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ES2253734T3 - Exotoxina recombinante de pseudomonas: construccion de una inmunotoxina activa con efectos secundarios bajos. - Google Patents

Exotoxina recombinante de pseudomonas: construccion de una inmunotoxina activa con efectos secundarios bajos.

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Publication number
ES2253734T3
ES2253734T3 ES93113917T ES93113917T ES2253734T3 ES 2253734 T3 ES2253734 T3 ES 2253734T3 ES 93113917 T ES93113917 T ES 93113917T ES 93113917 T ES93113917 T ES 93113917T ES 2253734 T3 ES2253734 T3 ES 2253734T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
exotoxin
modified
toxin
pseudomonas
vehicle
Prior art date
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Expired - Lifetime
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ES93113917T
Other languages
English (en)
Inventor
Ira Pastan
David J. Fitzgerald
Sankar Adhya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adidas AG
Original Assignee
Adidas Sportschuhfabriken Adi Dassier Stiftung and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adidas Sportschuhfabriken Adi Dassier Stiftung and Co KG filed Critical Adidas Sportschuhfabriken Adi Dassier Stiftung and Co KG
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A VARIAS FORMAS MODIFICADAS DE EXOTOXINAS DE PSEUDOMONAS QUE POR SI MISMAS PRESENTAN UNA BAJA TOXICIDAD A LAS CELULAS HUMANAS O ANIMALES PERO QUE RETIENEN SU ACTIVIDAD ENZIMATICA. LA EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS MODIFICADA DE LA PRESENTE INVENCION TIENE UNA ACTIVIDAD DE RIBOSILACION DE ADP PERO LE FALTA TODO O PARTE DEL DOMINIO II (RESPONSABLE DE LA TRANSUBICACION A TRAVES DE LA MEMBRANA CELULAR) DE LA TOXINA NATIVA. UNA EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS MODIFICADA PREFERENTE DE LA PRESENTE INVENCION CONTIENE ADEMAS UNA MODIFICACION EN EL DOMINIO IA AGLUTINANTE RECEPTOR DE LA TOXINA NATIVA. TAMBIEN SE PRESENTAN CONJUGADOS (INMUNOTOXINAS) QUE CONTIENEN LA EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS MODIFICADA Y UN PORTADOR OBJETIVO, TAL COMO UN ANTICUERPO O UNA HORMONA DE CRECIMIENTO, LOS METODO PARA LA PRODUCCION DE LA EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS MODIFICADA O DE CONJUGADOS DE LA MISMA Y LAS COMPOSICIONES ADECUADAS PARA SER ADMINISTRADAS A MAMIFEROS PARA ALCANZAR LA ACTIVIDAD DE LA CITOTOXINAOBJETIVO.

Description

Exotoxina recombinante de pseudomonas: construcción de una inmunotoxina activa con efectos secundarios bajos.
Antecedentes de la invención
Las toxinas son agentes destructores celulares extremadamente potentes que son responsables de muchas enfermedades humanas. Debido a su elevada actividad, estos agentes han sido unidos a anticuerpos monoclonales con el fin de formar agentes citotóxicos (inmunotoxinas) que se unan específicamente a células diana. Estas inmunotoxinas son, por tanto, muy útiles en la terapia del cáncer.
La exotoxina A de Pseudomonas (PE) es una proteína monomérica extremadamente activa (66 kd de peso molecular), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis de proteínas en células eucarióticas a través de la inactivación del factor de elongación 2 (EF-2) mediante la catalización de su ADP-ribosilación (catalización de la transferencia del resto ADP ribosilo del NAD oxidado al EF-2).
Se cree que el proceso de intoxicación se desarrolla mediante las etapas siguientes: En primer lugar, la PE se une a las células a través de un receptor específico en la superficie celular. A continuación, el complejo PE-receptor es internalizado en la célula. Finalmente, la PE es transferida al citosol donde inhibe enzimáticamente la síntesis de proteína. Se cree que el proceso de transferencia tiene lugar desde un compartimento ácido, ya que la intoxicación celular es impedida por bases libres tales como NH_{4}^{+}, que eleva el pH en las vesículas ácidas. Después de la exposición a condiciones ácidas, el dominio hidrofóbico de PE entra en la membrana, teniendo como resultado la formación de un canal a través del cual el dominio enzimático, en forma extendida, pasa hacia el citosol.
Gray y col., PNAS, 81 (1984), 2645 a 2649 se refieren al clonaje, a la secuencia de nucleótidos y a la expresión en E. coli del gen estructural de la exotoxina A de P. aeruginosa. D1 describe la expresión recombinante en E. coli de proteínas de fusión de beta-galactosidasa que comprenden los residuos de aminoácidos 308 a 613 y 492 a 613, respectivamente, de la exotoxina A de P. aeruginosa. Se ha encontrado que ambas proteínas de fusión presentan actividad de ADP-ribosilación.
La Patente de EE.UU. 4.545.985 describe que la toxina de Pseudomonas puede ser acoplada químicamente a un anticuerpo o a un factor de crecimiento. Sin embargo, estas toxinas ligadas químicamente han demostrado tener niveles indeseables de toxicidad. Sería útil, por tanto, tener toxinas muy dirigidas a tipos celulares específicos sin la destrucción celular generalizada asociada normalmente con estas toxinas.
