JPH01501655A - 固相免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍ旦 固相免疫測定法 本発明は、ある局面においては、固相免疫測定法に関する。

この固相免疫測定法は１次の工程を包含する二分析物を含有する試料液を、結合 物質を担体中または担体上に固定化した吸収性の担体と接触させることによって 該試料液中の分析物を該結合物質に結合させる工程；この結合した分析物に標識 インジケーターを接触させることによりインジケーターを該結合分析物に結合さ せ、非結合インジケーターを担体から除去する工程：および残存する結合インジ ケーターを検出する工程。

本発明は、他の局面においては、固相競合免疫測定法に関する。この測定法にお いては９分析物を含有する試料液および標識インジケーターを、結合物質を担体 中または担体上に固定化した吸収性の担体と接触させ、該分析物と該インジケー ターとを該結合物質と競合的に結合させ、そして結合したインジケーターの量を 検出する。

本発明は、さらに他の局面においては１面相免疫測定法に用いるための洗浄装置 に関する。この装置は、洗浄液供給手段、洗浄液受容槽、およびその間に保持プ レートを存する。

この保持プレートは、その上面に複数個のウェルを有し５かつ各ウェルが該保持 プレートの下面と連絡する出口を有する。

現在、いくつかの異なるタイプの固相免疫測定法が用いられている。その例には 、　ＲＡＳＴ　（放射性アレルゲン吸着測定法）およびＥＬＩＳＡ（酵素結合免 疫吸着測定法）がある。代表的には。

ＲＡＳＴ法では、セルロース祇ディスクが、キャリアとして使用され、それに光 源が結合する。その抗原に対する抗体を含む試験されるべき液体である試料は、 マイクロタイタープレート中のディスクに添加され、そしてそのプレートは９例 えば１８時間インキュベートされる０例えば、３μ！の液体容積量を有するディ スクに対しては、その試料の容量は典型的には５０μｉである。洗浄、そして過 剰の液体を除去後、測定されるべき抗体に特異的な放射性標識抗体を含む５０μ ｌの液体を。

そのプレート内のディスクに加え、そして、１８から２４時間の間、さらにイン キュベートを行う。ディスクを洗浄した後。

残存放射能を測定すると、そのディスクに結合している抗体の量が得られ、それ によって、もとの試料の量がめられる。

ＲＡＳＴは高感度な測定法であり、特にアレルゲン特異的抗体に有用であり、そ して、広範囲のアレルゲンに容易に適用される。しかし、その不利な点は、その 測定を行うのに必要とされる時間が比較的長いことである。ＰＲＩＳＴ（紙を用 いた放射免疫吸着測定法であって、この方法では、ＩｇＥに対する抗体がディス クに結合する）、　ＥＬＩＳＡ、クラス捕捉法（ｃｌａｓｓ−ｃａｐｔｕｒｅ） および二部位測定法のような他の固相免疫測定法は、すべて。

充分な感度を達成するためには有意なインキュベーションの時間を必要とする。

インジケーターが含まれる液体の容量をそのディスクの液体容積量に対して減少 させることによって、有意な感度の増加が達成され得、そのことにより２通常の 測定法による場合よりも試料中のより低濃度の被測定物の確実な検出を可能にし 、そしてインジケーターを含む液とのインキュベーションの時間もまた。有意に 減少することが現在では見い出されてそのディスクの液体容積量に対して試料液 の容量もまた減少させるならば、従来の測定法を用いたときと比較し得る感度に 達するまでに、５分間という短時間にまで、インキュベーションの時間を減少し 得る。

ＧＢ−Ａ−１４２０９１６では、ガラス繊維フィルター材料中で０．１ｄの液体 を用いて行われる放射免疫測定法が開示されており。

その液体量は、そのフィルター材料の容積量にほぼ等しい。

しかし、その測定法は、競合型の測定法であり１本発明に関するタイプの測定法 で行なうよりも有意に大量の液体を使用している。

本発明の第１の局面は、標識されたインジケーターが、そのキャリア（担体）の 飽和容積量の１０倍より少ない液量の液体中に含まれることにより特徴づけられ る。

その液体の容積量は、好ましくはそのキャリアの飽和液量の５倍より少なく、さ らに好ましくは、その飽和液量の２倍よりも少ない。最も好ましくは、その液体 の液量は、実質上。

その飽和液量に等しい。

分析物の濃度が非常に低いが量が制限されていない場合。

例えば９組織培養の上澄液、調帯血試料、そして唾液および鼻の洗液のような体 液の場合には、添加される試料液体の容量とインキュベーションの時間とは、従 来の測定法における場合と比較し得る程度に適切に選択される。

