JP2960697B2 - 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 - Google Patents
組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造Info
- Publication number
- JP2960697B2 JP2960697B2 JP9135626A JP13562697A JP2960697B2 JP 2960697 B2 JP2960697 B2 JP 2960697B2 JP 9135626 A JP9135626 A JP 9135626A JP 13562697 A JP13562697 A JP 13562697A JP 2960697 B2 JP2960697 B2 JP 2960697B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- modified
- plasmid
- host cell
- exotoxin
- toxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 8
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 title abstract description 15
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 title abstract description 15
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 title abstract description 15
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 title abstract description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 31
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 28
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 claims description 15
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 12
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 7
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 claims description 4
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims 3
- 241000108056 Monas Species 0.000 claims 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims 1
- 238000005247 gettering Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 abstract description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 230000007890 cytotoxin activity Effects 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 95
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 9
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 8
- 101100321445 Arabidopsis thaliana ZHD3 gene Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 3
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical group NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000637 Melanocyte-Stimulating Hormone Substances 0.000 description 1
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000606416 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Acyltransferase PE Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000938 luteal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000034429 protein ADP-ribosylation Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-imine Chemical compound N=C1CCCS1 CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の背景】毒素は、ヒトの多くの病気の原因とな
る、きわめて強力な細胞破壊をおこすものである。その
強い活性のために、毒素は、標的細胞に特異的に結合す
る細胞傷害剤(イムノトキシン)を作るためにモノクロ
ーナル抗体に結合される。したがってこれらのイムノト
キシンはガン療法において、最も有益である。 【0002】シュードモナスエクソトキシンA(PE)
はきわめて活性が高い蛋白質モノマー(分子量66K
d)であり、緑膿菌(Pseudomonas aer
uginosa)によって分泌される。この蛋白質モノ
マーは、ペプチド鎖延長因子2(EF−2)のADPリ
ボシル化を触媒(酸化型NAD+ のADPリボース部分
のEF−2への転移を触媒)することにより、EF2の
不活化を通して真核細胞の蛋白合成を阻害するものであ
る。 【0003】毒に侵される過程は次の様に考えられてい
る。:まず、PEが細胞表面の特異的受容体により結合
する。次にPE−受容体複合体が細胞内に吸収される。
最終的に、PEは、細胞質ゾルに移行し、そこで酵素的
に蛋白合成を阻害する。酸性液胞のPHを上昇するNH
4+ の様な弱塩基によって、細胞の被毒が防がれている
ので、移行過程は酸性区域から起こると考えられてい
る。PEの疎水ドメインは酸性状熊に曝されることによ
って細胞膜内に入り込み、酵素ドメインが伸長した状態
で細胞質ゾルを通過する通路を形成する。 【0004】米国特許第4,545,985号は、シュ
ードモナストキシンが抗体又は成長因子に化学的に結合
できることを教示している。しかし、これらの化学的に
結合された毒素は好ましくないレベルの毒性しか示さな
い。従って、一般にこれらの毒素に伴われる細胞の破壊
を生じることなく、ある特殊の細胞タイプを標的として
高特異的に作用する毒素が得られれば有益なことであろ
う。 【0005】PEを含むイムノトキシンは、天然のPE
とイミノチオラン(iminothiolane)との
第1の反応で製造される。この反応は、抗体を毒素に結
合するのに役立つ2つの新しいスルフヒドリル基をもた
らすと共に、その結果PEがその固有の受容体に結合す
るのを不活化する。この考え方はPE受容体を持った細
胞にPEが結合するために生ずる好ましくない副作用を
最少限に抑制するため、PE結合部位を化学的に不活化
することにもとづいている。この考えは、組織細胞培養
液内の特異細胞破壊や腫瘍接種マウスにおいてはかなり
旨い考えだが、イムノトキンンの毒性副作用のために、
20グラムのマウスに対しては2μg、3Kgのモンキ
ーに対しては1mg、成人に対しては4mg以上投与す
ることができない。従って、腫瘍細胞のより大きな壊滅
を為し遂げるために、より大量のイムノトキシンを投与
できることが望まれる。本発明は、高い効能と低い毒性
を持ったイムノトキシンを提供することにより、この目
的を達成するものである。さらに、上記PE結合部位の
化学的不活化についての考えを克服するために、本発明
ではDNA組換えの技術を用いた。即ち、異なった機能
のドメインを含んだり、細胞結合ドメインを持っていな
い毒素分子の全長(又は、その部分)が高度に発現され
るように、DNA組換えのテクニックを用いて完全な毒
素遺伝子(又はその断片)のクローニングを行なった。
これらのクローンの比較実験を例1に示した。 【0006】PEの3次構造は、X線結晶学により決定
された。第2図に示すように、PE分子は、3つの構造
的に異なるドメインを有している。ドメインIはアミノ
酸残基を1〜252(ドメインIa)、365〜404
(ドメインIb)含んでいる;ドメインIIはアミノ酸残
基を253〜364含んでいる;ドメインIII はアミノ
酸残基を405〜613有している。 【0007】PE分子の種々の部分を発現するプラスミ
ドが作製されている。このプラスミドはPE分子の異な
った構造のドメインを種々の作用活性に関係付けること
を可能にし、および(1)分子のどの部分が細胞認識
(結合)に寄与しているか、(構造ドメインI、アミノ
酸1−252);(2)どの部分が酵素活性に必要であ
るか(ADPリボシル化活性、ドメインIII をドメイン
Ibの部分に加えたもの)(アミノ酸385−61
3);(3)どの部分が細胞膜を通ってトランスロケー
ションするのに寄与するか(ドメインII)を決定するこ
とを可能とする。 【0008】構造ドメインIaが細胞認識に関係してい
ることは、次の事実から明らかである。すなわち、ドメ
インIaを含まず、ドメインII、ドメインIb及びドメ
インIII を含むプラスミドにより生産された蛋白はそれ
自身による細胞傷害性を有さず、無傷の毒素の細胞傷害
性に対する拮抗阻害を示さないのに対して、ドメインI
aをコードし、かつ他のドメインをコードしないプラス
ミドは感受性細胞のPE細胞傷害性をブロックした。構
造ドメインIIの最初の半分を欠失して導入したプラスミ
ドから得られたPEは、ブロック活性とADPリボシル
化活性の両方を示す。しかし、これらの分子は細胞傷害
活性をすべて失っていた。横造ドメインIII のみをコー
ドするプラスミドは大量の蛋白を生産するが、この蛋白
は防御的酵素活性(ADPリボシル化)を失っていた。
しかし、構造ドメインIII の全部と構造ドメインIbに
近接したアミノ酸とをコードするプラスミドは、大量の
蛋白を発現し、かつそのADPリボシル化活性が高い。 【0009】PEの3次構造に基づき、PEの異なった
部分が発現されるようにプラスミドが作られる。異なっ
た構造を発現している細胞の蛋白パターンはSDSゲル
電気泳動により分折され、組換え毒素のADPリボシル
化活性が測定された。これらのプラスミド(例1に記
載)のうち、アミノ酸253−613(構造ドメインI
b、II、とIII )を含むプラスミドpJH8とドメイン
Ibからのアミノ酸を含むプラスミドpJH17とは、
ヒト細胞に対する低い毒性を有するにもかかわらず高い
酵素活性を保持した大量の修飾PEをコードすることが
できる。 【0010】以上のプラスミドパターンを総合すると、
構造ドメインIaは受容体結合ドメインであること、構
造ドメインIIの前半部分は、宿主細胞内含物の液胞から
細胞質ゾルへの毒素の移行に必要な部分であること、並
びに構造ドメインIII はそれのみでは十分なADPリボ
シル化活性を発現しないことが示される。 【0011】動物にPEを投与すれば、PE特有の肝臓
障害により死に至る。同様にPEから作られるイムノト
キシンは肝臓に障害を与えるので、PEから作られる大
量のイムノトキシンを投与した場合は、肝臓毒性中毒に
より死に至る。第3表に示される実験は、構造ドメイン
Iaが細胞結合に寄与すること、並びに構造ドメインI
aが欠失したPE分子は天然のPEよりもマウスに対し
て毒性が少ないことを示している。この結論は例4のデ
ーターによっても裏付けられ、そこでは修飾PEのマウ
スに対する毒性が天然のPEの200分の一以下である
ことが示されている。例5は、pJH8から作られた蛋
白を精製してヒトのトランスフェリン受容体に対する抗
体に結合させると、天然のPEを含む抗毒素とほぼ同じ
程度の活性を示し、かつ標的細胞以外の細胞(マウス)
に対する毒性は100分の一ほどに少ないイムノトキシ
ンが得られることを示している。 【0012】したがって本発明を言替えれば、構造ドメ
インIaを欠失したPE分子は、肝臓中毒性の少ない、
副作用の少ない効果的なイムノトキシンであるというこ
とである。 【0013】 【発明の詳細な開示】好ましい実施例において、;本発
明は、修飾により活性イムノトキシンとなる修飾シュー
ドモナスエクソトキシン(PE)を製造することであ
る。それから作られた修飾毒素とそのイムノトキシンは
組織細胞培養液内のヒトとマウスの細胞に対する非特異
的毒性が著しく減少し、マウスの生体内細胞において
も、毒性が大きく減少している。 【0014】ゲノムDNAは緑膿菌の菌株をEcoRI
とPstIで完全に消化して得られる。緑膿菌のどの菌
株でも本発明の使用に適しているが、大量の活性毒素を
生産するPA103が最適菌株である。長さ2.6〜
2.9kbのDNA断片がゲノムDNAライブラリーか
ら分離される。この断片は、EcoRIとPstIでp
UC13プラスミドを切って得られる長さ2.7kbの
DNA断片に連結される。pUC13プラスミドはBo
ehringerMannheimより入手可能であ
る。適した宿主は、好ましくは大腸菌(E.coli)
で、上記の組換えプラスミドで形質転換される(好まし
い大腸菌の菌株は、HB101でこれはBethesd
aResearchLaboratoriesから入手
可能である)。 【0015】ptoxETAすなわちPE構造遺伝子を
含むプラスミドから得られた長さ2.7kbのDNA断
片をプローブとして用い、いくつかの陽性コロニーから
プラスミドDNAが調整され、サザーンブロット法によ
り同定される。次いで、異なった大きさの修飾PEが好
適な宿主中で発現される。溶薗性でかつ[BL21(D
E3 )]から誘導され得るバクテリオファージT7RN
Aポリメラーゼ遺伝子を有する宿主が、好ましく、この
