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DE69710911T2 - Monoklonale Antikörper gegen Endoglin und ihre Verwendung in der anti-Angiogenese-Therapie - Google Patents

Monoklonale Antikörper gegen Endoglin und ihre Verwendung in der anti-Angiogenese-Therapie

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DE69710911T2
DE69710911T2 DE69710911T DE69710911T DE69710911T2 DE 69710911 T2 DE69710911 T2 DE 69710911T2 DE 69710911 T DE69710911 T DE 69710911T DE 69710911 T DE69710911 T DE 69710911T DE 69710911 T2 DE69710911 T2 DE 69710911T2
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DE
Germany
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endoglin
human
angiogenesis
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murine
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K. Seon
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Original Assignee
Health Research Inc
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Description

  • Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung mit dem Zuschuss CA 19304, der vom U.S. Public Health Service gewährt wurde, gemacht. Die Regierung hat an der Erfindung bestimmte Rechte.
    • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen für die antiangiogenetische Therapie von bestimmten Krankheitsarten beim Menschen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Erzeugung von monoklonalen Anti-Endoglin-Antikörpern, und ein Verfahren zur Behandlung von Krebs und anderen pathologischen, mit der Angiogenese beim Menschen verbundenen Zuständen im Zusammenhang mit der Verabreichung von Immunkonjugaten, die monoklonale Anti-Endoglin-Antikörper umfassen, ist auch offenbart.
    • Hintergrund der Erfindung 1. Endoglin
  • Endoglin ist ein homodimeres Membranglycoprotein, das in hohem Ausmaß an proliferierenden, vaskulären Endothelzellen exprimiert ist (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634). So ist Endoglin hauptsächlich ein mit der Proliferation verbundener Marker für Endothelzellen, der einer aktiven Angiogenese unterzogen wird. Es gibt jedoch eine gewisse Expression des Endoglins durch das vaskuläre Endothelium normaler Gewebe (Burrows et al., s.o.; Wang et al., 1993, Int. J. Cancer 54: 363-370). Vor kurzem wurde festgestellt, dass humanes Endoglin den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) spezifisch bindet, und die deduzierte Aminosäuresequenz von Endoglin zeigte eine starke Homologie gegenüber β-Glycan, einem Typ des TGF-β-Rezeptors.
  • Murines Endoglin wurde als Dimer mit einer molekularen Größe von etwa 180 Kilodalton (kD) charakterisiert. Humanes Endoglin existiert in zwei Formen, d. h. einer kleineren Form mit 160 kD und einer größeren Form mit 170 kD, wobei der Unterschied zwischen den beiden im cytoplasmatischen Anteil des Proteins liegt. Endoglin hat einen extrazellulären Bereich, einen hydrophoben Transmembranbereich und einen cytoplasmatischen Schwanz. Ein Vergleich der Nucleotidsequenz des humanen Endoglins mit dem murinen Endoglin zeigt eine Identität von etwa 71 bis 72% (St. Jacques et al., 1994, Endocrinol. 134: 2645-2657; Ge et al., 1994, Gene 158: 2645-2657). Bei den humanen und murinen Sequenzen, die für die Transmembranbereiche und die cytoplasmatischen Bereiche von Endoglin codieren, besteht jedoch eine 93%ige bis 95%ige Identität. So gibt es bei den humanen und murinen Sequenzen, die für den extrazellulären Bereich codieren, signifikant weniger Identität.
    • 2. Monoklonale Antikörper mit Bezug auf Endoglin
  • Es wurde im Stand der Technik früher über mehrere monoklonale Anti- Endoglin-Antikörper ("MAb") berichtet. MAb SN6 ist ein Antikörper, der aus der Immunisierung von Mäusen mit Zellmembranen von humanen Leukämiezellen erzeugt wird (Haruta und Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 7898-7902). Es ist ein muriner MAb, der humanes Endoglin erkennt. MAb 44G4 ist ein Antikörper, der aus der Immunisierung von Mäusen mit Ganzzell-Suspensionen von humanen Prä-B-Leukämiezellen (Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141: 1925-1933; 1990, J. Biol. Chem. 2655: 8361-8364) erzeugt wird. Es ist ein muriner MAb, der humanes Endoglin erkennt. MAb MJ7/18 ist ein Antikörper, der aus der Immunisierung von Ratten mit entzündeten Mäusehäuten erzeugt wird (Ge and Butcher, 1994, s.o.). Es ist ein MAb, der murines Endoglin erkennt. MAb Tec-11 ist ein Antikörper, der aus der Immunisierung von Mäusen mit humanen Endothelzellen der Umbilikalvene erzeugt wird (Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623- 1634). Es ist ein muriner MAb mit einer auf humanes Endoglin beschränkten Reaktivität.
  • Durch die Verwendung von Anti-Endoglin-Antikörpern und verschiedenen im Stand der Technik bekannten Färbungsverfahren wurde bestimmt, dass Endoglin in einem mäßigen bis hohen Ausmaß an Endothelzellen exprimiert wird, die enthalten sind in:
  • (a) humanen Tumorzellen, wie von der humanen Leukämie, einschließlich vom Nicht-T-Zelltyp (Nicht-T), der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL), der myelomonocytischen Leukämie und von mit Tumoren assoziierten Gefäßsystemen von humanen soliden Tumoren, einschließlich Angiosarkom, Brustkarzinom, Zökumkarzinom, Kolonkarzinom, Hodgkin Lymphom, Lymphom, Lungenkarzinom, Melanom, Osteosarkom, Eierstockkarzinom, Parotistumor, Pharynxkarzinom, Karzinom des Rektums und Sigmas;
  • (b) humanen Gefäßsystemen aus den Plazenta-, den Nebennieren und lymphoiden Geweben; und
  • (c) murinen Stromazellen aus den Darm-, Magen-, Herz- und Fortpflanzungsgeweben.
  • Ein geringerer Grad an (einer schwachen) Endothelzellfärbung mit Bezug auf Endoglin wurde bei einer Vielzahl von normalen, humanen, ausgewachsenen Zellabschnitten aus den Lymphknoten, den Mandeln, der Milz, dem Thymus, den Nieren, der Lunge und der Leber beobachtet. Es wurde jedoch gefunden, dass unterschiedliche Anti-Endoglin-Antikörper, die gegen unterschiedliche Epitope auf Endoglin gerichtet sind, die gleiche Selektivität mit Bezug auf Tumorgefäßsysteme zeigen (Burrows et al., 1995, s.o.).
  • Bei pathologischen Zuständen, an der eine Angiogenese beteiligt ist, wurde auch über eine erhöhte Endoglinexpression an vaskulären Endothelzellen berichtet. Solche mit einer Angiogenese assoziierten Krankheiten umfassen die meisten Arten der humanen soliden Tumore, rheumatische Arthritis, Magengeschwüre und chronische entzündliche Hautläsionen (z. B. Psoriasis, Dermatitis; Westphal et aL, 1993, J. Invest. Dermatol. 100: 27-34).
    • 3. Angiogenese
  • Die Angiogenese ist die Bildung neuer kapillarer Blutgefäße, die zu einer Gefäßneubildung führen. Die Angiogenese ist ein komplexer Prozess, der eine Reihe von aufeinanderfolgenden Schritten, einschließlich eines durch Endothelzellen vermittelten Abbaus der vaskulären Basalmembran und interstitiellen Matrizen, Wanderung von Endothelzellen, Proliferation von Endothelzellen und Bildung von Kapillarschenkeln, umfasst. Solide Tumore hängen von der Angiogenese ab; d. h. wenn ein kleiner fester Tumor einen kritischen Durchmesser erreicht, muss er für das weitere Wachstum in dem ihn umgebenden, normalen Gewebe eine angiogenetische Antwort auslösen. Die resultierende Gefäßneubildung des Tumors ist mit einem schnelleren Wachstum und lokaler Invasion assoziiert. Des weiteren ist eine Erhöhung der Angiogenese mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko verbunden. Deswegen würde eine antiangiogenetische Therapie zur Verhinderung der Tumorangiogenese das Tumorwachstum und seine Ausbreitung unterdrücken oder zum Stillstand bringen.
  • Bei normalen physiologischen Prozessen, wie der Wundheilung, wird die Angiogenese zum Stillstand gebracht, wenn der Prozess beendet ist. Im Gegensatz dazu ist die Tumorangiogenese nicht selbstbeschränkend bzw. selbstbegrenzend. Des weiteren ist bei bestimmten pathologischen (und nicht malignen) Prozessen die Angiogenese anomal verlängert. Solche mit der Angiogenese zusammenhängenden Krankheiten umfassen diabetische Retinopathie, chronische Entzündungskrankheiten, einschließlich rheumatische Arthritis, Dermatitis und Psoriasis. Eine antiangiogenetische Therapie würde bei solchen mit der Angiogenese zusammenhängenden Erkrankungen mit exzessiver Gefäßbildung eine Modulation gestatten.
    • 4. Antiangiogenetische Therapie und vaskuläre Targeting-Therapie von humanen soliden Tumoren
  • Das fortschreitende Wachstum von soliden Tumoren über klinisch verborgene Größen hinaus (z. B. einige mm³) erfordert die kontinuierliche Bildung neuer Blutgefäße, ein Prozess, der als Tumorangiogenese bekannt ist. Das Tumorwachstum und die Metastasierung hängen von der Angiogenese ab. Ein Tumor muss das Wachstum neuer kapillarer Blutgefäße ständig stimulieren, die Nährstoffe und Sauerstoff liefern, damit der Tumor selbst wachsen kann. Deshalb stellen entweder die Verhinderung der Tumorangiogenese (antiangiogenetische Therapie) oder die selektive Zerstörung der existierenden Blutgefäße des Tumors (vaskuläre Targeting-Therapie) eine Strategie dar, die auf die Verhinderung oder Behandlung solider Tumore gerichtet ist.
  • Da ein örtliches Netzwerk neuer kapillarer Blutgefäße Wege schafft, durch die der Primärtumor zu anderen Teilen des Körpers metastasieren kann, sollte eine antiangiogenetische Therapie für das Verhindern der Ausbildung kleiner solider Tumore oder bei der Verhinderung der Metastasierung wichtig sein (siehe z. B. Folkman, 1995, Nature Medicine, 1: 27-31). Andererseits ist die vaskuläre Targeting-Therapie, die bestehende Gefäßsysteme angreift, wahrscheinlich bei großen Tumoren am wirksamsten, bei denen die Gefäßsysteme bereits gefährdet sind (siehe z. B. Bicknell and Harris, 1992, Semin. Cancer Biol. 3: 399-407). Monoklonale Antikörper und deren Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung werden als Mittel verwendet, entweder bestehenden Tumorgefäßsystemen oder sich neu bildender Tumorgefäßneubildung therapeutische Verbindungen bei einem Verfahren der antiangiogenetischen Therapie zuzuführen.
