DE3786351T2

DE3786351T2 - Festphasenimmunoassayverfahren.

Info

Publication number: DE3786351T2
Application number: DE88900078T
Authority: DE
Inventors: David Michael Kemeny
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-12-04
Filing date: 1987-12-04
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 2007-12-05
Also published as: WO1988004430A1; GB8816442D0; JPH01501655A; EP0292535A1; ATE91024T1; GB2206964A; AU1043088A; DE3786351D1; GB2206964B; EP0292535B1

Description

Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Festphasen-Immunassays
Derzeit werden mehrere verschiedene Typen von Festphasen-Immunassays angewandt. Ein Beispiel ist RAST (Radioallergosorbent-Test). Typischerweise werden beim RAST-Test Scheiben aus Cellulosepapier als Träger verwendet, an die ein Allergen gebunden wird. Eine Probe der Testflüssigkeit mit einem Gehalt an Antikörpern für das Allergen wird in einer Mikrotiterplatte zu der Scheibe gegeben, und die Platte wird beispielsweise 18 Stunden inkubiert. Für eine Scheibe mit einem Flüssigkeitsaufnahmevermögen von beispielsweise 3 ul beträgt das Flüssigkeitsvolumen typischerweise 50 ul. Nach Waschen und Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit werden 50 ul einer Flüssigkeit mit einem radioaktiv markierten Indikator, der für den zu bestimmenden Antikörper spezifisch ist, zu der Scheibe in der Platte gegeben, und eine weitere Inkubation wird 18 bis 24 Stunden durchgeführt. Nach dem Waschen der Scheibe wird die verbleibende Radioaktivität ausgezählt, was ein Maß für die Menge des an der Scheibe gebundenen Antikörpers und somit für dessen Menge in der ursprünglichen Probe ergibt.
RAST ist ein empfindlicher Test, der sich insbesondere für allergenspezifische Antikörper eignet und sich leicht an einen breiten Bereich von Allergenen anpassen läßt. Ein Nachteil ist jedoch die relativ lange Zeitspanne, die zur Durchführung des Tests erforderlich ist. Ein weiterer Festphasen-Immunassay, der PRIST-Test (Papier-Radioimmunabsorbent-Test, bei dem ein Antikörper für IgE an die Papierscheibe gebunden wird) erfordert ebenfalls eine erhebliche Inkubationszeit, um eine ausreichende Empfindlichkeit zu erzielen.
Es wurde nunmehr festgestellt, daß durch eine Verringerung des Volumens der Flüssigkeit, in der der Indikator enthalten ist, in bezug zum Flüssigkeitsaufnahmevermögen der Scheibe eine erhebliche Steigerung der Empfindlichkeit erreicht werden kann, was den positiven Nachweis einer im Vergleich zu herkömmlichen Tests geringeren Analytenkonzentration ermöglicht. Dadurch kann auch die Zeit der Inkubation mit der Indikatorflüssigkeit erheblich verkürzt werden.
Ferner wurde festgestellt, daß bei einer Verringerung des Volumens der Probenflüssigkeit relativ zum Flüssigkeitsaufnahmevermögen der Scheibe die Inkubationszeit bis auf nur 5 Minuten verkürzt werden kann, wobei man eine Empfindlichkeit erreicht, die mit der von herkömmlichen Tests vergleichbar ist.
In GB-A-1420916 ist ein Radioimmunassay beschrieben, der in einem Glasfaser-Filtermaterial unter Verwendung von 0,1 ml Flüssigkeit, was in etwa dem Fassungsvermögen des Filtermaterials entspricht, durchgeführt wird. Jedoch ist dieser Test vom kompetitiven Typ und verwendet ein erheblich größeres Flüssigkeitsvolumen als die Tests des Typs, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht.
EP-A-0132170 beschreibt ein Immunassay-Verfahren, bei dem ein Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex hergestellt wird, wobei der erste Antikörper an einen festen Träger gebunden ist und bei dem Volumina im Bereich von 10 bis 200 ul und Inkubationszeiten von einigen Minuten bis einigen Stunden zur Anwendung kommen sollen. Jedoch findet sich kein Hinweis darauf, daß eine Verringerung des Indikatorvolumens zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit führen kann. Ferner werden als Beispiele für Inkubationszeiten Größenordnungen von Stunden und nicht von Minuten genannt. EP-A-0063810 und FR-A-2369557 beschreiben Immunassay-Verfahren auf der Basis von festen Trägern.