Las inmunotoxinas que contienen PE son construidas haciendo reaccionar primeramente PE nativa con iminotiolano. Esta reacción sirve para introducir dos nuevos grupos sulfhidrilo utilizados para acoplar un anticuerpo a la toxina, y para inactivar la unión de PE a su propio receptor. Esta abordaje se basa en la inactivación química de los sitios de unión de PE con el fin de minimizar los efectos colaterales indeseables debidos a la unión de PE a las células que tienen receptores de PE. Aunque este abordaje ha tenido un éxito razonable para producir un reactivo destructor de células específicas en cultivo de tejidos y en ratones portadores de tumores, no ha sido posible administrar más de
2 \mug de inmunotoxina PE a un ratón de 20 gramos o más de 1 mg a un mono de 3 kilogramos, o más de 4 mg a un humano adulto, debido a los efectos colaterales tóxicos de la inmunotoxina. Es por tanto deseable poder administrar mayores cantidades de inmunotoxinas para conseguir una mayor destrucción de células tumorales. La presente invención satisface este deseo proporcionando una inmunotoxina con una elevada potencia y una baja toxicidad. Además, para superar la dependencia anteriormente indicada de la inactivación química de los sitios de unión de PE, la presente invención incorpora técnicas de ADN recombinante para clonar el gen de la toxina completa (o segmentos del mismo) con el fin de expresar a niveles elevados la molécula de toxina de longitud completa (o porciones de la misma) conteniendo diferentes dominios funcionales, incluyendo uno que carece del dominio de unión a las células. Ver el Ejemplo 1 para un examen comparativo de estos clones.
La estructura tridimensional de PE ha sido determinada mediante cristalografía de rayos-x. Según se muestra en la Figura 2, la molécula de PE contiene tres dominios estructuralmente distintos: el Dominio I contiene los residuos de aminoácidos 1 a 252 (Dominio Ia) y 365 a 404 (Dominio Ib); el Dominio II contiene los residuos de aminoácidos 253 a 364; y el Dominio III contiene los residuos de aminoácidos 405 a 613.
Se han construido plásmidos que expresan diferentes porciones de la molécula de PE, proporcionando la capacidad de correlacionar diferentes dominios estructurales con diferentes actividades funcionales y de determinar (1) qué porciones de la molécula son responsables del reconocimiento celular (unión), (Dominio Estructural I, aminoácidos 1-252); (2) qué porción se requiere para la actividad enzimática (actividad de ADP-ribosilación, Dominio III más una porción del Dominio Ib) (aminoácidos 385-613); (3) qué porción es responsable de la translocación a través de la membrana celular (Dominio II). La evidencia de que el Dominio Estructural Ia está implicado en el reconocimiento celular es que las proteínas producidas por plásmidos sin el Dominio Ia pero conteniendo los Dominios II, Ib y III, no son citotóxicas por sí mismas y no muestran inhibición competitiva de la citotoxicidad de las toxinas intactas, mientras que un plásmido que codificaba el Dominio Ia, pero que carecía de los demás dominios, bloqueaba la citotoxicidad de PE en células sensibles. La PE de plásmidos con una deleción de la primera mitad del Dominio Estructural II presentan actividad bloqueante de PE y actividad de ADP-ribosilación, pero estas moléculas han perdido toda actividad destructora de células. Los plásmidos que codifican solamente el Dominio Estructural III producen grandes cantidades de la proteína, pero carecen de actividad enzimática detectable (ADP-ribosilación). Sin embargo, plásmidos que codifican todo el Dominio Estructural III más aminoácidos adyacentes del Dominio Estructural Ib, expresan grandes cantidades de la proteína y su actividad de ADP-ribosilación es elevada.
Sobre la base de la estructura tridimensional de PE, se han construido plásmidos que expresan diferentes porciones de PE. El patrón de proteínas de las células que expresan las diferentes construcciones fue analizado mediante electroforesis en gel de SDS y se midió la actividad de ADP-ribosilación de las toxinas recombinantes. De estos plásmidos (descritos en el Ejemplo 1), el plásmido pJH8, que contenía los aminoácidos 253 a 613 (Dominios Ib, II y III), y el plásmido pJH17, que contenía los aminoácidos 385 a 613 (Dominio III, más 20 aminoácidos adyacentes del Dominio Ib), eran capaces de codificar grandes cantidades de PE modificada que presentaba una baja toxicidad para células humanas, pero que permanecía muy activa desde el punto de vista enzimático.
Tomados en conjunto, los patrones de los plásmidos indican que el Dominio Estructural Ia es un dominio de unión a receptores, que se requiere la primera mitad del Dominio Estructural II para la translocación de la toxina desde una vesícula endocítica de la célula huésped al citosol, y que el Dominio Estructural III solo no es suficiente para expresar la actividad de ADP-ribosilación completa.
Cuando se administra a animales, la PE produce de forma característica la muerte debido a una insuficiencia hepática. Las inmunotoxinas producidas con PE también atacan al hígado y, cuando se administran en grandes cantidades, producen la muerte debido a toxicidad hepática. Los experimentos mostrados en la Tabla III indican que el Dominio Ia es responsable de la unión a las células e indican que una molécula de PE en la que se ha eliminado el Dominio Ia, es menos tóxica para los ratones que la PE nativa. Los datos mostrados en el Ejemplo 4 apoyan esta conclusión, indicando que la PE modificada es al menos 200 veces menos tóxica para los ratones que la PE nativa. El Ejemplo 5 muestra que cuando la proteína producida por pJH6 es purificada y acoplada a un anticuerpo hacia el receptor de transferrina humano, se crea una inmunotoxina que es aproximadamente igual de activa que una inmunotoxina conteniendo la PE nativa, pero es 100 veces menos tóxica para las células no diana (células de ratón).