    • 5. Maus-Modelle für humane Erkrankung A. Maus-Modell mit Nacktmäusen ohne Thymusdrüse oder SCID-Maus-Modell
  • Bei den nachstehenden Ausführungsformen, die zur Veranschaulichung der Erfindung dienen, ist es wichtig, das folgende Konzept in Betracht zu ziehen.
  • Die Verwendung von Nacktmäusen ohne Thymusdrüse mit humanen Tumor-Xenotransplantaten wurde als Modell für die Bewertung der Chemotherapeutika bestätigt, da gezeigt wurde, dass das Modell die klinische Wirksamkeit der Chemotherapeutika bei den mit diesen Mitteln behandelten ursprünglichen Patienten und die Antitumor-Wirkungen dieser Mittel, wie die Tumorrückbildung oder Verhinderung des Tumorwachstums, als der Wirksamkeit gegen die entsprechenden Arten des klinischen Krebses entsprechend, widerspiegelt (siehe beispielsweise Neuwalt et al., 1985, Cancer Res. 45: 2827-2833; Ovejera et al., 1978, Annals of Clin. and Lab. Science 8: 50). SCID-Mäuse mit humanen Tumor-Xenotransplantaten wurden auch von Fachleuten als Modell für die Bewertung von Chemotherapeutika akzeptiert.
  • Monoklonale Antikörper sind für die selektive Zuführung der Mittel gegen Krebs zu Tumor-Zielgewebe(n) brauchbar. In dieser Hinsicht können Anti- Endoglin-MAbs zum Targeting von humanen Tumorgefäßsystemen verwendet werden. Nacktmäuse ohne Thymusdrüse oder SCID-Mäuse mit humanen Tumor- Xenotransplantaten sind ein Modell, bei dem das auf Antikörper gerichtete Targeting von Tumorgefäßsystemen bei einem Prozess der antiangiogenetischen Therapie getestet werden kann. Das Problem ist jedoch, dass die Gefäßneubildung für humane Xenotransplantate bei dem Maus-Modell aus den Wirtsgeweben (der Maus) entsteht. So können die Anti-Endoglin-MAbs des Standes der Technik, die auf das Reaktionsvermögen entweder mit dem humanen Endoglin oder dem murinen Endoglin beschränkt sind, nicht bei solchen Maus-Modellen zur Durchführung der Studien verwendet werden, die notwendig sind, um die klinische Wirksamkeit, die Pharmakokinetik und die Möglichkeit nachteiliger Nebenwirkungen der antiangiogenetischen Therapie zu bewerten.
    • B. Maus-Modelle für mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten
  • Bei den nachstehenden Ausführungsformen, die zur Veranschaulichung der Erfindung dienen, ist es wichtig, das folgende Konzept in Betracht zu ziehen.
  • Die Verwendung von Maus-Modellen der Angiogenese wurde als Modell für die Bewertung von Therapeutika akzeptiert und bestätigt, da es sich gezeigt hat, dass die Modelle die klinischen Parameter widerspiegeln, die für die jeweilige Krankheit charakteristisch sind und auch die Wirksamkeit der Therapeutika bei Patienten vorhersagen. Diese Maus-Modelle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Maus-Modell für die Retinagefäßneubildung (Pierce et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 905-909); Maus-Modelle für rheumatische Arthritis (MRL-lpr/lpr-Maus-Modell; Folliard et al., 1992, Agents Actions 36: 127-135; mev-Maus; Kovarik et al., 1994; J. Autoimmun. 7: 575-88); Maus-Modelle für die Angiogenese (Majewski et al., 1994, Int. J. Cancer 57: 81-85, Andrade et al., 1992; Int. J. Exp. Pathol., 73: 503-13; Sunderkotter et al., 1991, Am. J. Pathol. 138: 931- 939); Maus-Modell für Dermatitis (Maguire et al., 1982, J. Invest. Dermatol. 79: 147-152); und Maus-Modell für Psoriasis (Blandon et al., 1985, Arch. Dermatol. Res. 277: 121-125; Nagano et al., 1990, Arch. Dermatol. Res. 282: 459-462). So können die Anti-Endoglin-MAbs des Stands der Technik, die auf das Reaktionsvermögen entweder mit dem humanen Endoglin oder dem murinen Endoglin beschränkt sind, nicht bei dem Maus-Modell für die jeweilige mit der Angiogenese assoziierten Krankheit zur Durchführung der Studien verwendet werden, die notwendig sind, um die klinische Wirksamkeit, die Pharmakokinetik und die Möglichkeit nachteiliger Nebenwirkungen der antiangiogenetischen Therapien bei Menschen zu bewerten.
  • Folglich besteht noch Bedarf an Anti-Endoglin-MAbs, die bei der antiangiogenetischen Therapie der humanen Tumor-Angiogenese und anderer mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten mit exzessiver Gefäßneubildung verwendet werden können und die mit Bezug auf die klinische Wirksamkeit und die Pharmakokinetik bei Maus-Modellen mit humanen Xenotransplantaten oder Mausmodellen mit mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten bewertet werden können.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Dementsprechend ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Anti-Endoglin MAbs zu schaffen, die bei der antiangiogenetischen Therapie der humanen Tumor-Angiogenese verwendet werden können.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Anti-Endoglin- MAbs zu schaffen, die bei der antiangiogenetischen Therapie von humanen mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten mit exzessiver Gefäßneubildung verwendet werden können.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Anti- Endoglin-MAbs zu schaffen, die bei der antiangiogenetischen Therapie verwendet werden können und die bei dem Nacktmaus-Modell ohne Thymusdrüse oder Maus-Modellen von mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten bewertet werden können.
  • Ein Verfahren für die antiangiogenetische Therapie der humanen Tumor- Angiogenese unter Verwendung von Anti-Endoglin-MAbs ist auch offenbart.
  • Des weiteren ist ein Verfahren für die antiangiogenetische Therapie von humanen mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten mit exzessiver Gefäßneubildung unter Verwendung von Anti-Endoglin-MAbs offenbart.
  • Die vorstehenden Aufgaben werden durch die Schaffung neuer Anti- Endoglin-MAbs gelöst, die humanem Endoglin gegenüber reaktionsfähig sind und die auch unerwarteterweise mit murinem Endoglin kreuzreaktionsfähig sind. Die MAbs der vorliegenden Erfindung können an Antitumormittel bei der Schaffung eines Verfahrens für die antiangiogenetische Therapie des humanen Tumorgefäßsystems konjugiert werden. Die MAbs der vorliegenden Erfindung können an Angiogeneseinhibitoren bei der Schaffung eines Verfahrens für die antiangiogenetische Therapie von humanen mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten mit exzessiver Gefäßneubildung konjugiert werden. Diese und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen im Zusammenhang mit den Figur besser ersichtlich, in denen zeigen:
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1A eine graphische Darstellung, die die cytotoxische Wirksamkeit gegen proliferierende, murine Endothelzellen (SVEC4-10) von Immunkonjugaten zeigt, die die erfindungsgemäßen Anti- Endoglin-MAbs und Ricin A (RA) umfassen;
  • Fig. 1B eine graphische Darstellung, die die cytotoxische Wirksamkeit gegen proliferierende, murine Endothelzellen (SVEC4-10) von Immunkonjugaten zeigt, die die erfindungsgemäßen Anti- Endoglin-MAbs und deglycosyliertes Ricin A (dgRA) umfassen;
  • Fig. 2A eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen zeigt, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht;
  • Fig. 2B eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht, nach einer Behandlung mit nichtkonjugiertem MAb K4-2C10 zeigt;
  • Fig. 2C eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht, nach einer Behandlung mit einem Immunkonjugat (K4-2C10-dgRA-Konjugat) zeigt;
  • Fig. 2D eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht, nach einer Vorbehandlung mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb (K4-2C10) und der anschließenden Verabreichung des Immunkonjugats (K4-2C10-dgRA-Konjugat) zeigt;
  • Fig. 3A eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen zeigt, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht;
  • Fig. 3B eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht, nach einer Behandlung mit nichtkonjugiertem MAb K4-2C10 zeigt;
  • Fig. 3C eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht, nach einer Behandlung mit einem Immunkonjugat (K4-2C10-dgRA-Konjugat) zeigt;
  • Fig. 3D eine graphische Darstellung, die das Fortschreiten eines humanen Xenotransplantats bei SCID-Mäusen, das aus Brustkrebszellen (MCF-7) besteht, nach einer Vorbehandlung mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb und der anschließenden Verabreichung des Immunkonjugats (K4-2C10-dgRA-Konjugat) zeigt.
    • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Definitionen
  • Der Begriff "mit Angiogenese assoziierte Krankheit" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, bestimmte pathologische Prozesse beim Menschen, bei denen die Angiogenese anomal verlängert ist. Solche mit der Angiogenese assoziierte Krankheiten umfassen diabetische Retinopathie, chronische Entzündungskrankheiten, rheumatische Arthritis, Dermatitis, Psoriasis, Magengeschwüre und die meisten Arten der humanen soliden Tumore.
  • Der Begriff "Angiogenese-Hemmer" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, ein Biomolekül, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Peptide, Proteine, Enzyme, Polysaccharide, Oligonucleotide, DNA, RNA, rekombinante Vektoren und Arzneimittel, die die Angiogenese hemmen. Angiogeneseinhibitoren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen natürliche und synthetische Biomoleküle wie Paclitaxel, O-(Chloracetylcarbomyl)-Fumagillol ("TNP-470" oder "AGM 1470"), Thrombospondin-1, Thrombospondin-2, Angiostatin, die humanen, von Chondrozyten abgeleiteten Angiogeneseinhibitoren ("hCHIAMP"), die von Knorpel abgeleiteten angiogenetischen Inhibitoren, den Thrombozytenfaktor 4, Gro-Beta, das humane, von Interferon induzierbare Protein 10 ("IP10"), Interleukin 12, Ro 318220, Tricyclodecan-9- yl-xanthat ("D609"), Irsogladin, 8,9-Dihydroxy-7-methylbenzo[b]chinoliziniumbromid ("GPA 1734"), Medroxyprogesteron, eine Kombination von Heparin und Cortison, Glucosidasehemmer, Genistein, Thalidomid, Diaminoantrachinon, Herbimycin, Ursolsäure und Oleanolsäure.