試料液体中に分析物が高濃度で存在する場合１例えば、血清中の抗体のような場 合には、キャリアの飽和液量の１０倍より少ない液量の試料液が使用される。好 ましくは、飽和液量の５倍よりも少ない液量が使用され、さらに好ましくは、飽 和液量の２倍よりも少ない液量が使用される。最も好ましくは、その飽和液量に 実質的に等しい液量が使用される。試料液の液量を減少させると、必要とされる インキュベートの時間が実質的に短くなり、従って、測定は、従来の測定法に必 要とされるのより実質的に短い時間で完了し得る。例えばＩｇＥ抗体については 、６５分という短い時間で完了する。

本発明の固相競合免疫測定法は、飽和液体容量が０．１ｄ未満、好ましくは１０ μ！またはそれ以下、さらに好ましくは５μ！またはそれ以下のキャリアを使用 し、そしてそれに接触する液体の総量を、そのキャリアの飽和液量の１０倍より も少なくすることにより特徴づけられる。

好ましくは、液体の量は、５倍未満、さらに好ましくは２倍未満、そして最も好 ましくは実質的にそのキャリアの飽和液量に等しく、そしてそのキャリアは、セ ルロース紙キャリアが適当である。

本発明に従って試料の液量を少なくすると、標準試薬の使用を経済的にすること ができる。これにより、大容積量の試料を用いる従来のＲＡＳＴ測定法において は実用的でない血清試料のような場合には特に、広範囲の標準試薬の供給を維持 することができる。

従って３本発明はまた１本発明の免疫測定法に用いられる免疫測定キットを提供 する。このキットは、担体中または担体上に固定化した結合物質を有する複数の 担体部材、標識インジケーターを含有する溶液の供給手段、および既知濃度の既 知分析物を含有する複数の異なる対照試料を有する。

本発明のさらに他の局面においては９本発明の免疫測定法に用いられる免疫測定 キットが提供される。このキットは。

担体中または担体上に固定化した結合物質を有する複数の担体部材および標識イ ンジケーターを含有する溶液の供給手段を有し、該溶液の液量は該担体部材の総 液体容積量とほぼ等量である。

ＲＡＳＴ法のような非鯖合的な測定法においては、各インキュベーション操作の 後にキャリアディスクを洗浄することが有利であり、あるいは不可欠なことであ る。そしてこの目的のための既知の洗浄装置は洗浄液供給手段と真空チャンバー との間に設置し得るプレートを有し、そのプレートはフィルターディスクを受容 する複数のウェルを有する。その装置では。

複数のディスクを同時に洗浄することが可能である。そのディスクは、測定の各 工程においてはウェルの中に置かれているが、放射能測定試験の工程においては 、そこから除去される。典型的には、各プレートには９６個のウェルがあり、各 バッチにおいて、９６のディスクを用いて同時に操作を行うことが可能である。

従来の洗浄装置では、そのバッチにおいて迅速な操作が可能であるが、その測定 工程でそれぞれのウェルからディスクを注意深く除去することが必要であり、そ のため操作が遅くなり得る。

従って９本発明の洗浄装置は、供給手段と受容槽との間に保持プレートが着脱可 能なように設置されていることにより特徴づけられる。

本発明の１つの実施態様においては、それぞれのウェルに口に対応する排出孔を 有し、そして、洗浄液供給手段はそのホルダーに液体を供給するように配置され ている。

好ましくは、各ホルダー内の排出孔は、ホルダー中の液体が重力によりそこを通 してもれることのないような大きさにつ（られている、そのホルダーは、その底 に排出孔を有するカップ状またはチューブ状であり得る。そのカップまたはチュ ーブはプラスチック材料またはガラスで都合よく形成されていて、閉じることが できるが着脱可能であり、ウェル内にフィツトするように寸法が決められて設計 されている。ウェルからの出口は、ホルダー内の排出孔と同じサイズの適当な毛 細管である。

保持プレートは、それらが有する個々のフィルターディスクよりも容易に操作さ れる。そして、そのため、各々のバッチにおけるフィルターの操作が容易となる 。ある状況においては、ウェル内にあるホルダーの使用が好適である。必要に応 じて各々のホルダーは個々のディスクを同定するために適当に標識され得る。

次に図面の説明を行う。

第１図は、一連のグラフであり、第１Ａ図は、試料の液量が減少することによる 効果、第１Ｂ図は、インジケーターの液量が減少することによる効果、第１Ｃ図 は試料およびインジケーターの液量が減少することによる効果、そして第１Ｄ図 は、インジケーターおよび試料の液量の減少に伴うインジケーターの濃度の増加 による効果を示す。

第２図は本発明の方法によって得られうる結果と、従来のＲＡＳＴ法によって得 られうる結果との間の関係を示すグラフである。

第３図は、従来のＲＡＳＴ法において９分析物質（ＩｇＥ抗体）の結合速度（第 ３Ａ図）、およびインジケーター（Ｉ　ｔ’−１抗−ＩｇＥ）の結合速度（第３ Ｂ図）を示す一組のグラフである。

第４図は本発明の測定法に対する対応する結合速度を示す一組のグラフである。

第５図は本発明による測定の感度について、試料の液量の効果を示すグラフであ る。

第６図は、３種の試料の液量での感度についての、インジケーターの液量を減少 させた場合の効果（第６Ａ図）を、従来のＲＡＳＴ法（第６Ｂ図）と比較した一 組のグラフである。

第７図は一連のグラフであり、第７Ａ図および第７Ｂ図はそれぞれ高力価および 低力−のＩｇＧ抗体試料の種々の希釈物とＩｇＧ抗体との結合速度を示すグラフ 、そして第７Ｃ図および第７Ｄ図は、それぞれ高力価および低力価の試料の同様 の希釈物に対するインジケーター（ｔｚｓｌ抗１ｇＧ）の結合速度を示すグラフ である。

第８図は本発明によりハチ毒に対するＩｇＧ抗体の測定を行う場合において′、 試料の液量およびｌ！＄１抗ＩｇＧの液量の効果を示す１組のグラフ（それぞれ 第８Ａ図および第８Ｂ図）である。

第９図は、　ＰＲＩＳＴにおいて１２ｓ■抗１ｇＥの液量を減少させた場合の効 果を示すグラフである。

第１０図は、インジケーターとしてＦａｂ’抗−１１Ｂを使用し、酵素による増 幅を行った場合のＩｇＥ　ＥＬＩＳＡの感度における効果を示すグラフである。

第１１図は１本発明の他の実施態様における。保持プレートが取り外された状態 の洗浄装置を示す。

第１２図および第１３図は、それぞれ第１１図に示された装置の保持プレートの 側面図および平面図をそれぞれ示す。

次の実施例においては、血清試料はハチ毒、草の花粉、トウゴマの種子に対して アレルギーを有する患者から集められた。そしてその血清試料は、あらかじめＩ ｇＥ抗体を含むことが示されている。はとんどの実験には、陽性の血清のプール が使用された。

２コＩＩシ引１製 ウサギ抗−１ｇＥは、ニューシーラント白ウサギを、　０．２５■のＩｇＥ　Ｐ Ｓ　（骨髄腫患者由来のＰＳ）で免疫することにより調製された。完全フロイン ドアジュバントを筋肉注射した後、　０．２５■のＩｇＥ　ＰＳ　（不完全フロ インドアジュバント中）で２週問おきに３回投与して増幅した。その血清を分離 し、正常なヒトの血清（２０ｍ血清／１０ｄ　ＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ）お よびヒトガンマグロブリン［１００■／１００　ｍセファロース４Ｂ　（アガロ ース）］に広範囲に吸収させた０次に、その抗１ｇＥを、　ＩｇＥＷＴ　（骨髄 腫患者由来−丁）を含むカラムを用いてアフィニティ精製した。アガロース（１ ０ｇ／　１０ｍ　ＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ）。

その精製された抗体を、　Ａｍｅｒｓｈａ＋＊　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　 ＰＬＣ，ＵＫにより供給されるｌ２ｊＨａ１でＩｓ議した。

（以下余白） 旦１石辻１ ＲＡＳＴ法 従来のＲＡＳＴ法にて、アレルギー抗原でコートした液体容量３μ！のディスク を、上述のような公知の洗浄装置においてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０． ０５Ｍ、ｐＨ７，４＋０．０５％ツイー７２０で洗浄した。この洗浄装置により 、洗浄したディスクから全ての余剰液体が除かれる。試験試料（５０μりを、も し必要ならばウマ血清で希釈し、平底のマイクロタイタープレートのアレルギー 抗原でコートしたディスク（Ｌｉｎｂｒｏ、Ｆｌｏｗ　ＬａｂｓＬｉｍｉｔｅｄ 、ＵＫ）で１８時間インキュベートした。ディスクを先のように洗浄し、上述の ようにして調製した１０ｎｇの＋ｚｓｌ抗−１ｇＥ（５０μりを添加した。翌日 、こΦディスクを再び洗浄し。

残存する放射能をマルチチャンネルガンマカウンター（ＬＫＢ−５ｗｅｄｅｎ） で１分間カウントした。プール血清の１７５希釈における試験内変動は５．７％ （ｎ＝ｉ４）である。

２５μｆ、１０μｌおよび５μ！の試験試料を用い、その他の全ての条件は同じ にして試験を繰り返した。次いで、もとの試料の１０倍、１００倍および１００ ０倍希釈した試験試料を用いた試験をさらに行った。結果を第１Ａ図に示す。試 料の液量が減少すると、各希釈液で測定されるカウント数が減少することがわか る。つまり、試験の感度は試料の液量が減少すると低下するということがわかる 。

実施■土 試料の液量を５０ｇ！！と一定に保ち、インジケーターの液量を試料の希釈率を 変化させたのと同じ希釈段階で５０ｕｌがら５μ！まで変化させて、比較例で行 った試験を繰り返した。

１０ｎｇが５μｌ中に加えられるように　１２ｓｉ抗−１μｌの濃度を１０倍高 くした。第１Ｂ図から　、＋２ｓ１抗−ＩｇＥの液量を減少させると試験の感度 が上昇することがわかる。つまり１分間あたりに測定されるカウント数を増大さ せることがわかる。

１施班又 １番目と２番目の反応液量を同じにすると（５＋５．１０＋１０、２５＋２５お よび５０＋５０）　、試料が５μｌというような少ない量で、比較しうる結果を 得ることが可能であった（第１ｃ図）。通常、　ＲＡＳＴ法で使用するのと同じ 濃度（０，４μｇ／ｄ）で少ない液量の１２Ｓ１抗−１μｌを使用すると、結合 した放射能性のカウント数が少ないという結果となった。そのことにより長いカ ウント時間を必要とした。

裏五五主 １２５Ｉ抗−１μｌの濃度を４μｇ／ｍｅに上げて、実施例２で行った試験を繰 り返し行うた。同様の結果が得られ、５μｌを用いた分析は、５０μｌの試料お よび５０μｌのインジケーターを用いる従来の測定方法と非常によく匹敵する（ 第１Ｄ図）。

工較旦ｌ トウゴマの種子にアレルギーをもつ患者から採取した４８種の異なった血清試料 を、従来のＲＡＳＴ法で試験した。

災施拠土 実施例３で記述したように９本発明の方法を用いて比較例２で行った試験を繰り 返した。それぞれの試料について従来の方法で測定した１分間あたりのカウント 数を１本発明による試験で測定した１分間あたりのカウント数に対してプロット した（第２図）。第２図かられがるように、２つの方法の間には密接なな相関が 得られる（ｒ・０．９６）。

北較■主 異なった希釈率の試料における９時間に伴うＩｇＢ抗体結合速度の増大を測定す るために、従来のＲＡＳＴ法を用いて試験を行った。その結果を第３図に示す、 最初のインキュベージジンでは、　ＩｇＥ抗体が結合するのにかかる時間は、低 い希釈率よりも高い希釈率のほうが長いことがわかる。しがし、低い希釈率のも のでさえ、平衡に達するまで４〜５時間かがることがわかる。

北較■土 やはり従来のＲＡＳＴ法に従って試験を行い、インジケーターの希釈率を種々に 変化させて＋ｚｓ■抗−１ｇＨの結合速度を測定した。その結果を第３Ｂ図に示 す。Ｉ！５１抗−１μｌ結合速度は通常かなり遅く、２４時間後でさえもプラト ーに達しなかった。

亥蓋班ｉ ＩｇＥ抗体血清試料の希釈率を種々に変え９本発明の方法を用いて比較例３の試 験を繰り返した。その結果は第４Ａ図として図示されており、各希釈率における 。平衡化が非常に迅速に達成されることがわかる。本発明の方法では、従来の測 定法と比較すると、抗体が抗原と接触する前に拡散しなげればならない距離はず っと短く、このことはＩｇＥ抗体の結合速度の増大に反映さねている（第３Ａ図 ）。１Ｄ分以内に平衡に達し、その後の実験により約５分でプラトーに達するこ とが示された。３μｌのようなより少量の試料では、５分よりも短い時間で平衡 に達すると予想される。

（以下余白） 実去Ｉ生り 比較例４で行った試験を１本発明の方法を用いて繰り返した。１２％ｌ抗−１ｇ Ｈの結合速度は、第４Ｂ図かられかるように、０．４および４μｇ／ｉの＋２Ｓ １抗−１μｌの両方を用いた従来の試験における結合速度（第３Ｂ図）よりも迅 速である。

１隻■１ 本発明の方法における試料の液量に対する絶対的な最小液量の限界を決定するた めに、５０μｌから１μｌのより広い範囲の液量を　＋ｚｓ１抗−１ｇＥの液量 を一定（５μりにして用いた。結果を第５図に示す。実用の目的のためには、最 小液量の限界は約３μ！であることがわかる。５μｌより多いと、特に高い試料 希釈率では感度がかなり上がった。

１隻勇且 本発明に従っ・て、少い液量（５μりの１２％Ｉ抗−１ｇＥインジケーターおよ び異なる液量の血清試料を異なる希釈率で用い、試験を行った。結果は第６Ａ図 のように示され、３００μｉの試料原液を用いると添加された放射性インジケー ターの８０％までが結合され得ることがわかる。

比較！Ｌ 実施例８の試験を、同じ量の抗体を含み、それゆえ実施例８で用いた５μｌの液 量のインジケーターにおけるのと同じ放射能カウント数である。５０μｌのイン ジケーターを用いて繰り返した。第６Ｂ図かられかるように、３００μｌの試料 は本発明に従った試験における５μ！（第６Ａ図）に対するよりもほんの少し高 いカウント数を与えているにすぎないので。

感度は実質上低下している。

Ｉ！Ｓ１抗−ＴｇＥが、ディスクに結合したＩｇＥ抗体と、より密接に接触する ことに起因して感度が増大し、　ＩｇＥ抗体が結合され得る効率がより高いこと から、非常に少量（わずか３μｍ）の血清を用いても、従来の試験法で得られる のと同じ感度を得ることができる。本発明の方法は、かかと穿刺により幼児から 採取された血液試料中の総ＩｇＥおよびＩｇＥ抗体を測定するのに用いられる。

血清の同様の節約は、やはり血清が少ししか得られないラットを試験する場合に も有用である。

叉施■工 高力価および低力価の血清試料中のハチ毒に対するＩｇＧ抗体の一連の測定を、 ハチ毒でコートした約３μｌの液体容量のセルロース紙ディスクを用いて行った 。ディスクを試料と共にインキュベートした。試料は、高力価の試料については １　／１００から１　／１０．０００に希釈し、そして低力価の試料については １　／１００から１　／３００に希釈した。ある範囲のインキュベーション時間 を用い、インキュベーションの終了時に各試料を洗浄した。その後　１２％ｌ抗 −１ｇＧ　（Ｐｈａｒｍａｓｉａ　（ＣＢ）ｐｌｃ）と共にインキュベートし１ 次いでさらに洗浄した。残存する放射能をガンマカウンターでカウントし、その 結果を第７Ａ図（高力価）および第７Ｂ図（低力価）に示す。高い希釈率では、 約１分間以内という非常に速い時間でプラトーに達するが、低い希釈率の高力価 試料では約５分の時間を要す１１１１段 高力価および低力価の血清試料中のハチ毒に対するＩｇＧ抗体のさらなる一連の 測定を、実施例９と同様に行ったが、平衡化するのに充分な一定のインキュベー ション時間を採用した　１２％！抗−ＩｇＧインジケーターを実施例９のように 使用し１種々の異なるインキュベーション時間でのカウント数を測定した。結果 を第７Ｃ図（高力価）および第７Ｄ図（低力価）に示す。より高い希釈率の試料 では特に、約１０分以内という速い時間で平衡に達することが再び観察される。

凡藍■旦 実施例９と同様の方法を、血清の高力価（実線）および低力価（破線）について の一連のグラフを作成するために用いたが、異なる量の血清、いくつかの異なる 希釈率および平衡を確実にするのに充分な一定のインキュベーション時間を採用 した。そのグラフを第８Ａ図に示す、少い液量では感度が低下することがわかる 。

１旌ｍ 対照的に１種々の希釈率の一定量の血清および一定のインキュベーション時間を 使用して比較例６の試験と類領した一連の試験を行ったが、異なる液量の１ｔｓ ｉ抗−１ｇＧを用いた。

第８Ｂ図から　Ｉ！Ｊ抗−１ｇＧの液量を３μｌに減少させた場合、さらに感度 が増大するので、添加したカウント数の８３％まで結合することがわかる。

実ｌＩ汁制 本発明に従ってＰＲＩＳＴ分析を行った。ＰＲＩＳＴは二部位測定法であり、こ の方法に用いるセルロース紙ディスクは試料中の全てのＩｇＥを結合する抗−１ μｌでコートされている０次いで、特異的に結合されたＩｇＥは放射性標識され た抗−ＩｇＥインジケーターを用いて検出される（代わりに、酵素標識された抗 −ＩｇＥが使用され得る）、５μ！、１０μｌおよび２５μｌの液量の試料およ びインジケーターを、３μ！容量のディスクと共に用いた。比較として、５０ｕ ｊ２を用いた試験も行った。

異なるＩｇＥ濃度範囲の試料を試験した。結果を第９図に示す。

信号対雑音比＜ｇＮ比）に換算すると、５μｌを用いて得られる結果は５０μｌ で得られる結果と同様であることがわかるが。

５μｌの試料の場合にはずっと高い信号レベルであることがわかる。

裏施五Ｕ アルカリホスファターゼに結合させたＦａｂ’抗−１μｌの、全ＩｇＥ　ＥＬＩ ＳＡへの効果を試験した。測定方法は、以前に記述されており（Ｋｅｍｅｎｙ　 Ｄ　Ｍ　およびＲｉｃｈａｒｄ　Ｒ，“微生物学における免疫学的技術”Ｂｌａ ｃｋｗｅｌｌｓ、０ｘｆｏｒｄ、１９８７の“全血清１ｇＨの検出のためのＥＬ ＩＳＡ　：速度および感度”）、抗１ｇＥ全体を使用する。簡単に述べると、４ ５％飽和硫安沈澱およびＡｃＡ３４　（ＬＫＢＬｔｄ）を詰めたカラムを通すゲ ル濾過により単離されたモノクローナル抗ＩｇＥ　（ＵＣＬＡ　（米国）のＡ、 ５ａｘｏｎ教授からの親切なる寄贈による）の過剰量で、プラスチック製のマイ クロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　Ｉ＋ｎｍｕｎｏ　１　）をコートした。モノ クローナル抗体は、１μｉ／ｄで用いた。試料を添加し、３時間インキュベート し、洗浄し、２〜５μｇｒａｆｔのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識した 抗１ｇＥを添加し、３時間インキュベートした。続いて、基質のパラニトロフェ ニルホスファターゼを加え、　０．０．４０５ｎｏ＋を測定した。その他、　Ｆ ａｂ’抗−１ｇＥを用いた場合には、　０．１〜０．３　ｄのＡＰを増幅した基 質（ＡＭＰＡＫ　Ｎｏｖ。

Ｂｉｏ　Ｌｔｄ）とともに用い、　Ｏ，Ｄ、　４９２ｎ＋ｌｌを測定した。

第１０図かられかるように、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合させたウサ ギ抗−１ｇＥのＦａｂ”部分を用い、その後酵素の増幅（ＡＭＰＡＸ、Ｎｏｖｏ 　Ｂｉｏ　Ｌｔｄ、　ＵＫの商標）を行うと、感度が１０倍増大した。この理由 は、検出物（Ｆａｂ”抗１ｇＥ−ＡＰ）の固相への本来は低い非特異的な結合が 、より大きな増幅をもたらすためである。本発明の方法により、利点も得られる と予想される。

第１１図から第１３図に示されている洗浄装置、特に、まず第１１図を参照する と、洗浄液供給槽１は、洗浄液を導入する開口部５に通じている密封された蓋部 ４を有する矩形のパースペックス製タンク３の形をしている。槽１は、洗浄液の 出口を提供するために延長された通路７が通っている厚い基板６を有する。通路 ７は、基板の中に等間隔を置いて８×１２個配列されており、従来のマイクロタ イタープレートのウェルの配列に似ている０通路７の内側の開口部は、基板６の 上部表面に機械でつくられた円錐状の凹部８で形成されており１通路７の外側の 端部は、基板６の下部表面の浅い円筒状の凹部９に連絡している。浅い円筒状の 凹部９は、シールとして作用する合成ゴム製の０−リング１１の収容部を提供す る。

基板６の端部重複部分は１位置決め用の釘を収容するための該基板を通って延び ている穿孔１２を、一方の端部に２箇所および他方の端部に１箇所有する。他方 、縁部の重複部分は。

受容槽２に供給槽を固定できるようにするための固定用ボルトを収容するための 穿孔１３を有する。

受容槽２は供給槽１と類似の構造をしており９通路７に対応する排出通路２６が ８×１２個並んだ厚い上部板１６を有する閉じた矩形のパースペックス製洗浄液 受容タンク１５から実質的に構成される。各排出通路２６の上端部は、ゴム製の ０−リング２７がシールとして作用するように収容される凹部２５に開いている 。上部プレート１６の端部重複部分には、直立した釘１７が一方の端部には２箇 所、そして他方の端部には１箇所あり。

該釘１７は槽１および槽２がそれらの間の保持プレートと共に固定される場合に 、穿孔１２に位置する。上部プレート１６重複部分の端部は、該上部プレートを 通して延長された穿孔１８を有しており、該穿孔の下方の端部には固定用ボルト を受けるためのブシュ１９が取りつけられている。

第１２図および第１３図を参照すると、保持プレート２３０は。

供給槽１の基板６の通路７の位置に対応する９等間隔を置いて８×１２個配列さ れているウェルを有する矩形のパースペックス製ブロックから構成される。それ ぞれのウェル２０は、プレート２１の厚みの大部分を通って延びている円筒状の 穿孔。

およびプレートの厚みの残りの部分を通って延びている毛細管２２から構成され る。それぞれのウェル２０には、その基部に毛細孔２４を持つカップ２３が着脱 可能なように設置され得る。

保持プレート３０は、槽１と２の間のプレートの位置が正確であるのを確実にす るために基板６の穿孔に対応する穿孔を持つ。

洗浄液受容槽２の内部は、使用済の洗浄液のための出口。

ている、出口２８は、好ましくは使用した洗浄液を受けるためのトラップを通っ て１通常は真空源に接続されている真空ラインに直接取りつけられている。

供給槽と受容槽とがそれらの間に保持プレートをはさんで互いに固定されている 場合、プレート３０の上面か、またはカップ２３の縁部を支えるように０−リン グ１１が用いられる。もし使用する時には、この０−リングにより槽１に対して 化ロアが密閉されると同時に、凹部２５の０−リング２７は毛細管２２が排出通 路２６を経て受容槽２と連絡するのが断たれる。

洗浄液は開口部５を通って供給槽１に導入され、受容槽２の出口２８は真空源と 接続され、真空とされる。真空による吸引により洗浄液が化ロアを通ってカップ ２３．あるいはもし使用する場合にはウェル２０に、フィルター紙ディスクを通 り。

そこから出口孔２４１毛細管２２および排出通路２６を通り、そして受容槽２に 供給される。

フィルター紙ディスクは、この装置を使って部分的に乾燥することができる。例 えば、真空状態にするために供給槽１の洗浄液を空にした後に真空源とこの装置 を分離し１次いで真空源にこの装置を再び接続することによりフィルター紙ディ スクを通して空気が一度に流れて該フィルター紙ディスクが部分的に乾燥する０ 次いで、ディスクをカップ２３を取り除くことにより、保持プレートから除去し 、該ディスクをカップ２３に入れたまま放射能をカウントすることができる。

別の方法として、抗原を放射性標識する代わりに、酵素標識する方法が用いられ る。結果として得られる結合酵素は。

その後検出しうる呈色の変化を与える反応を触媒するのに用いられる。このよう な試験のためには、カップに入れた液体がもれないように１通常カップは孔２４ を密閉するように配置した収容部材（例えば９通常のタイタープレートのウェル ）の中に配置される。

本発明のこの局面の洗浄装置は１本発明の免疫測定法に便利に使用される。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．分析物を含有する試料液を，結合物質を担体中または担体上に固定化した吸 収性の担体と接触させることによって該試料液中の分析物を該結合物質に結合 させる工程；この結合した分析物に標識インジケーターを接触させることにより インジケーターを該結合分析物に結合させ，非結合インジケーターを担体から除 去する工程；および残存する結合インジケーターを検出する工程を包含する固相 免疫測定法であって， 該標識インジケーターが担体の飽和液量の１０倍を下回る量の液体中に含有され る方法。 ２．前記インジケーターが担体の飽和液量の５倍を下回る量の液体中に含有され る，請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記インジケーターが担体の飽和液量の２倍を下回る量の液体中に含有され る，請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．前記インジケーターが担体の飽和液量と実質的に等しい量の液体中に含有さ れる，請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．前記吸収性の担体と接触される試料液の液量が担体の飽和液量の１０倍を下 回る，請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の方法。 ６．前記試料液の液量が担体の飽和液量の５倍を下回る，請求の範囲第５項に記 載の方法。 ７．前記試料液の液量が担体の飽和液量の２倍を下回る，請求の範囲第６項に記 載の方法。 ８．前記試料液の液量が担体の飽和液量と実質的に等しい，請求の範囲第７項に 記載の方法。 ９．前記担体の飽和液量が０．１ｍｌを下回る，請求の範囲第１項から第８項の いずれかに記載の方法。 １０．前記担体の飽和液量が１０μｌまたはそれを下回る，請求の範囲第９項に 記載の方法。 １１．前記担体の飽和液量が５μｌまたはそれを下回る，請求の範囲第１０項に 記載の方法。 １２，前記分析物が抗体であり，かつ前記結合物質が該抗体に特異的な抗原であ る，請求の範囲第１項から第１１項のいずれかに記載の方法。 １３．前記抗体がＩｇＥである，請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４．前記抗体がＩｇＧである，請求の範囲第１２項に記載の方法。 １５．前記インジケーターが放射性標識インジケーターであり，残存する結合イ ンジケーターが過剰のインジケーターの放射能を除去することにより検出される ，請求の範囲第１項から第１４項のいずれかに記載の方法。 １６．前記放射性標識インジケーターが５μＣｉ／μｇを下回る比放射能を有す る，請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７．前記放射性標識インジケーターが，放射能をカウントして１〜２分以内で 残存する結合インジケーターを検出するのに十分な放射能を有する，請求の範囲 第１６項に記載の方法。 １８．前記インジケーターが酵素標識インジケーターであり，残存する結合イン ジケーターが，該インジケーター上の酵素の作用によって生じる基質溶液の光学 特性の変化を検出することにより検出される，請求の範囲第１項から第１４項の いずれかに記載の方法。 １９．試料溶液を担体に添加して共にインキュベートする工程： 該担体から該試料液を洗浄除去し，該担体を実質的に乾燥する工程； 該担体にインジケーターを含有する液体を添加して共にインキュベートする工程 ； 該担体から試料液を洗浄除去する工程；および結合したインジケーターを検出す る工程；を包含する，請求の範囲第１項から第１８項のいずれかに記載の方法。 ２０．前記吸収性の担体が紙である，請求の範囲第１項から第１９項のいずれか に記載の方法。 ２１．担体と試料溶液とを互いに接触させる前に該担体を洗浄し実質的に乾燥す る，請求の範囲第１項から第２０項のいずれかに記載の方法。 ２２．分析物を含有する試料液および標識インジケーターを，結合物質を担体中 または担体上に固定化した吸収性の担体と接触させ，該分析物と該インジケータ ーとを該結合物質と競合的に結合させ，そして結合したインジケーターの量を検 出する固相競合免疫測定法であって，該担体が０．１ｍｌを下回る液体飽和容量 を有し，かつ総量または該担体と接触させる液体が飽和液量の１０倍を下回る方 法。 ２３．前記担体の飽和液量が５μｌまたはそれを下回る，請求の範囲第２２項に 記載の方法。 ２４．洗浄液供給手段，洗浄液受容槽，およびその間に保持プレートを有し，該 保持プレートがその上面に複数個のウェルを有し，かつ各ウェルが該保持プレー トの下面と連絡する出口を有する固相免疫測定法に用いるための洗浄装置であっ て，該保持プレートが該供給手段と該受容槽との間に着脱可能に固定し得る装置 。 ２５．ホルダーが各ウェルに着脱可能に配置され，該ホルダーはその中に出口に 対応する排出孔を有し，かつ洗浄液供給手段が該ホルダーに液体を供給するため に配置されている，請求の範囲第２４項に記載の装置。 ２６．前記各ホルダー上の排出孔が，該ホルダー内の液体が重力により該ホルダ ーを通って失われないような大きさである，請求の範囲第２４項または第２５項 に記載の洗浄装置。 ２７．担体中または担体上に固定化した結合物質を有する複数の担体部材，標識 インジケーターを含有する溶液の供給手段，および既知濃度の既知分析物を含有 する複数の異なる対照試料を有する，請求の範囲第１項または第２２項に記載の 方法に使用する免疫測定キット。 ２８．担体中または担体上に固定化した結合物質を有する複数の担体部材および 標識インジケーターを含有する溶液の供給手段を有し，該溶液の液量が該担体部 材の総液体容積とほぼ等量である，請求の範囲第１項に記載の方法に使用する免 疫測定キット。