliches y-Globulin

(MG 12 800)
(MG 65 000)
(MG 90 000)
(MG 160 000)

In der vorgenannten Literaturstelle finden sich auch Ausführungen über die Genauigkeit von derartigen Molekulargewichtsbestimmungen (vgl. insbesondere S. 235, rechte Spalte):

Hyaluronidase aus Stiertestikel hat dagegen ein Molekulargewicht von 11 000, einen isoelektrischen Punkt von 5.7 und ein pH-Optimum von 4.0 bis 5.5: vgl. Biochim. Biophys. Acta, Bd. 11 (1953), S. 5? t bis 529 und J. Biol. Chem., Bd. 238 (1963), S. 3522 bis 3527.

Aus den vorstehend angegebenen Werten ist ersichtlich, daß sich das Hyaluronidase-Präparat der Erfindung aus menschlicher Plazenta von Hyaluronidase aus Stiertestikel unterscheidet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Bestimmung der Hyaluronidase-Aktivität wird nach einer modifizierten Methode von N. N. A r ο η s ο η , Jr. und E. A. P a d i d s ο η , J. Biol. Chem., Bd. 242 (3) (1967), Seiten 437 bis 440, und V. Patel, A. L. Ta ρ pe I und J. S. O'Brien, Biochem. Med., Bd. 3 (1972), Seiten 447 bis 45/, durchgeführt. In einem Reagenzglas werden 0,04molare Acetatpuffer (pH 3,6), 0,15molare Kochsalzlösung, 150 γ Natriumhyaluronat als Substrat und die Enzymlösung miteinander vermischt. Das Gesamtvolumen beträgt 0,40 ml. Das Reaktionsgemisch wird 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird das ReaKionsgemisch zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion mit 50 μΙ 50prozentiger Trichloressigsäurelösung versetzt. Ein anderes Reagenzglas wird zur Kontrolle ohne Zusatz von Enzym inkubiert und nach der Inkubierung unter den gleichen Bedingungen mit Trichloressigsäure und dem Enzymextrakt versetzt. In Abwesenheit des Enzyms wild kein Abbau der Hyaluronsäure beobachtet. Das mit Trichloressigsäure angesäuerte Reaktionsgemisch wird mit 50 μΙ einer Alkalilösung entsprechender Konzentration neutralisiert. Gewöhnlich wird 3,4 η-Natronlauge verwendet. Die Menge von N-Acetylhexosamin-Endgruppen. die aus derr Substrat durrh die enzymatische Reaktion abgespalten wurde, wird nach der Methode von Reissig.Stromingerund Leloir.J. Biol. Chem., Bd. 217 (1955). Seiten 959 bis 966, unter Verwendung von N-Acetylglucosamin als Standard bestimmt. Eine Aktivitätseinheit von Hyaluronidase ist diejenige Enzymmenge, die 1 Mol N-Acetylglucosamin aus Hyaluronsäure bei 37°C/min freisetzt.

Beispiel 1

Gefrorene menschliche Plazenta, die in feuchtem Zustand 2676 g wiegt, wird in einem Fleischwolf zerkleinert und dreimal in jeweils 10 Liter kalter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und filtriert, um anhaftendes Blut sorgfältig abzutrennen. l^;s werden 2071 g gewaschenes Plazentagcwcbc erhalten. (i:is mit einem Homogenisator mit dem 2.^r)f;tchcn Volumen gekühlten 0.02molaren Tris-HCI-Puffer (pH 9,0) bei der Höchstgeschwindigkeit des Schneidmesser 30 Sekunden homogenisiert wird. Es werden 5450 ml Homogenat erhalten. Das Homogenat wird 2 Stunden stehengelassen und sodann 15 Minuten bei 9600 g zentrifugiert Es werden 3950 ml eines klaren Überstands erhalten. Der Überstand wird mit 5 n-Salzsäure unter kräftigem Rühren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt Sodann werden 1290 g kristallines Natriumsulfat bei einer Temperatur von 0 bis 5°C