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Durchführung eines Radioallergosorbent-Tests (RAST-Test) oder eines Papier-Radioimmunoabsorbent-Tests, bei dem ein Antikörper gegen IgE an eine Papierscheibe gebunden wird (PRIST-Test), bereit, wobei das Verfahren darin besteht, daß eine einen Analyt enthaltende Probeflüssigkeit mit einem absorbierenden Träger, in dem oder auf dem ein Bindematerial immobilisiert ist, in Kontakt gebracht wird, wodurch der Analyt in der Flüssigkeit an das Bindematerial gebunden wird, ein radioaktiv markierter Indikator mit dem gebundenen Analyten in Kontakt gebracht wird, wodurch der Indikator an den gebundenen Analyten gebunden wird, der nicht gebundene Indikator von dem Träger entfernt und der verbliebene gebundene Indikator durch Messen seiner Radioaktivität nachgewiesen wird, wobei der markierte Indikator in einem Flüssigkeitsvolumen enthalten ist, das weniger als das Zehnfache des Flüssigkeits-Sättigungsvolumens des Trägers beträgt,
dadurch gekennzeichnet, daß
(a) das Volumen des Indikators nicht mehr als 25 ul ist und
(b) die Konzentration des verwendeten markierten Indikators derart ist, daß die in dem Flüssigkeitsvolumen vorhandene Menge des Indikators die gleiche wie die in einem RAST-Test oder PRIST-Test verwendete Menge ist.
Das Volumen der Indikatorflüssigkeit beträgt vorzugsweise weniger als das 5-fache des Sättigungsvolumens des Trägers und vorzugsweise weniger als das 2-fache des Sättigungsvolumens. Ganz besonders bevorzugt ist es, daß das Volumen der Flüssigkeit im wesentlichen gleich dem Sättigungsvolumen des Trägers ist, bei dem es sich geeigneterweise um einen Cellulosepapier-Träger handelt.
Wenn die Konzentration des Analyten sehr nieder ist, dessen Mengen aber nicht begrenzt sind, beispielsweise in Gewebekultur-Überständen, Nabelschnur-Blutproben und Körperflüssigkeiten, wie Speichel und Nasenflüssigkeit, werden das Volumen der zugesetzten Probenflüssigkeit und die Inkubationszeit in geeigneter Weise so gewählt, daß sie mit den entsprechenden Daten bei herkömmlichen RAST- oder PRIST-Tests vergleichbar sind.
Wenn eine höhere Analytenkonzentration in der Probenflüssigkeit vorliegt, beispielsweise bei Antikörpern in Serum, wird ein Volumen der Probenflüssigkeit von weniger als dem 10-fachen des Sättigungsvolumens des Trägers verwendet. Vorzugsweise wird weniger als als 5-fache des Sättigungsvolumens verwendet und insbesondere weniger als das 2-fache des Sättigungsvolumens. Ganz besonders bevorzugt ist es, ein Volumen einzusetzen, das im wesentlichen gleich dem Sättigungsvolumen ist. Bei verringerten Volumina der Probenflüssigkeit sind im allgemeinen geringere Inkubationszeiten erforderlich. Der Test kann daher in einer wesentlich kürzeren Zeit, als er für herkömmliche Tests erforderlich ist, beendet werden, beispielsweise in nur 65 Minuten für IgE-Antikörper.
Die Verwendung von kleinen Probenvolumina gemäß der Erfindung ermöglicht einen wirtschaftlichen Einsatz von Referenzreagentien. Dies macht es möglich, einen Vorrat an einer Vielzahl von Referenzreagentien, insbesondere Serumproben, bereitzuhalten, was bei herkömmlichen RAST-Assay-Verfahren unter Verwendung von großen Probenvolumina unzweckmäßig ist.
Erfindungsgemäß wird auch ein Immunassay-Kit zur Verwendung im erfindungsgemäßen Immunassay-Verfahren bereitgestellt, der eine Mehrzahl von absorbierenden Trägerelementen, in denen oder auf denen ein Bindematerial immobilisiert ist, einen Vorrat einer einen markierten Indikator enthaltenden Lösung und eine Vielzahl von verschiedenen Referenzproben mit einem Gehalt an bekannten Konzentrationen von bekannten Analyten umfaßt.
In nicht-kompetitiven Tests, wie dem RAST-Test, ist es vorteilhaft oder wesentlich, die Trägerscheiben nach jeder Inkubationsperiode zu waschen. Eine bekannte Waschvorrichtung für diesen Zweck weist eine Platte auf, die zwischen einer Vorratskammer für Waschflüssigkeit und einer Vakuumkammer befestigt ist, wobei die Platte zahlreiche Vertiefungen aufweist, von denen jede eine Filterscheibe aufnimmt. Die Vorrichtung ermöglicht es, zahlreiche Scheiben gleichzeitig zu waschen. Die Scheiben verbleiben während der einzelnen Verarbeitungsstufen in den Vertiefungen, werden aber für die Stufe des Tests auf Radioaktivität herausgenommen. Typischerweise sind in jeder Platte 96 Vertiefungen vorgesehen, was es ermöglicht, in jedem Ansatz gleichzeitig 96 Scheiben zu verarbeiten. Obgleich die herkömmliche Waschvorrichtung eine rasche Verarbeitung der Ansätze ermöglicht, erfordert die Teststufe eine sorgfältige Entfernung der einzelnen Scheiben aus ihrer jeweiligen Vertiefung, was den Betrieb verlangsamen kann.