Un aspecto de la presente invención es, por tanto, que moléculas de PE con una deleción del Dominio Ia son inmunotoxinas eficaces con efectos colaterales disminuidos, incluyendo una toxicidad hepática disminuida.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un conjugado vehículo vectorizante-toxina adecuado para ser utilizado con humanos o mamíferos, que comprende una toxina fusionada a un vehículo vectorizante, donde dicha toxina es una exotoxina de Pseudomonas modificada seleccionada de:
(i)
una exotoxina que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 30 y 308 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas;
(ii)
una exotoxina que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 252 y 308 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas; y
(iii)
una exotoxina que comprende los residuos de aminoácidos 385 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas.
En una realización de la invención, dicho vehículo vectorizante es un antígeno, un anticuerpo, un factor de crecimiento, una hormona, una linfoquina, una proteína de reconocimiento celular polipeptídica, una proteína sérica, una proteína sérica modificada, una endorfina, una asialoglicoproteína, insulina, glucagón, hormona luteinizante, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, hormona estimulante de melanocitos, bombesina o una lectina.
En otra realización, dicho vehículo vectorizante es interleuquina-2, factor de crecimiento transformante alfa o una hormona peptídica.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una inmunotoxina adecuada para ser utilizada con humanos o animales, que comprende una toxina fusionada a un anticuerpo capaz de reconocer células de una enfermedad o células causantes de una enfermedad, donde dicha toxina es una exotoxina de Pseudomonas modificada según se definió anteriormente.
De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporciona un plásmido de expresión que comprende un ADN que codifica los conjugados vehículo vectorizante-toxina.
De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona una célula huésped que comprende dicho plásmido.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona una célula huésped que contiene ADN que codifica los conjugados vehículo vectorizante-toxina.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un proceso para producir dicha inmunotoxina, que comprende:
(i)
la transfección de una célula huésped adecuada con un plásmido que codifica la exotoxina de Pseudomonas modificada según se definió anteriormente;
(ii)
el cultivo de dicha célula huésped bajo condiciones tales que se produzca la exotoxina de Pseudomonas modificada; y
(iii)
la conjugación de dicha exotoxina modificada con un anticuerpo para producir una inmunotoxina.
En una realización de la invención, dicha exotoxina de Pseudomonas modificada comprende los residuos de aminoácidos 385 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un proceso para producir dicho conjugado vehículo vectorizante-toxina, que comprende la transfección de una célula huésped adecuada con un plásmido que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho conjugado vehículo vectorizante-toxina, y el cultivo de dicha célula huésped bajo condiciones tales que se produzca un conjugado vehículo vectorizante-exotoxina de Pseudomonas.
De acuerdo con un aspecto más, se proporciona una composición adecuada para ser administrada a un mamífero con el fin de conseguir una actividad citotóxica vectorizada en dicho mamífero, donde la composición contiene dicho conjugado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona la utilización de dicho conjugado para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la construcción de los plásmidos de la presente invención utilizados para la expresión de diferentes dominios de PE.
La Figura 2 es un mapa simplificado de las moléculas de PE de diferentes tamaños producidas como parte de la presente invención.
La Figura 3 muestra el efecto de PE_{45}-HB21 y PE-HB21 sobre la síntesis de proteínas en células KB humanas. PE_{45} es la toxina proteica que carece del Dominio I codificada por el plásmido pJH8. Las células fueron incubadas durante 24 horas con la inmunotoxina apropiada y posteriormente incubadas con ^{3}H-leucina durante 1 hora. Se midió la incorporación de la (^{3}H)-leucina en las proteínas. En el Panel 3B, células Swiss 3T3 fueron incubadas durante 24 horas con la toxina de Pseudomonas nativa (PE), con la toxina de Pseudomonas nativa acoplada a HB21, con PE_{45} sola o con PE_{45} acoplada a HB21. Las células fueron expuestas a estos agentes durante 24 horas y posteriormente se midió la síntesis de proteínas durante 1 hora igual que anteriormente.
Descripción específica de la invención
En la realización preferida, la presente invención es la producción de una forma modificada de la exotoxina de Pseudomonas (PE), en la que la modificación tiene como resultado una inmunotoxina activa. La toxina modificada y la inmunotoxina producida a partir de la misma tienen una toxicidad no específica notablemente disminuida sobre células humanas y de ratón en cultivo de tejidos y una toxicidad enormemente disminuida en ratones
in vivo.
El ADN genómico es obtenido mediante digestión completa de una cepa de Pseudomonas aeruginosa con EcoRI y PstI. Aunque cualquier cepa de P. aeruginosa es adecuada para ser utilizada en esta invención, la cepa preferida es PA103, una cepa que produce una gran cantidad de toxina activa. Se aíslan de la biblioteca de ADN genómico fragmentos de ADN que varían en tamaño de 2,6 a 2,9 kb y se ligan con un fragmento de ADN de 2,7 kb procedente del plásmido pUC13 cortado con EcoRI y PstI. El plásmido pUC13 está disponible comercialmente en Boehringer Mannheim. Un huésped adecuado, preferiblemente una cepa de E. coli, es transformado posteriormente con los productos ligados (la cepa preferida de E. coli es HB101, disponible comercialmente en Bethesda Research Laboratories). El fragmento de ADN de 2,7 kb derivado de ptoxETA, un plásmido que contiene el gen estructural de PE, fue utilizado como sonda y se preparó y caracterizó mediante transferencia Southern ADN plasmídico de varias colonias positivas. Los diferentes tamaños de las PE recombinantes son posteriormente expresados en un huésped adecuado. Se prefiere un huésped que lleve el gen de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 en forma lisogénica e inducible [BL21(DE_{3})], y puede obtenerse del Dr. F.W. Studier de los Brookhaven National Laboratories. Se prefieren también plásmidos que lleven el promotor tardío del bacteriófago T7 y AMP^{r} y la secuencia de Shine-Dalgarno - -pAR2156, que puede obtenerse también del Dr. Studier.
