CH651061A5 - Endoproteinase-lys-c aus bakterien, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung. - Google Patents

Description

651 061

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Kette vom Molekulargewicht

35 000-38 000 besteht, ein pH-Optimum bei pH 7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alpha2-Makroglobulin, ai-Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure nicht gehemmt wird.

2. Verfahren zur Gewinnung der Endoproteinase-Lys-C gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man filtrierte oder vorgereinigte Kulturbrühe eines geeigneten Bakterienstammes überträgerfixierten alphaa-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert und das Enzym aus dem Filtrat gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man in 0,01-0,1 M Puffer pH 6,5-9 chromatographiert.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Kulturbrühe aus Lysobacterales-Züchtung verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der filtrierten Kulturbrühe das Protein durch Ammonsulfat fällt, den Niederschlag nach erneutem Auflösen zwischen 1,3 und 3 M Ammonsulfat fraktioniert und die in diesem Bereich unlösliche Fraktion in Wasser auflöst und nach Dialyse mit Aceton zwischen 1,2 und 2,4 Vol. Aceton fraktioniert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man den Niederschlag der Aceton-Fraktionierung nach Auflösung über einem Molekularsieb chromatographiert und die zu Beginn der Chromatographie eluierte Proteinfraktion der alphai-Makroglobulin-Metall-Komplex-Chromatogra-phie unterwirft.

7. Verwendung der Endoproteinase-Lys-C gemäss Anspruch 1 zur Sequenzbestimmung von Proteinen und Peptiden.

Für verschiedene Zwecke, insbesondere für die gezielte Spaltung von Proteinen und Peptiden, beispielsweise im Rahmen der Sequenzbestimmung, sind Endoproteinasen, die an einer bestimmten Stelle spalten, von technischem und wissenschaftlichem Interesse. So ist bereits eine am C-terminalen Ende von Lysin die Peptidbindung spaltende Endoproteinase aus Pilzen bekannt. Dieses Enzym ist jedoch schwierig zugänglich und steht daher nicht im gewünschten Ausmass zur Verfügung. Nunmehr wurde ein Enzym der gleichen Spezifität in Bakterien gefunden, welches als Endoproteinase-Lys-C charakterisiert wird und sich von anderen bakteriellen Proteasen durch die Eigenschaften deutlich unterscheidet.

Die erfindungsgemässe neue Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien ist dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Kette von Molekulargewicht 35 000-38 000 besteht, ein pH-Optimum bei pH 7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alphai-Makroglobulin, ai-Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure nicht gehemmt wird.

Das erfindungsgemässe Enzym neigt unter nicht reduzierenden Bedingungen zur Aggregation, wobei bevorzugt Tetramere mit einem Molekulargewicht von etwa 150 000 D und

Oktamere mit einem Molekulargewicht von etwa 300 000 D gebildet werden, die enzymatisch aktiv sind.

Das pH-Optimum des neuen Enzyms liegt, wie bereits erwähnt, bei pH 7,7, bestimmt bei 37 °C nach der Azocoll-5 Methode.

In der Elektrofokussierung spaltet sich das Enzym in zahlreiche Banden auf, die sich über fast den gesamten pH-Bereich erstrecken. Dieses Verhalten lässt darauf schliessen, dass es sich um ein Glycoprotein handelt; der isoelektrische io Punkt des Enzyms ist daher nicht bestimmbar.

Wie bereits erwähnt, hemmen alphai-Makroglobulin, a.-Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis höchstens 10° M nicht. Benzamidin hemmt dagegen bei 2,5 mM etwa 50ü'o; durch Erhöhung der Benzamidinkonzen-i5 tration lassen sich 70% Hemmung erzielen. Eine vollständige Hemmung ergibt Aprotinin.

Die Substratspezifität des neuen Enzyms zeigt Tabelle 1. Seine spezifische Aktivität, gemessen mit Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitroanilid bei 25 °C beträgt etwa 25 U/mg oder etwa 20 50 Azocoll-Einheiten/mg Enzym bei 37 CC.