  • Der Begriff "antiangiogentische Therapie" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, eine auf das proliferierende Gefäßsystem zielende Therapie, bei der Endoglin in hohem Ausmaß (im Vergleich zu einem inaktiven Gefäßsystem) exprimiert wird, gleichgültig ob die Therapie gegen die Angiogenese (d. h. die Bildung von neuen kapillaren Blutgefäßen, die zu einer Gefäßneubildung führt) und/oder ein bestehendes Gefäßsystem, das proliferiert und sich auf einen Krankheitszustand bezieht (z. B. eine vaskuläre Targeting- Therapie) gerichtet ist.
  • Der Begriff "Antikörperfragment" oder "ein Fragment hiervon" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, einen Teil oder ein Fragment eines intakten Antikörpermoleküls, bei dem das Fragment seine antigenbindende Funktion beibehält, d. h. F(ab')&sub2;-, Fab'-, Fab-, Fv-, Fd'- und Fd-Fragmente. Verfahren zur Erzeugung der verschiedenen Fragmente aus MAbs sind Fachleuten bekannt.
  • Der Begriff "Immunkonjugat" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, ein Konjugat, das aus den Anti- Endoglin-MAbs oder einem Fragment hiervon gemäß der vorliegenden Erfindung und mindestens einem Antitumormittel oder mindestens einem Angiogeneseinhibitor besteht. Solche Antitumormittel sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Toxine, Arzneimittel, Enzyme, Cytokine, Radionuclide, photodynamische Mittel und Angiogeneseinhibitoren. Toxine umfassen Ricin A-Kette, mutierte Pseudomonas-Exotoxine, Diphtherietoxoid, Streptonigrin, Boamycin, Saporin, Gelonin und antivirales Kermesbeerenprotein. Arzneimittel umfassen Daunorubicin und Methotrexat. Radionuclide umfassen Radiometalle. Cytokine umfassen den Tumornekrosefaktor. Photodynamische Mittel umfassen Porphyrine und ihre Derivate. Die Verfahren zum Komplexieren der Anti-Endoglin-MAbs oder einem Fragment hiervon mit mindestens einem Antitumormittel sind den Fachleuten wohlbekannt (d. h. Antikörperkonjugate wie von Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63: 209-34 überprüft). Solche Verfahren verwenden oft ein Reagenz von mehreren verfügbaren heterobifunktionellen Reagenzien, die zur Kopplung oder Verbindung von Molekülen verwendet werden.
  • Der Begriff "Säugerwirt" oder "Wirt" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, eine Maus oder einen Menschen.
  • Der Begriff "monoklonaler Antikörper" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, murine monoklonale Antikörper und technisch hergestellte Antikörpermoleküle, die daraus hergestellt werden, bei denen die Bindungsspezifizität für kreuzreaktionsfähige Epitope zwischen dem humanen Endoglin und dem murinen Endoglin aufrechterhalten wird, wie hybride oder "vermenschlichte" Antikörper, wie dies aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen besser ersichtlich wird. Hybridomzellinien Y4-2F1, K4-2C10, P3- 2G8 und D4-2G10, die monoklonale Antikörper erzeugen, die die vorliegende Erfindung veranschaulichen, wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt und haben die ATCC-Bezeichnungen HB-12171, HB-12172, HB-12173 bzw. HB-12174.
  • Der Begriff "Tumor" bedeutet, wie hier für die Zwecke der Beschreibung und der Ansprüche verwendet, ein zu einem mäßigen bis hohen Grad tumorexprimierendes Endoglin (im Vergleich zu der Expression durch normales Gewebe des gleichen Typs) wie humane Leukämien, einschließlich vom Nicht-T-Zelltyp (Nicht-T), akute lymphoblastische Leukämie (ALL), myelomonocytische Leukämie und humane solide Tumore, bei denen das sie umgebende Gefäßsystem Endoglin in einem mäßigen bis hohen Ausmaß exprimiert (im Vergleich zu der Expression durch normales Gewebe des gleichen Typs), einschließlich Angiosarkom, Brustkarzinom, Zökumkarzinom, Kolonkarzinom, Hodgkin Lymphom, Lymphom, Lungenkarzinom, Melanom, Osteosarkom, Eierstockkarzinom, Parotistumor, Pharynxkarzinom, Karzinom des Rektums und Sigmas.
  • Ein Nachteil für systemische Therapien ist der Mangel an selektiver Zuführung der Therapie zu dem beabsichtigten Zielort, dem erkrankten Gewebe, und nicht zu normalem Gewebe. Monoklonale Antikörper wurden verwendet, um Therapeutika mit einer größeren Target-Spezifizität zuzuführen, wodurch die Toxizität verringert wurde. Murine MAbs oder Fragmente hiervon wurden zur Behandlung humaner Krankheiten oft mit mäßiger bis beträchtlicher klinischer Wirksamkeit verwendet (siehe z. B. Ghetie et al., 1994, s.o.). Studien zeigen, dass murine monoklonale Antikörper wiederholt sicher gegeben werden können, selbst wenn sich eine humane Antimaus-Antikörper-Reaktion entwickelt. Außerdem verursachte eine humane Antimaus-Antikörper-Reaktion keine signifikanten klinischen Probleme bei weiteren wiederholten Infusionen des murinen MAb (siehe z. B. Frodin et al., 1992, Cell Biophys. 21: 153-165).
  • Targeting-Therapien gegen Tumorgefäßsysteme im Gegensatz zu dem Tumor selbst haben mehrere Vorteile. Typischerweise werden Immunkonjugate intravenös verabreicht, so dass das Tumorgefäßsystem schneller als die Sättigung des Tumorantigens gesättigt werden kann. Deshalb wird eine geringere Menge an Immunkonjugat bei einem Therapieplan benötigt, wodurch das Potential nichtspezifischer Nebenwirkungen verringert wird. Zweitens hängt eine beträchtliche Anzahl von Tumorzellen wesentlich von einer geringen Anzahl von Kapillarschenkeln ab. So kann eine minimale Schädigung solcher Kapillarschenkel zu einem signifikanten und verstärkten Tumorzelltod führen. Außerdem kann, wie vorstehend beschrieben, ein Anti-Endoglin-MAb-Konjugat selektiv gegen eine Vielzahl von Tumorarten und anderen pathologischen Zuständen mit einer exzessiven Gefäßbildung verwendet werden. Während der Anti-Endoglin-MAb die antiangiogenetische Therapie zielgenau zu dem Tumorgefäßsystem bringt, ist für Fachleute ersichtlich, dass das zugeführte Antitumormittel außerdem direkt auf Tumorzellen, mit denen es in Kontakt kommt, einwirken kann.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine neue Klasse von murinen MAbs, die gekennzeichnet sind durch ihre Bindungsspezifizität für kreuzreaktionsfähige Epitope zwischen humanem Endoglin und murinem Endoglin, ein stärkeres Immunreaktionsvermögen mit humanem Endoglin im Vergleich zu murinem Endoglin und ein selektives Immunreaktionsvermögen, das auf bestimmte Tumorgefäßsysteme und proliferierende vaskuläre Endothelzellen beschränkt ist, wie dies für die Angiogenese charakteristisch ist. So kann im Gegensatz zu den Anti-Endoglin-MAbs des Stands der Technik, die auf das Reaktionsvermögen mit entweder humanem Endoglin oder murinem Endoglin beschränkt sind, die Anti-Endoglin-MAbs der vorliegenden Erfindung bei dem Nacktmausmodell ohne Thymusdrüse oder anderen Mausmodellen von mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten verwendet werden, um die Studien durchzuführen, die notwendig sind, um die klinische Wirksamkeit, die Pharmakokinetik und mögliche nachteilige Nebenwirkungen der antiangiogenetischen Therapie beim Menschen zu bewerten. Bis jetzt wurden vier solche Anti-Endoglin-MAbs entwickelt: MAb K4-2C10, D4-2G10, Y4-2F1 und P3-2G8. Eine spezifische Ausführungsform, die die neue Klasse der erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAbs veranschaulicht, ist MAb K4-2C10.
  • Des weiteren ist ein Verfahren zur Verwendung von Anti-Endoglin-MAbs oder einem Fragment hiervon bei der antiangiogenetischen Therapie offenbart. Bei dieser Ausführungsform wird ein Immunkonjugat gebildet durch das Koppeln der Anti-Endoglin-MAbs oder eines Fragments hiervon an mindestens ein Antitumormittel, wobei das sich ergebende Immunkonjugat sein selektives Immunreaktionsvermögen beibehält, das auf bestimmte Tumorgefäßsysteme und proliferierende vaskuläre Endothelzellen, die für die Angiogenese charakteristisch sind, beschränkt ist. Das Immunkonjugat wird einem geeigneten Mausmodell zum Testen der antiangiogenetischen Therapie verabreicht, wobei die Verabreichung von der Lage des Ziel-Gefäßsystems abhängt. Nach Bewertung der Parameter wie der klinischen Wirksamkeit und Pharmakokinetik bei dem geeigneten Mausmodell kann die antiangiogenetische Therapie dann im Maßstab auf die Behandlung des Menschen angepasst werden. Eine physiologische Basis für das Anpassen des Maßstabs der therapeutischen Mittel, die MAbs enthalten, von einem Mausmodell auf Menschen ist den Fachleuten bekannt (siehe z. B. Baxter et al., 1995, Cancer Res. 55: 4611-4622, hier durch Bezugnahme aufgenommen).
    • Beispiel 1 Herstellung von kreuzreaktionsfähigen Anti-Endoglin-MAbs
  • Zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung wurden die Anti-Endoglin- MAbs, über die früher berichtet wurde, durch die Immunisierung von Mäusen mit rohen Zubereitungen, die Endoglin, einschließlich Zellmembranen oder Ganzzellsuspensionen von Leukämiezellen, entzündeter Haut und Endothelzellen der humanen Umbilikalvene enthielten, erzeugt. Es wurde berichtet, dass die Spezifizität der so hergestellten Anti-Endoglin-MAbs entweder gegenüber humanem Endoglin oder murinem Endoglin bestand. Im Gegensatz hierzu wurden die kreuzreaktionsfähigen Anti-Endoglin-MAbs der vorliegenden Erfindung durch die Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem humanen Endoglin ("hEDG") erzeugt.