W082/03690 beschreibt eine Vorrichtung zur Durchführung von Immunassay-Reaktionenn, bei denen am Boden poröse Reaktionsgefäße, die mit einem Filter zum Zurückhalten von unlöslichen Teilchen versehen sind, in die Vertiefungen einer Haltevorrichtung passen und bei denen Saugleitungen in Verbindung mit den Vertiefungen es möglich machen, Flüssigkeit den Reaktionsgefaßen zuzuführen oder aus diesen zu entfernen.
Demgemäß ist eine bevorzugte Waschvorrichtung zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren dadurch gekennzeichnet daß die Halteplatte abnehmbar zwischen der Vorrats- und Aufnahmekammer angebracht ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Waschvorrichtung ist ein Halter abnehmbar in jeder vertiefung angeordnet, wobei der Halter eine darin vorgesehene Abllauföffnung, die mit dem Auslaß in Verbindung steht, aufweist. Ferner ist die Vorratskammer für die Waschflüssigkeit so angeordnet, daß die Flüssigkeit zu den Haltern geleitet wird.
Vorzugsweise ist die Ablauföffnung in jedem Halter so bemessen, daß die Flüssigkeit im Halter unter Schwerkrafteinwirkung nicht durch die Öffnung verlorengeht. Die Halter können in Form von Bechern oder Röhrchen mit einer am Boden vorgesehenen Ablauföffnung vorliegen. Die Becher oder Röhrchen können zweckmäßigerweise aus Kunststoffmaterial oder Glas bestehen und so bemessen und angeordnet sein, daß sie paßgenau, aber leicht entfernbar in den Vertiefungen sitzen. Bei den Auslässen der Vertiefungen handelt es sich geeigneterweise um Kapillaren die die gleiche Größe wie die Ablauföffnungen in den Haltern aufweisen.
Die Halteplatten lassen sich leichter als die darin enthaltenen einzelnen Filterscheiben handhaben. Somit wird die Verarbeitung der Ansätze der Filter erleichtert. Unter bestimmten Umständen ist die Verwendung von Haltern in den Vertiefungen bevorzugt. Jeder Halter kann ggf. in geeigneter Weise markiert werden, um eine einzelne Scheibe zu identifizieren.
Nachstehend wird auf die Zeichnung Bezug genommen. Es zeigen:
Fig. 1 eine Reihe von Graphen zur Erläuterung der Wirkung der Verringerung der Probenvolumina (Fig. 1A(, des lndikatorvolumens (Fig. 1B) sowie der Proben- und Indikatorvolumina (Fig. 1C) und der Erhöhung der Indikatorkonzentration bei verringerten Volumina an Indikator und Probe (Fig. 1D);
Fig. 2 einen Graphen zur Erläuterung der Beziehung zwischen den Ergebnissen beim erfindungsgemäßen Verfahren und beim herkömmlichen RAST- Test;
Fig. 3 ein Graphenpaar zur Darstellung der Bindungsrate eines Analyten (IgE-Antikörper) (Fig. 3A) und der Bindungsrate eines Indikators (¹²&sup5;I-anti-IgE) (Fig. 3B) beim herkömmlichen RAST-Test;
Fig. 4 ein Graphenpaar zur Darstellung der entsprechenden Raten für den erfindungsgemäßen Assay;
Fig. 5 einen Graphen zur Erläuterung des Einflusses des Probenvolumens auf die Empfindlichkeit beim erfindungsgemäßen Assay;
Fig. 6 ein Graphenpaar zur Erläuterung des Einflusses des verringerten Indikatorvolumens auf die Empfindlichkeit bei 3 Probenvolumina (Fig. 6A) im Vergleich zum herkömmlichen RAST-Verfahren (Fig. 6B).
Fig. 7 eine Reihe von Graphen zur Darstellung der Bindungsrate von IgG-Antikörper bei verschiedenen Verdünnungen von IgG-Antikörperproben von hohem Titer (Fig. 7A) und geringem Titer (Fig. 7B) und der Bindungsrate des Indikators (¹²&sup5;I-Anti-IgG) für die gleichen Verdünnungen von Proben mit hohem und niedrigem Titer (Fig. 7C und 7D);
Fig. 8 ein Graphenpaar zur Darstellung des Einflusses des Probenvolumens (Fig. 8A) und des ¹²&sup5;I-anti-IgG-Volumens (Fig. 8B) beim erfindungsgemäßen Assay auf IgG-Antikörper gegen Bienengift;
Fig. 9 einen Graphen zur Erläuterung des Einflusses der Verringerung des ¹²&sup5;I-anti-IgE-Volumens beim PRIST-Test;
Fig. 10 eine Waschvorrichtung zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren bei abgenommener Halteplatte;
Figg. 11 und 12 eine Seitenansicht bzw. eine Draufsicht der Halteplatte für die Vorrichtung von Fig. 10.
Für die nachstehenden Beispiele wurden Serumproben von Patienten mit Allergie gegen Bienengift, Graspollen und Rizinussamen gewonnen, wobei bei den Patienten vorher ein Gehalt an IgE-Antikörpern nachgewiesen worden war. Bei den meisten Experimenten wurde ein Pool von positiven Seren verwendet.