宿主はBrookhavenNationalLabo
ratoriesのF.W.Studier博士から入
手可能である。同様にF.W.Studier博士から
入手可能である、バクテリオファージ後期T7プロモー
ター(lateT7promoter)とAMPr とS
hine−Dalgarno box――pAR215
6を持ったプラスミドが好ましい。例に示すように、好
ましいプラスミドは、pJH8とpJH17である。p
JH8は5.1kbのDNA断片で、pEのドメインI
I、Ib、III を発現可能である。このプラスミドは、
プラスミドpJH4をAvaIで部分的に切って製造さ
れる。線状に作られたDNA断片は、AvaIとHin
dIII の認識サイトをもった5.1kbの断片を得るた
めに、HindIII で完全に切られる。 【0016】この断片はその付着端を取り除くために、
S1ヌクレアーゼを加えてインキュベートし、次にプラ
スミドpJH8を作るために、T4リガーゼを加えて連
結した。 【0017】プラスミドpJH17は4. 8kbのDN
A断片を含み、PEの隣り合った20のアミノ酸と共に
ドメインIII を発現可能である。このプラスミドは、プ
ラスミドpJH4をApaIとHindIII で完全に切
って作られる。そして、4.8kbのDNA断片は分離
され、付着端を埋めるためにKlenowDNAポリメ
ラーゼI及びdNTPと共にインキュベートされ、続い
てT4リガーゼで連結される。 【0018】BL21(DE3 )中における組換え毒素
の発現 異なったサイズのPEを発現するプラスミドを含むBL
21(DE3 )は37℃の50μgAmpicilli
n/ml含むLB培地で培養される。波長650nmで
吸光度が0.3に達した時に、IPTG(isopro
pyl beta−D−thio−galatopyr
anoside)を濃度1mMになるように培養液に加
える。90分後細胞を回収し、組換え毒素の量を、SD
S−PACE、免疫ブロット法、ADPリボシル化、細
胞傷害実験により分析した。 【0019】SDS−PAGE、免疫ブロット法 細胞沈澱はLaemmli緩衝液で溶解される。試料を
0.1%SDS、10%アクリルアミドのスラブゲルに
掛ける前に5分間煮沸した。免疫ブロット法を行なうた
めに、電気泳動後の試料をニトロセルロースフィルター
に移し、次にPEに対する抗体と反応させ、その後第2
の抗体(抗ウサギ−ヤギ)と反応させ、染色する。PE
に対する抗体は、PEと反応させた(PE250μgず
つの接種)グルタルアルデヒド(0.2%)で高度に免
疫したウサギから得られる。免疫ブロット法のために、
IgG分画が調製される。 【0020】ADPリボシル化活性検定 従来法によりADPリボシル化活性検定を行なった。簡
単に言えば、ウサギ網状赤血球調製液または、ペプチド
鎖延長因子2(EF−2)を富化した小麦胚芽エキスを
EF−2源として用いた。検定液(全500μl)は約
10pmoleのEF−2と、37pmoleの14C−
NAD(0.06uCi)と、0.25〜1.25μg
のpEと、緩衝液(40mM DDT、1mM EDT
A、50mM Tris、pH8.1)とを含んでい
る。活性は30分間にEF−2に転移したNADのpm
ole数として測定される。既知濃度のPEの標準曲線
は確定されており、大腸菌抽出エキスのPE活性を決定
するためにこの標準曲線が使用される。37℃で30分
間インキュベートした後、0.5ml、12%TCAが
各定量用混合液に加えられる。定量用混合液はその後1
5分間氷浴され、続いて4℃、3000xgで10分間
遠心分離した。沈澱を1ml6%のTCAで洗浄し、同
様に遠心分離した。その後液体シンチレーションカウン
ターで沈澱の14C放射能を測定することによりADPリ
ボシル化活性の指標とした。 【0021】細胞傷害性テスト 修飾PEの細胞傷害活性のテストはNIH 3T3細胞
株とヒトKB細胞を用いて行なわれる。NIH 3T3
細胞又はヒトKB細胞は、細胞傷害活性テスト前に、2
4区画の組織培養プレートで1区画2×104 細胞密度
で24時間静置される。PEの異なった濃度液または、
異なったサイズのPEを発現するプラスミドを持ったB
L21(DE3 )から分離された蛋白抽出液と48時間
インキュベートし、生残った細胞を見付けるために、そ
の単層をメチレンブルーで染色した。その結果を第1表
に示した。 【0022】蛋白合成の阻害 PEによる、あるいはB121(DE3 )/pJH8か
ら得た抽出物とPEによる蛋白合成阻害の検定は、Sw
iss3T3細胞株において行なわれる。Swiss3
T3細胞は、定量1日前に24区画の組織培養プレート
で1区画105細胞密度で培養器に植え込まれる。細胞
は、PE(100ng/ml )または大きさの異なるP
E(第2表)を過剰に含む抽出液を有したPE(100
ng/ml)を加える前に、培養液をDMEMと0.2
%のBSAと取替える事により一度洗浄された。 【0023】37℃で15分経過後、培地は除かれ、代
わりに新鮮なDMEMと0.2%のBSAが入れられ
る。4時間後、培地に1時問[3 H]ロイシン(最終濃
度2−4uCi/ml)を加えて蛋白合成割合が測定さ
れる。 【0024】本発明の好ましい実施例において、上記し
たようにシュードモナスエクソトキシン遺伝子の構造ド
メインはT7発現ベクターのリボゾーム結合領域の下流
に組入れられ、それはATG開始コドンを伴っている
(第1図参照)。できた組換え蛋白産生の細胞を37℃
でA650 =0.3まで成長させた。T7RNAポリメラ
ーゼを誘導するために1mMのIPTGが加えられ、2
時問インキュベートされた。例1に示すように、一連の
プラスミドが製造される。 【0025】次に、プロセッシングされた天然PE(第
1表)におけるアミノ末端のアラニンに接近してメチオ
ニンが配列しており、リーダー配列のないPE分子をコ
ードするクローン(pJH4)を構成した。pJH4に
より製造された蛋白をMet−PEと表わす。全細胞蛋
白の20%を占める大量のMet−PEがIPTGによ
る誘導により製造される。天然PEの0.1mgに相当
するADPリボシル化活性がその上清に認められた。ま
た全細胞蛋白の1mg当り0.2mgの天然PEに相当
するADPリボシル化活性がその沈澱に認められた。p
JH4により製造されたPE分子はアミノ末端に1つの
余分のメチオニン残基がある点で天然のPE分子とは異
なる。 【0026】上述したようにpJH4により製造された
pJH8は、ドメインIaのほとんどを欠失した蛋白
(添加メチオニンとアミノ末端の3つのアミノ酸のみを
アミノ末端に保持している)を発現する。 【0027】免疫ブロット法により、この蛋白は45k
bで、ほぼ0.04mg/mg細胞蛋白の濃度であるこ
とが分かった。その反応混合液から尿素とDTTを除く
と、高いADPリボシル化活性を示す。天然PE(尿素
とDTTを加えると、高いADPリボシル化活性を示
す)とは対照的に、PJH8に尿素とDTTを加える
と、ADPリボシル化活性は低下する(約30%)。 【0028】PEのADPリボシル化活性は分子のカル
ボキシル末端によるものであるので、pJH4から構成
される(上記の様に)プラスミドpJH17が生産され
る。このプラスミドは、ドメインIII とドメインIbの
20アミノ酸を含む。このプラスミドからの抽出物は、
0.06mgPE(第1表)に相当する高いADPリボ
シル化活性を含んでいる。免疫ブロット法により、31
kdの蛋白が検出された。この蛋白は、濃度0.03m
g/mg細胞蛋白の濃度で存在する。 【0029】上記の(および後期の例で説明する)方法
で製造されたプラスミドは、pJH1、pJH2、pJ
H4を除いて、いずれも顕著な細胞破壊能を示さない。
しかし、これらの多くは高い酵素活性を示す(第1
表)。これらのプラスミドは、細胞を種々の修飾された
毒素3−5μg/mlの存在下で0.1μg/mlの天
然PEに15分間さらすことによって、蛋白合成の阻害
または天然PEによる細胞破壊を防止することが示され
る。第3表のデーターにより、ドメインIaのみ、若し
くはドメインI、ドメインIIの半分及びドメインIII の
いずれかを発現しているプラスミドは、PEの蛋白合成
阻害を妨げることがわかる。 【0030】動物毒性 天然PEを投与されたマウスは肝臓傷害により死亡す
る。20グラムのマウスでは0.1−0.2μgが致死
量となる。第4表は、ドメインIaを欠失しているPE
はマウスに対する毒性を著しく減じるものであることを
示している。マウスの腹腔内に、天然PEまたはドメイ
ンIaを欠如している天然PEを注射した。天然PE
1.0μgを投与されたすべてのマウスと、0.2μg
のPEを投与された1/2のマウスが40時間で死ん
だ。PE Ia50μgを投与された3匹のマウスの内
2匹が死んだ。PE Ia20μgを投与されたすべて
のマウスは生存した。PE Iaを5μgを投与された
すべてのマウスも生存した。従って、PE Iaは天然
PEより体重当りの毒性が100分の1より少なかっ
た。 【0031】修飾されたシュードモナスエクソトキシン
の組換え体を利用した遺伝子融合 本発明の修飾PEのためのPEの遺伝子のうち、特にp
JH8に含まれる遺伝子を、ヒトα形質転換成長因子
(a−TGF)又はヒトインターロイキン2(IL−
2)をコードしているDNA配列と融合した。例7と8
にこれらの遺伝子融合の詳細を示した。ペプチドホルモ
ン、成長因子、またはその特異的受容体が細胞表面に存
在する他のいかなるポリペプチド細胞認識蛋白との融合
においても、修飾されたPEの使用は適している。いく
つかの実施例はインシュリン、グルカゴン、エンドルフ
ィン、成長ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、トラ
ンスフェリン、ボンベシン、低密度のリポ蛋白、黄体形
成ホルモン(luteinizing nor mor
e)、アシアログリコ蛋白を含んでいる。 【0032】例 例1 第1表に示すように、本発明のプロセスは、異なったサ
イズのPE構造遺伝子とT7後期プロモーターの融合を
含んだいくつかのプラスミドを構成するために用いられ
た。pJH2は、修飾リーダー配列をコードする断片を
前方に有する、無傷のPE構造遺伝子を含んでいる。p
JH4は、アミノ末端にメチオニンコドンを付加した無
傷のPE構造遺伝子を含んでいる。pJH7は、PEの
構造ドメインIII (アミノ酸405−613)をコード
する遺伝子を含んでいる。pJH8は、pEの構造ドメ
インII、Ib及びIII (アミノ酸253−613)をコ
ードする遺伝子を含んでいる。pJH13は、アミノ酸
253−307を含む構造ドメインIIの最初の半分を欠
失したPEをコードしている。PJH14はPEの構造
ドメインIa(アミノ酸1−252)をコードしてい
る。pJH17は、構造ドメインIbから20のアミノ
酸の付加近接配列を有した、構造ドメインIIIをコード
している(アミノ酸385−613)。 【0033】pJH1は天然PE(pE0)をBamH
Iで部分的に切断し、そして、直鎖伏のDNAを溶出さ
せ、EcoRIで完全に切って構成された。pE0から
誘導された2.0kbのDNA断片は、2つの末端にB
amHIとEcoRIのサイトを持ち、BamHIとE
coRIで完全に切られたpAR2156に挿入され
た。 【0034】pJH2はpJH1をBamHIで部分的
に切断することによって構成された。直鎖状のDNAが
分離され、NdeIで完全に切られた。610kbのD
NA断片は下記の合成オリゴヌクレオチド二重鎖と連結
してpJH2を構成するために保存された。 5’TATGAAAAA ACTTTTTCTAG5’ 【0035】pJH4はpJH2をTaqIで部分的に
切断することによって構成された。直鎖状のDNA(6
10kb)が分離され、NdeIで完全に切られた。最
も大きいDNA断片(5.9kb)が分離され、下記の
合成オリゴヌクレオチド重鎖と連結された。 5’TATGGCCGAAGAAGCTTT ACCGGCTTCTTCGAAAGC5’ これはHindIII サイト…… AAGCTT TTCGAA を含んでいる 【0036】pJH7はpJH4をAatIIで部分的に
切断することによって構成された。直鎖状のDNA
(5.9kb)が分離され、HindIII で完全に切ら
れた。分離後AatIIとHindIII のサイ卜を持った
4. 7kbのDNA断片を、付着蛋白を除くためにS1
核酸分解酵素を加えてインキベートし、続いてT4リガ
ーゼで連結した。 【0037】pJH8は発明の詳細な開示に記載した様
にして構成される。 【0038】pJH13はpJH4をAvaIで部分的
に切断するとによって構成された。直鎖状のDNAが分
離され、EcoRIで完全に切られた。両端にAvaI
とEcoRIの切断末端を持った4.7kbのDNA断
片を、付着端を除くためにS1を加えてインキベートし
た(DNA断片1)。pJH4をSalIで部分的に切
断した。次いで、直鎖状になったDNA断片をEcoR
Iで完全に切断した。末端にSalIとEcoRIのサ
イトを持った1.0kbのDNA断片を、Klenow
DNAポリメラーゼI及びdNTPと共にインキュベー
トし、付着端を埋めた(DNA断片2)。DNA断片1
(4.7kb)とDNA断片2(1.0kb)を一昼夜
4℃で連結した。 【0039】pJH14はpJH4をAvaIで部分的
に切断して構成された。直鎖状のDNAがEcoRIで
完全に切られた。末端にAvaIとEcoRIのサイト
を持った4. 7kbのDNA断片を、付着端を埋めるた
めにS1加えてインキュベトし、続いてT4リガーゼで
連結した。 【0040】pJH17は発明の詳細な説明に記載した
様にして構成される。 【0041】例2 組換え毒素(実施例1で述べたプラスミドにより製造さ
れた)の量と活性がSDS−AGE、ADPリボシル化
と細胞破壊活性により測定された。結果を第1にまとめ
た。 【0042】 【表1】【0043】例3 発明の組換え毒素の特性を試すために、実験をした。結
果を2表にまとめた。 【0044】 【表2】 【0045】例4 天然PEの存在あるいは非存在下で、種々の欠失の細胞
蛋白合成への影響を決定した。結果を第3表に示した。
構造ドメインIa(pJH14)及び構造ドメインIと
構造ドメインIIの半分及びIII (pJH13)とを、音
波処理した細胞の沈澱から8M尿素で抽出した。組換え
蛋白3−5μgに匹敵するそれぞれの抽出液10μlを
検定に用いた。構造ドメインII、Ib、III (pJH
8)は音波処理したBL21(DE3 )/pJH8細胞
の上澄に存在した。組換え毒素2μgに匹敵する抽出液
10μlを使用した。第3表に示すように、細胞は0.