  • hEDG wurde aus humanen akuten lymphoblastischen Leukämiezellen(ALL- Zellen) aufgereinigt. Zellmembranglycoproteine wurden unter Verwendung von Detergenzextrakfion und Lectin-Affinitätschromatographie, wie früher beschrieben, isoliert (Haruta und Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7898-7902, hier durch Bezugnahme aufgenommen). Die isolierten Glycoproteine wurden auf eine Immunoaffinitätssäule aufgebracht, die Anti-Endoglin-MAb SN6 enthielt (Haruta und Seon, 1986, s.o.), der mit 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 0,5% Taurocholat, 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 0,03% NaN&sub3; und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, äquilibriert worden war. Die gebundenen Materialien wurden mit 50 mM Diethylamin-HCl, pH 11,3, eluiert, das 0,5% Taurocholat, 2 mM ED- TA, 0,03% NaN&sub3; ("alkalischer Puffer") enthielt. Das eluierte Material wurde erneut auf die Immunoaffinitätssäule aufgebracht und das gebundene Material wurde mit dem alkalischen Puffer eluiert, der weiterhin 0,01% Cytochrom-c (ein 12,4 kD Trägerprotein) enthielt, und neutralisiert. Das eluierte Material wurde konzentriert. Dieser Reinigungsprozess wurde bei 4 bis 6ºC durchgeführt. Die Reinigung von hEDG wurde durch ein Festphasen-Radioimmunoassay unter Verwendung von MAb SN6 überwacht und mittels Gelelektrophorese mit Silberfärbung bestätigt. Die sich ergebende hEDG-Zubereitung enthielt einen einzigen Hauptbestandteil von 170 kD unter nichtreduzierten Bedingungen und 92 kD unter reduzierten Bedingungen.
  • Bei einem ersten Immunisierungsprotokoll wurden 2 weibliche BALB/c- Mäuse mit dem isolierten hEDG immunisiert. Eine Antigenlösung, die 10 ug der hEDG-Zubereitung in 100 ul 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, mit 0,5% Taurocholat, 0,15 mM NaCl und 14 ug Cytochrom-c enthielt, wurde mit einem gleichen Volumen Adjuvans gemischt und dann subkutan an mehreren Stellen bei jeder Maus injiziert. Außerdem wurden 1 · 10&sup9; Bordetella pertussis Bakterien in 100 ul physiologischer Kochsalzlösung an verschiedenen Stellen injiziert. Zwei Booster- Immunisierungen der Antigenlösung in Adjuvans wurden verabreicht. Eine letzte Immunisierung, die 40 ul Antigenlösung umfasste, die 8 ug hEDG-Zubereitung, gemischt mit 200 ul physiologischer Kochsalzlösung, enthielt, wurde intraperitoneal verabreicht. Die Milz wurde entfernt und 4 Tage nach der letzten Immunisierung mit P3/NS1/1-Ag4-1 (NS-1) Maus-Myelomzellinie fusioniert. Die Zellfusionierung, das Hybridom-Screening und die Immunoglobulinklassenbestimmung wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Haruta und Seon, 1986, s.o.). Bei einem zweiten Immunisierungsprotokoll wurde eine weibliche BALB/c-Maus mit dem isolierten hEDG, wie für das erste Experiment beschrieben, jedoch ohne die Verabreichung von B. pertussis, immunisiert. Elf Hybridome, die durch diese Immunisierungen erzeugt werden, erzeugen einzeln unterschiedliche Anti-hEDG- MAbs, die weiter charakterisiert wurden.
    • Beispiel 2 Charakterisierung von Anti-Endoglin-MAbs
  • Bei dieser Ausführungsform wird die Bindungsspezifizität von vier der elf unterschiedlichen humanen Anti-Endoglin-Antikörpern veranschaulicht, die unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 1 erzeugt wurden. Es wurde gefunden, dass diese vier MAbs, K4-2C10, D4-2G10, Y4-2F1 und P3-2G8, die mit Endoglin, das an humanen Zellen exprimiert ist, reagieren, mit dem an murinen Zellen exprimierten Endoglin kreuzreagieren. Dieses Kreuzreaktionsvermögen ist ein unerwartetes Ergebnis, da (a) darüber nicht früher berichtet wurde und (b) es signifikant weniger Identität bei den murinen und humanen Sequenzen gibt, die für den extrazellulären Bereich (der dem Antikörper ausgesetzt ist) des Endoglins codieren als bei derjenigen, die für die transmembranen Bereiche und cytoplasmatischen Bereiche codiert. Die MAbs K4-2C10, Y4-2F1 und P3-2G8 wurden unter Verwendung des zuerst in Beispiel 1 beschriebenen Immunisierungsprotokolls erzeugt, während D4-2G10 unter Verwendung des zweiten Immunisierungsprotokolls erzeugt wurde.
  • Die Spezifizität des Immunreaktionsvermögens jedes dieser vier MAbs wurde weiter charakterisiert, indem sie gegen verschiedene hämatopoetische Zellinien in einem zellulären Radioimmunoassay (RIA) und durch Immunausfällung von hEDG unter Verwendung von zuvor beschriebenen Verfahren (Haruta und Seon, 1986, s.o.) getestet wurden. Kurz gesagt, 20 ul einer 1 : 9 Verdünnung der Kulturflüssigkeiten der einzelnen Hybridome und 2 · 10&sup5; hämatopoetische Zellen bei jedem Test mittels RIA. Die Maus-Plasmacytome IgG1 und IgG2a wurden in die Assays als Kontrolle aufgenommen. Die Ergebnisse, die das Immunreaktionsvermögen (+) oder kein nachweisbares Immunreaktionsvermögen (-) angeben, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
  • ALL - akute lymphoblastische Leukämie; CML-BC - chronische myelocytische Leukämie in der Blasten-Krise; BL - Burkitt-Lymphom, LS - Lymphosarkom, LY - Lymphom, HL - histiocytisches Lymphom, LTL - leukämische Phase des T- Zellenlymphoms, SS - Sezary-Syndrom; APL - akute promyelocytische Leukämie, AML - akute myelocytische Leukämie; n.b - nicht bestimmt.
  • Wie in Tabelle 1 für die Anti-Endoglin-MAbs der vorliegenden Erfindung gezeigt und wie früher für den Kontroll-Anti-Endoglin MAb SN6 bestimmt, wurde das Immunreaktionsvermögen für die getesteten unreifen Leukämie-Zellinien der B-Abstammungslinie (KM-3, REH, NALM-1, NALM-6 und NALM-16) und die getesteten myelomonocytischen Leukämie-Zellinien (ML-2, HL-60 und U937) gezeigt. Sie reagierten jedoch nicht mit irgendeiner der reifen Leukämie- Lymphom-Zellinien der B-Abstammungslinie (BALL-1, BALM-2, BALM-3, Daudi, Ramos, U698M und SU-DHL-4) und der EBV-transformierten B-Zellinien (CCRF-SB, RPMI 1788 und RPMI 8057). Das Immunoausfällungsassay zeigte, dass alle vier Anti-Endoglin-MAbs der vorliegenden Erfindung wie der Kontroll- Anti-hEDG-MAb SN6 unter nichtreduzierten Bedingungen eine 170 kD Komponente und unter reduzierten Bedingungen eine 92 kD Komponente ausfällte.
  • Unter Verwendung von RIA wurden die 11 Anti-hEDG-MAbs, die unter Verwendung der Protokolle gemäß Beispiel 1 erzeugt wurden, und die den AntihEDG-MAb SN6 mit Bezug auf das Immunreaktionsvermögen gegenüber proliferierenden murinen SVEC4-10-Endothelzellen, die an ihrer Zelloberfläche Endoglin exprimieren, getestet. Es wurde gefunden, dass nur die vier MAbs K4- 2C10, D4-2G10, Y4-2F1 und P3-2G8 eine Bindungsspezifizität (mindestens eine um eine Standardabweichung höhere Bindung als MAb SN6 oder der Kontroll- Antikörper) mit dem an den murinen Endothelzellen exprimierten Endoglin aufwiesen. Das Kreuzreaktionsvermögen dieser vier MAbs mit Bezug auf murine SVEC4-10-Zellen wird mit dem Immunreaktionsvermögen der MAbs K4-2C10 und D4-2G10 mit profilierenden humanen Endothelzellen der Umbilikalvene (HUVEC; hohe Expressoren von hEDG) zu verschiedenen Inkubationszeitpunkten bei dem RIA (2 Stunden, 4 Stunden, 8 Stunden, 24 Stunden und 32 Stunden), wie in Tabelle 2 gezeigt, verglichen. Die Kontrollen sind jeweilige speziesspezifische, isotypenabgestimmte IgG. Tabelle 2
  • Jeder Test wurde dreimal durchgeführt, und die angegebenen Werte (als Zählungen pro Minute) sind der Durchschnitt der dreimaligen Durchführung ± Standardabweichung.
  • Die Spezifizität des Immunreaktionsvermögens jeder der vier MAbs wurde weiter charakterisiert durch Verwenden dieser MAbs bei der histochemischen Färbung mehrerer humaner maligner Gewebe. Die Gewebe umfassten maligne Gewebe der Brust, des Kolons, der Niere, der Lunge und des Lymphknotens. Die Gewebe wurden gefroren, dann luftgetrocknet und mit Aceton fixiert und gemäß den Standardverfahren des Stands der Technik gefärbt. Die immunohistochemische Färbung der malignen Gewebe mit jedem der vier MAbs zeigte, dass diese MAbs mit dem vaskulären Endothel, das mit allen der malignen Gewebe assoziiert war, stark reagierte, während die Kontroll-IgG keine signifikante Färbung in jedem Gewebe zeigte.
  • Zusammenfassend zeigten die erfindungsgemäßen Anti-hEDG-MAbs ein starkes Immunreaktionsvermögen gegenüber Endoglin, wie durch proliferierende humane vaskuläre Endothelzellen exprimiert, wie sich durch ihr Reaktionsvermögen mit HUVEC und malignen Tumorgefäßsystemen zeigt. Es ist wichtig, festzustellen, dass das Immunreaktionsvermögen gegenüber dem Gefäßsystem des malignen Tumorgewebes und nicht gegenüber den Tumorzellen selbst bestand. Die erfindungsgemäßen Anti-hEDG-MAbs reagierten auch signifikant mit an proliferierenden murinen Endothelzellen exprimiertem Endoglin, obgleich in einem geringeren Ausmaß im Vergleich zum Immunreaktionsvermögen mit denjenigen an HUVEC. Da Endoglin hauptsächlich ein mit Proliferation assoziierter Marker für Endothelzellen ist, die einer aktiven Angiogenese unterzogen werden, können die erfindungsgemäßen Anti-hEDG-MAbs verwendet werden, um die antiangiogenetische Therapie selektiv auf das Tumorgefäßsystem oder die exzessive Gefäßbildung, die bei anderen mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten sowohl beim Menschen als auch bei Mausmodellen humaner Krankheiten vorhanden sind, zielgenau gerichtet zu werden.