Herstellung von ¹²&sup5;I-anti-IgE

Kaninchen-anti-IgE wurde hergestellt, indem man weiße New Zealand-Kaninchen mit 0,25 mg IgE-PS (aus Myelompatienten-PS) in inkomplettem Freund-Adjuvans auf intramuskulärem Wege unter anschließender Verabreichung von drei Auffrischungsimpfungen in zweiwöchigem Abstand mit 0,25 mg IgE-PS in inkomplettem Freund-Adjuvans immunisierte.
Das Serum wurde abgetrennt und gründlich mit normalem Humanserum (20 ml Serum/10 ml CNBr-Sepharose 4B und Human-gamma-globulin (100 mg/10 ml Sepharose 4B ) (Agarose) absorbiert. Das Anti-IgE wurde einer Affinitätsreinigung an einer Säule mit einem Gehalt an IgE-WT (aus Myelompatienten-WT) an Agarose (10 mg/10 ml CNBr-Sepharose 4B ) unterzogen. Der gereinigte Antikörper wurde mit Na¹²&sup5;I der Firma Amersham International PLC, UK, markiert.

Vergleichsbeispiel 1

RAST

In einem RAST-Verfahren wurden mit Allergen beschichtete Scheiben mit einem Flüssigkeitsaufnahmevermögen von 3 ul mit 0,05 m phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,4, + 0,05 % Tween 20 in einer herkömmlichen Waschvorrichtung gemäß den vorstehenden Angaben, die die gesamte überschüssige Flüssigkeit aus den gewaschenen Scheiben entfernt, gewaschen. Die Testprobe (50 ul), die ggf. in Pferdeserum verdünnt war, wurde mit einer mit Allergen beschichteten Scheibe in einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden (Linbro, Flow Labs Limited, UK) 18 Stunden inkubiert. Die Scheiben wurden auf die vorstehend beschriebene Weise gewaschen, und 10 ng ¹²&sup5;I-anti-IgE (50 ul), das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt worden war, wurden zugesetzt. Am nächsten Tag wurden die Scheiben erneut gewaschen. Die verbleibende Radioaktivität wurde 1 Minute in einem Mehrkanal-gamma-Zähler (LKB-Schweden) gezählt. Die Intra-Assay-Variation bei 1/5 Verdünnung des Serumpools entspricht 5,7 %, n = 14.
Der Test wurde unter Verwendung von 25 ul, 10 ul und 5 ul der Testprobe wiederholt, wobei sämtliche übrigen Bedingungen unverändert blieben. Weitere Tests wurden sodann unter Verwendung von Testproben durchgeführt, die auf 1/10, 1/100 und 1/1000 ihrer ursprünglichen Konzentration verdünnt waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 1A aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß die Verringerung des Probenvolumens zu einer Verringerung der Anzahl der für jede Verdünnung gemessenen Zählereignisse führt, d.h. die Empfindlichkeit des Tests ist bei vermindertem Probenvolumen verringert.

Beispiel 1

Die im Vergleichsbeispiel durchgeführten Tests wurden wiederholt, wobei das Probenvolumen konstant auf 50 ul gehalten wurde und das Indikatorvolumen von 50 ul bis herunter zu 5 ul stufenweise in der gleichen Weise wie bei den verschiedenen Probenverdünnungen verändert wurde. Die Konzentration an ¹²&sup5;I-anti-IgE wurde auf das 10-fache erhöht, so daß 10 ng in 5 ul zugesetzt wurden. Aus Fig. 1B ist ersichtlich, daß die Verringerung der ¹²&sup5;I-anti-IgE-Volumina die Testempfindlichkeit erhöhte, d.h. die Anzahl der pro Minute gemessenen Zählereignisse war erhöht.

Beispiel 2

Unter Verwendung der gleichen ersten und zweiten Inkubationsvolumina (5 + 5, l0 + 10, 25 + 25 und 50 + 50) war es möglich, vergleichbare Ergebnisse mit nur 5 ul Probe zu erzielen (Fig. 1C). Die Verwendung von kleinen Volumina an ¹²&sup5;I-anti-IgE bei der gleichen Konzentration, wie sie normalerweise beim RAST-Test eingesetzt wird (0,4 pg/ml), ergab verringerte Zählergebnisse von gebundener Radioaktivität, was eine verlängerte Zählung erforderlich machte.

Beispiel 3

Die Tests von Beispiel 2 wurden wiederholt, wobei die Konzentration des ¹²&sup5;I-anti-IgE auf 4 ug/ml erhöht wurde. Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Der 5 ul-Assay ist sehr gut vergleichbar mit dem herkömmlichen Assay unter Verwendung von 50 ul Probe und Indikator (Fig. 1D).

Vergleichsbeispiel 2

48 unterschiedliche Serumproben von Patienten mit Allergie gegen Rizinussamen wurden nach dem herkömmlichen RAST-Test getestet.

Beispiel 4

Die Tests von Vergleichsbeispiel 2 wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Beispiel 3 wiederholt. Für jede Probe wurden die beim herkömmlichen Test erzielten Zählereignisse pro Minute gegen die beim erfindungsgemäßen Test erzielten Zählereignisse pro Minute aufgetragen (Fig. 2). Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß eine enge Beziehung zwischen den beiden Methoden besteht (r = 0,96).

Vergleichsbeispiel 3

Herkömmliche RAST-Tests wurden durchgeführt, um den zeitlichen Verlauf der Erhöhung der Bindungsrate von IgE-Antikörpern bei verschiedenen Probenverdünnungen festzustellen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3A aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß bei der ersten Inkubation die Zeit zur Bindung des IgE-Antikörpers bei hoher Verdünnung größer als bei niedriger Verdünnung ist. Jedoch kann es auch bei geringer Verdünnung 4 bis 5 Stunden bis zum Erreichen des Gleichgewichts dauern.

Vergleichsbeispiel 4

Herkömmliche RAST-Tests wurden zur Messung der Bindungsrate von ¹²&sup5;I- anti-IgE bei verschiedenen Indikatorverdünnungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3B aufgetragen. Die Bindungsrate für ¹²&sup5;I-anti-IgE ist normalerweise sehr langsam. Ein Plateau wird selbst nach 24 Stunden nicht erreicht.