iü eingetragen. Man erhält eine etwa 50prozentige gesättigte Lösung. Der pH-Wert der Lösung wird erneut überprüft und mit 1 η-Natronlauge auf 7,0 eingestellt Hierauf wird die Lösung 15 bis 18 Stunden bei 0 bis 5° C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird 15 Minuten bei 9600 g zentrifugiert und in 200 ml Wasser gelöst Die Lösung wird gegen Wasser dialysiert, bis die Lösung frei von Sulfationen ist Das Dialysat wird mit einer 0,01 molaren Phosphatpufferlö sung (pH 8,2) äquilibriert und auf <».^:ne mit DEAE-CeIIu-

2Ii lose gefüllte Säule mit den Abmessungen 4,5 χ 50 cm gegeben. Die DEAE-Cellulose wuroe vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert. Sodann wird die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, um nicht absorbierbare Verunreinigungen abzutrennen. Hierauf wiro das Enzym mit 0,05molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) eluiert. Es werden 725 ml Eluat erhalten, das durch Dialyse gegen Wasser entsalzt wird. Die spezifische Aktivität des Enzyms beträgt 4,5 Millieinhei- ten pro mg Protein. Der Reinigungsgrad auf der Stufe

in der Ammoniumsulfat-Fraktionierung beträgt 1,8 und nach der Chromatographie an DEAE-Cellulose 10.

Die vom Puffersalz befreite Hyaluronidase-Fraktion wird gefriergetrocknet und in 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 7,0) gelöst. Diese Lösung wird der aufsteigenden

'·'' Gelfiltration an Sephadex G-200 unterworfen. Das Eluat wird in 2-ml-Fraktionen aufgefangen, die Hyaluro- nidase-Funktionen werden vereinigt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat gefriergetrocknet Es werden 20,8 mg stark gereinigte Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 17,2 Millieinheiten pro mg Proiein erhalten. Der Reinigungsgrad bei Verwendung von Sephadex G-200 beträgt 3,8.

Das erhaltene Hyaluronidase-Präparat hat ein Mole kulargewicht von etwa 69 000, bestimmt durch Gelfiltra-

'"' tion, und einen isoelektrischen Punkt von 5,19. Das Präparat ist bei 3O⁰C in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 6,5 für mindestens 24 Stunden stabil. Bei 30minütiger Inkubation bei 60°C und beim gleichen pH-Wert gehen 90 Prozent der ursprünglichen Aktivität

" verloren. Andererseits zeigt das Präparat keinen Aktivitätsverlust bei mindestens 5maligem wiederholtem Gefrieren und Auftauen. Ferner ist das Präparat stabil bei 0⁰C in wäßriger Lösung vom pH-Wert 4 bis 7,6.

Beispiel 2

1,5 kg gemäß Beispiel 1 hergestelltes gewaschenes Plazentageweo" wird zusammen mit dem 2,5fachen Volumen Wasser in einem hochtourigen Schneidmi-' scher homogenisiert. Das erhaltene Homogenisat wird mit 2 η-Natronlauge unter kräftigem Ruhten auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und 1 Stunde stchengelas sen. Sodann wird das Gemisch unter vermindertem Druck durch ein Filtertuch filtriert und der pH-Wert des Filtrats mit 2 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Die Lösung wird mit kristallinem Ammoniumsiilfat bis zur 45prozcntigen Sättigung versetzt und die entstandene Fällung nach mehrstündigem Stehen 20