Según se muestra en los Ejemplos, los plásmidos preferidos son pJH8 y pJH17. El pJH8 contiene un fragmento de ADN de 5,1 kb y es capaz de expresar los Dominios II, Ib y III de PE. Este plásmido es producido cortando parcialmente el plásmido pJH4 con AvaI. El fragmento de ADN linealizado es posteriormente cortado completamente con HindIII con el fin de obtener un fragmento de ADN de 5,1 kb que tiene en sus extremos sitios de AvaI y HindIII. Este fragmento es incubado posteriormente con nucleasa S1 para eliminar sus extremos cohesivos, seguido por ligadura con ligasa de T4 para formar el plásmido pJH8.
El plásmido pJH17 contiene un fragmento de ADN de 4,8 kb y es capaz de expresar el Dominio III con los 20 aminoácidos adyacentes de PE. Este plásmido es producido cortando completamente el plásmido pJH4 con HindIII y ApaI. El fragmento de ADN de 4,8 kb es posteriormente aislado e incubado con ADN polimerasa I Klenow y dNTP para rellenar los extremos cohesivos, seguido por ligadura con ligasa de T4.
Expresión de toxinas recombinantes en BL21(DE_{3})
BL21(DE_{3}) que contiene plásmidos para la expresión de diferentes tamaños de PE es cultivada en caldo LB con
50 \mug de ampicilina/ml a 37ºC. Cuando la absorbancia a 650 nm alcanza 0,3, se añade al cultivo IPTG (isopropil beta-D-tio-galactopiranósido) a una concentración final de 1 mM. Las células son recogidas 90 minutos más tarde y analizadas para determinar la cantidad de toxinas recombinantes mediante SDS-PAGE, inmunotransferencia, ADP-ribosilación y experimentos de destrucción celular.
SDS-PAGE e inmunotransferencia
Los aglutinados celulares son disueltos en tampón de Laemmli. Las muestras son llevadas a ebullición durante 5 minutos antes de su aplicación a un bloque de gel de SDS 0,1%, acrilamida 10%. Para la inmunotransferencia, las muestras, después de la electroforesis, son transferidas a un papel de nitrocelulosa, seguido por la reacción con anticuerpos hacia PE, posteriormente con un segundo anticuerpo (anti-conejo de cabra) y tinción. El anticuerpo hacia PE es obtenido mediante la hiperinmunización de conejos con PE reaccionada con glutaraldehído (0,2%) (250 \mug de PE por inyección). Se preparó una fracción de IgG para la inmunotransferencia.
Ensayo de la actividad de ADP-ribosilación
Se utilizan procedimientos conocidos para el ensayo de la actividad de ADP-ribosilación. Brevemente, preparaciones de reticulocitos de conejo o extractos de germen de trigo enriquecidos con el factor de elongación 2 (EF-2) son utilizados como fuente de EF-2. Los ensayos (volumen total 500 \mul) contienen 10 pmoles de EF-2 aproximadamente, 37 pmoles de ^{14}C-NAD (0,06 \muCi), de 0,25 a 1,25 \mug de PE y tampón (DTT 40 mM, EDTA 1 mM y Tris 50 mM, pH 8,1). La actividad es medida como pmoles de NAD transferidos a EF-2 en 30 minutos. Se establece una curva estándar de concentraciones conocidas de PE y se utiliza para determinar la actividad de PE en extractos de E. coli. Después de incubación durante 30 minutos a 37ºC, se añaden a cada mezcla de ensayo 0,5 ml de TCA al 12%. Las mezclas de ensayo son posteriormente colocadas en un baño de hielo durante 15 minutos, seguido por centrifugación a 4ºC,
3.000 xg durante 10 minutos. La pella es lavada con 1 ml de TCA al 6% y centrifugada igual que anteriormente. La pella es posteriormente medida para determinar la radiactividad de ^{14}C en un contador de centelleo líquido como índice de la actividad de ADP-ribosilación.
Ensayo de citotoxicidad celular
Se realizan ensayos de la actividad citotóxica de la PE modificada en cultivos de células NIH 3T3 y de células KB humanas. Las células NIH 3T3 o las células KB son sembradas 24 horas antes del ensayo de citotoxicidad en una placa para cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 2 x 10^{4} células por pocillo. Después de incubación durante 48 horas con varias concentraciones de PE o de extractos de proteína aislados de BL21(DE_{3}) con plásmidos que expresan diferentes tamaños de PE, las monocapas son teñidas con azul de metileno para detectar las células supervivientes. Los resultados están mostrados en la Tabla 1.