Im Gegensatz zu der aus Lysobacter beschriebenen Proteinase II spaltet das erfingungsgemässe Enzym nicht amino-ständig, sondern carboxyständig am Lysin. Die hohe Spezifität zeigt auch die geringe Zahl von Banden, die bei Gel-Chro-25 matographie von mit diesem Enzym erhaltenen Fibrin-Spalt-produkten auftreten.

Tabelle 1

Substratspezifität von Endoproteinase Lys-C

30

Substrat

Abbau durch Endoproteinase Lys-C

Azocoll Casein Fibrinogen Hämoglobin TLME

Chromozym PL® S 2251® Tos-Arg-Me Chromozvm TH® BAEE Leu-pNA Lys-pNA ATEE

B-Kette von Insulin

35

40

+

+

+

+ + + + + + +

Abkürzungen so TLME BAEE ATEE Chromozym PL® 55 Chromozym TH®

S 2251®

= Tosyl-lysyl-methylester = Benzoyl-arginyl-äthylester = Arginyl-tyrosyl-äthylester = Tosyl-glycvl-prolyl-lysyl-p-nitroanilid

= Tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-nitroanilid

= Valyl-leucyl-lysyl-p-nitroanilid

Die Tabelle 2 zeigt die Unterschiede des erfindungsge-60 mässen Enzyms gegen bisher in Lysobacter gefundene Proteasen.

651 061

Tabelle 2

EC-Nummer Molekulargewicht

Reaktionsmechanismus Spezifität a-lytic-proteinase ß-lytic-protease

AL-1 Proteinase I

3.4.21.12 20 000 D 19 000 D

3.4.99.29

AL-1 Proteinase II 3.4.99.30 Endoproteinase Lys-C -

9 000 D (Gelfiltration), 14 000 D

(Sedimentationsäquili-

brum)

17 000 D

36-38 000 D

(red. SDS-Gel),

etwa 35 000 D

(Sephacryl S-300)

Serin-Protease

Zn-Metalloproteinase unbekannt unbekannt Serin-Protease

Carboxylgruppe neutraler Aminosäuren, bes. Alanin Carboxylgruppe hydrophober Aminosäuren, lysiert bakterielle Zellwände hydrophobe Aminosäuren, lysiert bakterielle Zellwände (besonders grampositive)

Aminogruppen von Lysin Carboxylgruppe von Lysin

Das erfindungsgemässe Enzym lässt sich aus den Kulturbrühen von Bakterien, die dieses Enzym in ausreichender Menge bilden, insbesondere aus solchen der Ordnung Lyso-bacterales und hierunter vorzugsweise solchen der Familie Lysobacteraceae, z.B. der Gattung Lysobacter (auch Myxo-bacter genannt), nach üblichen Enzymreinigungsmethoden, wie Ammonsulfatfraktionierung, Acetonftraktionierung und Molekularsiebchromatographie, von den meisten Verunreinigungen befreien. Die Abtrennung anderer Proteasen gelingt erfindungsgemäss durch Behandlung mit trägerfixiertem alpha:-Makroglobulin-Metallkomplex. Bei diesem für Enzymreinigungen neuen Verfahrensschritt werden schwer zu entfernende Verunreinigungen, insbesondere aber die begleitenden Proteasen, abgetrennt, während die erfindungsgemässe Endoproteinase Lys-C in Lösung bleibt und aus dieser isoliert werden kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von Endoproteinase Lys-C ist daher dadurch gekennzeichnet,

dass man eine filtrierte oder gereinigte Kulturbrühe eines geeigneten Bakterienstammes über trägerfixiertem alpha>Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert und das Enzym aus dem Filtrat gewinnt.

In dem oben erwähnten alphai-Makroglobulin-Metall-Komplex besteht das Metall aus einem zweiwertigen Metall der Gruppe Zn, Co, Ni oder/und Cu. Die Verwendung dieses Komplexes und seine Herstellung ist in der gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung P 30 34 043.3 (int. Nr. 2380) näher beschrieben.

Wie bereits erwähnt, kann direkt von der Kulturbrühe ausgehend die erfindungsgemässe Behandlung mit trägerfixiertem alphai-Makroglobulin-Metall-Kompelex vorgenommen werden. Zweckmässiger ist es jedoch, die Proteine vorher von anderen Substanzen abzutrennen und eine Vorfraktionie-rung durchzuführen.

Die Abtrennung der Proteine aus dem Kulurfiltrat erfolgt zweckmässigerweise durch Fällung mit Ammonsulfat, obwohl auch andere übliche Proteinfällungsmittel, welche die enzy-matische Aktivität der darin enthaltenen, aktiven Proteine nicht beeinträchtigt, verwendet werden können. Bei Zusatz von Ammonsulfat gibt man dieses zweckmässig bis zu einer Konzentration von 2,5-3,5 M, vorzugsweise 3-3,2 M, zu. Der dabei gebildete Niederschlag wird abgetrennt, beispielsweise abfiltriert, und enthält die gesamte gesuchte Aktivität. Nach Auflösen mit Wasser und vorzugsweise Entfernung von restlichem Ammonsulfat durch Dialyse kann man die so erhaltene Lösung entweder der alpahi-Makroglobulin-Metall-Kom-

plex-Chromatographie unterwerfen, oder einer weiteren Vorreinigung unterziehen.

25 Wird eine weitere Vorreinigung gewünscht, so führt man zweckmässig eine Ammonsulfatfraktionierung durch, wobei die zwischen 2 und 3 M Ammonsulfatkonzentration ausfallende Fraktion die gewünschte Aktivität enthält. Dabei wird zweckmässig in einer ersten Stufe Ammonsulfat auf 0,7-1,3 M 3o zugegeben, der Niederschlag abgetrennt und dann die Ammonsulfatkonzentration auf 3 M, vorzugsweise auf 2,25-2,32 M, erhöht, und der dabei erhaltene aktive Niederschlag in üblicher Weise abgetrennt und durch Dialyse von verbindlichem Ammonsulfat gereinigt.

35 Falls die so erhaltene Lösung nicht der alphai-Makroglo-bulin-Metall-Komplex-Behandlung unterworfen wird, kann auch noch eine Acetonfraktionierung und eine Molekularsiebchromatographie vorgeschaltet werden. Im Falle einer Acetonfraktionierung fällt man durch Zusatz von 40 0,3-1,5 Vol., vorzugsweise 0,5-1,2 Vol. Aceton, trennt den Niederschlag ab und gibt weitere 1,2 Vol. Aceton zu, trennt den Niederschlag ab und löst ihn in Puffer pH 7,5-9 auf. Die Pufferkonzentration liegt zweckmässig zwischen 0,01 und 0,05 M. Nach Dialyse zur Entfernung von restlichem Aceton 45 und ggf. Einengung der erhaltenen Lösung kann über ein Molekularsieb, beispielsweise vernetztes Dextran, wie Sepha-dex-G-100 chromatographiert werden, wobei die gewünschte Aktivität zu Begilnn aus der Säure eluiert wird, während die bekannte AL-1 Proteinase I erst gegen Ende eluiert wird. Das so Eluat wird, ggf. nach Konzentrierung, über trägerfixiertem alpha:-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert, wobei die gesuchte Endoproteinase-Lys-C durchläuft. Die Elution erfolgt vorzugsweise im pH-Bereich 7,0-8,5 bei einer Pufferkonzentration von 0,03-0,08 M. Die üblichen in diesem 55 Bereich wirksamen Puffersubstanzen sind geeignet, bevorzugt werden Tris-Puffer, Hepes-Puffer und Phosphat-Puffer. Gute Ergebnisse werden bei pH 6,5-9 und 0,01-0,1 Puffergehalt erreicht. Das Eluat enthält reine Endoproteinase-Lys-C und Puffer und kann direkt lyophilisiert werden. 60 Das erfindungsgemässe neue Enzym wird zur Sequenzbestimmung von Proteinen und Peptiden verwendet. Auf Grund seiner sehr spezifischen Spaltungsaktivität lässt es sich auch therapeutisch einsetzen, beispielsweise bei Gerinnungsstörungen beziehungsweise anderen Erkrankungen, bei denen die 65 Spaltung von Proteinketten angestrebt wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Gewinnung des erfindungsgemässen Enzyms und seine Bestimmung.