1μg/mlの天然PEの存在あるいは非存在下で15
分間処理され、その後1mlのDMEMで洗われ、DM
EMと0.2%のBSA中で4時間インキュベートし、
次いで3 Hロイシンと共に1時間インキュベートした。 【0046】 【表3】【0047】例5 第4表に示すように、Balb/cマウスに、殺菌済み
の生理食塩水1.0ml及び殺菌済みのヒトアルプミン
10mg/ml中に含まれている種々の量のPEまたは
PEIaを腹腔内注射することにより、マウスにおける
致死量が決定された。動物は2週間に亘って毎日観察さ
れた。すべての死は48時間で起こった。 【0048】 【表4】 【0049】例6 第3図および第4図に示すように、pJH8をジスルフ
ィド結合によってヒトトランスフェリン受容体に対する
抗体(PE45−HB21)に結合することによって生産
された45kDの蛋白よりなるイムノトキンンは、トラ
ンスフェリン受容体(ID503ng/ml)を発現した
ヒト細胞を破壊する。上記のイムノトキシンはヒトトラ
ンスフェリン受容体を発現していないマウス紬胞に対し
ては1000ng/mlでもほとんどあるいは全く影響
がない。これに反して、ジスルフィド結合によってHB
21に結合された天然PEは、29ng/mlのID50
で非特異的にマウス細胞を破壊する。第3図および第4
図のデータは、PE45−HB21の非特異的毒性がPE
−HB21の100分の1ほど少ないことを示してい
る。 【0050】続いて、PE45の分子量が再び測定され
た。分子量は40,000であることが分かった。 【0051】例7 α形質転換成長因子PE融合遺伝子
の構成 AvaIIサイトをほとんど持っていない小さいプラスミ
ドpVC8を構成するために、pJH8をTth111
IとSphIで処理した。pVC31を作製するために
pVC8をAvaIIで部分的に切断し、STuIサイ
ト、Tth111Iサイト及び停止コドンを含む合成オ
リゴヌクレオチド(30bp)に連結した。pVC31
をTth111Iで切断し、DNAポリメラーゼ断片で
あるKlenow断片を用いて満たし、α−TGF遺伝
子(pvC33)を含むブラント末端クローンに連結し
た。α−TGF遺伝子、P−hTGF−10−925
[Derynck etal、細胞、38:287−2
97(1984)〕をEcoRIとBglIで切って3
22bp断片を得、分離し、Fnu 4HIで切り、T
4ポリメラーゼで処理して152bp断片を得、次いで
PE−αTGF融合遺伝子を製造するためにこの断片を
PVC31に連結した。大腸菌内で発現させると、この
プラスミドは、α−TGFに対する抗体およびPEと反
応する分子量51,000の蛋白を生産した。 【0052】例8 IL−2−PE融合遺伝子の構成 AvaIIによってpVC8を1190の位置で、切断
し、3.6断片を分離し、その一本鎖末端をKleno
w酵素を用いて埋め、脱リン化して断片Iを得た。IL
一2の1kDの断片を得るために、クローンPST−5
〔Ga110ら、PNAS、(81:2543−254
7(1984)]をPstIで切断してIL−2の1k
D断片を得、次いで該断片を105と669の位置でB
sp1286で切り、T4ポリメラーゼで処理して末端
を埋めた。564bp断片を断片Iに連結してPHL−
1を製造し、BL21発現細胞に形質転換した。誘導に
より、IL−2とPEに対する抗体に反応し、かつAD
Pリボシル化活性を有する60kDの蛋白が生産され
た。 【0053】寄託の表示以下のプラスミドは、Rock
vil1e、MarylandのAmerican T
ype Culture Collectionに、そ
れぞれATCC番号を付してこの出願前に寄託されてい
る。また、この出願が特許されたときには、寄託の日も
しくは最後の寄託申請から5年後の日から30年または
特許存続期間のうちの最も長い期間だけは維持される。
もし、寄託の間に株が突然変異したり、生育不能になっ
たりした場合は取替えられる。 pJH12 ATCC 67205 pJHL−1 ATCC 67206 pVC33 ATCC 67207 pJH8 ATCC 67208 pJH14 ATCC 67209
る、きわめて強力な細胞破壊をおこすものである。その
強い活性のために、毒素は、標的細胞に特異的に結合す
る細胞傷害剤(イムノトキシン)を作るためにモノクロ
ーナル抗体に結合される。したがってこれらのイムノト
キシンはガン療法において、最も有益である。 【0002】シュードモナスエクソトキシンA(PE)
はきわめて活性が高い蛋白質モノマー(分子量66K
d)であり、緑膿菌(Pseudomonas aer
uginosa)によって分泌される。この蛋白質モノ
マーは、ペプチド鎖延長因子2(EF−2)のADPリ
ボシル化を触媒(酸化型NAD+ のADPリボース部分
のEF−2への転移を触媒)することにより、EF2の
不活化を通して真核細胞の蛋白合成を阻害するものであ
る。 【0003】毒に侵される過程は次の様に考えられてい
る。:まず、PEが細胞表面の特異的受容体により結合
する。次にPE−受容体複合体が細胞内に吸収される。
最終的に、PEは、細胞質ゾルに移行し、そこで酵素的
に蛋白合成を阻害する。酸性液胞のPHを上昇するNH
4+ の様な弱塩基によって、細胞の被毒が防がれている
ので、移行過程は酸性区域から起こると考えられてい
る。PEの疎水ドメインは酸性状熊に曝されることによ
って細胞膜内に入り込み、酵素ドメインが伸長した状態
で細胞質ゾルを通過する通路を形成する。 【0004】米国特許第4,545,985号は、シュ
ードモナストキシンが抗体又は成長因子に化学的に結合
できることを教示している。しかし、これらの化学的に
結合された毒素は好ましくないレベルの毒性しか示さな
い。従って、一般にこれらの毒素に伴われる細胞の破壊
を生じることなく、ある特殊の細胞タイプを標的として
高特異的に作用する毒素が得られれば有益なことであろ
う。 【0005】PEを含むイムノトキシンは、天然のPE
とイミノチオラン(iminothiolane)との
第1の反応で製造される。この反応は、抗体を毒素に結
合するのに役立つ2つの新しいスルフヒドリル基をもた
らすと共に、その結果PEがその固有の受容体に結合す
るのを不活化する。この考え方はPE受容体を持った細
胞にPEが結合するために生ずる好ましくない副作用を
最少限に抑制するため、PE結合部位を化学的に不活化
することにもとづいている。この考えは、組織細胞培養
液内の特異細胞破壊や腫瘍接種マウスにおいてはかなり
旨い考えだが、イムノトキンンの毒性副作用のために、
20グラムのマウスに対しては2μg、3Kgのモンキ
ーに対しては1mg、成人に対しては4mg以上投与す
ることができない。従って、腫瘍細胞のより大きな壊滅
を為し遂げるために、より大量のイムノトキシンを投与
できることが望まれる。本発明は、高い効能と低い毒性
を持ったイムノトキシンを提供することにより、この目
的を達成するものである。さらに、上記PE結合部位の
化学的不活化についての考えを克服するために、本発明
ではDNA組換えの技術を用いた。即ち、異なった機能
のドメインを含んだり、細胞結合ドメインを持っていな
い毒素分子の全長(又は、その部分)が高度に発現され
るように、DNA組換えのテクニックを用いて完全な毒
素遺伝子(又はその断片)のクローニングを行なった。
これらのクローンの比較実験を例1に示した。 【0006】PEの3次構造は、X線結晶学により決定
された。第2図に示すように、PE分子は、3つの構造
的に異なるドメインを有している。ドメインIはアミノ
酸残基を1〜252(ドメインIa)、365〜404
(ドメインIb)含んでいる;ドメインIIはアミノ酸残
基を253〜364含んでいる;ドメインIII はアミノ
酸残基を405〜613有している。 【0007】PE分子の種々の部分を発現するプラスミ
ドが作製されている。このプラスミドはPE分子の異な
った構造のドメインを種々の作用活性に関係付けること
を可能にし、および(1)分子のどの部分が細胞認識
(結合)に寄与しているか、(構造ドメインI、アミノ
酸1−252);(2)どの部分が酵素活性に必要であ
るか(ADPリボシル化活性、ドメインIII をドメイン
Ibの部分に加えたもの)(アミノ酸385−61
3);(3)どの部分が細胞膜を通ってトランスロケー
ションするのに寄与するか(ドメインII)を決定するこ
とを可能とする。 【0008】構造ドメインIaが細胞認識に関係してい
ることは、次の事実から明らかである。すなわち、ドメ
インIaを含まず、ドメインII、ドメインIb及びドメ
インIII を含むプラスミドにより生産された蛋白はそれ
自身による細胞傷害性を有さず、無傷の毒素の細胞傷害
性に対する拮抗阻害を示さないのに対して、ドメインI
aをコードし、かつ他のドメインをコードしないプラス
ミドは感受性細胞のPE細胞傷害性をブロックした。構
造ドメインIIの最初の半分を欠失して導入したプラスミ
ドから得られたPEは、ブロック活性とADPリボシル
化活性の両方を示す。しかし、これらの分子は細胞傷害
活性をすべて失っていた。横造ドメインIII のみをコー
ドするプラスミドは大量の蛋白を生産するが、この蛋白
は防御的酵素活性(ADPリボシル化)を失っていた。
しかし、構造ドメインIII の全部と構造ドメインIbに
近接したアミノ酸とをコードするプラスミドは、大量の
蛋白を発現し、かつそのADPリボシル化活性が高い。 【0009】PEの3次構造に基づき、PEの異なった
部分が発現されるようにプラスミドが作られる。異なっ
た構造を発現している細胞の蛋白パターンはSDSゲル
電気泳動により分折され、組換え毒素のADPリボシル
化活性が測定された。これらのプラスミド(例1に記
載)のうち、アミノ酸253−613(構造ドメインI
b、II、とIII )を含むプラスミドpJH8とドメイン
Ibからのアミノ酸を含むプラスミドpJH17とは、
ヒト細胞に対する低い毒性を有するにもかかわらず高い
酵素活性を保持した大量の修飾PEをコードすることが
できる。 【0010】以上のプラスミドパターンを総合すると、
構造ドメインIaは受容体結合ドメインであること、構
造ドメインIIの前半部分は、宿主細胞内含物の液胞から
細胞質ゾルへの毒素の移行に必要な部分であること、並
びに構造ドメインIII はそれのみでは十分なADPリボ
シル化活性を発現しないことが示される。 【0011】動物にPEを投与すれば、PE特有の肝臓
障害により死に至る。同様にPEから作られるイムノト
キシンは肝臓に障害を与えるので、PEから作られる大
量のイムノトキシンを投与した場合は、肝臓毒性中毒に
より死に至る。第3表に示される実験は、構造ドメイン
Iaが細胞結合に寄与すること、並びに構造ドメインI
aが欠失したPE分子は天然のPEよりもマウスに対し
て毒性が少ないことを示している。この結論は例4のデ
ーターによっても裏付けられ、そこでは修飾PEのマウ
スに対する毒性が天然のPEの200分の一以下である
ことが示されている。例5は、pJH8から作られた蛋
白を精製してヒトのトランスフェリン受容体に対する抗
体に結合させると、天然のPEを含む抗毒素とほぼ同じ
程度の活性を示し、かつ標的細胞以外の細胞(マウス)
に対する毒性は100分の一ほどに少ないイムノトキシ
ンが得られることを示している。 【0012】したがって本発明を言替えれば、構造ドメ
インIaを欠失したPE分子は、肝臓中毒性の少ない、
副作用の少ない効果的なイムノトキシンであるというこ
とである。 【0013】 【発明の詳細な開示】好ましい実施例において、;本発
明は、修飾により活性イムノトキシンとなる修飾シュー
ドモナスエクソトキシン(PE)を製造することであ
る。それから作られた修飾毒素とそのイムノトキシンは
組織細胞培養液内のヒトとマウスの細胞に対する非特異
的毒性が著しく減少し、マウスの生体内細胞において
も、毒性が大きく減少している。 【0014】ゲノムDNAは緑膿菌の菌株をEcoRI
とPstIで完全に消化して得られる。緑膿菌のどの菌
株でも本発明の使用に適しているが、大量の活性毒素を
生産するPA103が最適菌株である。長さ2.6〜
2.9kbのDNA断片がゲノムDNAライブラリーか
ら分離される。この断片は、EcoRIとPstIでp
UC13プラスミドを切って得られる長さ2.7kbの
DNA断片に連結される。pUC13プラスミドはBo
ehringerMannheimより入手可能であ
る。適した宿主は、好ましくは大腸菌(E.coli)
で、上記の組換えプラスミドで形質転換される(好まし
い大腸菌の菌株は、HB101でこれはBethesd
aResearchLaboratoriesから入手
可能である)。 【0015】ptoxETAすなわちPE構造遺伝子を
含むプラスミドから得られた長さ2.7kbのDNA断
片をプローブとして用い、いくつかの陽性コロニーから
プラスミドDNAが調整され、サザーンブロット法によ
り同定される。次いで、異なった大きさの修飾PEが好
適な宿主中で発現される。溶薗性でかつ[BL21(D
E3 )]から誘導され得るバクテリオファージT7RN
Aポリメラーゼ遺伝子を有する宿主が、好ましく、この
宿主はBrookhavenNationalLabo
ratoriesのF.W.Studier博士から入
手可能である。同様にF.W.Studier博士から
入手可能である、バクテリオファージ後期T7プロモー
ター(lateT7promoter)とAMPr とS
hine−Dalgarno box――pAR215
6を持ったプラスミドが好ましい。例に示すように、好
ましいプラスミドは、pJH8とpJH17である。p
JH8は5.1kbのDNA断片で、pEのドメインI
I、Ib、III を発現可能である。このプラスミドは、
プラスミドpJH4をAvaIで部分的に切って製造さ
れる。線状に作られたDNA断片は、AvaIとHin
dIII の認識サイトをもった5.1kbの断片を得るた
めに、HindIII で完全に切られる。 【0016】この断片はその付着端を取り除くために、
S1ヌクレアーゼを加えてインキュベートし、次にプラ
スミドpJH8を作るために、T4リガーゼを加えて連
結した。 【0017】プラスミドpJH17は4. 8kbのDN
A断片を含み、PEの隣り合った20のアミノ酸と共に
ドメインIII を発現可能である。このプラスミドは、プ
ラスミドpJH4をApaIとHindIII で完全に切
って作られる。そして、4.8kbのDNA断片は分離
され、付着端を埋めるためにKlenowDNAポリメ
ラーゼI及びdNTPと共にインキュベートされ、続い
てT4リガーゼで連結される。 【0018】BL21(DE3 )中における組換え毒素
の発現 異なったサイズのPEを発現するプラスミドを含むBL
21(DE3 )は37℃の50μgAmpicilli
n/ml含むLB培地で培養される。波長650nmで
吸光度が0.3に達した時に、IPTG(isopro
pyl beta−D−thio−galatopyr
anoside)を濃度1mMになるように培養液に加
える。90分後細胞を回収し、組換え毒素の量を、SD
S−PACE、免疫ブロット法、ADPリボシル化、細
胞傷害実験により分析した。 【0019】SDS−PAGE、免疫ブロット法 細胞沈澱はLaemmli緩衝液で溶解される。試料を
0.1%SDS、10%アクリルアミドのスラブゲルに
掛ける前に5分間煮沸した。免疫ブロット法を行なうた
めに、電気泳動後の試料をニトロセルロースフィルター
に移し、次にPEに対する抗体と反応させ、その後第2
の抗体(抗ウサギ−ヤギ)と反応させ、染色する。PE
に対する抗体は、PEと反応させた(PE250μgず
つの接種)グルタルアルデヒド(0.2%)で高度に免
疫したウサギから得られる。免疫ブロット法のために、
IgG分画が調製される。 【0020】ADPリボシル化活性検定 従来法によりADPリボシル化活性検定を行なった。簡
単に言えば、ウサギ網状赤血球調製液または、ペプチド
鎖延長因子2(EF−2)を富化した小麦胚芽エキスを
EF−2源として用いた。検定液(全500μl)は約
10pmoleのEF−2と、37pmoleの14C−
NAD(0.06uCi)と、0.25〜1.25μg
のpEと、緩衝液(40mM DDT、1mM EDT
A、50mM Tris、pH8.1)とを含んでい
る。活性は30分間にEF−2に転移したNADのpm
ole数として測定される。既知濃度のPEの標準曲線
は確定されており、大腸菌抽出エキスのPE活性を決定
するためにこの標準曲線が使用される。37℃で30分
間インキュベートした後、0.5ml、12%TCAが
各定量用混合液に加えられる。定量用混合液はその後1
5分間氷浴され、続いて4℃、3000xgで10分間
遠心分離した。沈澱を1ml6%のTCAで洗浄し、同
様に遠心分離した。その後液体シンチレーションカウン
ターで沈澱の14C放射能を測定することによりADPリ
ボシル化活性の指標とした。 【0021】細胞傷害性テスト 修飾PEの細胞傷害活性のテストはNIH 3T3細胞