Inhibición de la síntesis de proteínas
Se realizan ensayos para determinar la inhibición de la síntesis proteínas por PE o PE con extractos de BL21(DE_{3})/pJH8 en cultivos de células Swiss 3T3. Las células Swiss 3T3 son sembradas un día antes del ensayo en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 10^{5} células por pocillo. Las células son lavadas una vez mediante la sustitución del medio por DMEM y un 0,2% de BSA antes de añadir PE (100 ng/ml) o PE (100 ng/ml) con extractos que contenían una cantidad en exceso de diferentes tamaños de PE (Tabla 2). Después de 15 minutos a 37ºC, el medio es posteriormente retirado y sustituido por DMEM y BSA 0,2% frescos. Cuatro horas más tarde, se analiza la tasa de síntesis de proteínas mediante la adición al medio de [^{3}H]-leucina (a una concentración final de 2-4 \muCi/ml) durante
1 hora.
En la realización preferida de la invención, el dominio estructural del gen de la exotoxina de Pseudomonas es insertado en un vector de expresión de T7 corriente abajo del sitio de unión de ribosomas y su codón de inicio ATG acompañante (como se muestra en la Figura 1), según se describió anteriormente. Para producir proteínas recombinantes, las células son cultivadas a 37ºC hasta una A_{650} = 0,3. Se añade posteriormente IPTG a 1 mM para inducir la ARN polimerasa de T7 y se incuba durante 2 horas. Se produce una serie de plásmidos, según se muestra en el Ejemplo 1.
A continuación, se construye un clon que codifica una molécula de PE sin secuencia líder (pJH4) y en la que una metionina está situada adyacentemente a la alanina en el extremo amino de la forma procesada de la PE nativa (Tabla 1). La proteína producida por pJH4 es denominada Met-PE. Se producen grandes cantidades de Met-PE después de la inducción por IPTG, representando el 20% de la proteína celular total. Se encuentra en el sobrenadante una actividad de ADP-ribosilación equivalente a 0,1 mg de PE nativa, y de 0,2 mg en la pella, por mg de proteína celular total. La molécula de PE producida por pJH4 difiere de las moléculas de PE nativa por la presencia de un residuo de metionina extra en el extremo amino.
El pJH8, producido a partir de pJH4 según se indicó anteriormente, expresa una proteína en la que se ha eliminado la mayor parte del Dominio Ia (conservando solamente la metionina añadida y tres aminoácidos en el extremo amino). La inmunotransferencia muestra que esta proteína tiene 45 kd y es expresada a una concentración de 0,04 mg/mg de proteína celular aproximadamente. Se muestra una elevada actividad de ADP-ribosilación cuando se excluyen de la mezcla de reacción urea y DTT. En contraste con la PE nativa (en la que la adición de urea y DTT activa la actividad de ADP-ribosilación), la adición de urea y DTT a pJH8 reduce (en un 30% aproximadamente) la actividad de ADP-ribosilación.
Como la actividad de ADP-ribosilación de PE reside en el extremo carboxilo de la molécula, se produjo el plásmido pJH17, construido a partir de pJH4 (según se indicó anteriormente). Este plásmido contiene el Dominio III y 20 aminoácidos del Dominio Ib. Extractos de este plásmido contienen niveles elevados de actividad de ADP-ribosilación - -equivalente a 0,06 mg de PE (Tabla 1). Mediante inmunotransferencia, se detecta una proteína de 31 kd presente a una concentración de 0,03 mg/mg de proteína celular.
Ninguno de los plásmidos producidos mediante el proceso anteriormente indicado (y descrito en los Ejemplos), excepto pJH1, pJH2 y pJH4, presenta capacidad de destrucción celular significativa, aunque muchos de éstos presentan una elevada actividad enzimática (Tabla 1). Se ha demostrado que estos plásmidos impiden la inhibición de la síntesis de proteínas o de la destrucción celular por la PE nativa mediante la exposición de las células durante 15 minutos a PE nativa a 0,1 \mug/ml en presencia de 3-5 \mug/ml de varias toxinas modificadas. Los datos de la Tabla III muestran que los plásmidos que expresan el Dominio Ia solo, o el Dominio I, la mitad del Dominio II y el Dominio III impiden que la PE inhiba la síntesis de proteínas.
Toxicidad en animales
Los ratones que reciben PE nativa sucumben debido a la destrucción del hígado. La dosis letal para un ratón de 20 gramos es de 0,1-0,2 \mug. Los datos de la Tabla IV muestran que PE con una deleción del Dominio Ia presenta una toxicidad en ratones enormemente disminuida. Los ratones fueron inyectados I.P. con PE nativa o con PE que carecía del Dominio Ia. Todos los ratones que recibieron 1,0 \mug de PE nativa y la mitad de los ratones que recibieron
0,2 \mug de PE estaban muertos a las 48 horas. Dos de tres ratones que recibieron 50 \mug de PE Ia murieron; todos los que recibieron 20 \mug de PE Ia vivieron; y todos los ratones que recibieron 5 \mug de PE Ia vivieron. Por tanto, PE Ia es más de 100 veces menos tóxica, en términos de peso, que la PE nativa.
Fusiones de genes utilizando exotoxina de pseudomonas modificada recombinante
El gen que codifica la PE modificada de esta invención contenido específicamente en pJH8, fue fusionado con secuencias de ADN que codifican el factor de crecimiento transformante alfa humano (a-TGF) o interleuquina 2 humana (IL-2). Ver los Ejemplos 7 y 8 para los detalles de estas fusiones de genes. La PE modificada es adecuada para ser utilizada en fusiones con cualquier hormona peptídica, factor de crecimiento u otra proteína de reconocimiento celular polipeptídica para los que exista un receptor específico en las células. Unos cuantos ejemplos incluyen: insulina, glucagón, endorfinas, hormona de crecimiento, hormona estimulante de melanocitos, transferrina, bombesina, lipoproteína de baja densidad, hormona luteinizante y asiaoglicoproteínas.