  • Alle potentiell neuen Mittel für die antiangiogenetische Therapie müssen mit Bezug auf ihre Sicherheit und Wirksamkeit in einem Tiermodell bewertet werden, bevor die Mittel bei klinischen Versuchen mit menschlichen Patienten verwendet werden. In dieser Hinsicht ist das beobachtete Kreuzreaktionsvermögen der erfindungsgemäßen humanen Anti-Endoglin-MAbs mit Maus-Endothelzellen von kritischer Bedeutung für die Bewertung der Sicherheit und Wirksamheit dieser MAbs und der Immunkonjugate, die unter Verwendung dieser MAbs gebildet werden.
    • Beispiel 3
  • In diesem Beispiel wird ein erstes Verfahren zum Targeting von Therapien gegen Tumorgefäßsysteme oder die exzessive Gefäßbildung, die bei anderen mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhanden ist (insgesamt als "antiangiogenetische Therapie" bezeichnet), veranschaulicht. Das Verfahren der antiangiogenetischen Therapie ist von hauptsächlichem Nutzen für die erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAbs. Bei dieser Ausführungsform wird ein Immunkonjugat unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAb oder eines Fragments hiervon hergestellt. Der Anti-Endoglin-MAb oder ein Fragment hiervon wird entweder an mindestens ein Antitumormittel, wie einen Angiogeneseinhibitor, bei der Bildung des Immunkonjugats gekoppelt. Ein solches Immunkonjugat wird dann in einem relevanten Maus-Modell verwendet, um die Antiangiogenesetherapie zu testen, bevor sie maßstäblich für die antiangiogenetische Therapie beim Menschen angepasst wird.
  • Während das Immunkonjugat mittels anderer Wege als intravenös (i.v.) verabreicht werden kann, ist eine bevorzugte Ausführungsform der Veranschaulichung die i.v. Verabreichung des Immunkonjugats, und zwar weil es das proliferierende Gefäßsystem ist, das die Angiogenese umfasst und das das Ziel der Therapie ist; und so sättigt das intravenöse Verabreichen des Immunkonjugats das als Ziel dienende Gefäßsystem viel schneller als bei der Verwendung eines anderen Verabreichungswegs. Außerdem gestattet der intravenöse Weg die Möglichkeit eines weiteren Targeting spezifischer Gewebe. So kann bei einer Abänderung dieser Ausführungsform ein Katheter verwendet werden, um das Immunkonjugat an den Ort der Target-Angiogenese zu richten. Falls beispielsweise die Tumorangiogenese das Ziel der antiangiogenetischen Therapie ist und falls sich der Tumor in der Leber befindet, dann kann das Immunkonjugat unter Verwendung eines Katheters der portalen Vene der Leber zugeführt werden. Bei dieser Abänderung gibt es noch weniger systemische Verteilung des Immunkonjugats, wodurch weiterhin jegliche möglichen Nebenwirkungen der antiangiogenetischen Therapie minimiert werden.
    • 1. Herstellung der Immunkonjugate
  • Zur Veranschaulichung dieser ersten Ausführungsform wurde ein Immunkonjugat unter Verwendung jedes der vier erfindungsgemäßen Anti-Endoglin- MAbs hergestellt. Das Immunkonjugat umfasst einen der MAbs K4-2C10, D4- 2G10, Y4-2F1 und P3-2G8, entweder an die Ricin A-Kette ("RA") oder die deglycosylierte Ricin A-Kette ("dgRA") unter Verwendung eines heterobifunktionellen Reagenz (SMPT) gekoppelt, das einen Disulfid-Linker, der in vivo stabil ist, in die IgG-Moleküle des MAb einführt (siehe z. B. Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931). Die RA oder dgRA wird dann mit dem modifizierten MAb gemischt und inkubiert. Die sich ergebenden MAb-dgRA-Konjugate oder MAb- RA-Konjugate werden von der ungebundenen dgRA bzw. RA getrennt und dann weiter gereinigt. Ein Kontroll-Immunkonjugat wird auf die gleiche Weise gebildet, die IgG-Komponente ist jedoch eine isotypenangepasste Kontroll-IgG (MOPC 195 Variante).
    • 2. Cytotoxische in vitro Wirksamkeit der Immunkonjugate
  • Die cytotoxische in vitro Wirksamkeit der verschiedenen MAb-dgRA- Konjugate, der MAb-RA-Konjugate und des Kontroll-Konjugats wurden durch ein modifiziertes Verfahren von May et al. (1990, J. Immunol. 144: 3637-3642) bewertet. Kurz gesagt, die proliferierenden murinen SVEC4-10-Endothelzellen oder die humanen MCF-7-Brustkrebszellen wurden in Vertiefungen von Mikrotiter-Platten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen mit 2,5 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung verteilt. Unterschiedliche Mengen der MAb-dgRA-Konjugate, der MAb-RA- Konjugate, des Kontrollkonjugats oder des Kulturmediums (zusätzliche Kontrolle) wurden in die Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden dann während 48 Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Die Zellen, die in den Vertiefungen enthalten waren, wurden dann während 18 Stunden mit 1 uCi/Vertiefung [³H] Thymidin pulsiert und auf Glasfaserfiltern unter Verwendung einer halbautomatischen Zellerntevorrichtung geerntet. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Szintillationszählers bestimmt und die Ergebnisse wurden als Prozentsatz des [³H] Thymidins ausgedrückt, das durch die nur mit dem Medium behandelten Zellen inkorporiert war. Wie in Fig. 1A gezeigt, zeigten MAb-RA-Konjugate (K4-2C10- RA: ; Y4-2F 1-RA: und P3-2G8-RA: ) signifikant mehr Cytotoxizität gegenüber den proliferierenden murinen Endothelzellen im Vergleich zu der Cytotoxizität des Kontroll-RA-Konjugats (x). In ähnlicher Weise und wie in Fig. 1B gezeigt, zeigten MAb-dgRA-Konjugate (K4-2C10-dgRA: ; D4-2G10-dgRA: O) signifikant mehr Cytotoxizität gegenüber den proliferierenden murinen Endothelzellen im Vergleich zu der Cytotoxizität des Kontroll-dgRA-Konjugats. Die Kontrollkonjugate zeigten schwache und nichtspezifische cytotoxische Wirkungen, wenn die Konzentrationen höher als 25 nM waren. Solche nichtspezifischen, cytotoxischen Wirkungen bei diesen Konzentrationen wurden früher schon beobachtet (siehe z. B. Seon 1984, Cancer Res. 44: 259-264). Es wurde jedoch gefunden, dass solche nichtspezifischen, cytotoxischen Wirkungen der Kontrollkonjugate in vivo insignifikant waren. Für die MAb-dgRA-Konjugate und die Kontrollkonjugate wurde keine signifikante Cytotoxizität gegenüber den humanen MCF-7-Brustkrebszellen beobachtet.
    • 3. Antiangiogenetische Therapie unter Verwendung von Immunkonjugaten
  • Ein MAb-dgRA-Konjugat, K4-2C10-dgRA, wurde verwendet, um die antiangiogenetische Therapie zu veranschaulichen. Ein MAb-dgRA-Konjugat wurde zur Veranschaulichung ausgewählt, da Konjugate, die dgRA enthalten, bei der in vivo Tumortherapie wirksamer zu sein scheinen als Konjugate, die RA enthalten, wenn sie intravenös verabreicht werden (siehe z. B. Fulton et al., 1988, Cancer Res. 48: 2626-2631).
  • A. Bevor das Immunkonjugat einem Maus-Modell mit Bezug auf eine humane Krankheit verabreicht wird, sollte die maximal verträgliche Dosis bestimmt werden. In dieser Hinsicht wurde der LD&sub5;&sub0;-Wert des K4-2C10-dgRA-Konjugats unter Verwendung einer Abänderung des von Fulton et al. beschriebenen Verfahrens (1988, s.o.) bestimmt. Kurz gesagt, erhielten Gruppen von 4 weiblichen BALB/c- Mäusen (7 Wochen alt) intraperitoneale Injektionen des K4-2C10-dgRA- Konjugats mit einer Dosierung von 0,025, 0,05, 0,1, 0,2 und 0,4 mg. Die Mäuse wurden vor der Injektion und täglich danach gewogen und während zwei Wochen mit Bezug auf Morbidität und Mortalität beobachtet. Der LD&sub5;&sub0;-Wert wurde bestimmt, indem der Prozentsatz der Mortalität gegenüber der injizierten Dosis aufgetragen wurde, um die Dosis zu bestimmen, die zu einer 50%igen Mortalität führt. Der LD&sub5;&sub0;-Wert des K4-2C10-dgRA-Konjugats bei Mäusen betrug 16,4 ug/g Körpergewicht.
  • B. SCID-Mäuse mit humanen Tumorxenotransplantaten, die humane MCF-7- Brustkrebszellen umfassten, waren ein Modell für die Bewertung der antiangiogenetischen Therapie, die die Verabreichung von K4-2C10-dgRA-Konjugat umfasste. Humaner Brustkrebs wurde bei diesem Modell verwendet, um humane solide Tumore darzustellen. Zur Erzeugung dieses Modells wurden MCF-7-Zellen in SCID-Mäuse transplantiert. Vorläufige dosisabhängige Titrierungsexperimente zeigten, dass alle SCID-Mäuse, die subkutan mit einer Dosis von 8 · 10&sup6; Zellen/Maus geimpft wurden, subkutane Tumore entwickelten. So waren 8 · 10&sup6; Zellen die Dosierung, die verwendet wurde, um subkutane Tumore bei den mit der erfindungsgemäßen antiangiogenetischen Therapie zu behandelnden Mäusen festzustellen. Das Wachstum der Tumore wurde täglich überwacht.