株とヒトKB細胞を用いて行なわれる。NIH 3T3
細胞又はヒトKB細胞は、細胞傷害活性テスト前に、2
4区画の組織培養プレートで1区画2×104 細胞密度
で24時間静置される。PEの異なった濃度液または、
異なったサイズのPEを発現するプラスミドを持ったB
L21(DE3 )から分離された蛋白抽出液と48時間
インキュベートし、生残った細胞を見付けるために、そ
の単層をメチレンブルーで染色した。その結果を第1表
に示した。 【0022】蛋白合成の阻害 PEによる、あるいはB121(DE3 )/pJH8か
ら得た抽出物とPEによる蛋白合成阻害の検定は、Sw
iss3T3細胞株において行なわれる。Swiss3
T3細胞は、定量1日前に24区画の組織培養プレート
で1区画105細胞密度で培養器に植え込まれる。細胞
は、PE(100ng/ml )または大きさの異なるP
E(第2表)を過剰に含む抽出液を有したPE(100
ng/ml)を加える前に、培養液をDMEMと0.2
%のBSAと取替える事により一度洗浄された。 【0023】37℃で15分経過後、培地は除かれ、代
わりに新鮮なDMEMと0.2%のBSAが入れられ
る。4時間後、培地に1時問[3 H]ロイシン(最終濃
度2−4uCi/ml)を加えて蛋白合成割合が測定さ
れる。 【0024】本発明の好ましい実施例において、上記し
たようにシュードモナスエクソトキシン遺伝子の構造ド
メインはT7発現ベクターのリボゾーム結合領域の下流
に組入れられ、それはATG開始コドンを伴っている
(第1図参照)。できた組換え蛋白産生の細胞を37℃
でA650 =0.3まで成長させた。T7RNAポリメラ
ーゼを誘導するために1mMのIPTGが加えられ、2
時問インキュベートされた。例1に示すように、一連の
プラスミドが製造される。 【0025】次に、プロセッシングされた天然PE(第
1表)におけるアミノ末端のアラニンに接近してメチオ
ニンが配列しており、リーダー配列のないPE分子をコ
ードするクローン(pJH4)を構成した。pJH4に
より製造された蛋白をMet−PEと表わす。全細胞蛋
白の20%を占める大量のMet−PEがIPTGによ
る誘導により製造される。天然PEの0.1mgに相当
するADPリボシル化活性がその上清に認められた。ま
た全細胞蛋白の1mg当り0.2mgの天然PEに相当
するADPリボシル化活性がその沈澱に認められた。p
JH4により製造されたPE分子はアミノ末端に1つの
余分のメチオニン残基がある点で天然のPE分子とは異
なる。 【0026】上述したようにpJH4により製造された
pJH8は、ドメインIaのほとんどを欠失した蛋白
(添加メチオニンとアミノ末端の3つのアミノ酸のみを
アミノ末端に保持している)を発現する。 【0027】免疫ブロット法により、この蛋白は45k
bで、ほぼ0.04mg/mg細胞蛋白の濃度であるこ
とが分かった。その反応混合液から尿素とDTTを除く
と、高いADPリボシル化活性を示す。天然PE(尿素
とDTTを加えると、高いADPリボシル化活性を示
す)とは対照的に、PJH8に尿素とDTTを加える
と、ADPリボシル化活性は低下する(約30%)。 【0028】PEのADPリボシル化活性は分子のカル
ボキシル末端によるものであるので、pJH4から構成
される(上記の様に)プラスミドpJH17が生産され
る。このプラスミドは、ドメインIII とドメインIbの
20アミノ酸を含む。このプラスミドからの抽出物は、
0.06mgPE(第1表)に相当する高いADPリボ
シル化活性を含んでいる。免疫ブロット法により、31
kdの蛋白が検出された。この蛋白は、濃度0.03m
g/mg細胞蛋白の濃度で存在する。 【0029】上記の(および後期の例で説明する)方法
で製造されたプラスミドは、pJH1、pJH2、pJ
H4を除いて、いずれも顕著な細胞破壊能を示さない。
しかし、これらの多くは高い酵素活性を示す(第1
表)。これらのプラスミドは、細胞を種々の修飾された
毒素3−5μg/mlの存在下で0.1μg/mlの天
然PEに15分間さらすことによって、蛋白合成の阻害
または天然PEによる細胞破壊を防止することが示され
る。第3表のデーターにより、ドメインIaのみ、若し
くはドメインI、ドメインIIの半分及びドメインIII の
いずれかを発現しているプラスミドは、PEの蛋白合成
阻害を妨げることがわかる。 【0030】動物毒性 天然PEを投与されたマウスは肝臓傷害により死亡す
る。20グラムのマウスでは0.1−0.2μgが致死
量となる。第4表は、ドメインIaを欠失しているPE
はマウスに対する毒性を著しく減じるものであることを
示している。マウスの腹腔内に、天然PEまたはドメイ
ンIaを欠如している天然PEを注射した。天然PE
1.0μgを投与されたすべてのマウスと、0.2μg
のPEを投与された1/2のマウスが40時間で死ん
だ。PE Ia50μgを投与された3匹のマウスの内
2匹が死んだ。PE Ia20μgを投与されたすべて
のマウスは生存した。PE Iaを5μgを投与された
すべてのマウスも生存した。従って、PE Iaは天然
PEより体重当りの毒性が100分の1より少なかっ
た。 【0031】修飾されたシュードモナスエクソトキシン
の組換え体を利用した遺伝子融合 本発明の修飾PEのためのPEの遺伝子のうち、特にp
JH8に含まれる遺伝子を、ヒトα形質転換成長因子
(a−TGF)又はヒトインターロイキン2(IL−
2)をコードしているDNA配列と融合した。例7と8
にこれらの遺伝子融合の詳細を示した。ペプチドホルモ
ン、成長因子、またはその特異的受容体が細胞表面に存
在する他のいかなるポリペプチド細胞認識蛋白との融合
においても、修飾されたPEの使用は適している。いく
つかの実施例はインシュリン、グルカゴン、エンドルフ
ィン、成長ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、トラ
ンスフェリン、ボンベシン、低密度のリポ蛋白、黄体形
成ホルモン(luteinizing nor mor
e)、アシアログリコ蛋白を含んでいる。 【0032】例 例1 第1表に示すように、本発明のプロセスは、異なったサ
イズのPE構造遺伝子とT7後期プロモーターの融合を
含んだいくつかのプラスミドを構成するために用いられ
た。pJH2は、修飾リーダー配列をコードする断片を
前方に有する、無傷のPE構造遺伝子を含んでいる。p
JH4は、アミノ末端にメチオニンコドンを付加した無
傷のPE構造遺伝子を含んでいる。pJH7は、PEの
構造ドメインIII (アミノ酸405−613)をコード
する遺伝子を含んでいる。pJH8は、pEの構造ドメ
インII、Ib及びIII (アミノ酸253−613)をコ
ードする遺伝子を含んでいる。pJH13は、アミノ酸
253−307を含む構造ドメインIIの最初の半分を欠
失したPEをコードしている。PJH14はPEの構造
ドメインIa(アミノ酸1−252)をコードしてい
る。pJH17は、構造ドメインIbから20のアミノ
酸の付加近接配列を有した、構造ドメインIIIをコード
している(アミノ酸385−613)。 【0033】pJH1は天然PE(pE0)をBamH
Iで部分的に切断し、そして、直鎖伏のDNAを溶出さ
せ、EcoRIで完全に切って構成された。pE0から
誘導された2.0kbのDNA断片は、2つの末端にB
amHIとEcoRIのサイトを持ち、BamHIとE
coRIで完全に切られたpAR2156に挿入され
た。 【0034】pJH2はpJH1をBamHIで部分的
に切断することによって構成された。直鎖状のDNAが
分離され、NdeIで完全に切られた。610kbのD
NA断片は下記の合成オリゴヌクレオチド二重鎖と連結
してpJH2を構成するために保存された。 5’TATGAAAAA ACTTTTTCTAG5’ 【0035】pJH4はpJH2をTaqIで部分的に
切断することによって構成された。直鎖状のDNA(6
10kb)が分離され、NdeIで完全に切られた。最
も大きいDNA断片(5.9kb)が分離され、下記の
合成オリゴヌクレオチド重鎖と連結された。 5’TATGGCCGAAGAAGCTTT ACCGGCTTCTTCGAAAGC5’ これはHindIII サイト…… AAGCTT TTCGAA を含んでいる 【0036】pJH7はpJH4をAatIIで部分的に
切断することによって構成された。直鎖状のDNA
(5.9kb)が分離され、HindIII で完全に切ら
れた。分離後AatIIとHindIII のサイ卜を持った
4. 7kbのDNA断片を、付着蛋白を除くためにS1
核酸分解酵素を加えてインキベートし、続いてT4リガ
ーゼで連結した。 【0037】pJH8は発明の詳細な開示に記載した様
にして構成される。 【0038】pJH13はpJH4をAvaIで部分的
に切断するとによって構成された。直鎖状のDNAが分
離され、EcoRIで完全に切られた。両端にAvaI
とEcoRIの切断末端を持った4.7kbのDNA断
片を、付着端を除くためにS1を加えてインキベートし
た(DNA断片1)。pJH4をSalIで部分的に切
断した。次いで、直鎖状になったDNA断片をEcoR
Iで完全に切断した。末端にSalIとEcoRIのサ
イトを持った1.0kbのDNA断片を、Klenow
DNAポリメラーゼI及びdNTPと共にインキュベー
トし、付着端を埋めた(DNA断片2)。DNA断片1
(4.7kb)とDNA断片2(1.0kb)を一昼夜
4℃で連結した。 【0039】pJH14はpJH4をAvaIで部分的
に切断して構成された。直鎖状のDNAがEcoRIで
完全に切られた。末端にAvaIとEcoRIのサイト
を持った4. 7kbのDNA断片を、付着端を埋めるた
めにS1加えてインキュベトし、続いてT4リガーゼで
連結した。 【0040】pJH17は発明の詳細な説明に記載した
様にして構成される。 【0041】例2 組換え毒素(実施例1で述べたプラスミドにより製造さ
れた)の量と活性がSDS−AGE、ADPリボシル化
と細胞破壊活性により測定された。結果を第1にまとめ
た。 【0042】 【表1】【0043】例3 発明の組換え毒素の特性を試すために、実験をした。結
果を2表にまとめた。 【0044】 【表2】 【0045】例4 天然PEの存在あるいは非存在下で、種々の欠失の細胞
蛋白合成への影響を決定した。結果を第3表に示した。
構造ドメインIa(pJH14)及び構造ドメインIと
構造ドメインIIの半分及びIII (pJH13)とを、音
波処理した細胞の沈澱から8M尿素で抽出した。組換え
蛋白3−5μgに匹敵するそれぞれの抽出液10μlを
検定に用いた。構造ドメインII、Ib、III (pJH
8)は音波処理したBL21(DE3 )/pJH8細胞
の上澄に存在した。組換え毒素2μgに匹敵する抽出液
10μlを使用した。第3表に示すように、細胞は0.
1μg/mlの天然PEの存在あるいは非存在下で15
分間処理され、その後1mlのDMEMで洗われ、DM
EMと0.2%のBSA中で4時間インキュベートし、
次いで3 Hロイシンと共に1時間インキュベートした。 【0046】 【表3】【0047】例5 第4表に示すように、Balb/cマウスに、殺菌済み
の生理食塩水1.0ml及び殺菌済みのヒトアルプミン
10mg/ml中に含まれている種々の量のPEまたは
PEIaを腹腔内注射することにより、マウスにおける
致死量が決定された。動物は2週間に亘って毎日観察さ
れた。すべての死は48時間で起こった。 【0048】 【表4】 【0049】例6 第3図および第4図に示すように、pJH8をジスルフ
ィド結合によってヒトトランスフェリン受容体に対する
抗体(PE45−HB21)に結合することによって生産
された45kDの蛋白よりなるイムノトキンンは、トラ
ンスフェリン受容体(ID503ng/ml)を発現した
ヒト細胞を破壊する。上記のイムノトキシンはヒトトラ
ンスフェリン受容体を発現していないマウス紬胞に対し
ては1000ng/mlでもほとんどあるいは全く影響
がない。これに反して、ジスルフィド結合によってHB
21に結合された天然PEは、29ng/mlのID50
で非特異的にマウス細胞を破壊する。第3図および第4
図のデータは、PE45−HB21の非特異的毒性がPE
−HB21の100分の1ほど少ないことを示してい
る。 【0050】続いて、PE45の分子量が再び測定され
た。分子量は40,000であることが分かった。 【0051】例7 α形質転換成長因子PE融合遺伝子
の構成 AvaIIサイトをほとんど持っていない小さいプラスミ
ドpVC8を構成するために、pJH8をTth111
IとSphIで処理した。pVC31を作製するために
pVC8をAvaIIで部分的に切断し、STuIサイ
ト、Tth111Iサイト及び停止コドンを含む合成オ
リゴヌクレオチド(30bp)に連結した。pVC31
をTth111Iで切断し、DNAポリメラーゼ断片で
あるKlenow断片を用いて満たし、α−TGF遺伝
子(pvC33)を含むブラント末端クローンに連結し
た。α−TGF遺伝子、P−hTGF−10−925
[Derynck etal、細胞、38:287−2
97(1984)〕をEcoRIとBglIで切って3
22bp断片を得、分離し、Fnu 4HIで切り、T
4ポリメラーゼで処理して152bp断片を得、次いで
PE−αTGF融合遺伝子を製造するためにこの断片を
PVC31に連結した。大腸菌内で発現させると、この
プラスミドは、α−TGFに対する抗体およびPEと反
応する分子量51,000の蛋白を生産した。 【0052】例8 IL−2−PE融合遺伝子の構成 AvaIIによってpVC8を1190の位置で、切断
し、3.6断片を分離し、その一本鎖末端をKleno
w酵素を用いて埋め、脱リン化して断片Iを得た。IL
一2の1kDの断片を得るために、クローンPST−5
〔Ga110ら、PNAS、(81:2543−254
7(1984)]をPstIで切断してIL−2の1k
D断片を得、次いで該断片を105と669の位置でB
sp1286で切り、T4ポリメラーゼで処理して末端
を埋めた。564bp断片を断片Iに連結してPHL−
1を製造し、BL21発現細胞に形質転換した。誘導に
より、IL−2とPEに対する抗体に反応し、かつAD
Pリボシル化活性を有する60kDの蛋白が生産され
た。 【0053】寄託の表示以下のプラスミドは、Rock
vil1e、MarylandのAmerican T
ype Culture Collectionに、そ
れぞれATCC番号を付してこの出願前に寄託されてい
る。また、この出願が特許されたときには、寄託の日も
しくは最後の寄託申請から5年後の日から30年または
特許存続期間のうちの最も長い期間だけは維持される。
もし、寄託の間に株が突然変異したり、生育不能になっ
たりした場合は取替えられる。 pJH12 ATCC 67205 pJHL−1 ATCC 67206 pVC33 ATCC 67207 pJH8 ATCC 67208 pJH14 ATCC 67209
【図面の簡単な説明】
【図1】第1図は、PEの異なったドメインの発現に使
用される本発明のプラスミドの構築を示している。 【図2】第2図は、本発明の一部分として製造される異
なったサイズのPE分子の簡略マップである。 【図3】第3図は、ヒトKB細胞での蛋白合成に対する
PE45−HB21とPE−HB21の影響を示してい
る。PE45はプラスミドpJH8によりコードされるド
メインIを欠失した毒素蛋白である。細胞は適当なイム
ノトキシンとともに24時間インキュベートされ、3 H
−ロイシンとともに1時間インキュベートされた。蛋白
内への3 H−ロイシンの取込みを測定した。パネル3B
において、Swiss3T3細胞は天然シュードモナス
トキシン(PE)、HB21に結合した天然シュードモ
ナストキシン、またはPE45のみ若しくはHB21と結
合したPE45のいずれかと24時間インキュベートされ
た。細胞をこれらの薬剤に24時間さらし、上記の方法
で蛋白合成を測定した。 【図4】第4図は、ヒトKB細胞での蛋白合成に対する
PE45−HB21とPE−HB21の影響を示してい
る。PE45はプラスミドpJH8によりコードされるド
メインIを欠失した毒素蛋白である。細胞は適当なイム
ノトキシンとともに24時間インキュベートされ、3 H
−ロイシンとともに1時間インキュベートされた。蛋白
内への3 H−ロイシンの取込みを測定した。パネル3B
において、Swiss3T3細胞は天然シュードモナス
トキシン(PE)、HB21に結合した天然シュードモ
ナストキシン、またはPE45のみ若しくはHB21と結
合したPE45のいずれかと24時間インキュベートされ
た。細胞をこれらの薬剤に24時間さらし、上記の方法
で蛋白合成を測定した。
用される本発明のプラスミドの構築を示している。 【図2】第2図は、本発明の一部分として製造される異
なったサイズのPE分子の簡略マップである。 【図3】第3図は、ヒトKB細胞での蛋白合成に対する
PE45−HB21とPE−HB21の影響を示してい