Ejemplos Ejemplo 1
Según se muestra en la Tabla 1, el proceso de la presente invención fue utilizado para construir varios plásmidos que contenían fusiones de los diferentes tamaños del gen estructural de PE y el promotor tardío de T7. El pJH2 contiene el gen estructural de PE intacto con un segmento que codifica una secuencia líder modificada delante. El pJH4 contiene el gen estructural intacto de PE con la adición de un codón de metionina en el extremo amino. El pJH7 contiene el gen que codifica el Dominio Estructural III de PE (aminoácidos 405-613). El pJH8 contiene el gen que codifica el Dominio Estructural II, Ib y III de PE (aminoácidos 253-613). El pJH13 codifica PE con una deleción de la primera mitad del Dominio Estructural II que incluye los aminoácidos 253-307. El pJH14 codifica el Dominio Estructural Ia de PE (aminoácidos 1-252). El pJH17 codifica el Dominio Estructural III con una secuencia adyacente adicional de 20 aminoácidos del Dominio Ib (aminoácidos 385-613).
El pJH1 fue construido cortando parcialmente el PE nativo (pE 0) con BamHI, y la forma lineal del ADN fue eluida y cortada completamente con EcoRI. El fragmento de ADN de 2,0 kb derivado de pE 0, que tenía BamHI y EcoRI en los dos extremos, fue luego insertado en pAR 2156, que había sido cortado completamente con BamHI y EcoRI.
El pJH2 fue construido cortando parcialmente pJH1 con BamHI. La forma lineal del ADN fue aislada y cortada completamente con NdeI. El fragmento de ADN de 610 kb fue reservado para construir pJH2 mediante la ligadura del mismo con el dúplice oligonucleotídico sintético
100
El pJH4 fue construido cortando parcialmente pJH2 con TaqI. El ADN linealizado (610 kb) fue aislado y cortado completamente con NdeI. El fragmento de ADN más grande (5,9 kb) fue separado y ligado con el dúplice oligonucleotídico sintético
101
El pJH7 fue construido cortando parcialmente pJH4 con AatII. El fragmento de ADN linealizado (5,9 kb) fue posteriormente cortado completamente con HindIII. El fragmento de ADN de 4,7 kb que tiene sitios de AatI y HindIII en sus extremos después de la separación fue incubado con nucleasa S1 para eliminar los extremos cohesivos, seguido por ligadura con ligasa de T4.
El pJH8 fue construido según está descrito en la Descripción Específica.
El pJH13 fue construido cortando parcialmente pJH4 con AvaI. El fragmento de ADN linealizado fue posteriormente cortado completamente con EcoRI. El ADN de 4,7 kb que tiene sitios de corte de AvaI y EcoRI en ambos extremos fue incubado con S1 para eliminar los extremos cohesivos (fragmento de ADN 1). El pJH4 fue cortado parcialmente con SalI. El fragmento de ADN linealizado fue posteriormente cortado completamente con EcoRI. El fragmento de ADN de 1,0 kb que tiene sitios de SalI y EcoRI en los extremos fue incubado con ADN polimerasa I Klenow y dNTP para rellenar los extremos cohesivos (fragmento de ADN 2). El fragmento de ADN 1 (4,7 kb) y el fragmento de ADN 2 (1,0 kb) fueron ligados a 4ºC durante una noche.
El pJH14 fue construido cortando parcialmente pJH4 con AvaI. El fragmento de ADN linealizado fue posteriormente cortado completamente con EcoRI. El ADN de 4,7 kb que tiene sitios de AvaI y EcoRI en sus extremos fue incubado con S1 para eliminar el extremo cohesivo, seguido por ligadura con ligasa de T4.
El pJH17 fue construido según está descrito en la Descripción Específica.
Ejemplo 2
La cantidad y la actividad de las toxinas recombinantes (producidas por los plásmidos descritos en el Ejemplo 1) fueron medidas mediante SDS-PAGE, ADP-ribosilación y por la capacidad de destrucción celular. Los resultados están tabulados en la Tabla 1.
Ejemplo 3
Se llevaron a cabo experimentos para examinar las características de la toxicidad recombinante de la presente invención. Los resultados están mostrados en la Tabla 2.
Ejemplo 4
Se determinó el efecto de varias deleciones sobre la síntesis de proteínas celular en presencia y ausencia de PE nativa. Los resultados están mostrados en la Tabla 3. El Dominio Estructural Ia (pJH14) y el Dominio Estructural I, la mitad de II y III (pJH13) fueron extraídos de la pella de células sonicadas con urea 8 M. Se utilizaron en cada ensayo 10 \mul de cada extracto, equivalentes a 3-5 \mug de proteínas recombinantes. Los Dominios Estructurales II, Ib y III (pJH8) estaban presentes en el sobrenadante de las células BL21(DE_{3})/pJH8 sonicadas. Se utilizaron 10 \mul de extracto, equivalentes a 2 \mug de toxina recombinante. Las células fueron tratadas según está indicado en la Tabla 3 durante 15 minutos con y sin PE nativa a 0,1 \mug/ml, seguido por lavado con 1 ml de DMEM; incubadas durante 4 horas en DMEM y BSA 0,2% e incubadas posteriormente con ^{3}H-leucina durante 1 hora.
Ejemplo 5
Según se muestra en la Tabla 4, la dosis que causaba la muerte en ratones fue determinada inyectando I.P. ratones Balb/c con varias cantidades de PE o de PE Ia contenidas en 1,0 ml de solución salina estéril y 10 mg/ml de albúmina humana estéril. Los animales fueron monitorizados diariamente durante dos semanas. Todas las muertes ocurrieron a las 48 horas.
Ejemplo 6
Según se muestra en la Figura 3, una inmunotoxina compuesta por la proteína de 45 kD producida por pJH8 conjugada mediante un enlace disulfuro a un anticuerpo hacia el receptor de transferrina humano (PE_{45}-HB21) destruye células humanas que expresan el receptor de transferrina (DI_{50} 3 ng/ml). Tiene poco o ningún efecto sobre células de ratón que no expresan el receptor de transferrina humano a 1000 ng/ml, mientras que la PE nativa conjugada mediante un enlace disulfuro a HB21 destruye de manera no específica células de ratón a una DI_{50} de 29 ng/ml. Los datos de la Figura 3 indican que la toxicidad no específica de PE_{45}-HB21 es 100 veces menor que la de PE-HB21.
Posteriormente se volvió a determinar el peso molecular de PE_{45}. Se encontró entonces que el peso molecular era de 40.000.
Ejemplo 7 Construcción del gen de fusión factor de crecimiento transformante alfa-PE
El pJH8 fue tratado con Tth 111I y con SphI con el fin de construir un plásmido más pequeño, pVC8, que tiene menos sitios de AvaII. El pVC8 fue cortado parcialmente con AvaII y ligado a un oligonucleótido sintético (30 pb) que contiene un sitio de STuI, un sitio de Tth 111I y un codón de parada, con el fin de crear pVC31. El pVC31 fue cortado con Tth 111I y rellenado con un fragmento Klenow, un fragmento de la ADN polimerasa, y ligado a un clon de extremos romos que contenía el gen del alfa-TGF (pVC33). El ADN del alfa-TGF, p-hTGF-10-295 (Derynck y col., Cell, 38:287-297 (1984)) fue cortado con EcoRI y BglI para dar un fragmento de 322 pb que fue aislado y cortado con Fnu 4HI y tratado con polimerasa de T4 para dar un fragmento de 152 pb que fue ligado a su vez a pVC31 para crear el gen de fusión PE-alfa-TGF. Cuando es expresado en E. coli B121, este plásmido produce una proteína que reacciona con anticuerpos hacia alfa-TGF y hacia PE y tiene un peso molecular de 51.000.
Ejemplo 8 Construcción del gen de fusión IL-2-PE
El pVC8 fue cortado con AvaII en la posición 1190, se aisló el fragmento de 3,6 kb, se rellenaron sus extremos de hebra sencilla con el enzima Klenow y se desfosforiló para producir el fragmento I. El clon PST-5 (Gallo y col., PNAS, 81:2543-2547 (1984)) fue cortado con PstI para producir un fragmento de IL-2 de 1 kD que fue cortado posteriormente con Bsp 1286 en las posiciones 105 y 669 y tratado con polimerasa de T4 para rellenar los extremos. El fragmento de 564 pb fue ligado al fragmento I para crear pHL-1 y transformado en células de expresión BL21. Después de la inducción, se produjo una proteína de 60 kD que reacciona con anticuerpos hacia IL-2 y hacia PE y contiene actividad de ADP-ribosilación.
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TABLA 1 Resumen de la cantidad y de la actividad de las toxinas recombinantes medidas mediante experimentos de SDS-PAGE, ADP-ribosilación y destrucción celular
Cantidad de PE por mg de proteína celular
Medida por Medida por Medida por
SDS-PAGE ADP-ribosilación* destrucción celular
(mg) (unidades) (unidades)
Total Sobrenadante Pella Sobrenadante Pella
pJH1 0,20^{a} N.D. N.D. N.D. N.D.
pJH2 0,20^{a} N.D. N.D. N.D. N.D.
pJH3 degradada <0,001 <0,001 N.D. N.D.
pJH4 0,20^{a} 0,10 0,20 <0,001 0,2
pJH5 degradada 0,15 0,02 N.D. N.D.
pJH6 degradada <0,001 <0,001 N.D. N.D.
pJH7 0,25^{o,a} <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
pJH8 0,04^{o,n} 0,66 0,04 <0,001 <0,001
pJH9 0,15^{a} 0,40 0,20 <0,001 <0,001
pJH10 0,15^{a} 0,40 0,15 <0,001 0,001
pJH11 0,25^{a} <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
pJH12 <0,01^{o,n} <0,001 <0,001 N.D. N.D.
pJH13 0,01 0,25 0,20 <0,001 <0,001
pJH14 0,30^{a} <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
pJH15 0,10^{a} 0,18 0,30 <0,001 <0,001
TABLA 1 (continuación)
Cantidad de PE por mg de proteína celular
Medida por Medida por Medida por
SDS-PAGE ADP-ribosilación* destrucción celular
(mg) (unidades) (unidades)
Total Sobrenadante Pella Sobrenadante Pella
pJH16 <0,01^{n} 0,02 N.D. N.D. N.D.
pJH17 0,03^{o,n} 0,06 <0,001 <0,001 <0,001
pJH18 <0,01^{n} 0,02 N.D. N.D. N.D.
* \begin{minipage}[t]{155mm}1 unidad de actividad de ADP-ribosilación o de actividad destructora de células es equivalente a la actividad de 1 mg de PE nativa. \end{minipage}
\begin{minipage}{155mm} N.D. = no determinado; a = agregado; o = positiva mediante Western; n = no visible en SDS-PAGE \end{minipage}
TABLA 2
Construcción Dominio presente Tamaño de la proteína
pJH4 met, I, II, III 68 kd
pJH7 III 28 kd
pJH8 II, Ib, III 45 kd
pJH13 I, mitad de II, III 63 kd
pJH14 Ia 32 kd
pJH17 20 a.a. de Ib, III 31 kd 
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TABLA 3
\hskip-1cm Incorporación de ^{3}H-leucina (cpm x10^{3})
Dominio Analizado sin PE con PE
(I, II, III)
ninguno 11,2 \pm 0,1 2,3 \pm 0,2
Ia 11,5 \pm 0,15 9,4 \pm 0,3
II, Ib y III 11,7 \pm 0,15 2,4 \pm 0,2
I, 1/2 de II, III 10,7 \pm 0,15 9,2 \pm 0,2
urea 8 M (10 \mul) 11,1 \pm 0,1 2,9 \pm 0,2 
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TABLA 4
Toxina Dosis (\mul) Muertes
PE_{45} \hskip5mm 50 2/3
PE_{45} \hskip5mm 20 0/3
PE_{45} \hskip6mm 5 0/3
PE \hskip5mm 10 3/3
PE \hskip4,5mm 1,0 3/3
PE \hskip4,5mm 0,3 3/3
PE \hskip4,5mm 0,2 1/3
PE \hskip4,5mm 0,1 0/3
Declaración de depósito
Los plásmidos siguientes han sido depositados en la American Type Culture Collection en Rockville, Maryland, bajo los números ATCC respectivos, antes del registro de esta solicitud, y en el momento de la emisión de esta solicitud como una patente serán mantenidos durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito o de cinco (5) años después de la última solicitud de tal depósito o durante la vida eficaz de la patente, cualquiera que sea su duración. Los depósitos serán sustituidos si los cultivos mutan o se convierten en no viables durante el periodo de depósito:
pJH12 ATCC 67205
pHL-1 ATCC 67206
pVC33 ATCC 67207
pJH8 ATCC 67208
pJH14 ATCC 67209
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Pastan, Ira
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 11710 Beall Mountain Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Potamac
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(D)
ESTADO: Maryland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20854
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\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Fitzgerald, David J.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1731 Ladd Street
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(C)
CIUDAD: Silver Spring
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Maryland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20902
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\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Adhya, Sankar
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1440 Kings Grant Street
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(C)
CIUDAD: Gaithersburg
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(D)
ESTADO: Maryland
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20878
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: "Exotoxina de Pseudomonas Recombinante: Construcción de una inmunotoxina activa con pocos efectos colaterales"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
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(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATGAAAAA 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTTTTTC A 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATGGCCGAA GAAGCTTT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAAAGCTTC TTCGGCCA 
\hfill
18

Claims (12)

1. Un conjugado vehículo vectorizante-toxina adecuado para ser utilizado con humanos o mamíferos que comprende una toxina fusionada a un vehículo vectorizante, en el que dicha toxina es una exotoxina de Pseudomonas modificada seleccionada de:
(i)
una exotoxina que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 30 y 308 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas;
(ii)
una exotoxina que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 252 y 308 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas; y
(iii)
una exotoxina que comprende los residuos de aminoácidos 385 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho vehículo vectorizante es un antígeno, un anticuerpo, un factor de crecimiento, una hormona, una linfoquina, una proteína de reconocimiento celular polipeptídica, una proteína sérica, una proteína sérica modificada, una endorfina, una asialoglicoproteína, insulina, glucagón, hormona luteinizante, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, hormona estimulante de melanocitos, bombesina o una lectina.
3. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho vehículo vectorizante es interleuquina-2, factor de crecimiento transformante alfa o una hormona peptídica.
4. Una inmunotoxina adecuada para ser utilizada con humanos o animales que comprende una toxina fusionada a un anticuerpo capaz de reconocer células de una enfermedad o células causantes de una enfermedad, donde dicha toxina es una exotoxina de Pseudomonas modificada según se definió en la reivindicación 1.
5. Un plásmido de expresión que comprende un ADN que codifica cualquiera de los conjugados vehículo vectorizante-toxina de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una célula huésped que contiene ADN que codifica cualquiera de los conjugados vehículo vectorizante-toxina de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Una célula huésped que comprende un plásmido de la reivindicación 5.
8. Un proceso para producir una inmunotoxina de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende:
(i)
la transfección de una célula huésped adecuada con un plásmido que codifica la exotoxina de Pseudomonas modificada según se definió en la reivindicación 1,
(ii)
el cultivo de dicha célula huésped bajo condiciones tales que se produzca la exotoxina de Pseudomonas modificada, y
(iii)
la conjugación de dicha exotoxina modificada con un anticuerpo para producir una inmunotoxina.
9. El proceso de la reivindicación 8, en el que dicha exotoxina de Pseudomonas modificada comprende los residuos de aminoácidos 385 a 613 de la exotoxina de Pseudomonas.
10. Un proceso para producir un conjugado vehículo vectorizante-toxina de acuerdo con la Reivindicación 1, que comprende la transfección de una célula huésped adecuada con un plásmido que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho conjugado vehículo vectorizante-toxina y el cultivo de dicha célula huésped bajo condiciones tales que se produzca un conjugado vehículo vectorizante-exotoxina de Pseudomonas.
11. Una composición adecuada para ser administrada a un mamífero para conseguir una actividad citotóxica vectorizada en dicho mamífero, donde la composición contiene un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Utilización de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
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