JA 40 ^r)29

Minuten I)Ci b800 g alvcnii liugiert. Du ! .ι!·. ■'.■ .·-ι ■ , wenig Wasser gelöst und die Losung /ur Abtrennung von Amuioniumsuliat gegen Wasser ι!ι.!^;\■■■·■''■ Dm· Dialys.it wird mit ti.OI molarer I'lio^- jvi.i; |ΐ·.; 11 l ;i< >·-ι id _t· (pllb.O) äquilibriert uiid anschließend .ii-f eine mi' (M-Sephai.!e\ (('-ΊΟ'! L't lii ι· siii:!i' >ir: ';·■ \'·ι: ■■■-'.!r gen ! -. HO cm gegeben. Uv \.nlier in; ü< '■' 'L'i.'lr ί Pufferlösung iiquililn ieit wurde, Smlann win! nut dieser Pufferlösung cluiert. Das ΙΊικιΐ wird anlgelangen. I.in gniUor Teil dor mehtakliven gloliulinahuliehen Proteine bleibt an der (M-Sepliadex-Kolonne adsorbiert. Im Kluat liegt partiell gereinigte llyaluronidase vor. Die niehtadsorbierte Fraktion wird mit 0,01 molarem Tris-Piiffcr (pi I 8.0)ii(|uilibricrt und auf einem mit DHAK-Scphadex (A-¹JO) gefüllte Säule mit den Abmessungen 2x15 cm gegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibrier! worden ist Ks wirtl mit 0.05molarer Tris-Pufferlösung (pH 7,0) cluiert und das Kliint gefriergetrocknet. Ks weiden JO mg partiell gereinigte . : .;: Iu r< und.. ·_■ ·"■;' ■ .!!■.: .pi' -■ 111 ■-(. π l'T! Aktivität von II..' \ 1:11 icmheit'.¹Ii pro mg ^!'r· 'lein erliallen Der Reinignn.L's-'.•r.ul bei \ ;ΤΛ-,·ιιιΙι;η.ι· ·. on', M Senhadi'x beträgt i.Miinl ..■f. I)|-A!·. Sepli.i·¹' \ ".·>.

!() ntg des Krvwnpräparats ν -.""den in 2 ml einer ii.1 ")iiu)iaren I'hosphaipiiffurlö'siiiig .! I hi) gelost und der ansteigenden (ielfiltration an Sephadex Cϊ-200 unterworfen. Die abfließende Lösung wird in 2-ml-Portionen aufgefangen. Die Hyaluronidase-Fraktionen (enzymatisch festgestellt) werden vereinigt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat gefriergetrocknet. Ks werden 15,7 g hochgereinigte llyaluronida.se mit einer spezifischen Aktivität von 19,8 Millieinheiten pro mg Protein erhalten. Die llyaluronidase hat ein Molekulargewicht von 72 000 und einen isoelektrischen Punkt von 3.21. Das Präparat hat die gleiche Stabilität wie das gemäß Beispiel I hergestellte Präparat.

Claims

Patentansprüche:

1. Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000, einem isoelektrischen Punkt von etwa 5,2, einem pH-Optimum von 3,6 bis 4,0 und einer Stabilität von mindestens 24 Stunden in wäßriger Lösung bei Temperaturen unterhalb 30⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 7, hergestellt durch Extrahieren von menschlichem Plazentagewebe mit einer wäßrig-al- ι ο kaiischen Lösung mit einem ρ H-Wert von 74 bis 10^, Isolieren der Globulinfraktion aus dem erhaltenen Extrakt, Adsorption der Globulinfraktion an einem Anionenaustauscher, der mit 0,005- bis 0,01 molarer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 äquilibriert worden ist, Eluieren der am Anionenaustauscher adsorbierten Hyaluronidase mit einer Pufferlösung erhöhter Molarität und/oder erniedrigtem pH-Wert und Gelfiltration der erhaltenen Hyaluronidase-Fraktion.

2. Hyaiuronidase-Präparai nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst entweder mit einem Kationenaustauscher, der mit einer 0,01- bis 0,05molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 2ϊ bis 7 äquilibriert worden ist, oder mit einem Anionenaustauscher behandelt worden ist, der mit einer 0,1- bis 0,2molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0 äquilibriert worden ist.

3. Hyaluronidase-Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt.

4. Arzneimittel mit spreading factor-Wirkung in Haut und Bindegewebe zur parenteralen Verabreichung, enthaltend das Hyaluronidase-Präparat nach i"> Anspruch I bis 3.