る。PE45はプラスミドpJH8によりコードされるド
メインIを欠失した毒素蛋白である。細胞は適当なイム
ノトキシンとともに24時間インキュベートされ、3 H
−ロイシンとともに1時間インキュベートされた。蛋白
内への3 H−ロイシンの取込みを測定した。パネル3B
において、Swiss3T3細胞は天然シュードモナス
トキシン(PE)、HB21に結合した天然シュードモ
ナストキシン、またはPE45のみ若しくはHB21と結
合したPE45のいずれかと24時間インキュベートされ
た。細胞をこれらの薬剤に24時間さらし、上記の方法
で蛋白合成を測定した。 【図4】第4図は、ヒトKB細胞での蛋白合成に対する
PE45−HB21とPE−HB21の影響を示してい
る。PE45はプラスミドpJH8によりコードされるド
メインIを欠失した毒素蛋白である。細胞は適当なイム
ノトキシンとともに24時間インキュベートされ、3 H
−ロイシンとともに1時間インキュベートされた。蛋白
内への3 H−ロイシンの取込みを測定した。パネル3B
において、Swiss3T3細胞は天然シュードモナス
トキシン(PE)、HB21に結合した天然シュードモ
ナストキシン、またはPE45のみ若しくはHB21と結
合したPE45のいずれかと24時間インキュベートされ
た。細胞をこれらの薬剤に24時間さらし、上記の方法
で蛋白合成を測定した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12R 1:19)
(73)特許権者 597072800
サンカー・アドヒャ
Sankar ADHYA
アメリカ合衆国、メリーランド州
20878 ガイザーズバーグ、キングス・
グラント・ストリート 14400
(72)発明者 イラ・エッチ・パスタン
アメリカ合衆国、メリーランド州
20854 ポトマック、ビオール・マウン
テイン・ロード 11710
(72)発明者 ダビッド・ジェイ・フィッツゲラルド
アメリカ合衆国、メリーランド州
20902 シルバー・スプリング、ラッ
ド・ストリート 1731
(72)発明者 サンカー・アドヒャ
アメリカ合衆国、メリーランド州
20878 ガイザーズバーグ、キングス・
グラント・ストリート 14400
(58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名)
C12N 15/09 ZNA
C12N 1/21
BIOSIS(DIALOG)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.ADPリボシル化活性および細胞膜を介してトラン
スロケーションする能力を具備する修飾されたシュード
モナスエクソトキシンをコードするDNAを含有する発
現プラスミドであって、前記修飾されたエクソトキシン
が、修飾されていないシュードモナスエクソトキシンに
比較して、in vitroでヒトまたは動物細胞に対してより
低い毒性で、かつ、in vivo で投与した場合に肝臓に対
してより低い毒性の修飾された毒素となるのに十分な、
天然の毒素の受容体結合ドメインIaの修飾を具備する
もの。 2.ADPリボシル化活性および細胞膜を介してトラン
スロケーションする能力を具備する修飾されたシュード
モナスエクソトキシンを含有する複合体をコードするD
NAを含有する発現プラスミドであって、前記修飾され
たエクソトキシンが、ターゲッティングキャリアーに融
合された修飾されていないシュードモナスエクソトキシ
ンに比較して、in vitroでヒトまたは動物細胞に対して
より低い毒性で、かつ、in vivo で投与した場合に肝臓
に対してより低い毒性の修飾された毒素となるのに十分
な、天然の毒素の受容体結合ドメインIaの修飾を具備
するものであり、前記複合体が標的細胞膜上の受容体若
しくは抗原に結合するもの。 3.請求項2に記載の発現プラスミドであって、前記タ
ーゲッティングキャリアーが、抗体、ホルモン、成長因
子、サイトカイン、または他の細胞認識蛋白質よりなる
群から選択されるもの。 4.請求項2に記載の発現プラスミドであって、前記タ
ーゲッティングキャリアーが抗体であるもの。 5.請求項3に記載のプラスミドであって、前記成長因
子がTFG−αであるもの。 6.請求項3に記載のプラスミドであって、前記サイト
カインがインターロイキン−2であるもの。 7.請求項4に記載のプラスミドであって、前記抗体が
抗トランスフェリン受容体抗体であるもの。 8.ADPリボシル化活性および細胞膜を介してトラン
スロケーションする能力を具備する修飾されたシュード
モナスエクソトキシンをコードするDNAを含有する発
現プラスミドであって、前記修飾されたエクソトキシン
が、修飾されていないシュードモナスエクソトキシンに
比較して、in vitroでヒトまたは動物細胞に対してより
低い毒性で、かつ、in vivo で投与した場合に肝臓に対
してより低い毒性の修飾された毒素となるのに十分な、
天然の毒素の受容体結合ドメインIaの修飾を具備する
プラスミドを含有するホスト細胞。 9.ADPリボシル化活性および細胞膜を介してトラン
スロケーションする能力を具備する修飾されたシュード
モナスエクソトキシンを含有する複合体をコードするD
NAを含有する発現プラスミドであって、前記修飾され
たエクソトキシンが、ターゲッティングキャリアーに融
合された修飾されていないシュードモナスエクソトキシ
ンに比較して、in vitroでヒトまたは動物細胞に対して
より低い毒性で、かつ、in vivo で投与した場合に肝臓
に対してより低い毒性の修飾された毒素となるのに十分
な、天然の毒素の受容体結合ドメインIaの修飾を具備
するものであり、前記複合体が標的細胞膜上の受容体若
しくは抗原に結合するものを含有するホスト細胞。 10.請求項9に記載のホスト細胞であって、前記ター
ゲッティングキャリアーが、抗体、ホルモン、成長因
子、サイトカイン、または他の細胞認識蛋白質よりなる
群から選択されるもの。 11.請求項9に記載のホスト細胞であって、前記ター
ゲッティングキャリアーが抗体であるもの。 12.請求項10に記載のホスト細胞であって、前記成
長因子がTFG−αであるもの。 13.請求項10に記載のホスト細胞であって、前記サ
イトカインがインターロイキン−2であるもの。 14.請求項11に記載のホスト細胞であって、前記抗
体が抗トランスフェリン受容体抗体であるもの。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US911227 | 1986-09-24 | ||
US06/911,227 US4892827A (en) | 1986-09-24 | 1986-09-24 | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62505905A Division JP2848489B2 (ja) | 1986-09-24 | 1987-09-22 | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10324676A Division JP3053087B2 (ja) | 1986-09-24 | 1998-11-16 | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10136988A JPH10136988A (ja) | 1998-05-26 |
JP2960697B2 true JP2960697B2 (ja) | 1999-10-12 |
Family
ID=25429936
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62505905A Expired - Lifetime JP2848489B2 (ja) | 1986-09-24 | 1987-09-22 | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 |
JP9135626A Expired - Fee Related JP2960697B2 (ja) | 1986-09-24 | 1997-05-26 | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 |
JP10324676A Expired - Lifetime JP3053087B2 (ja) | 1986-09-24 | 1998-11-16 | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62505905A Expired - Lifetime JP2848489B2 (ja) | 1986-09-24 | 1987-09-22 | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10324676A Expired - Lifetime JP3053087B2 (ja) | 1986-09-24 | 1998-11-16 | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US4892827A (ja) |
EP (2) | EP0583794B1 (ja) |
JP (3) | JP2848489B2 (ja) |
KR (1) | KR970001563B1 (ja) |
AT (2) | ATE311442T1 (ja) |
AU (1) | AU618722B2 (ja) |
CA (1) | CA1336691C (ja) |
DE (2) | DE3789587T2 (ja) |
DK (2) | DK173301B1 (ja) |
ES (2) | ES2074042T3 (ja) |
FI (1) | FI105271B (ja) |
IE (1) | IE66223B1 (ja) |
IL (2) | IL105160A (ja) |
NO (1) | NO180270C (ja) |
NZ (1) | NZ221923A (ja) |
PT (1) | PT85777B (ja) |
SG (1) | SG96159A1 (ja) |
WO (1) | WO1988002401A1 (ja) |
ZA (1) | ZA877153B (ja) |
Families Citing this family (157)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5668255A (en) * | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
US6022950A (en) * | 1984-06-07 | 2000-02-08 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
US5169939A (en) * | 1985-05-21 | 1992-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College | Chimeric antibodies |
US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
US6051405A (en) * | 1986-09-24 | 2000-04-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins |
WO1989010971A1 (en) * | 1988-05-09 | 1989-11-16 | The United States Of America, As Represented By Th | Vector for secretion of proteins directly into periplasm or culture medium |
US5206353A (en) * | 1988-07-23 | 1993-04-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | CD-4/cytotoxic gene fusions |
US5169933A (en) * | 1988-08-15 | 1992-12-08 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
US5135736A (en) * | 1988-08-15 | 1992-08-04 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
US5149782A (en) * | 1988-08-19 | 1992-09-22 | Tanox Biosystems, Inc. | Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents |
ZA898139B (en) * | 1988-11-17 | 1990-08-29 | Hoffmann La Roche | Recombinant interleukin-2 hybrid proteins |
DE69025211T2 (de) * | 1989-02-17 | 1996-09-19 | Merck & Co Inc | Protein-Antikrebsmittel |
US6406697B1 (en) * | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
IL93723A (en) * | 1989-03-22 | 1997-02-18 | Merck & Co Inc | Cystein modified truncated pseudomonas exotoxin A |
US5621078A (en) * | 1989-03-22 | 1997-04-15 | Merck & Co., Inc. | Modified pseudomonas exotoxin PE40 |
JPH0829101B2 (ja) * | 1989-04-21 | 1996-03-27 | アメリカ合衆国 | 組換え抗体―毒素融合タンパク質 |
US6207798B1 (en) | 1989-08-03 | 2001-03-27 | Merck & Co., Inc. | Modified PE40 toxin fusion proteins |
US5672683A (en) * | 1989-09-07 | 1997-09-30 | Alkermes, Inc. | Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein |
US6329508B1 (en) | 1989-09-07 | 2001-12-11 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor reactive chimeric antibodies |
US5977307A (en) * | 1989-09-07 | 1999-11-02 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins |
US5527527A (en) * | 1989-09-07 | 1996-06-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
CA2071946A1 (en) * | 1989-12-21 | 1991-06-22 | Ira H. Pastan | Toxin for construction of immunotoxins |
US5458878A (en) * | 1990-01-02 | 1995-10-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | P. exotoxin fusio proteins have COOHG220101al alterations which increase cytotoxicity |
AU644139B2 (en) * | 1990-01-02 | 1993-12-02 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin |
US5110912A (en) * | 1990-03-02 | 1992-05-05 | Seragen, Inc. | Purification of il-2-containing hybrid compounds |
DE69131449T2 (de) * | 1990-05-11 | 1999-11-25 | The United States Of America, Represented By The Secretary | Verbesserte exotoxine aus pseudomonas mit geringer toxität bei tieren und hoher zelltötender aktivität |