  • C. Bei einer ersten Ausführungsform und einer zweiten Ausführungsform wurde die antiangiogenetische Therapie, die die Verabreichung von K4-2C10-dgRA- Konjugat umfasste, bei dem Modell mit SCID-Maus und MCF-7-Xenotransplantat getestet. Zwei Sätze von therapeutischen Protokollen wurden durchgeführt. Bei einem ersten therapeutischen Protokoll wurde eine erste Gruppe von 8 SCID- Mäusen, die subkutan mit 8 · 10&sup6; MCF-7-Zellen/Maus geimpft wurde, nicht behandelt (Kontrolle). Eine zweite Gruppe von 8 SCID-Mäusen, die subkutan mit 8 · 10&sup6; MCF-7-Zellen/Maus geimpft wurde, wurde durch die i.v. Verabreichung von 17 ug/0,2 ml nichtkonjugiertem (freiem) MAb K4-2C10 behandelt. Eine dritte Gruppe von 8 SCID-Mäusen, die subkutan mit 8 · 10&sup6; MCF-7-Zellen/Maus geimpft wurde, wurde durch i.v. Verabreichung von 20 ug/0,2 ml K4-2C10- dgRA-Konjugat behandelt. Eine vierte Gruppe von 8 SCID-Mäusen, die subkutan mit 8 · 10&sup6; MCF-7-Zellen/Maus geimpft wurde, wurde durch i.v. Verabreichung von nichkonjugiertem (freiem) MAb K4-2C10 (75 ug), gefolgt von einer i.v. Verabreichung des K4-2C10-dgRA-Konjugats (20 ug/0,2 ml) am Tag 3, 5 und 7 nach der Impfung mit dem Tumor behandelt. Nichtkonjugierter MAb K4-2C10 für die Vorbehandlung der Mäuse, die in der Gruppe 4 enthalten waren, wurde 2 Stunden nach der Tumorimpfung verabreicht. Die sterilisierten Lösungen des nichtkonjugierten MAb K4-2C10 und des K4-2C10-dgRA-Konjugats wurden mit sterilem PBS, das Mausserumalbumin (0,05% endgültige Konzentration) enthielt, vor der Injizierung über die Schwanzvene der Mäuse verdünnt. Die Gesamtdosis dieses therapeutischen Protokolls, 3 · 20 ug des Immunkonjugats, entsprach 22% der LD&sub5;&sub0;-Dosis.
  • Während der Behandlung wurden die Mäuse täglich mit Bezug auf die Tumorgröße und die Morbidität überwacht, und das Gewicht der Mäuse wurde zweimal pro Woche gemessen. Die Tumorvolumina wurden gemäß der folgenden Gleichung abgeschätzt:
  • V = Länge · (Breite)² · π/6
  • Tastbare Tumore begannen ein bis zwei Wochen nach der Tumorimpfung bei allen vier Gruppen der Mäuse aufzutreten. Es gab jedoch bemerkenswerte Unterschiede bei dem Tumorwachstum zwischen den mit dem Immunkonjugat behandelten Gruppen und den Gruppen, die keine Immunkonjugat-Behandlung erhielten. Wie in Fig. 2A gezeigt, wuchsen die Tumore bei allen unbehandelten Mäusen solange wie die Mäuse weiter beobachtet wurden. Wie in Fig. 2B gezeigt, war nichtkonjugierter MAb K4-2C10 allein bei der Verhinderung des Tumorwachstums nicht signifikant wirksam. Im Gegensatz hierzu und wie in Fig. 2C und 2D gezeigt, zeigten die Gruppen der Mäuse, die mit dem Immunkonjugat (K4-2C10-dgRA-Konjugat) behandelt wurden, eine signifikante Tumorrückbildung. Tumore bei allen acht Mäusen, die mit dem Immunkonjugat allein behandelt wurden (Gruppe 3), bildeten sich vollständig zurück und die Rückbildung erfolgte so lange wie die Mäuse weiter beobachtet wurden (125 Tage). So ist auf der Grundlage dieser Ergebnisse eine erste Ausführungsform zur wirksamen Verabreichung der antiangiogenetischen Therapie die Verabreichung des Immunkonjugats allein. Tumore bei sieben der acht Mäuse (87,5%), die mit dem nichtkonjugierten MAb vorbehandelt und dann mit dem Immunkonjugat behandelt wurden (Gruppe 4), bildeten sich vollständig zurück und die Rückbildung hielt an so lange wie die Mäuse weiter beobachtet wurden (125 Tage nach der Tumorimpfung). So ist auf der Grundlage dieser Ergebnisse eine zweite Ausführungsform zur wirksamen Verabreichung der antiangiogenetischen Therapie die Verabreichung des nichtkonkugierten MAb, gefolgt von der Verabreichung des Immunkonjugats. Eine statistische Analyse der Daten wurde unter Verwendung des Student t-Tests und des Fisher Genauigkeitstests durchgeführt. Bei jedem Test waren die Unterschiede zwischen den mit Immunkonjugat behandelten Gruppen (Gruppen 3 und 4) und der Kontrollgruppe (Gruppe 1) statistisch signifikant (p < 0,001).
  • Diese Ergebnisse geben an, dass die antiangiogenetische Therapie mit dem Immunkonjugat, das aus einem erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAb besteht und an ein Antitumormittel gekoppelt ist, hoch wirksam bei der Ausübung heilender Antitumorwirkungen bei einem Mausmodell humaner Krankheit ist. Die antiangiogenetische Therapie entweder gemäß der ersten oder der zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform war wirksam bei der Induzierung einer vollständigen Rückbildung des humanen soliden Tumors bei den behandelten SCID- Mäusen.
  • Bei einem zweiten therapeutischen Protokoll waren vier Gruppen von sechs bis acht SCID-Mäusen, die subkutan mit 8 · 10&sup6; MCF-7-Brustkrebszellen/Maus geimpft waren, enthalten. Unter Verwendung der Verfahren gemäß dem ersten Protokoll blieb eine erste Gruppe unbehandelt (Kontrolle). Eine zweite Gruppe wurde durch i.v. Verabreichung von nichtkonjugiertem (freiem) MAb K4-2C10, jedoch nur am Tag 3, 4 und 5 nach der Tumorimpfung, behandelt. Eine dritte Gruppe wurde mit der i.v. Verabreichung des K4-2C10-dgRA-Konjugats, jedoch am Tag 3, 4 und 5 nach der Tumorimpfung, behandelt. Eine vierte Gruppe wurde mit der i.v. Verabreichung von nichtkonjugiertem (freiem) MAb K4-2C10 (50 ug, 1 Tag nach der Tumorimpfung), gefolgt von der i.v. Verabreichung des K4-2C10- dgRA-Konjugats am Tag 3, 4 und 5 nach der Tumorimpfung, behandelt. Die Mäuse wurden unter Verwendung der Verfahren und Parameter gemäß dem ersten therapeutischen Protokoll bewertet.
  • Wie in Fig. 3A gezeigt, wuchsen die Tumore bei allen außer einer der acht Mäuse der Gruppe 1 (unbehandelt) so lange weiter wie die Mäuse weiter beobachtet wurden. Wie in Fig. 3B gezeigt, war nichtkonjugiertes MAb K4-2C10 allein nicht signifikant wirksam bei der Verhinderung des Tumorwachstums. Im Gegensatz dazu und wie in Fig. 3C und 3D gezeigt, zeigten die Gruppen der Mäuse, die mit dem Immunkonjugat (K4-2C10-dgRA-Konjugat) behandelt wurden, eine signifikante Tumorrückbildung. Die Tumore bei sieben von acht (87,5%) der Mäuse, die mit dem Immunkonjugat allein (Gruppe 3) behandelt wurden, bildeten sich vollständig zurück und die Rückbildung dauerte so lange an wie die Mäuse weiter beobachtet wurden (105 Tage nach der Tumorimpfung) wie dies in Fig. 3C gezeigt ist. Wie in Fig. 3D gezeigt, bildeten sich die Tumore bei 5 von den 6 Mäusen, die mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb, gefolgt von der Verabreichung des Immunkonjugats (Gruppe 4), behandelt wurden, vollständig zurück und die Rückbildung dauerte solange an, wie die Mäuse weiter beobachtet wurden (105 Tage nach der Tumorimpfung). Die Ergebnisse des zweiten therapeutischen Protokolls entsprechen den Ergebnissen des ersten therapeutischen Protokolls sehr; d. h. die antiangiogenetische Therapie unter Verwendung des Anti-Endoglin- MAb-Konjugats ist bei der Induzierung einer andauernden, vollständigen Rückbildung der humanen soliden Tumore wirksam.
  • Die sehr wirksame Antitumorwirkung des Immunkonjugats in vivo ist aus folgenden Gründen ein unerwartetes Ergebnis. Erstens reagiert MAb K4-2C10 nur schwach mit murinen Endothelzellen und das K4-2C10-dgRA-Konjugat ist nur schwach cytotoxisch gegenüber murinen Endothelzellen (im Vergleich zu proliferierenden humanen Endothelzellen). Des weiteren wurde eine relativ kleine Menge (entsprechend 22% der LD&sub5;&sub0;-Dosis) des Immunkonjugats i.v. verabreicht. Bei der herkömmlichen, auf Tumorzellen gerichteten Therapie haben selbst hoch wirksame Antitumor-Immuntoxine selten so starke Antitumorwirkungen in vivo gezeigt, wenn eine geringe Menge des Mittels i.v. verabreicht wurde. Wie in der vorliegenden Erfindung gelehrt wird, wurde das Immunkonjugat selektiv auf das Gefäßsystem gerichtet statt auf den Tumor an sich gerichtet zu werden. Im Gegensatz zu anderen beschriebenen Versuchen der Verwendung von Targeting-Mitteln gegen die Tumorangiogenese (wie berichtet in Folkman, 1995, s.o.; Sipos et al., 1994, Ann. NY Acad. Sci. 732: 263-272; Hawkins 1995; Curr. Opin. Oncol. 7: 90- 93) scheint die Verwendung des humanen Anti-Endoglin-MAb in Immunkonjugaten gemäß der vorliegenden Erfindung heilende Antitumorwirkungen ausüben zu können.
    • Beispiel 4
  • In Beispiel 3 wurden eine erste Ausführungsform und eine zweite Ausführungsform eines Verfahrens für Targeting-Therapien gegen Tumorgefäßsysteme oder die exzessive Gefäßbildung, die bei mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhanden ist, veranschaulicht. Bei der Verwendung gemäß der ersten Ausführungsform wurde gezeigt, dass ein Immunkonjugat, das einen Anti-Endoglin- MAb gemäß der vorliegenden Erfindung enthält und an ein Antitumormittel gekoppelt ist, mit dem Tumor assoziierte Gefäßsysteme zerstört, indem es selektiv mit proliferierenden Endothelzellen des neuen, mit dem Tumor assoziierten Gefäßsystems reagiert und bestehende mit dem Tumor assoziierte Blutgefäße zerstört, wodurch verhindert wird, dass sich die mit dem Tumor assoziierte Angiogenese entwickelt (siehe z. B. Fig. 2C und 3C). In Beispiel 3 ist eine zweite Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens für die antiangiogenetische Therapie veranschaulicht.