651 061

4

Beispiel 1

Gewinnung von Endoproteinase-Lys-C aus Lysobactor enzy-mogenes ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796) Ausgangsmaterial: 206 1 Lysobacter-Kulturfiltrat

206 1 Lysobacter-Kulturfiltrat werden langsam mit festem Ammonsulfat auf 3-3,2 M ausgefällt. Der geringe flockige Niederschlag wird abfiltriert. Der Niederschlag auf den Filtern wird mit wenig destilliertem Wasser gelöst und mit festem Ammonsulfat auf 0,9 M (1,3-3 M) ausgefällt und zentrifugiert. Den Überstand fällt man nun weiter auf 2,25-2,32 M Ammonsulfat aus, und filtriert oder zentrifugiert den Niederschlag, löst ihn mit etwa 400 ml destilliertem Wasser und dialysiert gegen fliessendes Leitungswasser.

Das Dialysat wird mit 0,5-1,2 Vol. — 20 °C kaltem Aceton versetzt und abzentrifugiert. Den Überstand (klar) versetzt man nun mit weiteren 1,2 Vol. (berechnet aus Anfangsvol.) Aceton, zentrifugiert den Niederschlag ab und löst ihn so konzentriert wie möglich mit 0,025 M Tris, pH 9 auf und dialysiert gegen 10 1 desselben Puffers.

Das Dialysat wird auf eine Sephadex-G-100-Säule aufgetragen mit folgenden Abmessungen: 0 5 cm, Länge 150 cm, Säulenvol. etwa 2,9 I.

Die Säule wird mit 0,025 M Tris, pH 9,0 äquilibriert und nach dem Aufziehen mit demselben Puffer nachgewaschen.

Lysobacter-Protease wir zu Beginn eluiert.

Die Eluate werden mit festem Ammonsulfat auf 3,2 M ausgefällt und zentrifugiert. Der konzentriert aufgenommene Niederschlag wird gegen 0,05 M Tris pH 8,0 dialysiert.

Alpha:-Makroglubulin-Zn-Komplex, kovalent an Agarose gebunden, wird zur Weiterreinigung verwendet. 110 ml dieses Trägermaterials werden in 3 cm 0 Säule, Länge 17,5 cm, eingefüllt und mit 0,05 M Tris, pH 8,0 gewaschen, bis sich kein Protein im Durchlauf befindet.

Nun wird das Dialysat aufgezogen und mit 0,05 M Tris, pH 8,0 nachgewaschen. Proteinase-Lys-C läuft durch.

Der Durchlauf wird gegen 0,05 M Glycin, pH 8,0 dialysiert und auf 0,4 mg/ml mit demselben Puffer verdünnt und lyophilisiert.

Gesamtausbeute: etwa 50-140 mg Protein, 6-23 U/mg 5 Proteinase Lys-C, Chromozym TH Aktivität < 0,2 %

Beispiel 2

io Bestimmung der Endoproteinase Lys-C Herstellung der Lösungen:

1. 0,025 M Tris, 0,001 M EDTA, pH 7,7

0,303 g Tris, 37,2 mg EDTA werden in etwa 80 ml bidest. Wasser gelöst und pH mit 2 N HCl auf 7,7 eingestellt und auf 15 100 ml aufgefüllt.

2. Chromozym-PL (14 uM/ml)

9 mg Chromozym-PL in 1 ml bidest. H2O auflösen.

3. Endoproteinase-Lys-C-Lösung

10 mg Lyophilisat in 1 ml bidestilliertem H2O lösen. Vor 20 Gebrauch 1:100 mit Lösung 1 verdünnen.

Ausführung: 405 nm, 1 cm Halbmikroküvette, 25 °C, Testvolumen 1,07 ml.

In Küvette pipettieren:

25 Lösung 1 1 ml Lösung 2 0,05 ml mischen, etwa 2 min, bei 25 °C temperieren.

Probelösung 3 0,02 ml mischen, aus linearer Phase nach etwa 5 min. A E/min 30 berechnen.

Berechnung:

• 100= U/ml Endoproteinase-Lys-C 35 10,4x0,02 J

G