IL98528A0 (en) * | 1990-06-21 | 1992-07-15 | Merck & Co Inc | Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells |
US5241053A (en) * | 1990-09-05 | 1993-08-31 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Fused proteins comprising glycoprotein gD of HSV-1 and LTB |
US6099842A (en) * | 1990-12-03 | 2000-08-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin |
US5571894A (en) * | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
EP0529033B1 (fr) * | 1991-02-08 | 2006-08-30 | Aventis Pharma S.A. | Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines alpha des recepteurs des lymphocytes humains ainsi que leurs applications |
FR2672616B1 (fr) * | 1991-02-08 | 1994-09-23 | Roussel Uclaf | Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines alpha des recepteurs de lymphocytes t humains, segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et therapeutiques. |
IE920447A1 (en) * | 1991-02-12 | 1992-08-12 | Roussel Uclaf | NUCLEOTIDE SEQUENCES CODING FOR ß-CHAIN VARIABLE REGIONS OF¹HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTORS, CORRESPONDING PEPTIDE SEGMENTS¹AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS |
US5328984A (en) * | 1991-03-04 | 1994-07-12 | The United States As Represented By The Department Of Health & Human Services | Recombinant chimeric proteins deliverable across cellular membranes into cytosol of target cells |
US5223604A (en) * | 1991-06-25 | 1993-06-29 | S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated | Pseudomonas exoenzyme s peptide composition and method |
US5939531A (en) * | 1991-07-15 | 1999-08-17 | Novartis Corp. | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
CA2081952A1 (en) * | 1991-11-08 | 1993-05-09 | John J. Donnelly | Recombinant dna sequences and plasmids for cellular immunity vaccines from bacterial toxin-antigen conjugates, and methods of their use |
JP3553933B2 (ja) * | 1992-06-18 | 2004-08-11 | アメリカ合衆国 | 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素 |
GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
US6015555A (en) * | 1995-05-19 | 2000-01-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
JPH11513669A (ja) * | 1995-10-13 | 1999-11-24 | アメリカ合衆国 | ジスルフィド安定化抗体フラグメントを含む免疫毒素 |
WO1997031948A1 (en) | 1996-03-01 | 1997-09-04 | Novartis Ag | Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy |
WO1998020135A2 (en) | 1996-11-06 | 1998-05-14 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Protease-activatable pseudomonas exotoxin a-like proproteins |
US6818222B1 (en) | 1997-03-21 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
US20030198772A1 (en) * | 1997-06-26 | 2003-10-23 | Weder Donald E. | Polymeric materials having a texture or appearance simulating the texture or appearance of paper |
US20020004113A1 (en) * | 1997-06-26 | 2002-01-10 | Weder Donald E. | Decorative cover for flower pot or floral grouping formed of polymeric materials having a texture or appearance simulating the texture or appearance of paper |
US20030054012A1 (en) * | 2000-05-12 | 2003-03-20 | Fitzgerald David J. | Pseudomonas exotoxin a-like chimeric immunogens for eliciting a secretory iga-mediated immune response |
US7314632B1 (en) * | 1997-07-11 | 2008-01-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin A-like chimeric immunogens |
CA2295971C (en) * | 1997-07-11 | 2011-02-08 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Pseudomonas exotoxin a-like chimeric immunogens |
US6077676A (en) * | 1997-12-18 | 2000-06-20 | Spectral Diagnostics, Inc. | Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C |
US6794128B2 (en) | 1998-04-24 | 2004-09-21 | The Regents Of The University Of California | Methods of selecting internalizing antibodies |
US7244826B1 (en) | 1998-04-24 | 2007-07-17 | The Regents Of The University Of California | Internalizing ERB2 antibodies |
AU2004201055B2 (en) * | 1998-04-24 | 2007-08-23 | The Regents Of The University Of California | Internalizing ErbB2 antibodies |
US20020142000A1 (en) * | 1999-01-15 | 2002-10-03 | Digan Mary Ellen | Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor |
US20030103948A1 (en) * | 1999-06-07 | 2003-06-05 | Neorx Corporation | Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof |
US20030143233A1 (en) * | 1999-06-07 | 2003-07-31 | Neorx Corporation | Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof |
US7144991B2 (en) | 1999-06-07 | 2006-12-05 | Aletheon Pharmaceuticals, Inc. | Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof |
US6838553B1 (en) * | 1999-10-05 | 2005-01-04 | Academia Sinica | Peptide repeat immunogens |
US7078486B2 (en) * | 1999-12-10 | 2006-07-18 | Spectral Diagnostics, Inc. | Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C |
US20050287638A1 (en) * | 2000-04-25 | 2005-12-29 | Weigel Paul H | Hyaluronan receptor for endocytosis, variants thereof, and methods of making and using same |
CA2410024A1 (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-01 | The Board Of Regents Of The University Oklahoma | Identification and uses of a hyaluronan receptor |
US20030104987A1 (en) * | 2001-04-25 | 2003-06-05 | Weigel Paul H. | Methods of using the hyaluronan receptor for endocytosis |
DE60137969D1 (de) * | 2000-12-21 | 2009-04-23 | Us Gov Health & Human Serv | Ein chimäres protein das nichttoxische pseudomonas exotoxin a und typ iv pilin sequenzen enthält |
ATE468348T1 (de) | 2001-09-26 | 2010-06-15 | Government Of The Us Secretary | Mutierte anti-cd22-antikörper mit erhöhter affinität zu cd22-exprimierenden leukämiezellen |
JP2005508375A (ja) * | 2001-11-09 | 2005-03-31 | ネオファーム、インコーポレイティッド | Il−13を発現する腫瘍の選択的治療 |
WO2004087758A2 (en) * | 2003-03-26 | 2004-10-14 | Neopharm, Inc. | Il 13 receptor alpha 2 antibody and methods of use |
EP1635868A1 (en) | 2003-04-30 | 2006-03-22 | Uwe Zangemeister-Wittke | Methods for treating cancer using an immunotoxin |
AU2004293471C1 (en) * | 2003-11-25 | 2011-02-24 | The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Mutated anti-CD22 antibodies and immunoconjugates |
WO2006039238A2 (en) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Irta2 antibodies and methods of use |
CA2583226A1 (en) | 2004-10-04 | 2006-04-20 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for immunizing against pseudomonas infection |
JP2008515808A (ja) * | 2004-10-04 | 2008-05-15 | トリニティ バイオシステムズ インコーポレーテッド | 針不用の高分子送達のための方法及び組成物 |
CA2591992A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | The Salk Institute For Biological Studies | Compositions and methods for producing recombinant proteins |
EP1885393A4 (en) | 2005-05-18 | 2011-03-02 | Childrens Hosp & Res Ct Oak | METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST CHLAMYDIA INFECTIONS |
ES2564092T3 (es) | 2005-07-29 | 2016-03-17 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida |
US20070148131A1 (en) * | 2005-12-05 | 2007-06-28 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of binding partners |
US7666991B2 (en) * | 2005-12-05 | 2010-02-23 | Trinity Biosystems, Inc. | Compositions for needleless delivery of antibodies |
WO2007109110A2 (en) | 2006-03-16 | 2007-09-27 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs |
EP1878744A1 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-16 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) | Epitope-tag for surface-expressed T-cell receptor proteins, uses thereof and method of selecting host cells expressing them |
US20090092660A1 (en) * | 2006-08-09 | 2009-04-09 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of particles |