Beispiel 5

Die Tests von Vergleichsbeispiel 3 wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wiederholt, wobei die Verdünnung der IgE-Antikörper-Serumprobe variiert wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 4A aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß das Gleichgewicht bei allen Verdünnungen sehr rasch erreicht wird. Beim erfindungsgemäßen Verfahren sind die Diffusionsabstände für die Antikörper, bevor sie in Kontakt mit dem Antigen kommen, wesentlich kürzer, was sich im Vergleich zum herkömmlichen Assay (Fig. 3A) in einer erhöhten Bindungsgeschwindigkeit des IgE-Antikörpers ausdrückt. Der Gleichgewichtszustand wird innerhalb von 10 Minuten erreicht. Im Anschluß daran durchgeführte Versuche haben ergeben, daß das Flateau innerhalb von etwa 5 Minuten erreicht wird. Bei einer kleineren Probe, z.B. 3 ul, wird erwartet, daß der Gleichgewichtszustand in weniger als 5 Minuten erreicht wird.

Beispiel 6

Der in Vergleichsbeispiel 4 durchgeführte Test wurde unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wiederholt. Die Bindungsgeschwindigkeit von ¹²&sup5;I-anti-IgE ist, wie aus Fig. 4B hervorgeht, wesentlich rascher als beim herkömmlichen Test (Fig. 3B), und zwar sowohl bei 0,4 als auch bei 4 ug/ml ¹²&sup5;I-anti-IgE.

Beispiel 7

Zur Bestimmung der absoluten Untergrenze der Probengröße beim erfindungsgemäßen Verfahren wurde ein breiterer Volumenbereich von 50 ml bis 1 ul mit einem festen Volumen an ¹²&sup5;I-anti-IgE (5 ul) verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß für praktische Zwecke die Untergrenze etwa 3 ul beträgt. Bei mehr als 5 ul war die Empfindlichkeit deutlich erhöht, insbesondere bei hoher Probenverdünnung.

Beispiel 8

Erfindungsgemäße Tests mit verringertem Volumen an ¹²&sup5;I-anti-IgE-Indikator (5 ul) und mit unterschiedlichen Volumina an Serumprobe bei unterschiedlichen Verdünnungen wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6A aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß bei Verwendung von 300 ul an unverdünnter Probe bis zu 80 % des zugesetzten radioaktiven Indikators gebunden werden konnten.

Vergleichsbeispiel 5

Die Tests von Beispiel 8 wurden mit 50 ul Indikator mit der gleichen Menge an Antikörper wiederholt. Somit war die gleiche Anzahl an radioaktiven Zäh1ereignissen wie bei der in Beispiel 8 verwendeten Indikatormenge von 5 ul gegeben. Aus Fig. 6B ist ersichtlich, daß die Empfindlichkeit erheblich verringert ist, wobei 300 ul Probe nur eine geringfügig höhere Anzahl an Zählereignissen als 5 ul beim erfindungsgemäßen Test (Fig. 6A) ergeben.
Die erhöhte Empfindlichkeit, die sich daraus ergibt, daß ¹²&sup5;I-anti- IgE in engeren Kontakt mit dem an der Scheibe gebundenen IgE-Antikörper gebracht wird, und der größere Wirkungsgrad, mit dem der IgE-Antikörper gebunden werden kann, ermöglichen die Verwendung von sehr kleinen Serummengen (nur 3 ul) bei gleicher Empfindlichkeit wie bei herkömmlichen Tests. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde zur Bestimmung von Gesamt-IgE und IgE-Antikörpern in Blutproben, die Babys durch einen Stich in die Ferse entnommen wurden, verwendet. Der sparsame Serumeinsatz ist auch beim Testen von Ratten wertvoll, wo Serum nur in geringen Mengen zur Verfügung steht.

Beispiel 9

Eine Reihe von Messungen von IgG-Antikörpern gegen Bienengift in Blutproben mit hohem und niedrigem Titer wurde unter Verwendung von Cellulosepapier-Scheiben mit einem Flüssigkeitsfassungsvermögen von 3 ul, die mit Bienengift beschichtet waren, durchgeführt. Die Scheiben wurden mit Proben in Verdünnungen von 1/100 bis 1/10 000 für die Proben von hohem Titer und von 1/100 und 1/300 für die Proben von niedrigem Titer inkubiert. Es wurde ein Bereich von verschiedenen Inkubationszeiten angewandt. Nach der Inkubation wurden die einzelnen Proben gewaschen und sodann mit ¹²&sup5;I-anti-IgG (Pharmacia (GB) plc) inkubiert und erneut gewaschen. Die restliche Radioaktivität wurde in einem gamma-Zähler gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 7A (hoher Titer) und Fig. 7B (niedriger Titer) aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß für hohe Verdünnungen sehr rasch (innerhalb von etwa 1 Minute) ein Plateau erreicht wird, während für geringe Verdünnungen für die Proben von hohem Titer die erforderliche Zeit etwa 5 Minuten dauert.

Beispiel 10

Eine weitere Reihe von Messungen von IgG-Antikörpern gegen Bienengift in Serumproben von hohem und niedrigem Titer wurde wie in Beispiel 9, jedoch mit einer konstanten Inkubationszeit, die zur Erreichung des Gleichgewichtszustands ausreichte, durchgeführt. Der ¹²&sup5;I-anti-IgG-Indikator wurde wie in Beispiel 9 verwendet. Die Zählereignisse für verschiedene unterschiedliche Inkubationszeiten wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 7C (hoher Titer) und Fig. 7D (niedriger Titer) aufgetragen. Es ist wieder ersichtlich, daß der Gleichgewichtszustand rasch erreicht wird, insbesondere für hohe Probenverdünnungen innerhalb von etwa 10 Minuten.

Vergleichsbeispiel 6

Es wurde ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel 9, jedoch unter Verwendung von verschiedenen Serummengen, die in mehreren unterschiedlichen Verdünnungen und bei konstanter, zum Erreichen des Gleichgewichtszustands ausreichender Inkubationszeit eingesetzt wurden, verwendet, um eine Reihe von Graphen für hohe (ausgezogene Linien) und niedrige (unterbrochene Linien) Serumtiter zu erstellen. Die Graphen sind in Fig. 8A gezeigt. Es ist ersichtlich, daß bei geringeren Mengen die Empfindlichkeit verringert ist.

Beispiel 11

Im Gegensatz dazu wurde eine Reihe von ähnlichen Tests wie in Vergleichsbeispiel 6, jedoch unter Verwendung einer konstanten Serummenge in unterschiedlichen Verdünnungen und bei konstanter Inkubationszeit durchgeführt, wobei unterschiedliche Volumina an ¹²&sup5;I-anti-IgG verwendet wurden.
Aus Fig. 8B ist ersichtlich, daß bei Verringerung des ¹²&sup5;I-anti-IgGVolumens auf 3 ul sich ein weiterer Anstieg der Empfindlichkeit ergibt, so daß bis zu 83 % der zugegebenen Zählereignisse gebunden werden.

Beispiel 12

Ein PRIST-Assay wurde auf erfindungsgemäße Weise durchgeführt. Der PRIST-Test ist ein Zweistellen-Assay, bei dem eine Scheibe aus Gellulosepapier mit anti-IgE beschichtet ist, das das gesamte IgE in der Probe bindet. Spezifisch gebundenes IgE wird sodann unter Verwendung eines radioaktiv markierten anti-IgE-Indikators nachgewiesen. (Enzymmarkiertes anti-IgE kann als Alternative verwendet werden). Proben- und Indikatorvolumina von 5 ul, 10 ul und 25 ul wurden mit einer Scheibe von 3 ul Fassungsvermögen verwendet. Zum Vergleich wurde auch ein Test mit 50 ul durchgeführt. Ein Bereich von unterschiedlichen IgE-Konzentrationen in der Probe wurde getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 zusammengestellt. Es ist ersichtlich, daß bezogen auf das Signal-Rausch-Verhältnis die Ergebnisse unter Verwendung von 5 ul ebenso gut wie mit 50 ul sind, daß aber im Fall der 5 ul-Probe ein wesentlich höheres Signalniveau gegeben ist.
Nachstehend wird auf die in Fig. 10 bis 12 dargestellte Waschvorrichtung Bezug genommen. In Fig. 10 liegt die Vorratskammer für die Waschflüssigkeit 1 in Form eines rechwinkligen Plexiglas-Behälters 3 mit einem verschlossenen Deckel 4 vor, in dem eine Öffnung 5 zum Einführen der Waschflüssigkeit vorgesehen ist. Die Kammer 1 weist eine verdickte Grundplatte 6 auf, durch die sich Durchgänge 7 zur Bildung von Auslässen für die Waschflüssigkeit erstrecken. Die Durchgänge 7 sind in der Grundplatte in einer regelmäßigen 8x12-Anordnung mit gleichmäßigen Abständen angeordnet, und zwar in ähnlicher Weise wie die Anordnung der Vertiefungen in einer herkömmlichen Mikrotiterplatte. Die innere Öffnung des Durchgangs 7 wird von konischen Ausnehmungen 8 gebildet, die in der oberen Fläche der Grundplatte 6 ausgearbeitet sind. Die äußeren Enden der Durchgänge 7 stehen in Verbindung mit flachen zylindrischen Ausnehmungen 9 in der unteren Fläche der Basisplatte 6. Die flachen zylindrischen Ausnehmungen 9 ergeben einen Sitz für O-Ringe 11 aus Synthesegummi, die als Dichtungen fungieren.
Die überstehenden Enden der Grundplatte 6 weisen durchgehende Bohrungen 12 zur Aufnahme von Haltestiften auf, zwei an einem Ende und eine am anderen Ende, während die überstehenden Kanten 13 Bohrungen zur Aufnahme von Klemmbolzen aufweisen, um die Vorratskammer an der Aufnahmekammer 2 fes tzuklemmen.
Die Aufnahmekammer 2 ist von ähnlicher Bauart wie die Vorratskammer 1 und besteht im wesentlichen aus einem rechtwinkligen Plexiglas-Aufnahmebehälter 15 zur Aufnahme von Waschflüssigkeit mit einer verdickten Kopfplatte 16, die eine regelmäßige 8x12-Anordnung von Ablaufdurchgängen 26, die den Durchgängen 7 entsprechen, aufweist. Das obere Ende der einzelnen Ablaufdurchgänge 26 öffnet sich in eine Ausnehmung 25, in die ein Gummi-O-Ring 27 als Dichtung eingestzt wird. Die überlappenden Enden der Kopfplatte 16 sind mit vorstehenden Stiften 17, zwei an einem Ende und einer am anderen Ende, versehen, die in die Bohrungen 12 eingeführt werden, wenn die Kammern 1 und 2 mit der dazwischen angeordneten Halteplatte zusammengeklemmt werden. Die überstehenden Kanten der Kopfplatte 16 weisen durchgehende Bohrungen 18 auf, deren untere Enden mit Buchsen 19 zur Aufnahme der Klemmbolzen versehen sind.
Gemäß Fig. 11 und 12 umfaßt die Halteplatte 30 einen rechtwinkligen Plexiglas-Block mit einer gleichmäßigen 8x12-Anordnung von Vertiefungen 20, deren Position den Durchgängen 7 in der Grundplatte 6 der Vorratskammer 1 entspricht. Die einzelnen Vertiefungen 20 umfassen jeweils eine zylindrische Bohrung 21, die sich durch einen Großteil der Dicke der Platte 30 erstreckt, und eine Kapillare 22, die sich durch die restliche Dicke der Platte 30 erstreckt. In jede Vertiefung 20 kann ein Becher 23, der unten ein Kapillarloch 24 aufweist, herausnehmbar eingesetzt werden. Die Halteplatte 30 weist Bohrungen auf, die denen der Grundplatte 6 entsprechen, um einen genauen Sitz der Platte 30 zwischen den Kammern 1 und 2 zu gewährleisten. Das Innere der Kammer 2 zur Aufnahme der Waschflüssigkeit ist unten mit einem Auslaß 28 versehen, der einen Auslaß für verbrauchte Waschflüssigkeit und zum Absaugen der Kammer darstellt. Der Auslaß 28 ist zweckmäßigerweise direkt an eine Vakuumleitung in Verbindung mit einer Vakuumquelle angeschlossen, vorzugsweise mit einer Falle zur Aufnahme von verbrauchter Waschflüssigkeit.
Beim Zusammenklemmen der Vorratskammer und der Aufnahmekammer mit dazwischen angeordneter Halteplatte, werden die O-Ringe 11 in Kontakt mit der oberen Fläche der Platte 30 oder den Abschlußkanten der ggf. verwendeten Becher 23 gebracht, wodurch die Auslässe 7 der Kammer 1 abgedichtet werden, während die O-Ringe 27 in den Ausnehmungen 25 gewährleisten, daß die Kapillaren 22 in abgedichteter Verbindung über die Ablaufdurchgänge 26 mit der Aufnahmekammer 2 stehen.
Waschflüssigkeit wird in die Kammer 1 durch die Öffnung 5 eingeführt. Der Auslaß 28 der Aufnahmekammer 2 wird mit der Vakuumquelle verbunden, und ein Vakuum wird angelegt. Durch die Saugwirkung des Vakuums wird Waschflüssigkeit durch den Auslaß 7 in die ggf. verwendeten Becher 23 oder in die Vertiefungen 20 gesaugt, passiert die darin befindlichen Filterpapierscheiben und gelangt von dort durch die Auslaßöffnungen 24, die Kapillaren 22 und die Ablauföffnung 26 in die Aufnahmekammer 2.
Die Filterscheiben können unter Verwendung der Vorrichtung partiell getrocknet werden, indem man beispielsweise die Vorrichtung von der Vakuumquelle nach Entleeren der Waschflüssigkeit aus der Vorratskammer 1 isoliert, um das Anlegen des Vakuums zu ermöglichen, und anschließend die Vorrichtung wieder mit der Vakuumquelle verbindet, so daß der Luftstrom durch die Filterpapierscheiben eine teilweise Trocknung der Scheiben bewirkt. Die Scheiben werden sodann aus der Halteplatte durch Entfernen der Becher 23 entfernt. Eine Radioaktivitätszählung der Scheiben kann durchgeführt werden, wobei sich die Scheiben noch in den Bechern 23 befinden.
Gemäß einer alternativen Technik kann anstelle einer radioaktiven Markierung des Antigens ein markierendes Enzym verwendet werden. Die erhaltenen gebundenen Enzyme werden sodann zur Katalyse einer Reaktion verwendet, wobei diese Reaktion zu einer nachweisbaren Farbveränderung führt. Für einen derartigen Test werden die Becher zweckmäßigerweise in Aufnahmeelemente (z.B. Vertiefungen in einer herkömmlichen Titerplatte) angeordnet, um die Löcher 24 abzudichten, so daB die in die Becher gegossene Flüssigkeit nicht entweichen kann.
Die Waschvorrichtung gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird zweckmäßigerweise in den erfindungsgemäßen Ummunassay-Verfahren eingesetzt.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung eines Radioallergosorbent- Tests (RAST-Test) oder eines Papier-Radioimmunabsorbent Tests, bei den ein Antikörper gegen IgE an eine Papierscheibe gebunden wird (PRIST-Test), das darin besteht, daß eine einen Analyt enthaltende Probeflüssigkeit mit einem absorbierenden Träger, in dem oder auf dem ein Bindematerial immobilisiert ist, in Kontakt gebracht wird, wodurch der Analyt in der Flüssigkeit an das Bindematerial gebunden wird, ein radioaktiv markierter Indikator mit dem gebundenen Analyten in Kontakt gebracht wird, wodurch der Indikator an den gebundenen Analyten gebunden wird, der nicht gebundene Indikator von dem Träger entfernt und der verbliebene gebundene Indikator durch Messen seiner Radioaktivität nachgewiesen wird, wobei der markierte Indikator in einem Flüssigkeitsvolumen enthalten ist, das weniger als das Zehnfache des Flüssigkeits-Sättigungsvolumens des Trägers beträgt,

dadurch gekennzeichnet, daß

(a) das Volumen des Indikators nicht mehr als 25 ul ist und

(b) die Konzentration des verwendeten markierten Indikators derart ist, daß die in dem Flüssigkeitsvolumen vorhandene Menge des Indikators die gleiche wie die in einem RAST- Test oder PRIST-Test verwendete Menge ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Volumen des Indikators nicht mehr als 10 ul beträgt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Volumen des Indikators nicht mehr als 5 ul beträgt.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Volumen der Probeflüssigkeit nicht mehr als 25 ul beträgt.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Volumen der probeflüssigkeit nicht mehr als 10 ul beträgt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Volumen der Probeflüssigkeit nicht mehr als 5 ul beträgt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Sättigungsvolumen des Trägers 10 ul oder weniger beträgt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Sättigungsvolumen des Trägers 5uPl oder weniger beträgt.

9. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, bei dem der Indikator in einem Flüssigkeitsvolt1men enthalten ist, das weniger als das Fünffache des sättigungsvolumen des Trägers ist.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Indikator in einem Flüssigkeitsvolumen enthalten ist, das weniger als das Zweifache des sättigungsvolumens des Trägers ist.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Indikator in einem Flüssigkeitsvolumen enthalten ist, das im wesentlichen gleich dem Sättigungsvolumen des Trägers ist.

12. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, bei den das Volumen der Probeflüssigkeit, die in Kontakt mit dem absorbierenden Träger gebracht wird, weniger als das Zehnfache des Sättigungsvolumens des Trägers ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das Volumen der probeflüssigkeit, die in Kontakt mit dem absorbierenden Träger gebracht wird, weniger als das Fünffache des Sättigungsvolumens des Trägers ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das Volumen der probeflüssigkeit, die in Kontakt mit dem absorbierenden Träger gebracht wird, weniger als das Zweifache des Sättigungsvolumens des Trägers ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das Volumen der probeflüssigkeit die mit dem absorbierenden Träger in Kontakt gebracht wird, im wesentlichen gleich dem Sättigungsvolumen des Trägers ist.

16. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß (a) der radioaktiv markierte Indikator eine spezifische Aktivität von weniger als 5uCi/ug hat und (b) der radioaktiv markierte Indikator eine zum Auszählen der Radioaktivität ausreichende Radioaktivität hat, die es ermöglicht, den verbliebenen gebundenen Indikator in 1 bis 2 Minuten nachzuweisen.

17. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

Aufbringen der probeflüssigkeit auf den Träger und gemeinsames Tnkubieren dieser,

Abwaschen der Probeflüssigkeit von dem Träger und im wesentlichen Trocknen des Trägers,

Aufbringen einer den Indikator enthaltenden Flüssigkeit auf den Träger und gemeinsames Inkubieren dieser,

Abwaschen der Probeflüssigkeit von dem Träger und schließlich Nachweisen des gebundenen Indikators.

18. Verfahren nach einem vorhergehenden patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger gewaschen und im wesentlichen getrocknet wird, bevor der Träger und die probeflüssigkeit miteinander in Kontakt gebracht werden.

19. Verwendung einer Waschvorrichtung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, die umfaßt: eine Vorratskammer für die Waschflüssigkeit (1), eine Kammer (2) zur Aufnahme der Waschflüssigkeit und zwischen beiden eine Halteplatte (30), wobei die Halteplatte (30) zahlreiche Vertiefungen (20) in ihrer Oberseite aufweist und jede Vertiefung (20) einen Auslaß (22) hat, der mit der Unterseite der Halteplatte (30) kommuniziert, dadurch gekennzeichnet, daß die Halteplatte (30) abnehmbar zwischen der Vorrats- und der Aufnahmekam mer (1, 2) angebracht ist und daß (a) ein Halter (23) abnehmbar in jeder Vertiefung (20) vorgesehen ist, wobei in dem Halter (23) ein Ablauf (24) vorgesehen ist, der mit dem Auslaß in Verbindung steht, und daß die Vorratskammer für die Waschflüssigkeit (1) so angeordnet ist, daß Flüssigkeit zu den Haltern (23) geleitet wird und/oder (b) der Ablauf (24) in jedem Halter (23) so bemessen ist, daß durch diesen kein Verlust von Flüssigkeit in dem Halter unter der Schwerkraft eintritt.

20. Verwendung eines Immunassay-Kits in einem Verfahren genäß einem der Ansprüche 1 bis 18, welches zahlreiche absorbierende Träger, in denen oder auf denen ein Bindematerial immobilisiert ist, einen Vorrat einer einen markierten Indikator enthaltenden Lösung und zahlreiche verschiedene Referenzproben umfaßt, die bekannte Konzentrationen von bekannten Analyten enthalten.