DE3872588T2

DE3872588T2 - Vereinfachtes verfahren zur herstellung von menschlichen lymphokinaktivierten killerzellen.

Info

Publication number: DE3872588T2
Application number: DE8888106566T
Authority: DE
Inventors: Dunn, Jr; Lise Nadine Halpern; Joseph David Irr
Original assignee: Terumo Corp; Haemonetics Corp
Current assignee: Terumo Corp; Haemonetics Corp
Priority date: 1987-04-27
Filing date: 1988-04-23
Publication date: 1992-12-03
Anticipated expiration: 2008-04-24
Also published as: FI881952A0; EP0289896B1; US4808151A; ATE78053T1; EP0289896A1; PT87335B; DE3872588D1; FI881952L; JPH0657147B2; KR900004422B1; NZ224379A; JPS63295510A; ES2051790T3; NO881819D0; DK226288A; PT87335A; NO881819L; KR880012751A; IL86177A0; ZA882948B

Description

Diese Erfindung betrifft passive Immuntherapie, speziell betrifft sie die in vitro-Gewinnung menschlicher, Lymphokin-aktivierter Killer- Zellen zur Verwendung in der genannten Therapie.
Die passive Immuntherapie (E: adoptive i.) hat in jüngster Zeit bei einigen Tumorformen zu ermutigenden klinischen Resultaten geführt. Siehe dazu auch die Artikel in The Wall Street Journal, 9.April 1987, und in TIME Magazine, 20. April 1987. Die Therapieform umfasst die Entnahme von peripherem Blut eines Patienten, die Entfernung der roten Blutkörperchen (RBC) daraus zwecks Gewinnung der Lymphozythaltigen weissen-Blutkörperchen-Fraktion, die Inkubation dieser Blut- Fraktion in einem Interleukin-2(IL-2)-haltigen Nährmedium zur Herstellung von aktivierten, tumorzerstörenden Lymphozyten der Bezeichnung LAK-Zellen sowie die Injizierung dieser LAK-Zellen zusammen mit zusätzlichem IL-2 in den Patienten. In einigen Fällen wird IL-2 schon vor der Blutentnahme injiziert zwecks Stimulierung der Produktion von Lymphozyten im Patienten.
Ein Nachteil der passiven Immuntherapie sind deren hohe Kosten. Ein Grund dafür ist, dass die bekannten Verfahren zur Herstellung von LAK-Zellen arbeitsintensiv sind und viel Zeit erfordern. Die Verfahren sind beschrieben in Muul et al: "Large scale production of human lymphokine activated killer cells for use in adoptive immunotherapy", Journal of Immunological Methods, 88:265-275 (1986). Wie darin angegeben, ist - um genügend LAK-Zellen für eine Behandlung zu erhalten - von etwa 2,0 10² Lymphozyten aus 10 aufeinanderfolgenden Leukapheresen von peripherem Blut auszugehen. In jeder Leukapherese werden dabei 10 - 12 l Blut vier Stunden lang in einer automatischen Zell- Trennanlage behandelt und ergeben so eine 400 - 500 ml Leukozyt-Fraktion. Diese wird mit 2 Teilen einer Salzlösung verdünnt, dann in konische 50 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben (30 - 40 Röhrchen, je 40 ml Inhalt) und je mit 10 ml Ficoll-Hypaque-Lösung unterlegt. Dann wird zentrifugiert, wobei sich die folgenden Lagen ausbilden:
- eine blutplättchenreiche, oberste Lage,
- eine Lymphozyt-reiche Lage,
- eine Ficoll-Hypaque-Lage,
- eine Granulozyt-Lage und
- eine RBC-Lage.
Die obersten Lagen werden entnommen und verworfen. Die lymphozytreichen Lagen über dem Ficoll-Hypaque werden entnommen sowie zusammengegeben und drei Mal durch Suspendierung in Salzlösung und anschliessender Zentrifugierung gewaschen. All diese Schritte müssen für jede Leukapherese wiederholt werden; für jede Behandlung sind also 300 - 400 Zentrifugenröhrchen zu manipulieren.
Die Haemonetics Corp., Braintree, Massachusetts (U.S.A.), vertreibt unter der Bezeichnung Haemonetics V-50 eine automatische Blutzellen- Trennanlage. Diese benutzt eine 2-Stutzen-Zentrifugentrommel des US-Patentes 3 145 713. Die V-50-Anlage kann gemäss den Vorschriften der Standard-Leukapherese oder gemäss denjenigen der SurgeR-Lymphocytopherese betrieben werden. Das letztgenannte - in den US-Patenten 4 464 167 und 4 416 654 gelehrte - Verfahren umfasst die intermittierende Elutrierung mittels vorher abgeschiedenem Plasma und führt zu, verglichen mit der Standard-Leukapherese, schärfer getrennten Fraktionen von Blutplättchen, WBC und RBC. Das Verfahren wird im folgenden Elutrierungs-Leukapherese genannt werden.
Für die Behandlung von LAK-Zellen wird - zwecks Abtrennung der Buffy-Schicht (siehe weiter unten) - die Verwendung der Haemonetics V-50-Anlage empfohlen. In der gleichen Anlage können dann mittels einer Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Trennung in der gleichen Zentrifugentrommel die mononuklearen Zellen (Lymphozyten und Monozyten) von der genannten Schicht abgetrennt werden. Obwohl schon dieses Verfahren verglichen mit der Methode nach Muul et al weniger Arbeit und Zeit erfordert, wäre es immer noch vorteilhaft, wenn die Ficoll-Trennstufe gesamthaft daraus eliminiert werden könnte; sie erhöht die Kosten und kann zu einer verringerten Ausbeute an Lymphozyten führen. Bislang wird aber in der Fachwelt davon ausgegangen, dass die genannte Trennstufe wesentlich ist für die Gewinnung einer genügend RBC- und Granulozyt-freien Lymphozyt-Fraktion zur Herstellung von LAK-Zellen. Es wird angenommen, dass RBC und Granulozyten die Aktivierung der Lymphozyten verhältnismässig stark behindern.
Wir haben nun gefunden, dass die Ficoll-Dichtegradientenauftrennung in der Zentrifuge aus dem Verfahren eliminiert werden kann, ohne dass dadurch die Lymphozyt-Aktivierung merklich behindert wird. Unsere Erfindung betrifft also eine Verbesserung innerhalb der Methode zur Herstellung von LAK-Zellen in vitro, welche Methode die Entnahme von Blut zur Gewinnung einer lymphozythaltigen WBC-Fraktion und die Inkubation dieser Fraktion in einem Nährmedium mit IL-2 zwecks Aktivierung der Lymphozyten umfasst. Die Verbesserung wird also speziell durch die Verwendung der Lymphozyt-WBC-Fraktion ohne deren zusätzliche Aufteilung in Lymphozyt- und Monozyt-Lagen auf einer Ficoll-Dichtegradientensubstanz erreicht.
In der erfindungsgemäss verbesserten Methode können RBC auf verschiedene Arten abgetrennt werden. Diese umfassen Standard-Leukapherese, Elutrierungs-Leukapherese und Zentrifugierung ohne Zugabe von Ficoll. Ficoll ist bekanntlich ein wassserlösliches Polysaccharid mit einem gewichtgemittelten MG von ungefähr 400 000; es wird zur Herstellung von Dichtegradienten verwendet. Die Substanz ist als solche oder gemischt mit anderen als Markenprodukt (Ficoll-Paque, Ficoll-Hypaque und Ficoll-Isopaque) erhältlich. Mit Leukapherese wird bekanntlich ein Verfahren bezeichnet, bei welchem einem Patienten bzw. Donoren peripheres Blut entnommen wird, aus dem dann eine WBC-reiche Fraktion abgeschieden und die restlichen Blutanteile (Plasma, Blutplättchen und RBC) wieder zurückgeführt werden. Die Aufteilung von Blut in Plasma, WBC-Fraktion und RBC-Fraktion wird mittels Standard-Zentrifugierung erreicht; die Fraktionen werden für späteren Gebrauch aufbewahrt. Der Ausdruck "Buffy-Schicht" (siehe oben) wird hier zur Bezeichnung der WBC-reichen Faktion, die mittels Standard-Zentrifugierung erhalten wird, verwendet; anderweitig bezeichnet der Ausdruck auch eine Blutplättchen- und WBC-reiche Fraktion aus der Leukapherese.
Die verschiedenen Methoden zur Entfernung von RBC ergeben WBC-reiche Fraktionen mit unterschiedlichen Gehalten an Rest-RBC und variierenden, in % angegebenen Restgehalten an Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten in den WBC-reichen Fraktionen. Die Zusammensetzungen der verschiedenen Fraktionen variieren auch gemäss der Herkunft des Blutes. Beispielsweise kann ein mit IL-2 vorbehandelter Patient ein Blut mit hohem Lymphozyt-Gehalt zeigen. In der folgenden Tabelle werden typische Gehaltsbereiche von mittels verschiedener Methoden erhaltenen WBC-Fraktionen und von Blut angegeben: Gehaltsverhältnisse Anzahl RBC Anzahl WBC Standard Leukapherese (240 ml) Vol.-% RBC: 10 - 20 Elutrierungs-Leukapherese (400 ml) Vol.-% : 1 - 6 "Buffy Coat" (40 ml) Vol.-% RBC: 40 - 50 Normales Blut (450 ml) 1) Lymphozyten, 2) Monozyten, 3) Granulozyten.
Aus der obigen Tabelle folgt, dass erfindungsgemäss einzusetzende lymphozythaltige, mit WBC angereicherte Fraktionen ein RBC- zu WBC-Verhältnis von etwa 0,2 bis etwa 300 zeigen und einen Granulozyt- Gehalt von etwa 1 % bis 50 % haben können. In der Praxis würde der Buffy-Schicht die entscheidende Information, ob ein Donor LAK-Zellen zu entwickeln imstande ist, entnommen. Um LAK-Zellen für die passive Immuntherapie zu erhalten, sollten die Produkte der Leukapherese etwa 1 - 20 Vol.-% RBC haben und ein RBC/WBC-Verhältnis von 0,2 bis 250 zeigen.
Derzeit ist es vorteilhaft, die Produkte der Elutrierungs-Leukapherese zu verwenden, weil diese hinsichtlich der RBC- und Granulozyt- Gehalte näher bei den mittels Ficoll abgetrennten Produkten liegen; die Fachwelt akzeptiert sie daher eher. Zusätzlich scheinen die Produkte der Elutrierungs-Leukapherese zu einer etwas höheren Zelldichte kultiviert werden zu können (z.B. 1 10&sup7;/ml oder höher) als Standardleukapherese-Produkte. Aus der obigen Tabelle ist zudem ersichtlich, dass die Produkte der Elutrierungs-Leukapherese normalerweise ein RBC- zu WBC-Verhältnis von etwa 0,2 bis 50, RBC- Volumenprozente von etwa 1 bis 6 und Granulozyt-Volumen-Prozente von etwa 1 - 5 zeigen. Eigentlich typisch sind RBC- zu WBC-Verhältnisse von etwa 0,5 bis 25 und RBC-Volumen-Prozente von etwa 2 bis 4.
Standard-Leukaphereseverfahren können mittels verschiedener Vorrichtungen durchgeführt werden, u.a. solcher der Firmen Haemonetics, Fenwall und Cobe. Die einzige, heute erhältliche Vorrichtung zur Durchführung der Elutrierungs-Leukapherese ist die Haemonetics V-50, gemäss den Lehren der US-Patente 4 464 167 und 4 416 654 oder gemäss den Haemonetics-Anleitungen. Die V-50 kann eingesetzt werden, um hoch-WBC-haltige Fraktionen niederer RBC- und niederer Granulozyt- Gehalte zu gewinnen.
Der Monozyt-Gehalt der WBC-reichen Fraktion kann unter denjenigen gemäss der obigen Tabelle gebracht werden durch die Behandlung des Leukapherese-Produktes mit einem Niederalkylester einer L-Aminosäure oder einem HCl-Additionssalz davon. Beispiele dafür sind die Methyl-, Aethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, oder t-Butyl-Ester von Phenylamin, Glutaminsäure, Glutamin oder Tyrosin. Der Methylester des Phenylalanins wird bevorzugt. Weitere Details zu dieser Behandlung sind in der US-Anmeldung SN 868 697 von 30. Mai 1986 sowie in den folgenden Beispielen angeführt.
Die Aktivierung der Lymphozyten durch Inkubation mit IL-2 ist gemäss den bekannten Methoden durchzuführen. Dazu können Behälter wie übliche Kolben und Schüttelflaschen verwendet werden. Die bevorzugten Behälter sind aber 0,2- bis 5-Liter-Kultivierungsbeutel aus flexiblen Kopolymer-Schicht-Materialien, wie sie in der US-Anmeldung SN 008 273 vom 29. Januar 1987 gelehrt werden. Speziell geeignet sind solche Beutel aus einem Kopolymer basierend auf 97 M-% Aethylen und 1-Okten. Jedes bekannte Kultivierungs- und Nährmedium kann eingesetzt werden. Das bevorzugte Kultivierungsmedium ist RPMI 1640; es ist detailliert beschrieben in "Culture of Animal Cells", Freshney, 72 - 73; Alan R. Liss Inc., N.Y.; das Medium wird mit Serum versetzt. Anfängliche Zell-Konzentrationen von bis zu etwa 1 10&sup7;/ml können mit einem Elutrierungs-Leukaphereseprodukt oder einem Standard-Leukaphereseprodukt verwendet werden. Die Zell-Konzentration von 1 10&sup6;/ml sollte aus ökonomischen Gründen nicht unterschritten werden. Bevorzugte solche Konzentrationen sind für die Elutrierungs-Leukapherese 5 10&sup6; bis 1 10&sup7;/ml und für die Standard-Leukapherese 1 10&sup6; bis 5 10&sup6;/ml. Die Zellen werden, zusammen mit IL-2, etwa 2 bis 7 Tage, bevorzugterweise 3 bis 5 Tage lang, inkubiert und zwar bei einer Temperatur von etwa 35 bis 39ºC, bevorzugterweise bei 37ºC.
"Interleukin-2" (IL-2) steht hier für Human-IL-2. Es umfasst natürliches und rekombinantes IL-2 (rIL-2) sowie biofunktionelle Aequivalente davon wie die rIL-2-Mutationen gemäss dem US-Patent 4 518 584. Bevorzugterweise ist IL-2 eine rIL-2-Zusammensetzung enthaltend im wesentlichen Wasser, rIL-2 und - gewünschtenfalls - ein Polyol, wie es in der US-Anmeldung SN 825 133 vom 31. Januar 1986 beschrieben ist. Die IL-2-Konzentration im Kultivierungsmedium liegt im Bereich von 5 10² bis 5 10&sup4; pM, bevorzugterweise bei 1000 bis 2000 pM.
Die erfindungsgemäss hergestellten LAK-Zellen können in pharmakologisch annehmbaren Trägern suspendiert werden; Beispiele dafür sind physiologische Kochsalzlösungen - gegebenenfalls mit 5 % humanem Serumalbumin versetzt - oder Hauks-Salzlösungen. Es ergeben sich somit Zusammensetzungen, welche einem Tumorpatienten infundiert werden können. Derselbe wird gleichzeitig mit rIL-2 behandelt, wie ausführlich beschrieben in Rosenburg et al: The New England J. o. Medicine 313, 1485 - 92 (1985). Dabei wird dem Patienten Blut entnommen, dieses der Leukapherese unterworfen und die gewonnenen Zellen sofort drei Tage lang zwecks Herstellung von LAK-Zellen kultiviert.
Die LAK-Zellen werden in den Patienten rück-infundiert. Normalerweise werden etwa 3 10¹&sup0; bis 14 10¹&sup0; LAK-Zellen in 4 bis 9 Dosierungen infundiert. IL-2 wird alle 8 Stunden, in Dosierungen von 1 10&sup4;, 3 10&sup4; oder 1 10&sup5; Einheiten pro kg Körpergewicht verabreicht. Die gesamte Behandlung umfasst eine 2-Wochen-Phase mit Leukapherese und Rück- Infusion und, im allgemeinen, Wiederholungen von der dritten Woche an. In den LAK-Zellen-Zusammensetzungen kann rekombinantes IL-2 enthalten sein.

Zytotoxizitäts-Untersuchungen (LAK)

In den weiter unten folgenden Beispielen wurden, als Mass für die Zytotoxizität von LAK-Zellen gegenüber Tumorzellen (= LAK-Aktivität) ausser dort wo etwas anderes steht, Messungen betreffend die 4 h-&sup5;¹Cr-Freisetzung verwendet. Tumorzellen in Konzentrationen von etwa 2 10&sup6; bis 10 10&sup6;/ml wurden mit Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; von 100uCi Aktivität in 0,4 l einer mit Tris-Phosphat gepufferten physiologischen Salzlösung 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann drei Mal mit RPMI 1640 enthaltend 5 oder 10 % fötales Kälberserum (FCS) gewaschen und in RPMI mit 20 oder 10 % FCS zu 10&sup5;/ml resuspendiert. Die Effektorzellen (LAK-Zellen) wurden, in verschiedenen Konzentrationen suspendiert, in Portionen zu 0,1 ml in runden Mikroliterschalen vorgegeben. Die mit &sup5;¹Cr dotierten Zielzellen wurden in gleichen Portionen in die Schalen gegeben. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 ºC wurden die Schaleninhalte zentrifugiert und je eine Probe von 0,1 ml der überstehenden Flüssigkeit entnommen. In diesen Proben wurden dann in einem γ-Strahlenzahlrohr die Anzahl Zerfälle pro Zeiteinheit bestimmt (counts). Die prozentuale Zytolyse wird dann gemäss der folgenden Formel berechnet:
% Zytolyse = gemessene counts p.Ze - natürliche counts p.Ze gesamte counts p.Ze - natürliche counts p.Ze x 100
Jede Variable wurde dreifach bestimmt. Dieser Zytotoxizitäts-Test ist im Detail beschrieben in "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell a. Shiigi, Herausgeber, S. 124 - 137; W. H. Freeman & Co., San Francisco (1980).
In anderen Untersuchungen werden die Endresultate in "Lytic Units" (LU oder LU30) angegeben. Damit wird die Anzahl von Zielzellen bezeichnet, welche bei bestimmten Voraussetzungen zerstört worden sind. Diese Bestimmungsmethode ist detailliert beschrieben in Pross et al: J. o. Immunological Methods 68, S. 235 - 249 (1984). Je höher der LU-Wert, desto potenter die LAK-Zellen.
Alle in dieser Beschreibungseinleitung angegebenen Patente, Patentanmeldungen und anderen Veröffentlichungen sind auch als Teil dieser Anmeldung zu nehmen. Dies gilt speziell für die US-Patente 4 464 167 und 4 416 654, welche sich auf die Herstellung einer WBC-reichen Fraktion mittels Elutrierungs-Leukapherese unter Einsatz von vorgängig abgetrenntem Plasma als Elutrierungsmittel beziehen.

Beispiel 1

Zwecke:

1) Studium der LAK-Aktivität von Zellen, die mittels eines Haemonetics V-50 durch Elutrierungstechnik hergestellt worden sind, hinsichtlich der Gewinnung von weissen Blutzellen (WBC).
2) Studium der Einflüsse
- der Zugabe von Methylester des Phenylalanins (OAla) und
- der Ficoll-Trennstufe
auf die LAK-Trennstufe von Zellen, die mittels eines Haemonetics V-50 durch Elutrierungstechnik gwonnen worden sind.

Zellkulturen:

1) Human-Lymphozyten (von Haemonetics Corp.)
2) Raji-Zellen

Material:

1) Zellkultiviermedium (CCM) = RPMI 1640 mit 10 % FBS, L-glutamin und Gentamicin
2) Phosphat-gepufferte PBS, 1 x ohne CA&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus;
3) Ficoll Hypaque (Ficoll)
4) -Ala
5) UnopetteR zur Bestimmung der Anzahl WBC
6) Aethylen-Buten-Copolymer-Beutel für Zellkulturen
7) T25-Gewebekulturkolben
8) 1 % NP 40
9) 2 x TD-Puffer
10) &sup5;¹Cr (als Na-Chromat)
11) rekombinantes Interleukin-2, 10 Einheiten/ml in 0,5 Glukose (IL-2)
12) 96 Gewebekulturschalen
13) SCS Harvesting System (Skraton)
14) Beckman Gamma 4000 Counter (Zähl-Instrument)
15) Trypan Blau

Ausführung

A) Bereitstellung der Zellen

1) 250 ml einer an weissen Blutzellen (WBC) reichen Fraktion wurden mittels eines Haemonetics V-50 durch Elutrierungstechnik gewonnen gemäss dem Verfahren der US Patente 4 416 654 und 4 464 167.
2) Mittels der UnopetteR-Zählvorrichtung wurde die Anzahl WBC/ml bestimmt: 1,36 10&sup7;. Daneben wurden etwa 3 V-% RBC nachgewiesen.
3) Durch Verdünnung wurde die Anzahl WBC auf 1 10&sup7;/ml gebracht (Totales Volumen = 340 ml).
4) 40 ml der Zellsuspension wurden direkt in das Kultivierungsmedium gegeben (siehe unten).
5) Die restlichen 300 ml wurden der -Ala-Behandlung unterworfen (siehe unten).

B) Behandlung mit -Ala

1) 300 ml Zellsuspension werden in einen T150-Kolben gegeben.
2) 30 ml -Ala werden zugegeben.
3) Das Ganze wird sorgfältig gerührt.
4) Es folgt eine 40-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
5) Nach der Inkubation wird die Probe in 2 aliquote Teile von 165 ml aufgeteilt:
a) Aliquot 1 wurde in das Kultivierungsmedium gegeben;
b) Aliquot 2 wurde mit Ficoll unterlegt (siehe unten) und dann in das Kultivierungsmedium gegeben.

C) Zubereitung der Kultivierungsmedien

1) Zellen direkt von V-50 (kein Ficoll, kein -Ala)

a) 40 ml Zellsuspension werden in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
b) Zentrifugiert wird 10 min. lang bei 1200 Upm.
c) Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.
d) Die Zellen werden in CCM resuspendiert und zwar in einem Gesamtvolumen von 40 ml.
e) Vorbestimmte Mengen von Zellen in T25-Kolben
f) Zugabe von CCM, um die weissen Blutzellen auf die gewünschte Konzentration zu bringen.
g) Zugabe von 5ul IL-2 in jeden Kolben (Endkonzentration: 10 Einheiten/ml).
h) Einbringen der Kolben in einen 37ºC-Inkubator mit 5 % CO&sub2;- Atmosphäre. Aufteilung in 3 T25-Kolben: 1 ml Zellen 9 ml Medium (CCM) 5 ml Zellen 5 ml Medium (CCM) 10 ml Zellen

2) Aliquot 1: Zellen von V-50 mit -Ala-Behandlung, ohne Ficoll

a) 165 ml Suspension der mit -Ala behandelten Zellen in ein 250 ml-Zentrifugenrohr.
b) Zentrifugiert wird 10 min. lang bei 1200 Upm.
c) Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.
d) Die Zellen werden in 50 ml CCM resuspendiert.
e) Zell-Zählung mittels UnopetteR; Resultat: WBC = 1,9 10&sup7;/ml.
f) Aufsetzen von Kultivierungsmedium in Kolben und Beutel gemäss vorgegebener Zellkonzentration.
g) Einbringen der Kulturen in Behältern in einen 37ºC-Inkubator mit 5 % CO&sub2;. Aufteilung in 2 Behälter: in T25-Kolben: Zellen Medium (CCM) in Beutel

3) Aliquot 2: Zellen von V-50 mit -Ala-Behandlung und nach Ficoll-Trennung

a) 40 ml Zellsuspension werden in 4 - 50 ml Zentrifugenröhren gegeben.
b) Die Proben werden mit 10 ml Ficoll unterlegt.
c) Zentrifugiert wird 30 min. lang bei 1900 Upm.
d) Die Zwischenlage wird mit einer sterilen Pasteur-Pipette entnommen und in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
e) Auffüllen mit PBS auf 50 ml.
f) Zentrifugiert wird 10 min. lang bei 1200 Upm.
g) Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.
h) Das Pellet wird in 50 ml CCM resuspendiert.
i) Es wird noch einmal 10 min. lang bei 1200 Upm zentrifugiert
j) und wiederum in 5 ml CCM resuspendiert.
k) Es wird die Anzahl Zellen bestimmt, nach Anfärbung mit Trypan-Blau.
l) Die verschiedenen Kultivierungsansätze werden zubereitet und zwar in Kolben und in Beuteln (siehe unten).
m) Die Kulturen werden in einen 37ºC-Inkubator mit 5 % CO&sub2; gegeben.
Bemerkung: Bei c) vorerst keine Zwischenlage; diese ergab sich erst nach einer Wiederholung mit untergelegtem Ficoll. Aufgeteilt wurde in drei Kulturen: T25-Kolben mit 5 10&sup6; Zellen/ml: Zellen Medium (CCM) in T25-Kolben T25-Kolben mit 10 10&sup6; Zellen/ml: Zellen Medium (CCM) in T25-Kolben Beutel mit 1,9 10&sup6; Zellen/ml: Zellen Medium (CCM) in Beutel

D) LAK-Bestimmung

Die LAK-Bestimmung wurde nach Ablauf der 4-tägigen Zellkultivierung gemäss dem folgenden Prozedere ausgeführt:
Anmerkung: Wegen zuviel roter Blutzellen wurden drei Proben vor der LAK-Bestimmung einer Puffer-Lyse unterzogen:
(Lyse-Lösung: 0,83 g NH&sub4;Cl, 200 ml dest. H&sub2;O)
1) Resuspendierung des Zell-Pellets in 10 ml Lyse-Lösung.
2) Inkubation während 20 min. bei Raumtemperatur.
3) 10 min.-Zentrifugieren bei 1200 Upm.
4) Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit.
5) Resuspendieren in 1 ml CCM.
6) Bestimmung der Anzahl Zellen.
7) Einstellen der E : T-Verhältnisse gemäss LAK-Bestimmungsmethode. Resultate: Proben Anzahl Zellen Total Zellen Direkt von V-50 Nach -Ala Nach -Ala und Ficoll

Vorbereiten der Zellen für die -Ala-Vorbehandlung:

Alle Zell-Konzentrationen werden auf 1 10&sup7;/ml eingestellt.
Es wird eine 40-ml-Probe entnommen und in das Kultivierungsmedium gegeben.
Den restlichen Zellen werden 40 ml -Ala beigegeben und das Ganze wird 40 min. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Tag 4: &sup5;¹Cr-Freisetzungs-Daten Proben zu/nicht zu berücksichtigende Zellen /ml ml Zellen ml Medium Total Zellen Direkt vom V-50 Kolben Ala-Vorbehandlung, kein Ficoll Beutel Ala-Vorbehandlung und Ficoll Direkt vom V-50 Kolben -Ala-Vorbehandlung, kein Ficoll Kolben Beutel -Ala-Vorbehandlung und Ficoll Kolben Beutel Raji Zellen Medium *Proben, die vor der LAK-Bestimmung einer Lyse-Behandlung unterzogen worden waren. F Proben, die mittels der UnopetteR- Methode untersucht worden sind. Tag 4: &sup5;¹ Cr-Freisetzungs-Daten Maximum (Total) Freisetzung Spontane Freisetzung Durchschnitt cpm = Zerfälle/min. Zellen direkt vom V-50, keine -Ala-Vorbehandlung, kein Ficoll Kolben 1 10&sup6; Kolben 5 10&sup6; Kolben 1 10&sup7; Verdünnung CPM* % Zytolyse -Ala-Vorbehandlung, kein Ficoll Kolben 5 10&sup6; Beutel 9 10&sup6; Verdünnung CPM* % Zytolyse *CPM: Anzahl Zerfälle pro Minute -Ala-Vorbehandlung und Ficoll Kolben 1 10&sup6; Kolben 5 10&sup6; Kolben 1 10&sup7; Verdünnung CPM* % Zytolyse * CPM = Anzahl Zerfälle pro Minute (counts per minute)

Beispiel 2

Vorgehen: Das folgende Verfahrensdiagramm fasst das Vorgehen in diesem Beispiel zusammen: Bestimmung der Anzahl Zellen Waschung K = T25-Kolben B = Kultivierbeutel P = Probe

Vorgehen:

A) Abtrennung der Zellen

1) Die Zellen wurden mittels der Elutrierungsmethode anhand eines Haemonetics V-50-Apparates gewonnen.
2) Die Anzahl Zellen wurde bestimmt: 1,3 10&sup7;/ml bei 442 ml, ergibt 5,8 10&sup9; totale Anzahl Zellen.
3) Die Zellsuspension wurde in zwei Teile zwecks weiterer Verarbeitung aufgeteilt.

B) LAB Ficoll

1) 221 ml der Zellsuspension wurden mit PBS gemischt und auf Ficoll aufgegeben.
2) Zentrifugiert wurde 30 min. lang bei 2000 Upm.
3) Die Zellen wurden gewaschen und gezählt:
256 lebensfähige Zellen (99%)
5,1 10&sup6;/ml = 2 10&sup9;/40ml.
4) Einbringen der Zellen in Kultiviermedium zur Herstellung von LAK-Zellen in einer Konzentration von 1 10&sup6;. Beispiel Bezeichnung Ziel-Konzentration Berechnung ml Zellen + ml Medium
5) Die verbleibenden Zellen wurden zusätzlich noch einer -Ala- Vorbehandlung unterzogen:
a) V&sub1;C&sub1; = V&sub2;C&sub2;
40 ml 5,1 10&sup7;/ml = V&sub2; 1 10&sup7;/ml
V&sub2; = 200 ml; ml Medium = 160 ml
ml -Ala = V&sub2;/9 = 22,2 ml
b) 40 min.-Inkubation, dann Waschung der Zellen
c) Bestimmung der Anzahl Zellen und Einbringen derselben in Kultiviermedium zum Erhalt von LAK-Zellen.
Lebendige (d.h. zu berücksichtigende) Zellen: 229 (97%)
Nicht zu berücksichtigende Zellen: 6
Anzahl Zellen/ml: 4,6 10&sup7;.
d) Aufsetzen der Kultivierungsversuche. Beispiel Bezeichnung Zell-Konzentration ml Zellen + ml Medium + ul IL-2

C) LAK-Zellen direkt vom V-50

1) Von der zweiten Hälfte der Zellen wurden jeweils soviele genommen, um Kulturen mit Konzentrationen von 1 10&sup6;/ml, 5 10&sup6;/ml und 1 10&sup7;/ml zu erhalten; die restlichen Zellen wurden verdünnt und mit dem Methylester des Phenylalanins versetzt. Beispiel Bezeichnung Zell-Konzentration ml Zellen + ml Medium + ul Il-2 * 10-ml-Probe: Nach Zentrifugieren Entfernen von 5 ml Plasma und Zugabe von 5 ml Medium; Verdünnung auf 1 10&sup7; Zellen /ml.

D) Vorbehandlung mit -Ala, aber keine Ficoll-Abtrennung:

C&sub1; V&sub1; = C&sub2; V&sub2;
200 ml 1,2 10&sup7;/ml = V&sub2; 1 10&sup7;/ml
V&sub2; = 260 ml; 60 ml Medium; 29 ml -Ala.
40 min. lang inkubieren, dann waschen.
Bestimmung der Anzahl Zellen und Aufsetzen der Kulturen.
Zu berücksichtigen: 240 Zellen (93 %)
Anzahl Zellen: 4,8 10&sup7;/ml
Total Anzahl Zellen: 1,9 10&sup9; (40 ml). Beispiel Bezeichnung Zell-Konzentration ml Zellen + ml Medium + ul IL-2
Die Kulturen wurden 3 Tage lang bei 37ºC und 5 % CO&sub2; inkubiert. Dann wurde die LAK-&sup5;¹Cr-Freisetzung untersucht. In den folgenden Tabellen bedeutet % REL % Freisetzung, was dem obigen % Zytolyse entspricht. Mit E : T wird das Zahlenverhältnis zwischen Effektorzellen (= LAK-Zellen, "E") und Zielzellen (= Tumorzellen, "T") bezeichnet. In allen Kulturen wurde die Anzahl Zellen bestimmt: Beispiel zu/nicht zu berücksichtigen Total
Probe E zeigte ein Fibrin-Agglomerat nach dem Zentrifugieren. Als Zielzellen wurden Raji-Zellen verwendet; 100 % davon waren lebend, also zu berücksichtigen, und dies bei einer Konzentration von 3,6 10&sup5;/ml. LAB Ficoll plus -Ala-Vorbehandlung P 1: 1 10&sup6; Zellen/ml P 2: 5 10&sup6; Zellen/ml * (counts per minute): Anzahl Zerfälle/min. P 3: 1 10&sup7; Zellen/ml Standard-Ficoll; keine -Ala-Vorbehandlung P 4: 1 10&sup6; Zellen/ml Elutrierung, kein Ficoll, keine -Ala-Vorbehandlung P 5: 1 10&sup6; Zellen/ml P 6: 5 10&sup6; Zellen/ml P 7: 1 10&sup7; Zellen/ml P 7A: 1 10&sup7; Zellen/ml Elutrierung, -Ala-Vorbehandlung; kein Ficoll P 8: 1 10&sup6; Zellen/ml P 9: 5 10&sup6; Zellen/ml P 10: 1 10&sup7; Zellen/ml * Anzahl Zerfälle/min.

Beispiel 3

Von der Biological Specialty Corp., Lansdale, PA, wurde ein Standard- Leukapherese-Produkt, enthaltend 225 ml Human-Leukozyten aus 3600 ml Blut mit 550 ml Antikoagulans ACD-B, erstanden. Das genannte Produkt wurde wie folgt weiter verarbeitet:
1) UnopetteR-Zählung der WBC und Ausführung einer Differentialauszählung:
Differential: 90 % Lymphozyten
6 % Monozyten
4 % Granulozyten
(Direkt gezählt: 165 Zellen)
Konzentration: 3,3 10&sup7;/ml
Total: 7,4 10&sup9;/225 ml.
2) Zubereiten der Zellen für direkte LAK-Kulturen:
Proben mit 1 10&sup6;/ml: 0,3 ml Zellen, 9,7 ml Medium, 5ul IL-2,
Proben mit 5 10&sup6;/ml: 1,52 ml Zellen, 8,48 ml Medium, 5ul IL-2,
Proben mit 1 10&sup7;/ml: 3,04 ml Zellen, 6,96 ml Medium, 5ul IL-2.
Inkubiert wurden die Proben 4 Tage lang bei 37ºC und 5 % CO&sub2;.
3) 20 ml der ursprünglichen Zellsuspension wurden mit 20 ml PBS ohne Ca&spplus;² und Mg&spplus;² gemischt. 40 ml dieser Mischung wurden über 40 ml Ficoll gegeben und 30 min. lang zentrifugiert. Die Lage mit den mononuklearen Zellen wurde entnommen und diese Zellen drei mal gewaschen. Weitere Monozyt-Abtrennung während 90 min. Die Zellen nochmals zwei mal gewaschen und dann gezählt und in Kulturen zur Gewinnung von LAK eingebracht.
Standardprobe: Berücksichtigte Zellen: 155
Nicht berücksichtigte Zellen: 1
(%: 99 %)
Konzentration; 3,1 10&sup7;/ml
Total: 7,7 10&sup8;/25 ml
Verdünnung auf 1 10&sup6;/ml: 0,32 ml Zellen, 9,68 ml Medium, 5ul IL-2.
4) Die verbleibende Zellsuspension (200 ml) wurde verdünnt mit 460 ml CCM zu einer Konzentration von 1 10&sup7;/ml und mit 73 ml -Ala versetzt. Dann wurde 40 min. lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei ein Teil der Zellen koagulierte. Möglichst alle nicht-koagulierten Zellen wurden gewonnen, gewaschen und mittels WBC-UnopetteR- Methode gezählt:
Anzahl berücksichtigter Zellen: 26 lebend (96 %)
Anzahl nicht-berücksichtigter Zellen: 1 nicht-lebend
Konzentration: 5,2 10&sup6;/ml Total: 1,04 10&sup9;/200 ml.
Die Zellen werden zu einer Konzentration von 5 10&sup6;/ml in einen Kultivierungsbeutel gegeben, d.h. 48 ml Zellen, 2 ml Medium, 25 ul IL-2.
Inkubiert wurde 4 Tage lang bei 37ºC und 5 % CO&sub2; zwecks Herstellung von LAK-Zellen. 5) Bestimmung der Anzahl Zellen nach der Inkubation lebend nicht lebend Zellen/ml Total Standard "Direkt" 1 x 10&sup6; "Direkt" 5 x 10&sup6; "Direkt" 1 x 10&sup7; -Ala-Probe Raji-Zellen E : T-Verhältnisse: 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 2,5 : 1 Verdünnungen, ausgehend von 2 10&sup6;/ml "Direkt" 11 x 10&sup7; Resultate: Anzahl Zerfälle/min. (CPM): Totale und spontane CPM Bezeichnung % Zytolyse Nullprobe Max. Freisetzung Spont. Freisetzung Standard-Ficoll; 1 10&sup6;/ml "Direkt"-Kein Ficoll; 1 10&sup6;/ml "Direkt"-Kein Ficoll; 5 10&sup6;/ml "Direkt"-Kein Ficoll; 1 10&sup7;/ml -Ala-Vorbehandlung; 5 10&sup6;/ml

Beispiel 4

Von der Biological Specialty Corp., Lansdale, PA, wurde ein Standard- Leukapherese-Produkt, enthaltend 230 ml Human-Leukozyten aus 3600 ml Blut mit 520 ml Antikoagulans ACD-B, erstanden. Das Produkt wurde gemäss dem folgenden Vorgehen weiterbehandelt:

1) 10 ml Zellsuspension wurde entnommen.

A) 1) 5 ml davon werden mit 5 ml PBS gemischt und
2) über 10 ml Ficoll gegeben
3) Zentrifugiert während 30 min. bei 2000 Upm
4) Die Zellen werden gewaschen und gezählt
5) Daraus Standardproben mit Zellkonzentrationen von 1,5 10&sup6;/ml in 10 ml-Kolben.
Standard: Anzahl lebende Zellen: 49 (100 %)
Anzahl nicht-lebende Zellen: 0
Konzentration: 9,8 10&sup6;/ml
Total: 1,96 10&sup8;/20 ml.
Verdünnung: 1,5 ml Zellen, 8,5 ml Medium, 1 ul IL-2.
B) 1) Die andern 5 ml Zellsuspension wurden für die direkte Bestimmung verwendet
2) Gemäss UnopetteR-Methode wurden die Gesamtzahl und die Differentialzahl der Zellen bestimmt
3) WBC: 4,5 10&sup7;/ml; 2,25 10&sup8;/ml
Lymphozyten: 72 %
Granulozyten: 22 %
Monozyten: 6 %
4) Die Zellen wurden dann in Kulturen eingebracht (10 ml-Kolben) zu Konzentrationen 1,5 10&sup6;/ml und 5 10&sup6;/ml
1,5 10&sup6;/ml: .33 ml Zellen, 9,67 ml Medium, 1 ul IL-2
5 10&sup6;/ml: 1,11 ml Zellen, 8,89 ml Medium, 1 ul IL-2
Nach 4-tägiger Inkubation wurde die LAK-Aktivität der Zellen anhand der &sup5;¹Cr-Freisetzungstests bestimmt. Zählung der Zellen: lebend nicht-lebend Zellen/ml Standard 1,5 10&sup6;/ml "Direkt" 1,5 10&sup6;/ml "Direkt" 5 10&sup6;/ml Raji-Zellen

3) LAK-Untersuchung

E : T-Verhältnisse: 40 : 1, 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 2,5 : 1, 1,25 : 1
Zellen wurden verdünnt zu 4 10&sup6;/ml
Raji-Zellen wurden verdünnt zu 1 10&sup5;/ml
Verdünnung
Standard 0,5 ml Zellen + 0,5 ml Medium
"Direkt" 1,5 10&sup6;/ml 0,5 ml Zellen + 0,5 ml Medium
"Direkt" 5 10&sup6;/ml 0,83 ml Zellen + 0,17 ml Medium
Raji-Zellen 0,25 ml Zellen + 19,75 ml Medium Resultate: Anzahl Zerfälle/min. (CPM): Total und spontane Bezeichnung % Zytolyse Nullprobe Max. Freisetzung Spont. Freisetzung "Standard"; 1,5 10&sup6;/ml "Direkt"-Kein Ficoll; 1,5 10&sup6;/ml "Direkt"-Kein Ficoll; 5 10&sup6;/ml

Beispiel 5

Material: "Buffy coat" - 52 ml Blut (Siehe weiter oben)
Zellzählung: 4,3 10&sup7;/ml (totale WBC)
1,8 10&sup7;/ml neutrophile (42 %)
geschätzt: 1 - 2 10&sup7;/ml Lymphozyten (20 - 50 %)
geschätzt: 5 - 10 10&sup9;/ml RBC
geschätzt:0,5 - 1 10&sup7;/ml Monozyten
Behandlung: Ficoll-Hypaque (Ficoll)
CCM - 5 % FCS - RPMI

Vorgehen:

1) Kein Ficoll
a) zu 10,5 ml "Buffy coat" werden 215 ml CCM gegeben. Zellzählung: 2 10&sup6;/ml (totale WBC)
b) Zugabe von 10ul/ml IL-2
c) Einbringen von 112 ml Kultivieransatz in Kolben
d) Einbringen von 112 ml Kultivieransatz in Beutel
e) 20 Tage Inkubation bei 37ºC
f) Probenahmen: jeweils nach 3, 6, 12, 17 und 20 Tagen zwecks Zellzählung und &sup5;¹Cr-Freisetzungs-(= LAK-)Untersuchung

2) Ficoll

a) 42 ml "Buffy coat" werden in 50 ml Zentrifugengläschen gegeben
b) Zentrifugierung bei 800 g während 10 min.
c) Ueberstehende Flüssigkeit verwerfen:
gewonnen wird die WBC-Mononuklearschicht über der Ficoll-Lage (Lympho- und Monozyten); 3 mal waschen Abgetrennt wurden total 300 10&sup6; mononukleare Zellen
d) Zugabe von CCM zu einer Mononuklearzellen-Konzentration von 2 10&sup6;/ml
e) 75 ml davon in Kolben
f) 75 ml davon in Beutel
g) Inkubation während 20 Tagen bei 37ºC
h) Probenahmen nach 3, 6, 12, 17 und 20 Taben zwecks Zellzählung und &sup5;¹Cr-Freisetzungstest. Resultate der Zellzählung (Proben mit x 10&sup6;/ml): Kolben Beutel Inkubation Tage Ficoll kein Ficoll Resultate der LAK-Untersuchung: Kolben Beutel Inkubation Tage Ficoll kein Ficoll

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung von LAK-Zellen in vitro, umfassend das Entfernen der RBCs und des Plasmas aus Vollblut zur Gewinnung einer Lymphocyten enthaltenden, an WBCs reichen Fraktion und Inkubieren der WBC-reichen Fraktion in einem Kulturmedium mit IL-2, dadurch gekennzeichnet, daß die RBCs und das Plasma entfernt werden und die WBC-reiche Fraktion ohne intermediäre Abtrennung von Lymphocyten auf einem Ficoll-Gradienten verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die RBCs durch Leukapherese entfernt werden und der Anteil der RBCs in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 1 bis 20 vol.-% liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Verhältnis RBC/WBC in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 0,2 bis 250 liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die RBCs durch Schlämm- Leukapherese entfernt werden und der Anteil der RBCs in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 1 bis 6 Vol.-% liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Verhältnis RBC/WBC in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 0,2 bis 50 liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das WBC-Differential etwa 80 bis 85 % Lymphocyten, etwa 10 bis 20 % Monocyten und etwa 1 bis 5 % Granulocyten zeigt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Anteil der RBCs in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 2 bis 4 Vol.-% liegt und das Verhältnis RBC/WBC in der WBC- reichen Fraktion im Bereich von etwa 0,5 bis 25 liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin vor der Inkubation der WBC-reichen Fraktion die Monocyten durch Behandlung mit Phenylalaninmethylester abgereichert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 2, worin die WBC-reiche Fraktion vor der Inkubation mit Salz-Lösung gewaschen wird, um eine Gerinnsel-Bildung zu hemmen.

10. Verfahren zur Erzeugung von LAK-Zellen durch Inkubieren einer Lymphocyten enthaltenden, WBC-reichen Fraktion in einem Kulturmedium mit IL-2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lymphocyten enthaltende, WBC-reiche Fraktion mit einem Zahlen-Verhältnis RBC/WBC im Bereich von etwa 0,2 bis 300 und einem Anteil der RBCs von etwa 1 bis 50 Vol.-% eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Verhältnis RBC/WBC im Bereich von etwa 0,2 bis 250 liegt und der Anteil der RBCs in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 1 bis 20 Vol.-% liegt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Verhältnis RBC/WBC im Bereich von etwa 0,2 bis 50 liegt und der Anteil der RBCs in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 1 bis 6 Vol.-% liegt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Differential der WBC-reichen Fraktion etwa 1 bis 5 % Granulocyten, 0 bis 20 % Monocyten und mehr als etwa 80 % Lymphocyten zeigt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Verhältnis RBC/WBC im Bereich von etwa 0,5 bis 25 liegt und der Anteil der RBCs in der WBC-reichen Fraktion etwa 2 bis 4 Vol.-% beträgt.

15. Verfahren zur Behandlung eines Krebs-Patienten durch passive Immuntherapie, umfassend

die Entnahme von peripherem Blut des Patienten,

das Abtrennen einer Lymphocyten enthaltenden, an WBCs reichen Fraktion aus dem Blut,

das Inkubieren der Lymphocyten enthaltenden, WBC-reichen Fraktion mit Interleukin-2, um Lymphokin-aktivierte Killer-Zellen zu erzeugen, und

das Rückinjizieren der aktivierten Zellen in den Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphocyten enthaltende, WBC-reiche Fraktion ohne Anwendung eines Ficoll-Gradienten abgetrennt wird, wodurch der Anteil der Anteil der RBCs in der WBC-reichen Fraktion im Bereich von etwa 1 bis 20 Vol.-% liegt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Lymphocyten enthaltende, WBC-reiche Fraktion durch Schlämm-Leukapherese abgetrennt wird, wodurch der Anteil der RBCs in der WBC- reichen Fraktion im Bereich von etwa 1 bis 6 Vol.-% liegt.