EP2178559B1 (en) | 2007-07-20 | 2015-06-24 | The General Hospital Corporation | Recombinant vibrio cholerae exotoxins |
US8871906B2 (en) | 2007-09-04 | 2014-10-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Deletions in domain II of pseudomonas exotoxin a that remove immunogenic epitopes |
CN108129573B (zh) * | 2007-09-21 | 2021-10-08 | 加利福尼亚大学董事会 | 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性 |
JP5836125B2 (ja) | 2008-10-16 | 2015-12-24 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | 高分子量メラノーマ関連抗原に対する完全ヒト抗体およびその使用 |
WO2011031441A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-17 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Therapy with a chimeric molecule and a pro-apoptotic agent |
AU2010292069B2 (en) | 2009-09-11 | 2015-08-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Improved Pseudomonas Exotoxin A with reduced immunogenicity |
WO2011100455A1 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Inhibition of antibody responses to foreign proteins |
CA2793978C (en) | 2010-03-30 | 2021-08-03 | Pfenex Inc. | High level expression of recombinant toxin proteins |
US8497354B2 (en) | 2010-06-16 | 2013-07-30 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Antibodies to endoplasmin and their use |
US9580461B2 (en) | 2010-07-30 | 2017-02-28 | Medimmune, Llc | Method for purifying active polypeptides or immunoconjugates |
US11246915B2 (en) | 2010-09-15 | 2022-02-15 | Applied Molecular Transport Inc. | Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo |
DK2646470T3 (en) * | 2010-11-30 | 2017-05-08 | Hoffmann La Roche | ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES WITH LOW AFFINITY AND ITS USE FOR TRANSPORTING THERAPEUTIC SCFV OVER THE BLOOD-BRAIN BARRIER |
US9206257B2 (en) | 2011-04-19 | 2015-12-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof |
CN103748107B (zh) | 2011-06-09 | 2020-06-02 | 美利坚合众国, 由健康及人类服务部部长代表 | 具有免疫原性较小的t细胞和/或b细胞表位的假单胞菌外毒素a |
US8932586B2 (en) | 2011-09-06 | 2015-01-13 | Intrexon Corporation | Modified forms of Pseudomonas exotoxin A |
WO2013039916A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Compositions for and methods of treatment and enhanced detection of non-pituitary tumors |
US9206240B2 (en) | 2011-09-16 | 2015-12-08 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Helath and Human Services | Pseudomonas exotoxin A with less immunogenic B cell epitopes |
CA2848842C (en) | 2011-10-04 | 2020-09-29 | King's College London | Ige anti -hmw-maa antibody |
US9169304B2 (en) | 2012-05-01 | 2015-10-27 | Pfenex Inc. | Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
SG11201407972RA (en) | 2012-06-01 | 2015-01-29 | Us Health | High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof |
CA2882753C (en) | 2012-08-21 | 2021-08-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof |
CN104955845B (zh) | 2012-09-27 | 2018-11-16 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法 |
US9803021B2 (en) | 2012-12-07 | 2017-10-31 | The Regents Of The University Of California | CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities |
US9764006B2 (en) | 2012-12-10 | 2017-09-19 | The General Hospital Corporation | Bivalent IL-2 fusion toxins |
JP6553515B2 (ja) | 2012-12-20 | 2019-07-31 | メディミューン,エルエルシー | 免疫複合体の製造方法 |
WO2014160627A1 (en) | 2013-03-25 | 2014-10-02 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-cd276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors |
WO2014194100A1 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | The Regents Of The University Of California | Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy |
EP3038641B1 (en) | 2013-10-06 | 2019-04-17 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Modified pseudomonas exotoxin a |
EP3054987B1 (en) | 2013-10-11 | 2019-10-09 | The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Tem8 antibodies and their use |
US20160280798A1 (en) | 2013-11-06 | 2016-09-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Service | Alk antibodies, conjugates, and chimeric antigen receptors, and their use |
US10246505B2 (en) | 2013-11-25 | 2019-04-02 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric antigen receptors to control HIV infection |
EP3102245B1 (en) | 2014-02-05 | 2021-09-08 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
US10624955B2 (en) | 2014-05-07 | 2020-04-21 | Applied Molecular Transport Inc. | Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo |
EP3473271B1 (en) | 2014-07-31 | 2022-07-20 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Human monoclonal antibodies against epha4 and their use |
CA2961609C (en) | 2014-09-17 | 2023-03-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-cd276 antibodies (b7h3) |
WO2016146833A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance |
CA2981509A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | The Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Educ. On Behalf Of The University Of Nevada, La | Compositions comprising talens and methods of treating hiv |
EP3314250A4 (en) | 2015-06-26 | 2018-12-05 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Cancer therapy targeting tetraspanin 33 (tspan33) in myeloid derived suppressor cells |
US11078286B2 (en) | 2015-09-20 | 2021-08-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies specific for fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) and methods of their use |
US10772946B2 (en) | 2015-10-13 | 2020-09-15 | Sanofi Pasteur | Immunogenic compositions against S. aureus |
EP3184547A1 (en) | 2015-10-29 | 2017-06-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-tpbg antibodies and methods of use |
WO2017083511A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-bcma polypeptides and proteins |
WO2017196847A1 (en) | 2016-05-10 | 2017-11-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens |
WO2017214182A1 (en) | 2016-06-07 | 2017-12-14 | The United States Of America. As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Fully human antibody targeting pdi for cancer immunotherapy |
EP3494135A1 (en) | 2016-08-02 | 2019-06-12 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof |
WO2018119279A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies specific for flt3 and uses thereof |
WO2018213612A1 (en) | 2017-05-18 | 2018-11-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-mesothelin polypeptides and proteins |
US11389480B2 (en) | 2017-05-19 | 2022-07-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibody targeting TNFR2 for cancer immunotherapy |
WO2019005208A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | ANTIBODIES TO HUMAN MESOTHELIN AND USES IN ANTICANCER THERAPY |
CA3066953A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Lentigen Technology, Inc. | Human monoclonal antibodies specific for cd33 and methods of their use |
WO2019051204A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | SYNERGISTIC COMBINATION OF IL4, INTERFERON GAMMA AND INTERFERON ALPHA RECEPTOR AGENTS FOR USE IN THE TREATMENT OF OVARIAN CANCER |
US11795235B2 (en) | 2017-09-18 | 2023-10-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Immunotoxins with albumin binding domain |
US11198722B2 (en) | 2017-10-06 | 2021-12-14 | University Of Utah Research Foundation | Immune tolerant elastin-like peptide tetramer guided nanoparticles and methods of use |
PL3762009T3 (pl) | 2018-03-08 | 2022-09-12 | Applied Molecular Transport Inc. | Pochodzące z toksyny konstrukty dostarczające do dostarczania doustnego |