  • Gemäß der zweiten Ausführungsform wird ein Immunkonjugat verwendet, das unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAbs oder eines Fragments hiervon, das entweder mit mindestens einem Antitumormittel oder einem Angiogeneseinhibitor gekoppelt ist, zur Bildung des Immunkonjugats hergestellt wird. Bei dieser zweiten Ausführungsform der antiangiogenetischen Therapie wird jedoch der den Tumor aufweisende Wirt oder der Wirt mit exzessiver Gefäßbildung aufgrund einer mit der Angiogenese assoziierten Krankheit mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb gemäß der vorliegenden Erfindung oder einem Fragment hiervon (z. B. F(ab')&sub2;) vorbehandelt. Das Grundprinzip für die Vorbehandlung vor der Verabreichung des Immunkonjugats ist, dass die Vorbehandlung mit einem nichtkonjugierten Anti-Endoglin-MAb, das das gleiche Epitop auf dem Endoglin wie das Immunkonjugat erkennt, die Selektivität des Immunkonjugats für das Zielgefäßsystem weiter verbessert. Beispielsweise ist der Endothelzellenumsatz bei normalen ruhenden Zellsystemen sehr langsam. Im Gegensatz hierzu machen die in den mit dem Tumor assoziierten neuen Gefäßsystemen oder in der exzessive Gefäßbildung, die bei mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhanden ist, eine schnelle Proliferation während plötzlichen Aktivitäten der Angiogenese durch (siehe z. B. Folkman et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 10931-10934). Deshalb kann die Vorbehandlung des Wirts mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb oder einem Fragment hiervon imstande sein, die schwachen Bindungsstellen an ruhenden Endothelzellen bei den normalen (nicht von der Krankheit befallenen Geweben) abzudecken (vorzubeschichten), während große Mengen der neu erzeugten Bindungsstellen an den proliferierenden Endothelzellen, die bei der Angiogenese gefunden werden, dann für die Bindung durch eine anschließende Verabreichung des Immunkonjugats verfügbar sind. Das Vorbeschichten des normalen Gewebes vor der Verabreichung des Immunkonjugats kann unerwünschte Nebenwirkungen des verabreichten Immunkonjugats, die möglicherweise verursacht werden, dadurch verringern, dass das Immunkonjugat schwach mit normalem Gewebe reagiert. Des weiteren kann der Vorbeschichtungsschritt die antiangiogenetische Wirksamkeit des Immunkonjugats aufgrund der wirksameren Zuführung des systemisch verabreichten Immunkonjugats zu dem Zielgefäßsystem verbessern. Wie in Fig. 2D und 3D gezeigt, kann das Gefäßsystem (das mit dem Tumor assoziierte neue Gefäßsystem oder die exzessive bei mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhandene Gefäßbildung) wirksam das Ziel der systemischen Verabreichung des Immunkonjugats sein, nachdem dem Wirt eine Vorbeschichtung von nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb zugeführt wurde. So ist die i.v. Verabreichung von nichtkonjugiertem Anti-Endoglin- MAb bei Patienten als Vorbeschichtungsschritt, gefolgt von der i.v. Verabreichung des Anti-Endoglin-Immunkonjugats, ein neuer und wirksamer Ansatz der antiangiogenetischen Therapie.
    • Beispiel 5
  • Zwei Ausführungsformen für ein Verfahren zum Targeting von Therapien gegen Tumorgefäßsysteme oder die bei mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhandene, exzessive Gefäßbildung wurden in Beispiel 3 und 4 mit dem SCID-Mausmodell mit humanem Xenotransplantat veranschaulicht und detailliert angegeben. Ein weiteres Mausmodell der humanen mit der Angiogenese assoziierten Krankheit wurde verwendet, um die antiangiogenetische Therapie unter Verwendung der Anti-Endoglin-MAbs und der Verwendungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu zeigen. Die antiangiogenetische Wirksamkeit des Immunkonjugats, K4-2C10-dgRA, wurde mittels der dorsalen Luftbeutelmethode (siehe z. B. Asano et al., 1995, Cancer Res. 55: 5296-5301), einem Assay für die in vivo Angiogenese, getestet. Kurz gesagt, wurden 1 · 10&sup7; HT1080 huniane Tumorzellen in PBS suspendiert und dann in eine Kunststoffkammer (14 mm Durchmesser) verbracht, die an jedem Kammerende mit einem Cellulosemembranfilter (0,45 um Porengröße) abgedichtet wurde. Eine so vorbereitete Kammer wurde in den dorsalen Luftbeutel jeder der mehreren weiblichen BALB/c-Mäuse implantiert. Eine Gruppe der Mäuse, die die Implantate aufwiesen, blieben als positive Kontrolle der Angiogenese unbehandelt. Eine zweite Gruppe Mäuse, die die Implantate aufwiesen, wurde durch i.v. Verabreichung des nichtkonjugierten MAb K4- 2C10 (17 ug/0,2 ml) 2 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Kammerimplantation behandelt. Eine dritte Gruppe Mäuse, die die Implantate aufwiesen, wurde durch i.v. Verabreichung mit Immunkonjugat, K4-2C10-dgRA (20 ug/0,2 ml) 2 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Kammerimplantation behandelt. Einer vierten Gruppe Mäuse wurden Kammern, die nur PBS (ohne irgendwelche Tumorzellen) enthielten, implantiert, und sie wurden als negative Kontrolle der Angiogenese nicht behandelt. Am Tag 4 wurden die Mäuse jeder Gruppe mit Bezug auf die Bildung neuer Blutgefäße (Angiogenese) in subkutanen Bereichen analysiert. Die Behandlung der Mäuse mit dem Immunkonjugat führte zu einer signifikanten Unterdrückung der Angiogenese, während bei demn mit dem nichtkonjugierten MAb K4-2C10 behandelten Mäusen die Angiogenese viel weniger gehemmt war. Die Ergebnisse stützen die Verabreichung des Anti-Endoglin- Immunkonjugats als neuen und wirksamen Ansatz der antiangiogenetischen Therapie weiter.
    • Beispiel 6
  • In den Beispielen 3 und 4 wurden bei Maus-Modellen der humanen Krankheit zwei Ausführungsformen für ein Verfahren zum Targeting von Therapien gegen Tumorgefäßsysteme oder die bei mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhandene exzessive Gefäßbildung veranschaulicht. Unter Verwendung des Verfahrens gemäß einer der beiden Ausführungsformen wurde gezeigt, dass ein Immunkonjugat, das einen Anti-Endoglin-MAb gemäß der vorliegenden Erfindung enthält und an ein Antitumormittel gekoppelt ist, selektiv mit proliferierenden Endothelzellen des Ziel-Gefäßsystems reagiert und diese zerstört, wodurch verhindert wird, dass sich die assoziierte Angiogenese entwickelt. Des weiteren ist ein Vorbeschichten mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb, gefolgt von der Verabreichung des Immunkonjugats, auch bei der antiangiogenetischen Therapie wirksam.
  • Ein Fachmann würde sich darüber bewusst sein, dass die antiangiogenetische Therapie gemäß der ersten oder der zweiten Ausführungsform für die klinische Verwendung beim Menschen optimiert werden müsste. Eine physiologische Basis für das größenmäßige Anpassen der therapeutischen Mittel, die MAbs enthalten, von einem Mausmodell auf den Menschen ist den Fachleuten bekannt (siehe z. B. Baxter et al., 1995, s.o.). Beispielsweise muss die optimale zeitliche Abstimmung für die anschließende Verabreichung des Immunkonjugats nach der Vorbehandlung mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb und das optimale Molverhältnis des nichtkonjugierten Anti-Endoglin-MAb zu dem Immunkonjugat für individuelle Patienten, die wegen eines mit einem Tumor assoziierten, neuen Gefäßsystems oder einer bei mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhandenen exzessiven Gefäßbildung behandelt werden sollen, bestimmt werden. Die optimale zeitliche Abstimmung wird durch mehrere Faktoren, wie die Pharmakokinetik des verabreichten erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAb oder einem Fragment hiervon, beeinflusst. Ein weiterer Faktor ist die Rate der Endocytose/des Abstoßens des MAb oder eines Fragments hiervon, der bzw. das an humanes Endoglin auf der Oberfläche humaner Endothelzellen gebunden ist. Die Vorbehandlung von Patienten mit autologem oder homologem Anti-Endoglin-MAb kann die Sicherheit und Wirksamkeit der klinischen Anwendung des Anti-hEDG- MAb-Immunkonjugats gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verbessern.
  • Bei einem weiteren Beispiel der antiangiogenetischen Therapie wird ein humaner Patient mit einer mit einer Angiogenese assoziierten Krankheit, wie einer diabetischen Retinopathie, chronischen Entzündungskrankheiten, einer rheumatischen Arthritis, Dermatitis und Psoriasis mit einem therapeutischen Protokoll der multiplen Verabreichung eines erfindungsgemäßen Immunkonjugats behandelt. Das Immunkonjugat umfasst einen erfindungsgemäßen humanen Anti-Endoglin- MAb oder ein Fragment hiervon, der bzw. das an mindestens einen Angiogeneseinhibitor oder mindestens ein Antitumormittel gekoppelt ist. Das Immunkonjugat kann weiterhin ein pharmazeutisch akzeptables Trägermedium umfassen. Bei einer weiteren Ausführungsform wird der humane Patient mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb (oder einem Fragment hiervon), gefolgt von der Verabreichung eines Anti-hEDG-MAb-Immunkonjugats (oder eines Fragments hiervon) gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt. Der nichtkonjugierte Anti- Endoglin-MAb (oder ein Fragment hiervon) kann weiterhin ein pharmazeutisch akzeptables Trägermedium umfassen.
  • Bei einem weiteren Beispiel der antiangiogenetischen Therapie wird ein humaner Patient mit einem Tumor, wie einer humanen Leukämie, einschließlich vom Nicht-T-Zelltyp (Nicht-T), einer akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL), einer myelomonocytischen Leukämie oder einem humanen soliden Tumor, einschließlich Angiosarkom, Brustkarzinom, Zökumkarzinom, Kolonkarzinom, Hodgkin Lymphom, Lymphom, Lungenkarzinom, Melanom, Osteosarkom, Eierstockkarzinom, Parotistumor, Pharynxkarzinom, Karzinom des Rektums und Sigmas, mit einem therapeutischen Protokoll der multiplen Verabreichung eines erfindungsgemäßen Immunkonjugats behandelt. Das Immunkonjugat umfasst einen erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAb oder ein Fragment hiervon, der bzw. das an mindestens einen Angiogeneseinhibitor oder an mindestens ein Antitumormittel gekoppelt ist. Das Immunkonjugat kann weiterhin ein pharmazeutisch akzeptables Trägermedium umfassen. Bei einer weiteren Ausführungsform wird der humane Patient mit nichtkonjugiertem Anti-Endoglin-MAb (oder einem Fragment hiervon), gefolgt von der Verabreichung eines Anti-hEDG-MAb- Immunkonjugats (oder eines Fragments hiervon) gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt. Der nichtkonjugierte Anti-Endoglin-MAb (oder ein Fragment hiervon) kann weiterhin ein pharmazeutisch akzeptables Trägermedium umfassen.
  • Ein Fachmann ist sich darüber bewusst, dass das therapeutische Protokoll in Abhängigkeit von dem verwendeten Angiogeneseinhibitor oder Antitumormittel zusätzliche Schritte erfordern kann. Wenn beispielsweise das verabreichte Immunkonjugat ein Anti-hEDG (oder ein Fragment hiervon) umfasst, das an einen Photosensibilisator (meistens Porphyrine) konjugiert ist, ist ein weiterer Schritt der Bestrahlung des Zielbereichs mit Licht erforderlich.
    • Beispiel 7
  • In den Beispielen 3 bis 5 wurde die Verabreichung des Anti-Endoglin- Immunkonjugats als neuer und wirksamer Ansatz der antiangiogenetischen Therapie gezeigt, bei der der Anti-Endoglin-MAb verwendet wird, um Therapien zielgenau gegen Tumorgefäßsysteme oder die bei mit der Angiogenese assoziierten Krankheiten vorhandene, exzessive Gefäßbildung zu richten. Während der monoklonale Antikörper, der benutzt wird, um die Wirksamkeit der antiangiogenetischen Therapie zu veranschaulichen, ein muriner monoklonaler Antikörper ist, wird von Fachleuten erkannt, dass solche murinen MAbs unter Verwendung von Standardtechniken des Stands der Technik modifiziert ("engineered") werden können (z. B. wie von Adair, 1992, Immunological Reviews 130: 6-37, berichtet, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird).
  • Beispielsweise können murine monoklonale Antikörper "vermenschlicht" werden, indem Bereiche des murinen monoklonalen Antikörpers durch die äquivalente humane Sequenz ersetzt werden. Bei einer Ausführungsform wird ein hybrider Antikörper konstruiert. Die Konstruktion von hybriden Antikörpern ist jetzt ein unkompliziertes Verfahren (Adair, 1992, s.o., Seite 13), bei dem der hybride Antikörper hergestellt wird durch Zusammenfügen des murinen variablen Bereichs mit einem humanen konstanten Bereich. Des weiteren können hybride Antikörper hergestellt werden durch Zusammenfügen der hypervariablen Bereiche des murinen monoklonalen Antikörpers mit humanen konstanten Bereichen und Teilen von humanen variablen Bereichen unter Verwendung von einer von mehreren im Stand der Technik bekannten Techniken. Techniken zum Konstruieren von hybriden Antikörpern (murin-human) mit therapeutischem Potential wurden bereits beschrieben (siehe z. B. Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851- 6855; Larrick et al., 1991, Hum. Antibod. Hybridomas 2: 172-189, hier durch Bezugnahme aufgenommen). So wird bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren der murine variable Bereich des erfindungsgemäßen Anti-Endoglin-MAb mit einem humanen konstanten Bereich zur Bildung eines hybriden Anti-Endoglin- Antikörpers mit der gleichen Spezifizität wie der Anti-Endoglin-MAb zusammengefügt. Im allgemeinen beschränkt die "Vermenschlichung" eines murinen MAb, wie durch die Herstellung eines hybriden Antikörpers, die Entwicklung der humanen Anti-Maus-Antikörper-Reaktionen. Des weiteren ändern "vermenschlichte" Antikörper im allgemeinen die Pharmakokinetik, indem sie den einen solchen Antikörper enthaltenden Immunkonjugaten eine längere Halbwertzeit im Vergleich zu der Halbwertzeit der Immunkonjugate, die einen murinen Antikörper enthalten, verleihen.
  • Ein hybrider MAb kann auch unter Verwendung einer Standardkombination von Techniken, einschließlich Polymerasekettenreaktion (PCR), dem Klonen von variablen Antikörperbereichen, der Verwendung von geeigneten Expressionsvektoren, die bereits die DNA enthalten, die für den humanen konstanten Bereich codiert, das Insertieren der DNA für den variablen murinen MAb-Bereich in einen solchen Vektor unter Bildung eines rekombinanten Vektors und Expression des sich ergebenden hybriden Antikörpers durch ein den rekombinanten Vektor enthaltendes Expressionssystem (siehe z. B. Daugherty et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476; Maeda et al., 1991, Human Antibodies and Hybridomas 2: 124- 134, hier durch Bezugnahme aufgenommen) konstruiert werden. Ein Expressionsvektor kann verwendet werden, wobei der Vektor so konstruiert ist, dass die Gene des variablen Bereichs und des konstanten Bereichs in Tandemanordnung sind. Alternativ wird die für den murinen variablen Bereich codierende DNA in einen Expressionsvektor insertiert und die für den humanen konstanten Bereich codierende DNA kann in einen zweiten Expressionsvektor insertiert werden, gefolgt von Transfektionen unter Verwendung von sowohl dem ersten als auch dem zweiten Expressionsvektor. Expressionssysteme, die Fachleuten für die Herstellung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten bekannt sind, umfassen Säugerzellen (z. B. Zellinien wie COS, NSO oder CHO, Phagenexpressionsbibliotheken, Escherichia coli und Hefe (Adair, 1992, s.o.).
  • Die vorliegenden Ausführungsformen und Beispiele sind in jeglicher Hinsicht als veranschaulichend und nicht beschränkend anzusehen, und alle Änderungen, die unter die Bedeutung und den Umfang der Äquivalenz der Ansprüche fallen, sollen deshalb als von ihnen umfasst angesehen werden.

Claims (20)

1. Monoclonaler Antikörper oder Fragment desselben mit detektierbarer Bindungsspezifität für Endoglin, exprimiert an proliferierenden humanen vasculären Endothelzellen, und Endoglin, exprimiert an proliferierenden murinen Endothelzellen, worin die Bindungsspezifität für Endoglin, exprimiert an proliferierenden murinen Endothelzellen, geringer als die Bindungsspezifität für Endoglin ist, exprimiert an proliferierenden humanen vasculären Endothelzellen.
2. Fragment des monoclonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1, worin das Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F(ab')&sub2;, Fab', Fab, Fv, Fd' und Fd.
3. Monoclonaler Antikörper oder Fragment gemäß Anspruch 1, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist, umfassend einen murinen variablen Bereich mit Anti-Endoglin-Bindungsspezifität sowohl für humanes Endoglin als auch für murines Endoglin und einen humanen konstanten Bereich.
4. Monoclonaler Antikörper oder Fragment gemäß Anspruch 1, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist, umfassend murine hypervariable Bereiche mit Anti- Endoglin-Bindungsspezifität sowohl für humanes Endoglin als auch für murines Endoglin und einen konstanten Bereich und variable Bereichssequenzen von humanem Immunglobulin.
5. Zubereitung für die antiangiogene therapeutische Behandlung einer Angiogeneseverbundenen Erkrankung in einem Säuger als Wirt, worin die Zubereitung eine therapeutisch wirksame Menge eines Immunkonjugats, gebildet aus einem monoclonalen Antikörper oder einem Fragment desselben gemäß Anspruch 1, konjugiert an ein Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Angiogeneseinhibitor und einem Antitumormittel, enthält.
6. Zubereitung gemäß Anspruch 5, worin das Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F(ab')&sub2;, Fab', Fab, Fv, Fd' und Fd.
7. Zubereitung gemäß Anspruch 5, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist, umfassend einen murinen variablen Bereich mit Anti-Endoglin-Bindungsspezifität sowohl für human Endoglin als auch murines Endoglin und einen humanen konstanten Bereich.
8. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das Mittel ein Antitumormittel ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Ricin A-Kette und einer deglycosylierten Ricin A-Kette.
9. Verwendung eines Immunkonjugats, gebildet aus einem monoclonalen Antikörper oder einem Fragment desselben gemäß Anspruch 1, konjugiert an ein Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Angiogeneseinhibitor und einem Antitumormittel, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung für die antiangiogene Therapie eines Tumors in einem Säuger als Wirt.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9, worin die Zubereitung an die intravenöse Verabreichung angepasst ist.
11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin das Mittel ein Antitumormittel ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Ricin A-Kette und der deglycolysierten Ricin A-Kette.
12. Verwendung eines monoclonalen Antikörpers oder eines Fragments desselben gemäß Anspruch 1 filz die Herstellung eines zweiteiligen Pharmazeutikums fit die antiangiogene Therapie einer Angiogenese verbundenen Erkrankung in einem Säuger als Wirt, wobei das Pharmazeutikum für die sequentielle Verabreichung umfasst:
(a) eine Zubereitung, umfassend den monoclonalen Antikörper oder ein Fragment desselben gemäß Anspruch 1 in unkonjugierter Form; und
(b) eine Zubereitung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Immunkonjugats, gebildet aus dem monoclonalen Antikörper oder dem Fragment desselben gemäß Anspruch 1, konjugiert an ein Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Angiogeneseinhibitor und einem Antitumormittel.
13. Verwendung gemäß Anspruch 12, worin das Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F(ab')&sub2;, Fab', Fab, Fv, Fd' und Fd.
14. Verwendung gemäß Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin der Antikörper ein chimärer Antikörper ist, umfassend einen murinen variablen Bereich mit Anti-Endoglin- Bindungsspezifität sowohl für human Endoglin als auch murines Endoglin und einen humanen konstanten Bereich.
15. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, worin jede der Zubereitungen ein pharmazeutisch annehmbares Trägermedium umfasst.
16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, worin jede der Zubereitungen an die intravenöse Verabreichung angepasst ist.
17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, worin das Mittel ein Antitumormittel ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Ricin A-Kette und einer deglycosylierten Ricin A-Kette.
18. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, worin das Mittel ein Angiogeneseinhibitor ist.
19. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 18, worin die Angiogenese verbundene Erkrankung einen Tumor umfasst.
20. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 18, worin die Angiogenese verbundene Erkrankung eine andere Erkrankung als ein Tumor ist.
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