DE3034045C2 - - Google Patents
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Description
Für verschiedene Zwecke, insbesondere für die gezielte
Spaltung von Proteinen und Peptiden, beispielsweise im Rahmen
der Sequenzbestimmung, sind Endoproteinasen, die an einer bestimmten
Stelle spalten, von technischem und wissenschaftlichem
Interesse. So ist bereits eine am C-terminalen Ende von Lysin
die Peptidbindung spaltende Endoproteinase aus Pilzen bekannt.
Dieses Enzym ist jedoch schwierig zugänglich und steht daher
nicht im gewünschten Ausmaß zur Verfügung. Nunmehr wurde ein
Enzym der gleichen Spezifität in Bakterien gefunden, welches
als Endproteinase-Lys-C charakterisiert wird und sich von
anderen bakteriellen Proteasen durch die Eigenschaften deutlich
unterscheidet.
Die erfindungsgemäße neue Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien
ist dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Kette von Molekulargewicht
35 000-38 000 Dalton besteht, ein pH-Optimum
bei pH 7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alpha₂-
Makroglobulin, α₁-Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure
nicht gehemmt wird.
Das erfindungsgemäße Enzym neigt unter nicht reduzierenden Bedingungen
zur Aggregation, wobei bevorzugt Tetramere mit einem
Molekulargewicht von etwa 150 000 D und Oktamere mit einem
Molekulargewicht von etwa 300 000 D gebildet werden, die enzymatisch
aktiv sind.
Das pH-Optimum des neuen Ezyms liegt, wie bereits erwähnt, bei
pH 7,7, bestimmt bei 37°C nach der Azocoll-Methode.
In der Elektrofokussierung spaltet sich das Enzym in zahlreiche
Banden auf, die sich über fast den gesamten pH-Bereich
erstreken. Dieses Verhalten läßt darauf schließen, daß es sich
um ein Glycoprotein handelt; der isoelektrische Punkt des
Enzyms ist daher nicht bestimmbar.
Wie bereits erwähnt, hemmen alpha₂-Makroglobulin, a₁-Antitrypsin
und Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis höchstens 10-2 M
nicht. Benzamidin hemmt dagegen bei 2,5 mM etwa 50%; durch
Erhöhung der Benzamidinkonzentration lassen sich 70% Hemmung
erzielen. Eine vollständige Hemmung ergibt Aprotinin.
Die Substratspezifität des neuen Enzyms zeigt Tabelle 1. Seine
spezifische Aktivität, gemessen mit Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-
p-nitroanilid bei 25°C beträgt ca. 25 U/mg oder ca. 50 Azocoll-Einheiten/mg
Enzym bei 37°C.
Im Gegensatz zu der aus Lysobacter beschriebenen Proteinase II
spaltet das erfindungsgemäße Enzym nicht aminoständig, sondern
carboxyständig am Lysin, Die hohe Spezifität zeigt auch die
geringe Zahl von Banden, die bei Gel-Chromatographie von mit
diesem Enzym erhaltenen Fibrin-Spaltprodukten auftreten.
SubstratAbbau durch
Endoproteinase Lys-C
SubstratAbbau durch
Endoproteinase Lys-C
Azocoll+
Casein+
Fibrinogen+
Hämoglobin+
TLME++
Chromozym PLR++
S 2251R++
Tos-Arg-Me-
Chromozym THR-
BAEE-
Leu-pNA-
Lys-pNA-
ATEE-
B-Kette von Insulin-
Abkürzungen
TLME= Tosyl-lysyl-methylester
BAEE= Benzoyl-arginyl-äthylester
ATEE= Arginyl-tyrosyl-äthylester
Chromozym PLR= Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitroanilid
Chromozym THR= Tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-nitroanilid
S 2251R= Valyl-leucyl-lysyl-p-nitroanilid
Die Tabelle 2 zeigt die Unterschiede des erfindungsgemäßen
Enzyms gegen bisher in Lysobacter gefundene Proteasen.
Das erfindungsgemäße Enzym läßt sich aus den Kulturbrühen
von Mikroorganismen
der Ordnung
Lysobacterales (vgl. International Journal of Systematic Bacteriology 28, 367-393 (1978)) und hierunter vorzugsweise solchen der
Familie Lysobacteraceae, z. B. der Gattung Lysobacter
(auch Myxobacter genannt) nach üblichen Enzymreinigungsmethoden,
wie Ammonsulfatfraktionierung, Acetonfraktionierung
und Molekularsiebchromatographie von den meisten
Verunreinigungen befreien. Die Abtrennung anderer
Proteasen gelingt erfindungsgemäß durch Behandlung mit
trägerfixiertem alpha₂-Makroglobulin-Metallkomplex. Bei
diesem, für Enzymreinigungen neuen Verfahrensschritt
werden schwer zu entfernende Verunreinigungen, insbesondere
aber die begleitenden Proteasen, abgetrennt,
während die erfindungsgemäße Endoproteinase Lys-C in
Lösung bleibt und aus dieser isoliert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Endoproteinase
Lys-C ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man
eine filtrierte, oder nach an sich bekannten Methoden
gereinigte Kulturbrühe aus Lysobacterales-Züchtung über
trägerfixiertem alpha₂-Makroglobulin-Metall-Komplex
chromatographiert und das Enzym aus dem Filtrat gewinnt.
In dem oben erwähnten alpha₂-Makroglobulin-Metall-Komplex
besteht das Metall aus einem zweiwertigen Metall der
Gruppe Zn, Co, Ni oder/und Cu. Die Verwendung dieses
Komplexes und seine Herstellung ist in der gleichzeitig
eingereichten deutschen Patentanmeldung P 30 34 043 (vgl. zugehörige DE-OS)
näher beschrieben.
Wie bereits erwähnt, kann direkt von der Kulturbrühe
ausgehend die erfindungsgemäße Behandlung mit trägerfixiertem
alpha₂-Makroglobulin-Metall-Komplex vorgenommen
werden. Zweckmäßiger ist es jedoch, die Proteine vorher
von anderen Substanzen abzutrennen und eine Vorfraktionierung
durchzuführen.
Die Abtrennung der Proteine aus dem Kulturfiltrat erfolgt
zweckmäßigerweise durch Fällung mit Ammonsulfat, obwohl
auch
andere übliche Proteinfällungsmittel, welche die enzymatische
Aktivität der darin enthaltenen, aktiven Proteine nicht beeinträchtigt,
verwendet werden können. Bei Zusatz von Ammonsulfat
gibt man dieses zweckmäßig bis zu einer Konzentration von
2,5-3,5 M, vorzugsweise 3-3,2 M zu. Der dabei gebildete
Niederschlag wird abgetrennt, beispielsweise abfiltriert, und
enthält die gesamte gesuchte Aktivität. Nach Auflösen mit
Wasser und vorzugsweise Entfernung von restlichem Ammonsulfat
durch Dialyse kann man die so erhaltene Lösung entweder der
alpha₂-Makroglobulin-Metall-Komplex-Chromatographie unterwerfen,
oder einer weiteren Vorreinigung unterziehen.
Wird eine weitere Vorreinigung gewünscht, so führt man zweckmäßig
eine Ammonsulfatfraktionierung durch, wobei die zwischen
2 und 3 M Ammonsulfatkonzentration ausfallende Fraktion die gewünschte
Aktivität enthält. Dabei wird zweckmäßig in einer
ersten Stufe Ammonsulfat auf 0,7-1,3 M zugegeben, der Niederschlag
abgetrennt und dann die Ammonsulfatkonzentration auf
3 M, vorzugsweise auf 2,25-2,32 M, erhöht, und der dabei erhaltene
aktive Niederschlag in üblicher Weise abgetrennt und
durch Dialyse von verbliebenem Ammonsulfat gereinigt.
Falls die so erhaltene Lösung nicht der alpha₂-Makroglobulin-
Metall-Komplex-Behandlung unterworfen wird, kann auch noch
eine Acetonfraktionierung und eine Molekularsiebchromatographie
vorgeschaltet werden. Im Falle einer Acetonfraktionierung fällt
man durch Zusatz von 0,3-1,5 Vol., vorzugsweise 0,5-1,2 Vol.
Aceton, trennt den Niederschlag ab und gibt weitere 1,2 Vol. Aceton zu,
trennt den Niederschlag ab und und löst ihn in Puffer pH 7,5-9 auf. Die Pufferkonzentration
liegt zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,05 M. Nach Dialyse
zur Entfernung von restlichem Aceton und ggf. Einengung der erhaltenen Lösung
kann über ein Molekularsieb, beispielsweise vernetztes Dextran, wie
Sephadex-G-100 chromatographiert werden, wobei die gewünschte
Aktivität zu Beginn aus der Säure eluiert wird, während die
bekannte AL-1 Proteinase I erst gegen Ende eluiert wird. Das
Eluat wird, ggf. nach Konzentrierung, über trägerfixiertem
alpha₂-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert, wobei
die gesuchte Endoproteinase-Lys-C durchläuft. Die Elution erfolgt
vorzugsweise im pH-Bereich 7,0-8,5 bei einer Pufferkonzentration
von 0,03-0,08 M. Die üblichen in diesem Bereich
wirksamen Puffersubstanzen sind geeignet, bevorzugt werden
Tris-Puffer, Hepes-Puffer und Phosphat-Puffer. Gute Ergebnisse
werden bei pH 6,5-9 und 0,01-0,1 Puffergehalt erreicht. Das
Eluat enthält reine Endoproteinase-Lys-C und Puffer und kann
direkt lyophilisiert werden.
Das erfindungsgemäße neue Enzym ist insbesondere zur Sequenzbestimmung
von Proteinen und Peptiden anwendbar. Auf Grund seiner
sehr spezifischen Spaltungsaktivität läßt es sich auch therapeutisch
einsetzen, beispielsweise bei Gerinnungsstörungen, beziehungsweise
anderen Erkrankungen, bei denen die Spaltung von
Proteinketten angestrebt wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Gewinnung des erfindungsgemäßen
Enzyms und seine Bestimmung.
206 Ltr. Lysobacter-Kulturfiltrat werden langsam mit festem
Ammonsulfat auf 3-3,2 M ausgefällt. Der geringe flockige
Niederschlag wird abfiltriert. Der Niederschlag auf den Filtern
wird mit wenig dest. Wasser gelöst und mit festem Ammonsulfat
auf 0,9 M (1,3-3 M) ausgefällt und zentrifugiert. Den Überstand
fällt man nun weiter auf 2,25-2,32 M Ammonsulfat aus,
und filtriert oder zentrifugiert den Niederschlag, löst ihn mit
ca. 400 ml dest. Wasser und dialysiert gegen fließendes
Leitungswasser.
Das Dialysat wird mit 0,5-1,2 Vol. -20°C kaltem Aceton versetzt
und abzentrifugiert. Den Überstand (klar) versetzt man
nun mit weiteren 1,2 Vol. (berechnet aus Anfangsvol.) Aceton,
zentrifugiert den Niederschlag ab und löst ihn so konzentriert
wie möglich mit 0,025 M Tris, pH 9 auf und dialysiert gegen
10 Ltr. desselben Puffers.
Das Dialysat wird auf eine Sephadex-G-100-Säule aufgetragen mit
folgenden Abmessungen:
⌀ 5 cm, Länge 150 cm, Säulenvol. ca. 2,9 Ltr.
⌀ 5 cm, Länge 150 cm, Säulenvol. ca. 2,9 Ltr.
Die Säule wird mit 0,025 M Tris, pH 9,0 äquilibriert und nach
dem Aufziehen mit demselben Puffer nachgewaschen.
Lysobacter-Protease wird zu Beginn eluiert.
Die Eluate werden mit festem Ammonsulfat auf 3,2 M ausgefällt
und zentrifugiert. Der konzentriert aufgenommene Niederschlag
wird gegen 0,05 M Tris pH 8,0 dialysiert.
Alpha₂-Makroglobulin-Zn-Komplex, kovalent an Agarose gebunden,
wird zur Weiterreinigung verwendet. 110 ml dieses Trägermaterials
werden in 3 cm ⌀ Säule, Länge 17,5 cm, eingefüllt und mit
0,05 M Tris, pH 8,0 gewaschen, bis sich kein Protein im Durchlauf
befindet.
Nun wird das Dialysat aufgezogen und mit 0,05 M Tris, pH 8,0
nachgewaschen. Proteinase-Lys-C läuft durch.
Der Durchlauf wird gegen 0,05 M Glycin, pH 8,0 dialysiert und
auf 0,4 mg/ml mit demselben Puffer verdünnt und lyophilisiert.
Gesamt-Ausbeute:
ca. 50-140 mg Protein, 6-23 U/mg Proteinase Lys-C
Chromozym TH Aktivität <0,2%.
Gesamt-Ausbeute:
ca. 50-140 mg Protein, 6-23 U/mg Proteinase Lys-C
Chromozym TH Aktivität <0,2%.
Herstellung der Lösungen:
- 1. 0,025 M Tris, 0,001 M EDTA, pH 7,7
0,303 g Tris, 37,2 mg EDTA werden in ca. 80 ml bidest. Wasser gelöst und pH mit 2 N HCl auf 7,7 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt. - 2. Chromozym-PL (14 µM/ml)
9 mg Chromozym-PL in 1 ml bidest. H₂O auflösen. - 3. Endoproteinase-Lys-C-Lösung
10 mg Lyophilisat in 1 ml bidest. H₂O lösen. Vor Gebrauch 1 : 100 mit Lösung 1 verdünnen.
Ausführung:
405 nm1 cm Halbmikroküvette
25°CTestvolumen 1,07 ml
In Küvette pipettieren:
Lösung 11 ml
Lösung 20,05 ml
mischen, ca. 2 min bei 25°C temperieren.
Probelösung 30,02 ml
mischen,
aus linearer Phase nach ca. 5 min
ΔE/min berechnen.
Berechnung:
Claims (6)
1. Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien, dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus einer Kette vom Molekulargewicht
35 000-38 000 Dalton besteht, ein pH-Optimum bei
pH 7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alpha₂-Makroglobulin,
α₁-Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure
nicht gehemmt wird.
2. Verfahren zur Gewinnung der Endoproteinase-Lys-C
von Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man filtrierte oder nach üblichen Methodenn
vorgereinigte Kulturbrühe aus Lysobacterales-Züchtung
über trägerfixierten alpha₂-Makroglobulin-
Metall-Komplex chromatographiert und das Enzym aus
dem Filtrat gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man in 0,01-0,1 M Puffer pH 6,5-9
chromatographiert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß man aus der filtrierten
Kulturbrühe das Protein durch Ammonsulfat fällt, den Niederschlag
nach erneutem Auflösen zwischen 1,3 und 3 M Ammonsulfat fraktioniert
und die in diesem Bereich unlösliche Fraktion in Wasser
auflöst und nach Dialyse mit Aceton zwischen 1,2 und 2,4 Vol.
Aceton fraktioniert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man den Niederschlag der Aceton-Fraktionierung
nach Auflösung über einem Molekularsieb chromatographiert
und die zu Beginn der Chromatographie eluierte
Proteinfraktion der alpha₂-Makroglobulin-Metall-Komplex-
Chromatographie unterwirft.
6. Verwendung der Endoproteinase-Lys-C von Anspruch 1 zur
Sequenzbestimmung von Proteinen und Peptiden.
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