WO2020014482A1 (en) | 2018-07-12 | 2020-01-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Affinity matured cd22-specific monoclonal antibody and uses thereof |
CN112585163B (zh) | 2018-08-08 | 2025-03-25 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2的高亲和力单克隆抗体及其用途 |
KR102353086B1 (ko) * | 2018-09-07 | 2022-01-20 | 아주대학교산학협력단 | 신규 면역독소 제조방법 |
WO2020096695A1 (en) | 2018-11-07 | 2020-05-14 | Applied Molecular Transport Inc. | Cholix-derived carriers for oral delivery of heterologous payload |
JP7516369B2 (ja) | 2018-11-07 | 2024-07-16 | アプライド モレキュラー トランスポート インコーポレイテッド | トランスサイトーシスのための送達構築物および関連する方法 |
CN113490510B (zh) | 2019-01-08 | 2025-02-14 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 用于治疗实体瘤的靶向间皮素的跨物种单结构域抗体 |
AU2020212534A1 (en) | 2019-01-22 | 2021-07-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use |
EP3927731A4 (en) | 2019-02-19 | 2022-12-28 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Bispecific immunotoxins targeting human cd25+ccr4+ tumors and regulatory t-cells |
WO2021003297A1 (en) | 2019-07-02 | 2021-01-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies that bind egfrviii and their use |
PH12022550330A1 (en) | 2019-08-16 | 2023-02-06 | Applied Molecular Transport Inc | Compositions, formulations, and interleukin production and purification |
AU2020370125A1 (en) | 2019-10-22 | 2022-05-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | High affinity nanobodies targeting B7H3 (CD276) for treating multiple solid tumors |
WO2021097289A1 (en) | 2019-11-15 | 2021-05-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Pegylated recombinant immunotoxins |
WO2021173674A1 (en) | 2020-02-26 | 2021-09-02 | A2 Biotherapeutics, Inc. | Polypeptides targeting mage-a3 peptide-mhc complexes and methods of use thereof |
WO2022093745A1 (en) | 2020-10-26 | 2022-05-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof |
CN116583539A (zh) | 2020-12-22 | 2023-08-11 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗il-4r抗体或其抗原结合片段的复合物及医药用途 |
US20240218055A1 (en) | 2021-04-29 | 2024-07-04 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use |
AU2022291120A1 (en) | 2021-06-09 | 2023-11-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors |
US20240417446A1 (en) | 2021-10-26 | 2024-12-19 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein |
CA3240254A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-mesothelin polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors |
WO2024050399A1 (en) | 2022-09-01 | 2024-03-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes |
WO2024104584A1 (en) | 2022-11-17 | 2024-05-23 | University Of Cape Town | Deimmunized pseudomonas exotoxin a |
WO2024238346A1 (en) | 2023-05-12 | 2024-11-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies that specifically bind the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein and compositions and uses thereof |
WO2025014896A1 (en) | 2023-07-07 | 2025-01-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Humanized 40h3 antibody |
WO2025019228A1 (en) | 2023-07-20 | 2025-01-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Fully human monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors against cd276 for the treatment of solid tumors |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4470924A (en) * | 1981-12-30 | 1984-09-11 | Iglewski Barbara M | Nontoxic, immunologically crossreactive toxin A protein from Pseudomonas aeruginosa |
JP2534222B2 (ja) * | 1982-05-12 | 1996-09-11 | プレジデント アンド フエロウズ オブ ハ−バ−ド カレツジ | 混成タンパク質生産用融合遺伝子 |
US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
US4894443A (en) * | 1984-02-08 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Toxin conjugates |
NZ212312A (en) * | 1984-06-07 | 1988-09-29 | John Richard Murphy | Hybrid protein comprising fragments of diphtheria toxin and part of cell-specific ligand; and fused gene therefor |
US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
US4867962A (en) * | 1988-02-26 | 1989-09-19 | Neorx Corporation | Functionally specific antibodies |
-
1986
- 1986-09-24 US US06/911,227 patent/US4892827A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-09-22 IE IE255387A patent/IE66223B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-09-22 IL IL105160A patent/IL105160A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-09-22 WO PCT/US1987/002373 patent/WO1988002401A1/en active IP Right Grant
- 1987-09-22 KR KR1019880700570A patent/KR970001563B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-09-22 AU AU80211/87A patent/AU618722B2/en not_active Expired
- 1987-09-22 IL IL8397187A patent/IL83971A/en not_active IP Right Cessation
- 1987-09-22 JP JP62505905A patent/JP2848489B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-23 PT PT85777A patent/PT85777B/pt unknown
- 1987-09-23 EP EP93113917A patent/EP0583794B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-23 DE DE3789587T patent/DE3789587T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-23 NZ NZ221923A patent/NZ221923A/en unknown
- 1987-09-23 ES ES87113929T patent/ES2074042T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-23 DE DE3752387T patent/DE3752387T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-23 EP EP87113929A patent/EP0261671B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-23 SG SG9607253A patent/SG96159A1/en unknown
- 1987-09-23 ZA ZA877153A patent/ZA877153B/xx unknown
- 1987-09-23 CA CA000547614A patent/CA1336691C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-09-23 AT AT93113917T patent/ATE311442T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-09-23 AT AT87113929T patent/ATE104153T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-09-23 ES ES93113917T patent/ES2253734T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-05-20 DK DK198802764A patent/DK173301B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-05-24 NO NO882269A patent/NO180270C/no unknown
-
1989
- 1989-03-21 FI FI891321A patent/FI105271B/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-05 US US08/463,163 patent/US5696237A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-26 JP JP9135626A patent/JP2960697B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-11-16 JP JP10324676A patent/JP3053087B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-28 DK DK199901377A patent/DK173560B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2960697B2 (ja) | 組換えシュードモナスエクソトキシン:低副作用の活性イムノトキシンの構造 | |
DE69529517T2 (de) | Kreisförmig permutierte liganden und kreisförmig permutierte chimärische molekülen | |
AU660616B2 (en) | Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin | |
AU665360B2 (en) | Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis | |
US4894443A (en) | Toxin conjugates | |
JPH07508641A (ja) | 高められた活性を有する組換シュードモナス外毒素 | |
WO1994004689A1 (en) | Recombinant toxin with increased half-life | |
WO1993015766A1 (en) | Desensitization to specific allergens | |
JP2635035B2 (ja) | Cysコドン修飾DNA | |
DE69526521T2 (de) | Modulation der immunantwort | |
EP0467536A2 (en) | Method of treating bladder cancer cells | |
US7311912B1 (en) | Epithelial tissue targeting agent | |
WO1993015751A1 (en) | CHIMERIC TOXINS BINDING TO THE GnRH RECEPTOR | |
CA2108886A1 (en) | Interleukin receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis | |
JP2006514984A (ja) | 癌療法で用いる修飾されたサイトカイン | |
AU7242491A (en) | Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin | |
IE84490B1 (en) | Recombinant pseudomonas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |