[go: up one dir, main page]

DE3789587T2 - Rekombinantes Pseudomonastoxin : Konstruktion eines wirksamen Immunotoxins mit wenigen Nebenwirkungen. - Google Patents

Rekombinantes Pseudomonastoxin : Konstruktion eines wirksamen Immunotoxins mit wenigen Nebenwirkungen.

Info

Publication number
DE3789587T2
DE3789587T2 DE3789587T DE3789587T DE3789587T2 DE 3789587 T2 DE3789587 T2 DE 3789587T2 DE 3789587 T DE3789587 T DE 3789587T DE 3789587 T DE3789587 T DE 3789587T DE 3789587 T2 DE3789587 T2 DE 3789587T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
exotoxin
modified
plasmid
pseudomonas exotoxin
pseudomonas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE3789587T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3789587D1 (de
Inventor
Sankar Gaithersbourg Adhya, Md.
David J. Silver Spring Fitzgerald, Md.
Ira Potamac Pastan, Md.
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adidas AG
Original Assignee
Adidas Sportschuhfabriken Adi Dassier Stiftung and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adidas Sportschuhfabriken Adi Dassier Stiftung and Co KG filed Critical Adidas Sportschuhfabriken Adi Dassier Stiftung and Co KG
Application granted granted Critical
Publication of DE3789587D1 publication Critical patent/DE3789587D1/de
Publication of DE3789587T2 publication Critical patent/DE3789587T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Toxine sind äußerst wirksame zelltötende Agenzien, die für viele Krankheiten der Menschen verantwortlich sind. Aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit sind diese Agenzien an monoklonale Antikörper gebunden worden, um zytotoxische Agenzien (Immuntoxine) zu bilden, die spezifisch an Zielzellen binden. Diese Immuntoxine sind daher am besten verwendbar bei der Krebstherapie.
  • Das Pseudomonas-Exotoxin A (PE) ist ein äußerst wirksames monomeres Protein (Molekulargewicht 66 Kd), das von Pseudomonas aeruginosa sezerniert wird und die Proteinsynthese in eukaryotischen Zellen durch die Inaktivierung des Elongationsfaktors 2 (EF-2) hemmt, indem dessen ADP-Ribosylierung katalysiert wird (Katalysieren des Transfers des ADP-Ribosylanteils von oxidiertem NAD auf EF-2).
  • Der Vergiftungsprozeß verläuft vermutlich über die folgenden Stufen: Als erstes bindet PE über einen spezifischen Rezeptor auf der Zelloberfläche an Zellen. Als nächstes wird der PE-Rezeptor-Komplex in die Zelle internalisiert. Letztendlich wird PE in das Zytosol transferiert, wo es enzymatisch die Proteinsynthese hemmt. Der Transferprozeß findet vermutlich aus einem sauren Kompartiment heraus statt, da die zelluläre Intoxikation durch schwache Basen, wie z. B. NH&sub4;&sbplus;, welches den pH in sauren Vesikeln anhebt, verhindert wird. Nachdem die hydrophobe Domäne von PE sauren Bedingungen ausgesetzt worden ist, dringt diese in die Membran ein, wodurch sich die Bildung eines Kanals ergibt, durch den die enzymatische Domäne in gestreckter Form in das Zytosol eindringt.
  • WO 83/03 971 offenbart einen vorausschauenden Entwurf zum Herstellen eines Hybridproteins, das das enzymatisch aktive Fragment A des Diphtherie-Toxins und einen Teil der Bindungsdomäne eines zellspezifischen Polypeptidliganden umfaßt, wobei der Teil der Bindungsdomäne theoretisch die Fähigkeit besitzt, das Hybridprotein selektiv an eine vorbestimmte Klasse von Zellen, die durch das enzymatisch aktive Fragment A bekämpft werden sollen, binden zu lassen.
  • Das U.S.-Patent 4,545,985 lehrt, daß Pseudomonas-Toxin chemisch an einen Antikörper oder Wachstumsfaktor gebunden werden kann. Es ist jedoch gezeigt worden, daß diese chemisch gebundenen Toxine nicht wünschenwerte Toxizitätsraten besitzen. Es wäre daher vorteilhaft, Toxine zu haben, die stark zielgerichtet auf spezifische Zelltypen sind, jedoch die normalerweise mit diesen Toxinen assoziierte allgemeine Zelltötungsfähigkeit nicht besitzen.
  • PE-enthaltende Immuntoxine werden dadurch konstruiert, daß man zuerst natives PE mit Iminothiolan reagieren läßt. Diese Reaktion dient sowohl dazu, zwei neue Sulfhydrylgruppen einzuführen, die für die Bindung eines Antikörpers an das Toxin verwendet werden, als auch die Bindungsfähigkeit von PE an dessen eigenen Rezeptor zu inaktivieren. Dieser Versuchsentwurf basiert auf der chemischen Inaktivierung der PE-Bindungsstellen, um die ungewollten Nebeneffekte aufgrund der Bindung von PE an Zellen mit PE-Rezeptoren möglichst klein zu halten. Während dieser Versuchsentwurf hinsichtlich des Herstellens eines spezifischen zelltötenden Reagenzes in Gewebekultur und in tumortragenden Mäusen einigermaßen erfolgreich gewesen ist, ist es nicht möglich gewesen, mehr als 2 ug des PE-Immuntoxins an eine 20 g-schwere Maus oder 1 mg an einen 3 kg-schweren Affen oder 4 mg an einen erwachsenen Menschen aufgrund der toxischen Nebenwirkungen des Immuntoxins zu verabreichen. Es ist daher wünschenswert, größere Mengen des Immuntoxins verabreichen zu können, um eine erhöhte Absterbungsrate von Tumorzellen zu erreichen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Wunsch durch das Bereitstellen eines Immuntoxins mit hoher Wirksamkeit und niedriger Toxizität. Um von der vorstehend erwähnten Abhängigkeit von einer chemischen Inaktivierung der PE-Bindungsstellen wegzukommen, beinhaltet die vorliegende Erfindung weiterhin rekombinante DNA-Techniken, um das vollständige Toxingen (oder Segmente davon) zu klonieren, mit dem Ziel, große Mengen des Toxinmoleküls der gesamten Länge (oder Teile davon), welches verschiedene funktionelle Domänen enthält, zu exprimieren, einschließlich eines Toxinmoleküls, welchem die Zellbindungsdomäne fehlt. Siehe Beispiel 1 hinsichtlich einer vergleichenden Untersuchung dieser Klone.
  • Die dreidimensionale Struktur von PE ist durch Röntgenstrahlkristallographie bestimmt worden. Wie in Fig. 2 gezeigt, enthält das PE-Molekül 3 strukturell verschiedene Domänen: die Domäne I enthält die Aminosäurereste 1 bis 252 (Domäne Ia) und 365 bis 404 (Domäne Ib); die Domäne II die Aminosäurereste 253 bis 364; und die Domäne III enthält die Aminosäurereste 405 bis 613.
  • Plasmide sind konstruiert worden, die verschiedene Anteile des PE-Moleküls exprimieren, wodurch die Möglichkeit bereitgestellt wird, verschiedene strukturelle Domänen mit verschieden funktionellen Aktivitäten zu korrelieren und zu bestimmen, (1) welche Anteile des Moleküls für die Zellerkennung verantwortlich sind (Bindung, strukturelle Domäne I, Aminosäure 1-252); (2) welcher Anteil für die enzymatische Aktivität benötigt wird (ADP-Ribosylierungsaktivität, Domäne 111 plus einen Teil der Domäne Ib, Aminosäure 385-613); (3) welcher Anteil für die Translokation über die Zellmembran verantwortlich ist (Domäne II). Der Hinweis, daß die strukturelle Domäne Ia bei der Zellerkennung eine Rolle spielt, ist, daß durch Plasmide hergestellte Proteine ohne die Domäne Ia, die jedoch die Domäne II, Ib und III enthalten, nicht selbst zytotoxisch sind und keine kompetitive Hemmung der Zytotoxizität des intakten Toxins zeigen, wohingegen ein für die Domäne Ia kodierendes Plasmid, dem jedoch die anderen Domänen fehlen, die PE-Zytotoxizität sensitiver Zellen blockierte. PE von Plasmiden mit einer Deletion der ersten Hälfte der strukturellen Domäne II übte sowohl PE-blockierende Aktivität als auch ADP-Ribosylierungsaktivität aus, wobei diese Moleküle jedoch die gesamte Zelltötungsaktivität verloren hatten. Plasmide, die nur für die strukturelle Domäne 111 kodieren, produzieren große Mengen des Proteins, besitzen jedoch keine nachweisbare enzymatische Aktivität (ADP-Ribosylierung). Plasmide, die jedoch für die gesamte strukturelle Domäne III plus angrenzende Aminosäuren aus der strukturellen Domäne Ib kodieren, exprimieren große Mengen des Proteins, und ihre ADP-Ribosylierungsaktivität ist hoch.
  • Auf der Grundlage der dreidimensionalen Struktur von PE sind Plasmide konstruiert worden, die verschiedene Anteile von PE exprimieren. Das Proteinmuster der Zellen, die die verschiedenen Konstrukte exprimieren, wurde durch SDS-Gelelektrophorese analysiert, und die ADP-Ribosylierungsaktivität des rekombinanten Toxins wurde gemessen. Unter diesen Plasmiden (beschrieben in Beispiel 1) ist das Plasmid pJH8, welches die Aminosäuren 253-613 (Domänen Ib, II und III) enthält, fähig, für große Mengen des modifizierten PE zu kodieren, welches niedrige Toxizität für humane Zellen ausübt, jedoch enzymatisch sehr aktiv bleibt.
  • Zusammenfassend zeigt das Plasmidschema, daß die strukturelle Domäne Ia eine Rezeptorbindungsdomäne ist, daß die erste Hälfte der strukturellen Domäne II für die Translokation des Toxins von einem endozytischen Vesikel der Wirtszelle in das Zytosol benötigt wird und daß die strukturelle Domäne III allein nicht ausreichend ist, volle ADP-Ribosylierungsaktivität zu exprimieren.
  • Wenn PE an Tiere verabreicht wird, verursacht es in charakteristischer Weise den Tod aufgrund von Leberversagen. Immuntoxine, die mit PE hergestellt werden, greifen auch die Leber an und verursachen Tod aufgrund von Lebertoxizität, wenn diese in großen Mengen verabreicht werden. Die in Tabelle 111 gezeigten Experimente deuten an, daß die Domäne Ia für die Zellbindung verantwortlich ist und daß ein PE-Molekül, in welchem die Domäne Ia deletiert ist, weniger toxisch für Mäuse ist als natives PE. Die in Beispiel 4 gezeigten Daten unterstützen diesen Schluß, indem sie andeuten, daß modifiziertes PE mindestens 200fach weniger toxisch für Mäuse als natives PE ist. Beispiel 5 zeigt, daß, wenn das durch pJH8 hergestellt Protein gereinigt und an einen Antikörper, der an den humanen Transferrinrezeptor bindet, geknüpft wird, ein Immuntoxin hergestellt wird, das ungefähr genauso aktiv wie ein Immuntoxin ist, welches natives PE enthält, jedoch 100fach weniger toxisch für Nicht-Zielzellen (Mauszellen) ist.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher, daß PE-Moleküle mit einer Deletion der Domäne Ia wirksame Immuntoxine mit verminderten Nebeneffekten, einschließlich verminderter Lebertoxizität, sind.
    • Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1 zeigt die Konstruktion der erfindungsgemäßen Plasmide, die für die Expression verschiedener Domänen von PE verwendet wurden.
  • Fig. 2 ist eine vereinfachte Karte der PE-Moleküle verschiedener Größe, die als Teil der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
  • Fig. 3 zeigt die Wirkung von PE&sub4;&sub5;-HB21 und PE-HB21 auf die Proteinsynthese in humanen KB-Zellen. PE&sub4;&sub5; ist das Toxinprotein, welchem die Domäne I fehlt und welches durch das Plasmid pJH8 kodiert wird. Die Zellen wurden für 24 h mit dem geeigneten Immuntoxin inkubiert und danach für 1 h mit ³H-Leucin inkubiert. Der Einbau (³H)-Leucin in das Protein wurde gemessen. Im Bild 3B wurden Swiss 3T3-Zellen für 24 h mit entweder nativem Pseudomonas-Toxin (PE), nativem Pseudomonas-Toxin, gebunden an HB21, PE&sub4;&sub5; allein oder PE&sub4;&sub5;, gebunden an HB21 inkubiert. Die Zellen wurden diesen Agenzien für 24 h ausgesetzt, und danach wurde die Proteinsynthese für eine Stunde wie vorstehend beschrieben gemessen.
    • Spezifische- Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein modifiziertes Pseudomonas-Exotoxin bereit, welches ADP-Ribosylierungsaktivität und die Fähigkeit, eine Zellmembran zu passieren, umfaßt und worin das Exotoxin eine Modifizierung in der rezeptorbindenden Domäne Ia des nativen Toxins umfaßt, die ausreichend ist, das modifizierte Toxin weniger toxisch für humane oder tierische Zellen in vitro und weniger toxisch für die Leber im Vergleich zu einem nicht-modifizierten Pseudomonas-Exotoxin werden zu lassen, wenn dieses in vivo verabreicht wird. Das modifizierte Toxin und das daraus hergestellte Immuntoxin besitzt eine deutlich verminderte nicht-spezifische Toxizität auf humane und Mauszellen in Gewebekultur und eine größtenteils verminderte Toxizität in Mäusen in vivo.
  • Genomische DNA wird durch vollständiges Schneiden eines Stammes von Pseudomonas aeruginosa mit EcoRI und PstI erhalten. Obwohl jeder Stamm von P. aeruginosa für die Verwendung dieser Erfindung geeignet ist, ist der bevorzugte Stamm PA103, ein Stamm, der eine große Menge des aktiven Toxins produziert. DNA-Fragmente in einem Größenbereich von 2,6 bis 2,9 kb werden aus der genomischen DNA-Bank isoliert und mit einem 2,7 kb DNA-Fragment von dem mit EcoRI und PstI geschnittenen Plasmid pUC13 ligiert. Das Plasmid pUC13 ist kommerziell erhältlich von Boehringer, Mannheim. Ein geeigneter Wirt, bevorzugt ein E.coli-Stamm, wird danach mit den ligierten Produkten transformiert (der bevorzugte Stamm von E.coli ist HB101, kommerziell erhältlich von Bethesda Research Laboratories). Das 2,7 kb DNA-Fragment, das von ptoxETA stammt, einem Plasmid, welches das PE Strukturgen enthält, wird als Probe verwendet, und Plasmid-DNA von mehreren positiven Kolonien wurde präpariert und durch Southern-Blotting charakterisiert. Die verschiedenen Größen des rekombinanten PE werden danach in einem geeigneten Wirt exprimiert. Ein Wirt, der das Gen für die RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 in lysogener und induzierbarer Form [BL21 (DE&sub3;)] trägt, ist bevorzugt und erhältlich von Dr. F.W. Studier bei Brookhaven National Laboratories. Ebenso bevorzugt sind Plasmide, die den späten Promotor des Bakteriophagen T7 und AMPr und die Shine-Dalgarno-Box--pAR2156 tragen, und ebenso von Dr. Studier erhältlich sind.
  • Wie in den Beispielen gezeigt ist, ist das bevorzugte Plasmid pJH8. pJH8 enthält ein 5,1 kb DNA-Fragment und ist fähig, die Domänen II, Ib und III von PE zu exprimieren. Dieses Plasmid wird durch partielles Schneiden des Plasmids pJH4 mit AvaI hergestellt. Das linearisierte DNA-Fragment wird danach vollständig mit HindIII geschnitten, um ein 5,1 kb DNA-Fragment zu erhalten, welches AvaI- und HindIII-Stellen an den Enden besitzt. Dieses Fragment wird dann mit 51- Nuklease inkubiert, um dessen überhängende Enden zu entfernen, gefolgt von einer Ligierung mit T4-Ligase, um das Plasmid pJH8 zu erzeugen.
    • Expression des rekombinanten Toxins in BL21(DE&sub3;)
  • BL21(DE&sub3;), welcher Plasmide für die Expression von PE verschiedener Größe enthält, wird in LB-Kulturmedium mit 50 ug Ampicilliin/ml bei 37ºC kultiviert. Wenn die Absorption bei 650 nm 0,3 erreicht, wird IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) zu einer Endkonzentration von 1 mM zu der Kultur zugefügt. Die Zellen werden 90 min. später geerntet und auf die Menge an rekombinanten Toxinen durch SDS-PAGE, Immunblotting, ADP-Ribosylierung und Zelltötungsexperimente untersucht.
    • SDS-PAGE und Immunblotting
  • Die Zellpellets werden in Laemmli-Puffer gelöst. Die Proben werden für 5 min. vor dem Auftragen auf ein 0,1% SDS, 10% Acrylamid-Flachgel gekocht. Zum Immunblotten werden die Proben nach der Elektrophorese auf einen Nitrocellulosefilter überführt, worauf die Reaktion mit einen gegen PE gerichteten Antikörper, danach einem zweiten Antikörper (Ziege-anti- Kaninchen) und das Färben folgte. Der gegen PE gerichtete Antikörper wird durch Hyperimmunisieren von Kaninchen mit Glutaraldehyd (0,2%)-behandeltem PE (250 ug PE pro Injektion) erhalten. Eine IgG-Fraktion wurde für das Immunblotten hergestellt.
    • Assay der ADP-Ribosylierungsaktivität
  • Bekannte Verfahren werden für den Assay der ADP-Ribosylierungsaktivität verwendet. Kurz zusammengefaßt: Präparationen von Retikulocyten aus Kaninchen oder Weizenkeimextrakte, die mit Elongationsfaktor 2 (EF-2) angereichert sind, werden als Quelle von EF-2 verwendet. Die Assays (500 41 Gesamtvolumen) enthalten ungefähr 10 pmol EF-2, 37 pmol ¹&sup4;C-NAD (0,06 uci), 0,25 bis 1,25 ug PE und Puffer (40 mM DTT, 1 mM EDTA und 50 mM Tris, pH 8,1). Die Aktivität wird als pmol NAD gemessen, welches in 30 min auf EF-2 übertragen wurde. Eine Standardkurve bekannter PE-Konzentrationen wird aufgestellt und zur Bestimmung der PE-Aktivität in Extrakten von E.coli verwendet. Nach 30minütiger Inkubation bei 37ºC wird 0,5 ml 12% TCA zu jeder Reaktionsmischung zugefügt. Die Reaktionsmischung wird danach für 15 min in ein Eisbad gesetzt, worauf Zentrifugation für 10 min bei 4ºC, 3.000·g folgt. Das Pellet wird mit 1 ml 6% TCA gewaschen und wie vorstehend erwähnt zentrifugiert. Das Pellet wird danach hinsichtlich ¹&sup4;C-Radioaktivität in einem Flüssigszintillationszähler als Index der ADP-Ribosylierungsaktivität gemessen.
    • Zellzytotoxizitätstest
  • Die Tests auf zytotoxische Aktivität des modifizierten PE werden mit NIH 3T3-Zellkulturen und humanen KB-Zellen durchgeführt. NIH 3T3-Zellen oder KB-Zellen werden 24 h vor dem Zytotoxizitätstest zu einer Dichte von 2·10&sup4; Zellen pro Vertiefung in einer Gewebekulturschale mit 24 Vertiefung ausgesät. Nach 48stündiger Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen an PE oder Proteinextrakten, die von BL21(DE&sub3;) mit Plasmiden, welche PE verschiedener Größe exprimieren, isoliert wurden, werden die einschichtigen Kulturen mit Methylenblau gefärbt, um die überlebenden Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
    • Hemmung der Proteinsynthese
  • Die Assays für die Hemmung der Proteinsynthese durch PE oder PE mit Extrakten von BL21(DE&sub3;)/pJH8 werden in Swiss 3T3- Zellkulturen durchgeführt. Swiss 3T3-Zellen werden einen Tag vor dem Assay in Gewebekulturschalen mit 24 Vertiefungen zu einer Dichte von 10- Zellen pro Vertiefung ausgesät. Die Zellen werden einmal dadurch gewaschen, daß das Medium durch DMEM und 0,2% BSA ersetzt wird, bevor PE (100 ng/ml) oder PE (100 ng/ml) mit Extrakten, die eine Überschußmenge an PE verschiedener Größe enthielten, zugefügt wurde (Tabelle 2). Nach 15 min bei 37ºC wird das Medium daraufhin entfernt und mit frischem DMEM und 0,2% BSA ersetzt. 4 Stunden später wird die Rate der Proteinsynthese durch Zufügen von [³H]- Leucin zum Medium (zu einer Endkonzentration von 2-4 uCi/ml) für 1 Stunde bestimmt.
  • In einer bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Strukturdomäne des Pseudomonas-Exotoxingens stromabwärts von der Ribosomen-Bindungsstelle und des begleitenden ATG- Initiationskodons (wie in Fig. 1 gezeigt) wie vorstehend beschrieben in einen T7-Expressionsvektor eingesetzt. Um rekombinante Proteine herzustellen werden die Zellen bei 37ºC zu einer A&sub6;&sub5;&sub0; = 0,3 kultiviert. IPTG wird danach zu 1 mM zugefügt, um die T7-RNA-Polymerase zu induzieren und für 2 Stunden inkubiert. Eine Plasmidserie wird wie in Beispiel 1 gezeigt hergestellt.
  • Als nächstes wird ein Klon, der für ein PE-Molekül ohne Leader-Sequenz (pJH4) kodiert und in welchen ein Methionin benachbart zum Alanin am Amino-Terminus der prozessierten Form des nativen PE (Tabelle 1) plaziert ist, konstruiert. Das durch pJH4 produzierte Protein wird Met-PE bezeichnet. Große Mengen an Met-PE werden nach Induktion durch IPTG hergestellt, so daß es 20% des Gesamt-Zellproteins darstellt. Eine ADP-Ribosylierungsaktivität, die äquivalent zu 0,1 mg nativem PE ist, wird im Überstand und 0,2 mg im Pellet pro mg Gesamt-Zellprotein gefunden. Das von pJH4 hergestellt PE-Molekül unterscheidet sich von nativen PE-Molekülen durch die Gegenwart eines zusätzlichen Methionin-Rests am Amino-Terminus.
  • pJH8, das wie vorstehend bemerkt ausgehend von pJH4 hergestellt wird, exprimiert ein Protein, in welchem der größte Teil der Domäne Ia deletiert ist (wobei nur das angefügte Methionin und drei Aminosäuren am Amino-Terminus übrig sind). Immunblotting zeigt, daß dieses Protein eine Größe von 45 kd besitzt und zu einer Konzentration von ungefähr 0,04 mg/mg Zellprotein exprimiert wird. Eine hohe ADP-Ribosylierungsaktivität wird ausgeübt, wenn Harnstoff und DTT in der Reaktionsmischung fehlt. Im Gegensatz zu nativem PE (bei dem der Zusatz von Harnstoff und DTT ADP-Ribosylierungsaktivität aktiviert), vermindert der Zusatz von Harnstoff und DTT zu pJH8 die ADP-Ribosylierungsaktivität (um ungefähr 30%).
  • Keines der durch das vorstehend erwähnte (und in den Beispielen beschriebene) Verfahren hergestellten Plasmide, außer pJH1, pJH2 und pJH4, übte signifikante Zelltötungsfähigkeit aus, obwohl viele von diesen Plasmiden hohe enzymatische Aktivität aufweisen (Tabelle 1). Es zeigt sich, daß diese Plasmide die Hemmung der Proteinsynthese oder die Zelltötung durch natives PE verhindern, wenn die Zellen für 15 min nativem PE zu 0,1 ug/ml in der Gegenwart von 3-5 ug/ml verschiedener modifizierter Toxine ausgesetzt werden. Die Daten in Tabelle III zeigen, daß die Plasmide, welche entweder die Domäne Ia allein oder die Domäne I, die Hälfte der Domäne II und die Domäne III exprimieren, PE an einer Hemmung der Proteinsynthese hindern.
    • Toxizität auf Tiere
  • Mäuse, die natives PE erhalten, erliegen aufgrund einer Leberzerstörung. Die letale Dosis für eine 20 g-Maus ist 0,1- 0,2 ug. Die Daten in Tabelle IV zeigen, daß PE mit einer Deletion der Domäne Ia eine stark verminderte Toxizität in Mäusen ausübt. Mäuse wurden i.p. mit entweder nativem PE oder PE ohne die Domäne Ia injiziert. Alle Mäuse, die 1,0 ug natives PE erhielten, und die Hälfte der Mäuse, die 0,2 ug PE erhielten, waren nach 48 Stunden tot. 2 von 3 Mäusen, die 50 ug PE Ia erhielten, starben; alle Mäuse, die 20 ug PE Ia erhielten, lebten; und alle Mäuse, die 5 ug PE Ia erhielten, lebten. Folglich ist PE Ia mehr als 100fach weniger toxisch auf Gewichtsgrundlage als natives PE.
    • Genfusionen unter Verwendung von rekombinantem, modifiziertem Pseudomonas-Exotoxin
  • Das Gen für erfindungsgemäßes, modifiziertes PE, das speziell in pJH8 enthalten ist, wurde mit DNA-Sequenzen, die für den humanen alpha-transformierenden Wachstumsfaktor (a- TGF) oder humanes Interleukin 2 (IL-2) kodieren, fusioniert. Siehe Beispiele 7 und 8 hinsichtlich der Einzelheiten dieser Genfusionen. Modifiziertes PE ist für eine Verwendung in Fusionen mit jedem Peptidhormon, Wachstumsfaktor oder einem anderen Polypeptid-Zellerkennungsprotein, für welches ein spezifischer Rezeptor auf Zellen vorkommt, geeignet. Einige Beispiele umfassen: Insulin, Glucagon, Endorphine, Wachstumshormon, Melanocyten-stimulierendes Hormon, Transferrin, Bombesin, Lipoprotein niederer Dichte (low-density lipoprotein), luteinisierendes Hormon und Asialoglycoproteine.
    • Beispiele Beispiel 1
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde das erfindungsgemäße Verfahren dazu verwendet, mehrere Plasmide, welche Fusionen des PE-Strukturgens verschiedener Größe und des späten Promotors von T7 enthielten, zu konstruieren. pJH2 enthält das intakte PE-Strukturgen mit einem Segment, das für eine davorstehende, modifizierte Leader-Sequenz kodiert. pJH4 enthält das intakte PE-Strukturgen mit der Zufügung eines Methioninkodons am Amino-Terminus. pJH7 enthält das Gen, das für die Strukturdomäne 111 von PE (Aminosäure 405-613) kodiert. pJH8 enthält das Gen, das für die Strukturdomäne II, Ib und 111 von PE (Aminosäure 253-613) kodiert. pJH13 kodiert für PE mit einer Deletion der ersten Hälfte der Strukturdomäne II, die die Aminosäuren 253-307 umfaßt. pJH14 kodiert für die Strukturdomäne Ia von PE (Aminosäuren 1-252).
  • pJH1 wurde durch partielles Schneiden des nativen PE (pE 0) mit BamHI konstruiert, und die lineare Form der DNA wurde eluiert und vollständig mit EcoRI geschnitten. Das von pE 0 stammende 2,0 kb DNA-Fragment, welches BamHI- und EcoRI- Stellen an den zwei Enden besitzt, wurde danach in pAR 2156, welches vollständig mit BamHI und EcoRI geschnitten worden ist, eingesetzt.
  • pJH2 wurde durch partielles Schneiden von pJH1 mit BamHI konstruiert. Die lineare Form der DNA wurde isoliert und vollständig mit NdeI geschnitten. Das 610 kb DNA-Fragment wurde gewonnen, um pJH2 dadurch zu konstruieren, daß dieses mit dem synthetischen Oligonukleotid-Doppelstrang
  • 5' T A T G A A A A A A C T T T T T C T A G 5'
  • ligiert wurde.
  • pJH4 wurde durch partielles Schneiden von pJH2 mit TaqI konstruiert. Die linearisierte DNA (610 kb) wurde isoliert und vollständig mit NdeI geschnitten. Das größte DNA-Fragment (5,9 kb) wurde abgetrennt und mit dem synthetischen Oligonukleotid-Doppelstrang
  • 5' T A T G G C C G A A G A A G C T T T A C C G G C T T C T T C G A A A G C 5'
  • ligiert (welches eine HindIII-Stelle--AAGCTT enthält). TTCGAA
  • pJH7 wurde durch partielles Schneiden von pJH4 mit AatII konstruiert. Das linearisierte DNA-Fragment (5,9 kb) wurde danach vollständig mit HindIII geschnitten. Das 4,7 kb DNA- Fragment, welches nach der Abtrennung AatII- und HindIII- Stellen an den Enden besitzt, wurde mit S1 Nuklease inkubiert, um die überhängenden Enden zu entfernen, worauf eine Ligierung mit T4-Ligase folgte.
  • pJH8 wurde wie in der "Spezifischen Offenbarung" beschrieben konstruiert.
  • pJH13 wurde durch partielles Schneiden von pJH4 mit AvaI konstruiert. Das linearisierte DNA-Fragment wurde danach vollständig mit EcoRI geschnitten. Die 4,7 kb DNA, die AvaI- und EcoRI-Schnitte an beiden Enden besitzt, wurde mit S1 inkubiert, um die kohäsiven Enden zu entfernen (DNA-Fragment 1).
  • pJH4 wurde partiell mit SalI geschnitten. Das linearisierte DNA-Fragment wurde danach vollständig mit EcoRI geschnitten. Das 1,0 kb DNA-Fragment, das SalI- und EcoRI- Stellen an den Enden besitzt, wurde mit Klenow-DNA-Polymerase I und dNTP inkubiert, um die kohäsiven Enden auf zufüllen (DNA-Fragment 2). Das DNA-Fragment 1 (4,7 kb) und das DNA-Fragment 2 (1,0 kb) wurden über Nacht bei 40 ligiert.
  • pJH14 wurde durch partielles Schneiden von pJH4 mit AvaI konstruiert. Das linearisierte DNA-Fragment wurde danach vollständig mit EcoRI geschnitten. Die 4,7 kb DNA, die AvaI- und EcoRI-Stellen an dessen Enden besitzt, wurde mit S1 inkubiert, um die kohäsiven Enden zu entfernen, worauf eine Ligierung mit T4-Ligase erfolgte.
    • Beispiel 2
  • Die Menge und Aktivität der rekombinanten Toxine (hergestellt durch die in Beispiel 1 beschriebenen Plasmide) wurde durch SDS-PAGE, ADP-Ribosylierung und Zelltötungsfähigkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 tabellarisch aufgeführt.
    • Beispiel 3
  • Experimente wurden durchgeführt, um die Eigenschaften der rekombinanten Toxizität der vorliegenden Erfindung zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
    • Beispiel 4
  • Der Effekt der verschiedenen Deletionen auf die Zellproteinsynthese wurde in der Gegenwart und in Abwesenheit von nativem PE bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Strukturdomäne Ia (pJH14) und die Strukturdomänen I, die Hälfte von II und III (pJH13) wurden aus dem Pellet beschallter Zellen mit 8M Harnstoff extrahiert. 10 ul eines jeden Extrakts, entsprechend 3-5 ug rekombinante Proteine, wurde in jedem Assay verwendet. Die Strukturdomänen II, Ib und III (pJH8) waren im Überstand der beschallten BL21(DE&sub3;)/pJH8-Zellen vorhanden. 10 ul Extrakt, entsprechend 2 ug rekombinantes Toxin, wurden verwendet. Die Zellen wurden wie in Tabelle 3 gezeigt für 15 min mit und ohne nativem PE zu 0,1 ug/ml behandelt, worauf Waschen durch 1 ml DMEM folgte; inkubiert für 4 Stunden in DMEM und 0,2% BSA, danach inkubiert mit ³H-Leucin für 1 Stunde.
    • Beispiel 5
  • Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde die Dosis, die den Tod bei Mäusen verursacht, dadurch bestimmt, daß Balb/c-Mäuse i.p. mit verschiedenen Mengen an PE oder PE Ia, enthalten in 1,0 ml steriler Kochsalzlösung und 10 mg/ml sterilem humanen Albumin, injiziert wurden. Die Tiere wurden täglich zwei Wochen lang überwacht. Alle Todesfälle ereigneten sich innerhalb 48 Stunden.
    • Beispiel 6
  • Wie in Fig. 3 gezeigt, tötet ein Immuntoxin, das aus dem durch pJH8 hergestellten 45 kD Protein, welches durch eine Disulfidbindung an einen gegen den humanen Transferrin-Rezeptor (PE&sub4;&sub5;-HB21) gerichteten Antikörper konjugiert ist, besteht, humane Zellen, die den Transferrin-Rezeptor exprimieren (ID&sub5;&sub0; 3 ng/ml). Es hat wenig oder keine Wirkung bei 1000 ng/ml auf Mauszellen, die den humanen Transferrin-Rezeptor nicht exprimieren, während natives PE, das durch eine Sulfidbindung an HB21 konjugiert ist, nicht-spezifisch Mauszellen mit einer ID&sub5;&sub0; von 29 ng/ml tötet. Die Daten in Fig. 3 zeigen, daß die nicht-spezifische Toxizität von PE&sub4;&sub5;-HB21 100fach niedriger im Vergleich zu PE-HB21 ist.
  • Das Molekulargewicht von PE&sub4;&sub5; wurde nachfolgend nochmals bestimmt. Es wurde gefunden, daß das Molekulargewicht dann 40.000 war.
    • Beispiel 7 Konstruktion des Fusionsgens aus alpha-transformierendem Wachstumsfaktor und PE
  • pJH8 wurde mit Tth 111I und SphI behandelt, um ein kleineres Plasmid pVC8 zu konstruieren, welches weniger AvaII-Stellen besitzt. pVC8 wurde partiell mit AvaII geschnitten und an ein synthetisches Oligonukleotid (30bp), das eine StuI-Stelle, eine Tth 111I-Stelle und ein Stoppkodon enthält, ligiert, um pVC31 zu erzeugen. pvc3l wurde mit Tth 111I geschnitten und mit einem Klenow-Fragment, einem Fragment der DNA-Polymerase, aufgefüllt und an einen Klon mit glatten Enden, der das alpha-TGF-Gen enthält, ligiert (pVC33). Die alpha-TGF DNA, p-hTGF-10-925 [Derynck et al., Cell, 38 : 287-297 (1984)] wurde mit EcoRI und BglI geschnitten, um ein 322 bp-Fragment zu erzeugen, welches isoliert, mit Fnu 4HI geschnitten und mit T4-Polymerase behandelt wurde, um ein 152 bp-Fragment zu erzeugen, welches wiederum an pVC31 ligiert wurde, um das Fusionsgen aus PE und alpha-TGF zu erzeugen. Dieses Plasmid produziert, wenn es in E.coli B121 exprimiert wird, ein Protein, das mit Antikörpern gegen alpha-TGF und gegen PE reagiert und ein Molekulargewicht von 51.000 besitzt.
    • Beispiel 8 Konstruktion des Fusionsgens aus IL-2 und PE
  • pVC8 wurde mit AvaII an der Position 1190 geschnitten, das 3,6 kb-Fragment isoliert, dessen einzelsträngige Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und dephosphoryliert, um das Fragment I herzustellen. Der Klon PST-5 [Gallo et al., PNAS, 81:2543-2547 (1984] wurde PstI geschnitten, um ein 1 kb- Fragment von 11-2 herzustellen, welches danach mit Bsp 1286 an den Positionen 105 und 669 geschnitten und mit T4-Polymerase behandelt wurde, um die Enden aufzufüllen. Das 564 bp- Fragment wurde an das Fragment I ligiert, um pHL-1 zu erzeugen und in BL21-Expressionszellen transformiert. Nach Induktion wurde ein 60 kD-Protein hergestellt, das mit Antikörpern gegen IL-2 und gegen PE reagiert und ADP-Ribosylierungsaktivität besitzt. Tabelle 2 Konstruktion Domäne vorhanden Proteingröße pJH4 met, I, II, III 68 kd pJH7 III 28 kd pJH8 II, Ib, III 45 kd pJH13 I, Hälfte von II, III 63 kd pJH14 Ia 32 kd Tabelle 3 ³H-Leucin-Einbau (cm·10³ getestete Domäne ohne PE mit PE (I, IIf III) keine 11,2 ± 0,1 2,3 ± 0,2 Ia 11,5 ± 0,15 9,4 ± 0,3 II, Ib & III 11,7 ± 0,15 2,4 ± 0,2 I, ½ II, III 10,7 ± 0,15 9,2 ± 0,2 8 M Harnstoff 11,1 ± 0,1 2,9 ± 0,2 (10 ul) Tabelle 3 Toxin Dosis (ug) Tote PE&sub4;&sub5; 50 2/3 PE&sub4;&sub5; 20 0/3 PE&sub4;&sub5; 5 0/3 PE 10 3/3 PE 1, 0 3/3 PE 0,3 3/3 PE 0,2 1/3 PE 0,1 0/3

Claims (32)

1. Modifiziertes Pseudomonas-Exotoxin, welches ADP-Ribosylierungsaktivität und die Fähigkeit, eine Zellmembran zu passieren, umfaßt, und worin das Exotoxin eine Modifizierung in der Rezeptor-bindenden Domäne Ia des nativen Toxins umfaßt, die ausreichend ist, das modifizierte Toxin weniger toxisch für humane oder tierische Zellen in vitro und weniger toxisch für die Leber im Vergleich zu einem nicht-modifizierten Pseudomonas-Exotoxin werden zu lassen, wenn dieses in vivo verabreicht wird.
2. Konjugat aus einem zielorientierten Träger und Toxin, welches für die Verwendung bei Menschen oder Säugetieren geeignet ist, umfassend ein Toxin, welches an einen zielorientierten Träger fusioniert ist, worin das Toxin ein modifiziertes Pseudomonas-Exotoxin nach Anspruch 1 ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2, worin der zielorientierte Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper, einem Wachstumsfaktor, einem Hormon, einem Lymphokin, einem Polypeptid-Zellerkennungsprotein, einem Serumprotein, einem modifizierten Serumprotein, einem Endorphin, einem Asialoglykoprotein, Insulin, Glucagon, luteinisierendem Hormon, Fibroblastenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, Melanocyten-stimulierendem Hormon, Bombesin und einem Lectin.
4. Konjugat nach Anspruch 2, worin der zielorientierte Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin 2 und α-transformierendem Wachstumsfaktor und einem Peptidhormon.
5. Immuntoxin, welches für die Verwendung bei Menschen oder Tieren geeignet ist, umfassend ein Toxin, welches an einen Antikörper fusioniert ist, der fähig ist, erkrankte oder Krankheit verursachende Zellen zu erkennen, worin das Toxin ein modifiziertes Pseudomonas-Exotoxin nach Anspruch 1 ist.
6. Immuntoxin nach Anspruch 5, worin das Exotoxin die Domänen Ib, II und III des Pseudomonas-Exotoxins enthält.
7. Immuntoxin nach Anspruch 5, worin das Exotoxin das rekombinante Pseudomonas-Exotoxin ist, welches durch das Plasmid pJH8 kodiert ist, das unter der ATCC-Nr. 67208 hinterlegt ist.
8. Pseudomonas-Immuntoxin nach Anspruch 5, worin mindestens eine Aminosäure aus der Domäne Ia des Exotoxins deletiert ist.
9. Pseudomonas-Immuntoxin nach Anspruch 5, worin mindestens 11 Aminosäuren in der Domäne Ia aus dem Exotoxin deletiert worden sind.
10. Pseudomonas-Immuntoxin nach Anspruch 5, worin mindestens 25 Aminosäuren in der Domäne Ia aus dem Exotoxin deletiert worden sind.
11. Pseudomonas-Immuntoxin nach Anspruch 5, worin mindestens 70 Aminosäuren in der Domäne Ia aus dem Exotoxin deletiert worden sind.
12. Pseudomonas-Immuntoxin nach Anspruch 5, worin mindestens 130 Aminosäuren aus der Domäne Ia aus dem Exotoxin deletiert worden sind.
13. Expressionsplasmid, umfassend DNA, welche eines der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 12 kodiert.
14. Verfahren zum Herstellen eines modifizierten Pseudomonas- Exotoxins nach Anspruch 1, umfassend das Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend, welche das modifizierte Exotoxin kodiert, und das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, so daß das modifizierte Pseudomonas-Exotoxin produziert wird.
15. Verfahren zum Herstellen eines Immuntoxins nach Anspruch 5, umfassend
a) das Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Plasmid, welches das modifizierte Pseudomonas-Exotoxin nach Anspruch 1 kodiert
b) das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, so daß das modifizierte Pseudomonas-Exotoxin produziert wird, und
c) das Konjugieren des modifizierten Exotoxins mit einem Antikörper, um ein Immuntoxin herzustellen.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das modifizierte Pseudomonas-Exotoxingen die Domänen Ib, II und III des Pseudomonas-Exotoxins enthält.
17. Verfahren zum Herstellen eines Konjugats aus einem zielorientierten Träger und Pseudomonas-Exotoxin nach Anspruch 2, umfassend das Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend eine DNA-Sequenz, welche das Konjugat mit dem zielorientierten Träger kodiert, und das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, so daß ein Konjugat aus einem zielorientierten Träger und Pseudomonas-Exotoxin produziert wird.
18. Zusammensetzung, welche für die Verabreichung an ein Säugetier zum Erreichen einer zielorientierten zytotoxischen Aktivität in dem Säugetier geeignet ist, worin die Zusammensetzung ein Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 12 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
19. Rekombinantes Plasmid, umfassen- DNA, welche die Aminosäuren 253 bis 364 der Domäne II des Pseudomonas-Exotoxins kodiert.
20. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 19, worin das Plasmid pJH12 ist, welches unter der ATCC-Nr. 67205 hinterlegt ist.
21. Rekombinantes Plasmid, umfassend DNA, welche ein modifiziertes Pseudoinonas-Exotoxin nach Anspruch 1 kodiert, fusioniert an DNA, welche mindestens die Aminosäuren 35 bis 223 von Interleukin 2 kodiert.
22. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 21, worin das Plasmid pHL-1 ist, welches unter der ATCC-Nr. 67206 hinterlegt ist.
23. Rekombinantes Plasmid, umfassend DNA, welche ein modifiziertes Pseudomonas-Exotoxin nach Anspruch 1 kodiert, fusioniert an DNA, welche α-TGF kodiert.
24. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 23, worin das Plasmid pVC33 ist, welches unter der ATCC-Nr. 67207 hinterlegt ist.
25. Rekombinantes Plasmid, umfassend DNA, welche ein modifiziertes Pseudomonas-Exotoxin nach Anspruch 1 kodiert.
26. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 25, worin das Plasmid pJH8 ist, welches unter der ATCC-Nr. 67208 hinterlegt ist.
27. Rekombinantes Plasmid, umfassend DNA, welche die strukturelle Domäne Ia des Pseudomonas-Exotoxins kodiert.
28. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 27, worin das Plasmid pJH14 ist, welches unter der ATCC-Nr. 67209 hinterlegt ist.
29. Modifiziertes Pseudomonas-Exotoxin nach Anspruch 1, worin das Exotoxin genetisch modifiziert worden ist.
30. Konjugat aus einem Antigen und Toxin nach Anspruch 3, worin das Exotoxin durch rekombinante Techniken modifiziert worden ist.
31. Verwendung eines Exotoxins nach Anspruch 1 oder eines Exotoxins, welches durch eines der Plasmide nach den Ansprüchen 19 bis 28 kodiert ist, für die Herstellung eines Impfstoffes für aktive Immunisierung.
32. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 2 bis 12 für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Krebs.
DE3789587T 1986-09-24 1987-09-23 Rekombinantes Pseudomonastoxin : Konstruktion eines wirksamen Immunotoxins mit wenigen Nebenwirkungen. Expired - Lifetime DE3789587T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/911,227 US4892827A (en) 1986-09-24 1986-09-24 Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3789587D1 DE3789587D1 (de) 1994-05-19
DE3789587T2 true DE3789587T2 (de) 1994-07-28

Family

ID=25429936

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3789587T Expired - Lifetime DE3789587T2 (de) 1986-09-24 1987-09-23 Rekombinantes Pseudomonastoxin : Konstruktion eines wirksamen Immunotoxins mit wenigen Nebenwirkungen.
DE3752387T Expired - Lifetime DE3752387T2 (de) 1986-09-24 1987-09-23 Rekombinantes Exotoxin von Pseudomonas: Konstruktion eines aktiven Immunotoxins mit schwachen Nebenwirkungen

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3752387T Expired - Lifetime DE3752387T2 (de) 1986-09-24 1987-09-23 Rekombinantes Exotoxin von Pseudomonas: Konstruktion eines aktiven Immunotoxins mit schwachen Nebenwirkungen

Country Status (19)

Country Link
US (2) US4892827A (de)
EP (2) EP0583794B1 (de)
JP (3) JP2848489B2 (de)
KR (1) KR970001563B1 (de)
AT (2) ATE311442T1 (de)
AU (1) AU618722B2 (de)
CA (1) CA1336691C (de)
DE (2) DE3789587T2 (de)
DK (2) DK173301B1 (de)
ES (2) ES2074042T3 (de)
FI (1) FI105271B (de)
IE (1) IE66223B1 (de)
IL (2) IL105160A (de)
NO (1) NO180270C (de)
NZ (1) NZ221923A (de)
PT (1) PT85777B (de)
SG (1) SG96159A1 (de)
WO (1) WO1988002401A1 (de)
ZA (1) ZA877153B (de)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5169939A (en) * 1985-05-21 1992-12-08 Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College Chimeric antibodies
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US6051405A (en) * 1986-09-24 2000-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins
WO1989010971A1 (en) * 1988-05-09 1989-11-16 The United States Of America, As Represented By Th Vector for secretion of proteins directly into periplasm or culture medium
US5206353A (en) * 1988-07-23 1993-04-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CD-4/cytotoxic gene fusions
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5135736A (en) * 1988-08-15 1992-08-04 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
ZA898139B (en) * 1988-11-17 1990-08-29 Hoffmann La Roche Recombinant interleukin-2 hybrid proteins
DE69025211T2 (de) * 1989-02-17 1996-09-19 Merck & Co Inc Protein-Antikrebsmittel
US6406697B1 (en) * 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
IL93723A (en) * 1989-03-22 1997-02-18 Merck & Co Inc Cystein modified truncated pseudomonas exotoxin A
US5621078A (en) * 1989-03-22 1997-04-15 Merck & Co., Inc. Modified pseudomonas exotoxin PE40
JPH0829101B2 (ja) * 1989-04-21 1996-03-27 アメリカ合衆国 組換え抗体―毒素融合タンパク質
US6207798B1 (en) 1989-08-03 2001-03-27 Merck & Co., Inc. Modified PE40 toxin fusion proteins
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US6329508B1 (en) 1989-09-07 2001-12-11 Alkermes, Inc. Transferrin receptor reactive chimeric antibodies
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5527527A (en) * 1989-09-07 1996-06-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
CA2071946A1 (en) * 1989-12-21 1991-06-22 Ira H. Pastan Toxin for construction of immunotoxins
US5458878A (en) * 1990-01-02 1995-10-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services P. exotoxin fusio proteins have COOHG220101al alterations which increase cytotoxicity
AU644139B2 (en) * 1990-01-02 1993-12-02 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin
US5110912A (en) * 1990-03-02 1992-05-05 Seragen, Inc. Purification of il-2-containing hybrid compounds
DE69131449T2 (de) * 1990-05-11 1999-11-25 The United States Of America, Represented By The Secretary Verbesserte exotoxine aus pseudomonas mit geringer toxität bei tieren und hoher zelltötender aktivität
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
US5241053A (en) * 1990-09-05 1993-08-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Fused proteins comprising glycoprotein gD of HSV-1 and LTB
US6099842A (en) * 1990-12-03 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin
US5571894A (en) * 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0529033B1 (de) * 1991-02-08 2006-08-30 Aventis Pharma S.A. Nukleotidsequenzen, die für die veränderlichen bereiche der alpha-ketten menschlicher t-zell-rezeptoren kodieren sowie ihre verwendungen
FR2672616B1 (fr) * 1991-02-08 1994-09-23 Roussel Uclaf Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines alpha des recepteurs de lymphocytes t humains, segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et therapeutiques.
IE920447A1 (en) * 1991-02-12 1992-08-12 Roussel Uclaf NUCLEOTIDE SEQUENCES CODING FOR ß-CHAIN VARIABLE REGIONS OF¹HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTORS, CORRESPONDING PEPTIDE SEGMENTS¹AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS
US5328984A (en) * 1991-03-04 1994-07-12 The United States As Represented By The Department Of Health & Human Services Recombinant chimeric proteins deliverable across cellular membranes into cytosol of target cells
US5223604A (en) * 1991-06-25 1993-06-29 S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated Pseudomonas exoenzyme s peptide composition and method
US5939531A (en) * 1991-07-15 1999-08-17 Novartis Corp. Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2081952A1 (en) * 1991-11-08 1993-05-09 John J. Donnelly Recombinant dna sequences and plasmids for cellular immunity vaccines from bacterial toxin-antigen conjugates, and methods of their use
JP3553933B2 (ja) * 1992-06-18 2004-08-11 アメリカ合衆国 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素
GB9326174D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
US6015555A (en) * 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
JPH11513669A (ja) * 1995-10-13 1999-11-24 アメリカ合衆国 ジスルフィド安定化抗体フラグメントを含む免疫毒素
WO1997031948A1 (en) 1996-03-01 1997-09-04 Novartis Ag Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy
WO1998020135A2 (en) 1996-11-06 1998-05-14 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Protease-activatable pseudomonas exotoxin a-like proproteins
US6818222B1 (en) 1997-03-21 2004-11-16 Chiron Corporation Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants
US20030198772A1 (en) * 1997-06-26 2003-10-23 Weder Donald E. Polymeric materials having a texture or appearance simulating the texture or appearance of paper
US20020004113A1 (en) * 1997-06-26 2002-01-10 Weder Donald E. Decorative cover for flower pot or floral grouping formed of polymeric materials having a texture or appearance simulating the texture or appearance of paper
US20030054012A1 (en) * 2000-05-12 2003-03-20 Fitzgerald David J. Pseudomonas exotoxin a-like chimeric immunogens for eliciting a secretory iga-mediated immune response
US7314632B1 (en) * 1997-07-11 2008-01-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin A-like chimeric immunogens
CA2295971C (en) * 1997-07-11 2011-02-08 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Pseudomonas exotoxin a-like chimeric immunogens
US6077676A (en) * 1997-12-18 2000-06-20 Spectral Diagnostics, Inc. Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C
US6794128B2 (en) 1998-04-24 2004-09-21 The Regents Of The University Of California Methods of selecting internalizing antibodies
US7244826B1 (en) 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
AU2004201055B2 (en) * 1998-04-24 2007-08-23 The Regents Of The University Of California Internalizing ErbB2 antibodies
US20020142000A1 (en) * 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
US20030103948A1 (en) * 1999-06-07 2003-06-05 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US20030143233A1 (en) * 1999-06-07 2003-07-31 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US7144991B2 (en) 1999-06-07 2006-12-05 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US6838553B1 (en) * 1999-10-05 2005-01-04 Academia Sinica Peptide repeat immunogens
US7078486B2 (en) * 1999-12-10 2006-07-18 Spectral Diagnostics, Inc. Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C
US20050287638A1 (en) * 2000-04-25 2005-12-29 Weigel Paul H Hyaluronan receptor for endocytosis, variants thereof, and methods of making and using same
CA2410024A1 (en) * 2000-04-25 2001-11-01 The Board Of Regents Of The University Oklahoma Identification and uses of a hyaluronan receptor
US20030104987A1 (en) * 2001-04-25 2003-06-05 Weigel Paul H. Methods of using the hyaluronan receptor for endocytosis
DE60137969D1 (de) * 2000-12-21 2009-04-23 Us Gov Health & Human Serv Ein chimäres protein das nichttoxische pseudomonas exotoxin a und typ iv pilin sequenzen enthält
ATE468348T1 (de) 2001-09-26 2010-06-15 Government Of The Us Secretary Mutierte anti-cd22-antikörper mit erhöhter affinität zu cd22-exprimierenden leukämiezellen
JP2005508375A (ja) * 2001-11-09 2005-03-31 ネオファーム、インコーポレイティッド Ｉｌ−１３を発現する腫瘍の選択的治療
WO2004087758A2 (en) * 2003-03-26 2004-10-14 Neopharm, Inc. Il 13 receptor alpha 2 antibody and methods of use
EP1635868A1 (de) 2003-04-30 2006-03-22 Uwe Zangemeister-Wittke Methode zur krebsbehandlung mittels immunotoxin
AU2004293471C1 (en) * 2003-11-25 2011-02-24 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Mutated anti-CD22 antibodies and immunoconjugates
WO2006039238A2 (en) * 2004-09-30 2006-04-13 The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Irta2 antibodies and methods of use
CA2583226A1 (en) 2004-10-04 2006-04-20 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for immunizing against pseudomonas infection
JP2008515808A (ja) * 2004-10-04 2008-05-15 トリニティ バイオシステムズ インコーポレーテッド 針不用の高分子送達のための方法及び組成物
CA2591992A1 (en) 2004-12-22 2006-06-29 The Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for producing recombinant proteins
EP1885393A4 (de) 2005-05-18 2011-03-02 Childrens Hosp & Res Ct Oak Verfahren und zusammensetzungen zur immunisierung gegen chlamydien-infektionen
ES2564092T3 (es) 2005-07-29 2016-03-17 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida
US20070148131A1 (en) * 2005-12-05 2007-06-28 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of binding partners
US7666991B2 (en) * 2005-12-05 2010-02-23 Trinity Biosystems, Inc. Compositions for needleless delivery of antibodies
WO2007109110A2 (en) 2006-03-16 2007-09-27 Trinity Biosystems, Inc. Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs
EP1878744A1 (de) * 2006-07-13 2008-01-16 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Epitope-Tag für an der Oberfläche exprimierte T-Zell Rezeptor Proteine, deren Anwendung und Verfahren zur Selection von Wirtszellen, die sie exprimieren
US20090092660A1 (en) * 2006-08-09 2009-04-09 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of particles
EP2178559B1 (de) 2007-07-20 2015-06-24 The General Hospital Corporation Rekombinante vibrio-cholerae-exotoxine
US8871906B2 (en) 2007-09-04 2014-10-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Deletions in domain II of pseudomonas exotoxin a that remove immunogenic epitopes
CN108129573B (zh) * 2007-09-21 2021-10-08 加利福尼亚大学董事会 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性
JP5836125B2 (ja) 2008-10-16 2015-12-24 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 高分子量メラノーマ関連抗原に対する完全ヒト抗体およびその使用
WO2011031441A1 (en) 2009-08-28 2011-03-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Therapy with a chimeric molecule and a pro-apoptotic agent
AU2010292069B2 (en) 2009-09-11 2015-08-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Improved Pseudomonas Exotoxin A with reduced immunogenicity
WO2011100455A1 (en) 2010-02-12 2011-08-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Inhibition of antibody responses to foreign proteins
CA2793978C (en) 2010-03-30 2021-08-03 Pfenex Inc. High level expression of recombinant toxin proteins
US8497354B2 (en) 2010-06-16 2013-07-30 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Antibodies to endoplasmin and their use
US9580461B2 (en) 2010-07-30 2017-02-28 Medimmune, Llc Method for purifying active polypeptides or immunoconjugates
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
DK2646470T3 (en) * 2010-11-30 2017-05-08 Hoffmann La Roche ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES WITH LOW AFFINITY AND ITS USE FOR TRANSPORTING THERAPEUTIC SCFV OVER THE BLOOD-BRAIN BARRIER
US9206257B2 (en) 2011-04-19 2015-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
CN103748107B (zh) 2011-06-09 2020-06-02 美利坚合众国, 由健康及人类服务部部长代表 具有免疫原性较小的t细胞和/或b细胞表位的假单胞菌外毒素a
US8932586B2 (en) 2011-09-06 2015-01-13 Intrexon Corporation Modified forms of Pseudomonas exotoxin A
WO2013039916A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 The United States Of America, Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Compositions for and methods of treatment and enhanced detection of non-pituitary tumors
US9206240B2 (en) 2011-09-16 2015-12-08 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Helath and Human Services Pseudomonas exotoxin A with less immunogenic B cell epitopes
CA2848842C (en) 2011-10-04 2020-09-29 King's College London Ige anti -hmw-maa antibody
US9169304B2 (en) 2012-05-01 2015-10-27 Pfenex Inc. Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein
SG11201407972RA (en) 2012-06-01 2015-01-29 Us Health High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
CA2882753C (en) 2012-08-21 2021-08-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
CN104955845B (zh) 2012-09-27 2018-11-16 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法
US9803021B2 (en) 2012-12-07 2017-10-31 The Regents Of The University Of California CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
US9764006B2 (en) 2012-12-10 2017-09-19 The General Hospital Corporation Bivalent IL-2 fusion toxins
JP6553515B2 (ja) 2012-12-20 2019-07-31 メディミューン，エルエルシー 免疫複合体の製造方法
WO2014160627A1 (en) 2013-03-25 2014-10-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
WO2014194100A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
EP3038641B1 (de) 2013-10-06 2019-04-17 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Modifiziertes pseudomonas-exotoxin a
EP3054987B1 (de) 2013-10-11 2019-10-09 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Tem-8-antikörper und deren verwendung
US20160280798A1 (en) 2013-11-06 2016-09-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Service Alk antibodies, conjugates, and chimeric antigen receptors, and their use
US10246505B2 (en) 2013-11-25 2019-04-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors to control HIV infection
EP3102245B1 (de) 2014-02-05 2021-09-08 Molecular Templates, Inc. Verfahren zum abtasten, auswählen und identifizieren von cytotoxischen rekombinanten polypeptiden auf grundlage einer vorläufigen minderung der ribotoxizität
US10624955B2 (en) 2014-05-07 2020-04-21 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
EP3473271B1 (de) 2014-07-31 2022-07-20 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Humane monoklonale antikörper gegen epha4 und deren verwendung
CA2961609C (en) 2014-09-17 2023-03-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd276 antibodies (b7h3)
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
CA2981509A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 The Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Educ. On Behalf Of The University Of Nevada, La Compositions comprising talens and methods of treating hiv
EP3314250A4 (de) 2015-06-26 2018-12-05 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Auf tetraspanin 33 (tspann33) in myeloidabgeleiteten suppressorzellen abzielende krebstherapie
US11078286B2 (en) 2015-09-20 2021-08-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies specific for fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) and methods of their use
US10772946B2 (en) 2015-10-13 2020-09-15 Sanofi Pasteur Immunogenic compositions against S. aureus
EP3184547A1 (de) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg-antikörper und verfahren zur verwendung
WO2017083511A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-bcma polypeptides and proteins
WO2017196847A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens
WO2017214182A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 The United States Of America. As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Fully human antibody targeting pdi for cancer immunotherapy
EP3494135A1 (de) 2016-08-02 2019-06-12 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Gegen glypican-2 (gpc2) gerichtete monoklonale antikörper und verwendung davon
WO2018119279A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for flt3 and uses thereof
WO2018213612A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin polypeptides and proteins
US11389480B2 (en) 2017-05-19 2022-07-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibody targeting TNFR2 for cancer immunotherapy
WO2019005208A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODIES TO HUMAN MESOTHELIN AND USES IN ANTICANCER THERAPY
CA3066953A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Lentigen Technology, Inc. Human monoclonal antibodies specific for cd33 and methods of their use
WO2019051204A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services SYNERGISTIC COMBINATION OF IL4, INTERFERON GAMMA AND INTERFERON ALPHA RECEPTOR AGENTS FOR USE IN THE TREATMENT OF OVARIAN CANCER
US11795235B2 (en) 2017-09-18 2023-10-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunotoxins with albumin binding domain
US11198722B2 (en) 2017-10-06 2021-12-14 University Of Utah Research Foundation Immune tolerant elastin-like peptide tetramer guided nanoparticles and methods of use
PL3762009T3 (pl) 2018-03-08 2022-09-12 Applied Molecular Transport Inc. Pochodzące z toksyny konstrukty dostarczające do dostarczania doustnego
WO2020014482A1 (en) 2018-07-12 2020-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Affinity matured cd22-specific monoclonal antibody and uses thereof
CN112585163B (zh) 2018-08-08 2025-03-25 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2的高亲和力单克隆抗体及其用途
KR102353086B1 (ko) * 2018-09-07 2022-01-20 아주대학교산학협력단 신규 면역독소 제조방법
WO2020096695A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Applied Molecular Transport Inc. Cholix-derived carriers for oral delivery of heterologous payload
JP7516369B2 (ja) 2018-11-07 2024-07-16 アプライド モレキュラー トランスポート インコーポレイテッド トランスサイトーシスのための送達構築物および関連する方法
CN113490510B (zh) 2019-01-08 2025-02-14 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 用于治疗实体瘤的靶向间皮素的跨物种单结构域抗体
AU2020212534A1 (en) 2019-01-22 2021-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use
EP3927731A4 (de) 2019-02-19 2022-12-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Bispezifische immunotoxine zur targeting von menschlichen cd25s-ccr4+ tumoren und regulatorischen t-zellen
WO2021003297A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind egfrviii and their use
PH12022550330A1 (en) 2019-08-16 2023-02-06 Applied Molecular Transport Inc Compositions, formulations, and interleukin production and purification
AU2020370125A1 (en) 2019-10-22 2022-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity nanobodies targeting B7H3 (CD276) for treating multiple solid tumors
WO2021097289A1 (en) 2019-11-15 2021-05-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pegylated recombinant immunotoxins
WO2021173674A1 (en) 2020-02-26 2021-09-02 A2 Biotherapeutics, Inc. Polypeptides targeting mage-a3 peptide-mhc complexes and methods of use thereof
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
CN116583539A (zh) 2020-12-22 2023-08-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗il-4r抗体或其抗原结合片段的复合物及医药用途
US20240218055A1 (en) 2021-04-29 2024-07-04 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
AU2022291120A1 (en) 2021-06-09 2023-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
US20240417446A1 (en) 2021-10-26 2024-12-19 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CA3240254A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
WO2024050399A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes
WO2024104584A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 University Of Cape Town Deimmunized pseudomonas exotoxin a
WO2024238346A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies that specifically bind the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein and compositions and uses thereof
WO2025014896A1 (en) 2023-07-07 2025-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Humanized 40h3 antibody
WO2025019228A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors against cd276 for the treatment of solid tumors

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4470924A (en) * 1981-12-30 1984-09-11 Iglewski Barbara M Nontoxic, immunologically crossreactive toxin A protein from Pseudomonas aeruginosa
JP2534222B2 (ja) * 1982-05-12 1996-09-11 プレジデント アンド フエロウズ オブ ハ−バ−ド カレツジ 混成タンパク質生産用融合遺伝子
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4894443A (en) * 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
NZ212312A (en) * 1984-06-07 1988-09-29 John Richard Murphy Hybrid protein comprising fragments of diphtheria toxin and part of cell-specific ligand; and fused gene therefor
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US4867962A (en) * 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
DE3752387D1 (de) 2006-01-05
EP0583794A1 (de) 1994-02-23
DK276488D0 (da) 1988-05-20
EP0583794B1 (de) 2005-11-30
NO882269L (no) 1988-05-24
FI105271B (fi) 2000-07-14
NO180270B (no) 1996-12-09
NO882269D0 (no) 1988-05-24
ES2253734T3 (es) 2006-06-01
ZA877153B (en) 1989-08-30
AU618722B2 (en) 1992-01-09
DE3752387T2 (de) 2006-06-08
EP0261671A3 (en) 1988-08-10
EP0261671A2 (de) 1988-03-30
JP2960697B2 (ja) 1999-10-12
IE66223B1 (en) 1995-12-13
NO180270C (no) 1997-03-19
IL83971A (en) 1994-06-24
JP3053087B2 (ja) 2000-06-19
JPH11253181A (ja) 1999-09-21
WO1988002401A1 (en) 1988-04-07
DK276488A (da) 1988-05-20
KR970001563B1 (ko) 1997-02-11
KR890700162A (ko) 1989-03-10
PT85777A (en) 1987-10-01
IL83971A0 (en) 1988-02-29
IE872553L (en) 1988-03-24
JPH02502063A (ja) 1990-07-12
FI891321A0 (fi) 1989-03-21
DE3789587D1 (de) 1994-05-19
NZ221923A (en) 1991-12-23
PT85777B (pt) 1990-07-31
CA1336691C (en) 1995-08-15
AU8021187A (en) 1988-04-21
EP0261671B1 (de) 1994-04-13
DK199901377A (da) 1999-09-28
JP2848489B2 (ja) 1999-01-20
ATE311442T1 (de) 2005-12-15
SG96159A1 (en) 2003-05-23
US5696237A (en) 1997-12-09
JPH10136988A (ja) 1998-05-26
ES2074042T3 (es) 1995-09-01
DK173560B1 (da) 2001-03-12
IE950321L (en) 1988-03-24
FI891321L (fi) 1989-03-21
IL105160A (en) 1997-07-13
ATE104153T1 (de) 1994-04-15
DK173301B1 (da) 2000-06-19
US4892827A (en) 1990-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3789587T2 (de) Rekombinantes Pseudomonastoxin : Konstruktion eines wirksamen Immunotoxins mit wenigen Nebenwirkungen.
DE69529517T2 (de) Kreisförmig permutierte liganden und kreisförmig permutierte chimärische molekülen
DE69131449T2 (de) Verbesserte exotoxine aus pseudomonas mit geringer toxität bei tieren und hoher zelltötender aktivität
Hwang et al. Functional domains of Pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed in E. coli
DE69028739T2 (de) Modifizierte PF4-Zusammensetzung und Methoden zu deren Verwendung
DE69005352T2 (de) Antikörper enthaltende Verabreichungssysteme für biologische verhaltensändernde Stoffe.
DE69523857T2 (de) Immunokonjugate
DE69010206T2 (de) Stabilisierte protein- oder peptidkonjugate.
DE69127749T2 (de) Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region
DE69133036T2 (de) Cytokine immunokonjugate
DE69333574T2 (de) Gegen c-erb b-2 (her-2/neu) vewandte oberflächenantigene gerichtete immuntoxine
DE69710911T2 (de) Monoklonale Antikörper gegen Endoglin und ihre Verwendung in der anti-Angiogenese-Therapie
DE69027210T2 (de) Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein
DE69130466T2 (de) Basen-Tumorzellen Behandlungsverfahren
DE19882755B4 (de) Ein Fusionsprotein des hEGF und des humanen Angiogenins und ein Verfahren zu dessen Herstellung
JPH04506976A (ja) 免疫毒素の構築のための改良された毒素
DE3689299T2 (de) Verwendung von amphipatischen Molekülen zur Radiodarstellung und Therapie mittels monoklonaler oder polyklonaler Antikörperkonjugate.
DE69026812T2 (de) Konjugate von "pokeweed" antiviralem protein und monoklonalen antikörpern
DE69925817T2 (de) Rekombinante onconase und fusionsproteine davon
IE84490B1 (en) Recombinant pseudomonas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects
Bourdenet et al. The cytotoxicity of Pseudomonas exotoxin A, inactivated by modification of the cell-binding domain I, is restored when conjugated to an erythroid cell-specific targeting agent
Kreitman et al. Targeted toxin hybrid proteins
DE69225035T2 (de) Konjugate

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition