[go: up one dir, main page]

DE3751109T2 - Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan. - Google Patents

Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan.

Info

Publication number
DE3751109T2
DE3751109T2 DE3751109T DE3751109T DE3751109T2 DE 3751109 T2 DE3751109 T2 DE 3751109T2 DE 3751109 T DE3751109 T DE 3751109T DE 3751109 T DE3751109 T DE 3751109T DE 3751109 T2 DE3751109 T2 DE 3751109T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
reagent
insect
peptidoglycan
glucan
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE3751109T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3751109D1 (de
Inventor
Masaaki Ashida
Shuji Matsuura
Yoshitsugu Sakata
Masakazu Tsuchiya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Original Assignee
Wako Pure Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP28824486A external-priority patent/JPH07114706B2/ja
Priority claimed from JP28824586A external-priority patent/JPH07114707B2/ja
Application filed by Wako Pure Chemical Industries Ltd filed Critical Wako Pure Chemical Industries Ltd
Application granted granted Critical
Publication of DE3751109D1 publication Critical patent/DE3751109D1/de
Publication of DE3751109T2 publication Critical patent/DE3751109T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4722—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
    • Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

    Ausgangssituation
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien zur Bestimmung von β-1,3-Glucan oder Peptidoglykan und ein Verfahren zur Bestimmung von β-1,3-Glucan oder Peptidoglykan, bei dem diese verwendet werden.
  • β-1,3-Glucan (nachfolgend bezeichnet als "β-G") liegt in der Natur als eine Zellwandkomponente von echten Pilzen vor, wie beispielsweise Hefepilze und Schimmelpilze, sowie als überwiegende Polysaccharid-Komponente in den Fruchtkörpern vieler Basidiomyceten. Es ist bekannt, daß β-G gegenüber dem sogenannten Limulustest positiv ist, bei dem es sich um eine Methode zum Nachweis von Endotoxin unter Verwendung eines aus Hämatozytenlysat von Königskrabben gereinigten Reagens handelt. Unter Anwendung dieser Eigenschaft von β-G wurde eine Methode zur Bestimmung von β-G vorgeschlagen, die speziell von Endotoxin nicht beeinflußt wurde, und bei der ein aus Hämatozytenlysat von Königskrabben gereinigtes Reagens verwendet wurde (Rinsho Byori (Clinical Pathology) 33, 639 ... 644, 1985). Eine solche Methode wurde in der Praxis jedoch aufgrund von Schwierigkeiten, wie beispielsweise Instabilität des Reagens, nicht eingesetzt. Es wurde ebenfalls eine Methode zum Nachweis von Endotoxinen oder β-G unter Verwendung eines durch Reinigung von Hämatozytenlysat aus einem Crustacea oder einem Insekt (PCT, International Publication Nr. WO 83/02123) erhaltenen Reagens vorgeschlagen. Das für diesen Prozeß vorgeschlagene Reagens reagiert jedoch sowohl mit den Endotoxinen als auch mit β-G. Um daher dieses Reagens zur Bestimmung speziell von β-G zu verwenden, ist der Zusatz von aus Blutzellen von Flußkrebsen gereinigten Anti-Endotoxin-Faktoren erforderlich.
  • Andererseits ist Peptidoglykan (nachfolgend bezeichnet als "PG") eine Art von Glykopeptidpolymer, bei dem es sich um einen Bestandteil von Zellwandungen von Bakterien handelt und das verstärkt in Zellwandungen von grampositiven Bakterien enthalten ist und weniger in Zellwandungen von gramnegativ Bakterien. Normalerweise ist PG dadurch gekennzeichnet, daß es N-Acetyl- oder N-Glykolylmuraminsäure und D-Aminosäure enthält. Es ist bekannt, daß PG viele biologische Aktivitäten hat, wie beispielsweise das Auslösen von Fieberanfällen; Herabsetzen der Leberfunktion und Nierenfunktion; Verstärken der Endotoxin-Aktivität und Erhöhung der Wirkung der Immunfunktion (Adjuvans-Aktivität). Solche Untersuchungen über PG wurden auf den Gebieten der Medizin, Pharmakologie und Mikrobiologie ausgeführt, eine spezifische Nachweismethode wurde jedoch nicht gefunden.
  • Einige der Erfinder haben bereits festgestellt, daß eine von der Seidenraupe erhaltene Körperflüssigkeit mit Endotoxin nicht reagiert, wohl aber mit PG oder β-G reagiert, so daß zumindest 3 Arten von Enzymen aktiviert werden, d.h. eine den N-α-Benzoyl-L-argininethylester hydrolysierende Esterase (BAEEase), Propenoloxidase aktivierendes Enzym (PPAE) und Phenoloxidase (PO) (Insect Biochem, Bd. 16, Nr. 3, S. 539 ... 545, 1986). Da es jedoch in bezug auf die Selektivität ein Problem gab, wurde diese Reaktion zur Bestimmung von oder PG nicht angewendet.
  • Da sich, wie bereits erwähnt, geeignete Bestimmungsmethoden nicht etabliert haben, sind die Einflüsse von β-G oder PG auf den menschlichen Körper noch nicht vollständig bekannt. Neuerdings hat sich jedoch die Frage ergeben, ob β- G nicht eine der Schockursachen ist, wenn Hämodialysefilme von Cellulosederivaten verwendet werden. Es ist auch nahegelegt worden, daß β-G in der Körperflüssigkeit von Patienten vorhanden sein könnte, die an mykotischen Infektionen leiden. Daher wird in der Medizin auf Gebieten wie der Pharmakologie und Mikrobiologie die geeignete Bestimmung von β-G oder PG immer wichtiger.
    • Zusammenfassung
  • Die Anmelder haben mit Erfolg eine Komponente isoliert, welche spezifisch β-G oder PG bindet, und zwar aus Insektenplasma, und haben festgestellt, daß β-G oder PG bestimmt werden können, indem die resultierenden Plasmafraktionen mit einer zu testenden Probe zur Reaktion gebracht werden, die β-G oder PG enthält, und die ausgeprägten enzymatischen Aktivitäten von beispielsweise BAEEase, PPAE, PO gemessen werden oder die zum Ausprägen dieser enzymatischen Aktivitäten erforderliche Zeit gemessen wird. Auf diese Weise ist man zu der vorliegenden Erfindung gelangt.
  • In einem ihrer Aspekte gewährt die vorliegende Erfindung ein Reagens zum Bestimmen von β-1,3-Glucan. Das Reagens umfaßt eine Fraktion, die aus dem Plasma eines Insektes erhalten wird, welches spezifisch mit β-1,3-Glucan reagieren kann. Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls ein Verfahren zum Bestimmen von β-1,3-Glucan, welches umfaßt: Reagierenlassen einer Probe mit einem Reagens, umfassend eine aus dem Plasma eines Insekts erhaltene Fraktion, die mit β-1,3-Glucan spezifisch reagieren kann und Messen der erzeugten enzymatischen Aktivität.
  • Die erzeugte enzymatische Aktivität kann durch Messen der für eine auszuprägende enzymatische Aktivität erforderlichen Zeit quantitativ bestimmt werden.
  • In einem weiteren Aspekt gewährt die vorliegende Erfindung ein Reagens zum Bestimmen von Peptidoglykan. Das Reagens umfaßt eine aus dem Plasma eines Insekts erhaltene Fraktion, die mit Peptidoglykan spezifisch reagieren kann.
  • Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Verfahren zum Bestimmen von Peptidoglykan, welches umfaßt: Reagierenlassen einer Probe mit einem Reagens, umfassend eine aus dem Plasma eines Insekts erhaltene Fraktion, die mit Peptidoglykan spezifisch reagieren kann, und Messen der erzeugten enzymatischen Aktivität.
  • Die erzeugte enzymatische Aktivität kann durch Messen der für eine auszuprägende enzymatische Aktivität erforderlichen Zeit quantitativ bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung gewährt ferner ein Verfahren zum Herstellen des erwähnten Reagens, wie es in den beigefügten Ansprüchen 8 und 9 festgelegt wurde.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Es zeigen:
  • Fig. 1 eine graphische Darstellung der Änderung des Absorptionsvermögens bei 520 nm in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, wenn man die in Beispiel 3 erhaltenen verschiedenen Proben mit Substratlösungen reagieren läßt;
  • Fig. 2 eine in Beispiel 4 erhaltene Eichkurve;
  • Fig. 3 eine in Beispiel 5 erhaltene Eichkurve;
  • Fig. 4 eine graphische Darstellung der Änderung des Absorptionsvermögens bei 520 nm in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, wenn man die in Beispiel 6 erhaltenen verschieenen Proben mit Substratlösungen reagieren läßt;
  • Fig. 5 eine in Beispiel 7 erhaltene Eichkurve;
  • Fig. 6 eine in Beispiel 8 erhaltene Eichkurve.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Hinsichtlich der Insekten, die in der vorliegenden Erfindung Körperflüssigkeiten liefern können, gibt es keine Beschränkung, jedoch werden größere Formen mit dafür bekannten Aufzuchtmethoden bevorzugt. Beispiele für derartige Insekten sind die zur Ordnung der Lepidoptera gehörenden Manduca serta, Gelleria melonella, Hyalphoma ceropia und Bombyx mori (Seidenspinner); die zur Ordnung der Diptera gehörenden Sarcophaga peregrina und musca; die zur Ordnung der Orthoptera gehörenden Heuschrecken und Migratoria Teleogryllus sowie der zur Ordnung der Coleoptera gehörende Cerambyx ((Bockkäfer)).
  • Die aus dem Körperhohlraum erhaltene Körperflüssigkeit, die Hämolymphe, ist am leichtesten zu erhalten und wird daher normalerweise verwendet.
  • Die Körperflüssigkeit von Insekten kann beispielsweise nach der von M. Ashida (Insect Biochem., 11, 57 ... 65 (1981)) offenbarten Methode gesammelt werden, d.h. Insekten, wie beispielsweise Seidenraupenlarven, werden auf Eis betäubt und in das Hämocoel (Körperhöhle) der Seidenraupenlarve physiologische Kochsalzlösung injiziert, die Zucker, einschließend als Verunreinigungen Zuckerrohr-Faktor (im Zuckerrohr enthaltende polymere Substanzen und beispielsweise umfassend Glucose und Aminsosäuren) enthielten oder der Zuckerrohr-Faktor selbst injiziert wurde. Sodann wurde der Larvenkörper mit einem feinen Faden festgebunden, so daß ein Austreten der injizierten Kochsalzlösung verhindert wurde. Nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten wurde ein Bein weggeschnitten und die Körperflüssigkeit gesammelt. Die gesammelte Flüssigkeit wurde sodann zum Isolieren von Blutzellen zentrifugiert, danach dialysiert und Insektenplasma erhalten.
  • Wahlweise kann die Körperflüssigkeit von Insekten (umfassend die vorgenannten Reagenzien) nach einem vor kurzem von einigen Anmeldern der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen Verfahren gesammelt werden, d.h. zu einer Lösung, die in bezug auf eine zu sammelnde Insektenkörperflüssigkeit isotonisch ist und Serinprotease enthält (nachfolgend bezeichnet als "SP")-Inhibitor (nachfolgend bezeichnet als "SPI"), bei dem es sich um eine das SP irreversibel inhibierende Substanz handelt, wird eine Insektenkörperflüssigkeit zugesetzt und überschüssiges SPI danach entfernt. Die Insektenkörperflüssigkeit ohne freies SPI nimmt das Reaktionsvermögen mit β-G oder PG auf.
  • Ferner kann die Körperflüssigkeit von Insekten (umfassend die vorgenannten Reagenzien) ebenfalls nach einem Verfahren gesammelt werden, umfassend das Injizieren einer für das zu verwendende Insekt isotonen Lösung, die eine die Serinprotease für das Insekt irreversibel inhibierende Substanz enthält, Abtrennen eines Teils des Körpers, Sammeln einer austretenden Körperflüssigkeit und Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz. Die Insektenkörperflüssigkeit ohne freies SPI nimmt das Reaktionsvermögen mit β-G oder PG auf.
  • In bezug auf das SPI gibt es keinerlei Beschränkung, solange es das SPI irreversibel inhibieren kann und von der Fraktion einer Insektenkörperflüssigkeit abgetrennt werden kann, die mit β-G oder PG reagiert. Zu den SPI-Substanzen gehören vorzugsweise solche vom Standpunkt der Handhabung, die verhältnismäßig geringe relative Molekülmassen haben, z.B. 2.000 oder weniger, und sich mit Hilfe der Dialyse isolieren lassen. Bevorzugte Beispiele für das SPI sind (p- Amidinophenyl) methansulfonylfluorid (p-APMSF), Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), Diisopropylfluorphosphorsäure (DFP), p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoesäure (NPPB) und Dihydroxychlormethylcumalin.
  • Es ist ausreichend, zu der vorgenannten isotonen Lösung das SPI in einer Menge hinzuzufügen, die mindestens notwendig ist, um das SP zu inaktivieren, das während des Sammelns der Körperflüssigkeit inaktiviert werden soll. Die bevorzugte SPI-Menge in der isotonen Lösung beträgt 0,1 ... 10 mMol, mehr bevorzugt 0,5 ... 5 mMol.
  • Diese Methode kann beispielsweise folgendermaßen ausgeführt werden:
  • Zu einer Lösung, die SPI enthält und in bezug auf eine zu sammelnde Insektenkörperflüssigkeit isoton ist, wird eine Körperflüssigkeit direkt tropfenweise zugesetzt, die aus einem verletzten Abschnitt eines Insekts ausgetreten ist. Wahlweise wird, nach dem Injizieren einer Lösung, die SPI enthält und in bezug auf eine in dem Insekt zu sammelnde Insektenkörperflüssigkeit isotonisch ist, eine aus dem verletzten Teil des Insekts austretende Körperflüssigkeit gesammelt. Sodann wird die gesammelte Flüssigkeit zum Entfernen der Blutzellen u.dgl. zentrifugiert. Darüber hinaus wird das in der resultierenden, die Körperflüssigkeit enthaltenden Lösung vorhandene SPI mit Hilfe einer oder mehrerer am besten geeigneten Methode entfernt, die normalerweise auf dem Gebiet der Biochemie für die Isolation und Reinigung angewendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des zu verwendenden SPI, z.B. mit Hilfe einer Methode der Dialyse, einer Methode der Gelfiltration, einer Methode des Ionenaustausches, Hochleistungsflüssigchromatographie. Als Resultat wird die angestrebte Lösung erhalten, die das Insektenplasma enthält. Außerdem kann die Operation der SPI-Isolation durchgeführt werden, nachdem man die zentrifugierte Lösung nach einer konventionellen Methode, wie beispielsweise der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, bis zu einem gewissen Maße eingeengt und gereinigt hat.
  • Das so erhaltene Plasma enthält eine Substanz, die mit Endotoxin nicht reagiert, sich jedoch spezifisch mit β-G bindet und mit β-G unter Ausprägung einer enzymatischen Aktivität (oder Einleiten der Ausprägung einer enzymatischen Aktivität) reagiert, sowie eine weitere Substanz, die mit Endotoxin nicht reagiert, sich jedoch spezifisch mit PG bindet und mit diesem unter Ausprägung einer enzymatischen Aktivität (oder Einleitung der Ausprägung einer enzymatischen Aktivität) reagiert. Wenn die Substanz(en), die mit β- G unter Ausprägung der enzymatischen Aktivität (oder Einleiten der Ausprägung der enzymatischen Aktivität) reagiert/reagieren, entfernt wird, wird eine Fraktion erhalten, die spezifisch mit PG reagiert. Im Gegensatz dazu wird, wenn die Substanz(en) entfernt wird/werden, die mit PG unter Ausprägung der enzymatischen Aktivität (oder Einleiten der Ausprägung der enzymatischen Aktivität) reagiert/reagieren, die Fraktion erhalten, die spezifisch mit β-G reagiert.
  • Als die Methode zum Entfernen von Substanz(en), die mit β-G oder PG unter Ausprägung der enzymatischen Aktivität (oder Einleiten der Ausprägung der enzymatischen Aktivität) reagiert/reagieren, kann jede beliebige Trenn- und Reinigungsmethode verwendet werden, die üblicherweise auf dem Gebiet der Biochemie eingesetzt werden, wie beispielsweise Gelfiltration, Elektrophorese, Hochleistungsflüssigchromatographie, Affinitätschromatographie. Unter diesen Methoden ist die Affinitätschromatographie unter Verwendung eines an β-G oder PG gebundenen Trägers besonders bevorzugt, da ihr Betrieb besonders wirksam und ausgesprochen leicht ist.
  • Eine solche Affinitätschromatographie wird nachfolgend ausführlich erläutert.
  • Als Träger zum Binden von β-G oder PG können verwendet werden: Cellulose, Agarose, Dextran oder Polyacrylamid, poröses Glas. Diese Träger sind die üblicherweise in der Affinitätschromatographie verwendeten Träger. Unter ihnen wird Agarose besonders bevorzugt. Kommerziell verfügbare Träger sind Träger vom Agarose-Typ, wie beispielsweise Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals), Biogel A (Bio-Rad Laboratries); Träger vom Dextran-Typ, wie beispielsweise Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals), P-L DEX (P-L Biochemicals); Träger van Polyacrylamid-Typ, wie beispielsweise Sephacryl (Pharmacia Fine Chemicals) und Biogel P (Bio-Rad Laboratories).
  • Um β-G oder PG auf einem solchen Träger zu binden, muß der Träger aktiviert werden. Der Träger kann beispielsweise durch Aktivierung mit CNBr für den Fall des Bindens von PG an einen Träger vom Agarose-Typ aktiviert werden. Es ist auch möglich, eine durch Epoxy aktivierte (Epichlorhydrinaktiviert) Agarose als aktivierte Agarose sowohl für β-G als auch PG zu verwenden.
  • Als das an einem Träger gebundene β-G kann ein natürliches verwendet werden, daß aus verschiedenen Bakterien erhalten wird (z.B. Alcaligenes Genus und Agrobacterium Genus), Hefen (z.B. Saccharomyces Genus) und Hutpilzen (z.B. Cortinellus shiitake, Schizophyrum communis, Coriolus versicolor); oder Reserve-Polysacchariden von Algen, z.B. Braunalgen, Laminaria Genus, Euglena, Diatomeen.
  • Für den Fall, daß ein Material, wie beispielsweise Curdlan, das sich zu einem unlöslichen Träger (z.B. Kügelchen) verarbeiten läßt, anstelle des vorstehend erwähnten, an β-G gebundenen Trägers verwendet wird, ist es möglich, zur Ausführung der Affinitätschromatographie ein solches Material als einen Träger ohne Binden an andere Träger zu verwenden. Die für einen solchen Zweck zu verwendenden Curdlan- Kügelchen können beispielsweise nach den in den US-P-4 143 201 und 4 493 894 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
  • Andererseits kann als das an einem Träger gebundene PG ein natürliches verwendet werden, das aus Zellwandungen von verschiedenen Bakterien erhalten wird (z.B. Micrococcus Genus, Streptococcus Genus, Mycobacterium Genus, Bacillus Genus und Staphylococcus Genus); oder ein zersetztes (abgebautes) PG, das bis zu einem gewissen Maß durch ein geeignetes Enzym, wie beispielsweise Eiklar-Lysozym, zersetzt (abgebaut) wird. Es ist ebenfalls möglich, zur Ausführung der Affinitätschromatographie anstelle des am PG gebundenen Trägers PG selbst als einen Träger zu verwenden.
  • Zur wirksamen Ausführung der Affinitätschromatographie wird angestrebt, als einen ersten Schritt den Einfluß der Kationen zu beseitigen, die in der Körperflüssigkeit vorliegen, wie beispielsweise Ca²&spplus; und Mg²&spplus;, indem ein Chelatbildner zu dem Plasma und Eluat für die Affinitätschromatographie zugesetzt wird. Beispiele für den Chelatbildner sind Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Natriumsalz der Ethylenglykol-bis ((3-aminoethylether) -N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA). Der Chelatbildner wird vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 10 mMol in Plasma oder Eluat verwendet. Es ist ebenfalls möglich, anstelle des Chelatbildners das vorgenannte SPI zu verwenden. Bevorzugte Mengen von SPI im Plasma oder Eluat sind 0,1 ... 10 mMol, mir beeorzugt 0,5 ... 5 mMol.
  • Die Affinitätschromatographie kann nach dem konventionellen Vorgehen ausgeführt werden. Durch Behandeln des Insektenplasmas mit Hilfe der Affinitätschromatographie unter Verwendung des an dem vorgenannten β-G oder PG gebundenen Trägers kann mühelos die Fraktion erhalten werden, die spezifisch mit PG oder β-G reagiert.
  • Unter Verwendung der so erhaltenen Fraktion kann die Bestimmung von β-G oder PG folgendennaßen ausgeführt werden.
  • Es wird eine β-G oder PG enthaltende Probe mit einem Reagens gemischt, welches eine Fraktion aufweist, die spezifisch mit β-G oder PG reagiert (nachfolgend bezeichnet als "β-G-Reagens" oder "PG-Reagens"), um eine Lösung zur Reaktion zuzubereiten. Nach einer bestimmten Zeitdauer wird eine enzymatische Aktivität (z.B. Aktivität von BAEEase, PPAE, PO, in der Reaktionslösung mit Hilfe einer konven-tionellen Methode gemessen und mit Eichkurven verglichen, die zuvor unter Verwendung von β-G- oder PG-Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen zur Bestimmung der Menge von β-G oder PG erhalten wurden (nachfolgend wird die Methode bezeichnet als "End-Methode").
  • Wahlweise ist es möglich, von einem Phänomen Gebrauch zu machen, bei dem eine für die Aktivierung von PO erforderliche Zeit von der Konzentration von β-G oder PG in der Probe abhängt, d.h. nach dem Mischen des β-G-Reagens oder PG-Reagens mit einer Probe in Gegenwart des Substrats von PO wird eine Zeit gemessen, die zum Erreichen eines bestimmten Wertes der Menge des durch PO erzeugten Reaktionsprodukts benötigt wird. Von den Anmeldern der vorliegenden Erfindung wird diese Methode empfohlen (nachfolgend bezeichnet als die "Zeit-Methode").
  • Vor der Bestimmung von β-G oder PG durch Anwendung entweder der End-Methode oder der Zeit-Methode müssen zweiwertige Metallionen der Reaktionslösung zugesetzt werden, wie beispielsweise Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, die bei der Herstellung der spezifisch mit β-G oder PG reagierenden Fraktion aus der Reagenslösung entfernt wurden. Die Endkonzentration dieser zweiwertigen Metallionen in der Reaktionslösung beträgt vorzugsweise etwa 4 ... 10 mMol.
  • In der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Zusätzen oder Reagenzien möglich, die zur konventionellen Bestimmung enzymatischer Aktivitäten benötigt werden, wie beispielsweise Substrate, Puffer, kuppelnde Enzyme, Coenzyme sowie Farbentwicklungsmittel, die Enzymaktivität verbessernde Mittel, Stabilisatoren von Enzymen und Farbstoffen und grenzflächenaktive Mittel, was von den Enzymen abhängt, deren Aktivitäten gemessen werden sollen. Diese Zusätze oder Reagenzien können zuvor in dem β-G- oder PG-Reagens aufgelöst werden, oder es ist wie im Falle der End-Methode möglich, einen Teil der Reaktionslösung, der diese Zusätze oder Reagenzien nicht enthält und aus einer Probe genommen wurde, mit einem Reagens zum Messen der enzymatischen Aktivität reagieren zu lassen.
  • Bei der Bestimmung von β-G oder PG unter Anwendung dieser Methoden ist die Reaktionstemperatur solange nicht besonders begrenzt, wie die Reaktion zwischen einer β-G oder PG enthaltenen Probe und dem β-G- oder PG-Reagens ablaufen kann, wobei die Temperatur vorzugsweise 20 ºC ... 40 ºC beträgt.
  • Die Änderungen des Reaktions-pH-Wertes hängen von den zu messenden Enzymen ab. Um den pH-Wert der Reaktion aufrecht zu erhalten, wird normalerweise ein Puffer verwendet, soweit die Reaktion nicht beeinflußt wird. Beispiele der Puffer sind Phosphatpuffer, Borat-Puffer, Acetat-Puffer und Tris-HCl-Puffer, Goods-Puffer.
  • Mit den vorgenannten Methoden meßbare β-G sind beispielsweise: Zymosan, Curdlan und Pachyman; sowie Glykosepolymere mit β-1,3-Bindung und deren Derivate, wie beispielsweise Sclerotan, Lentinan, Schizophyllan, Coriolan, Laminarin, Lichenin.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
    • Vergleichsbeispiel 1 Herstellung von Seidenraupenplasma
  • Es wurde nach der Ashida-Methode (Insect Biochem., 11, 57 ... 65, 1981) folgendermaßen Seidenraupenplasma gewonnen.
  • Es wurden Seidenraupenlarven im fünften Larvenstadium für 10 Minuten auf Eis anästhesiert. In das Hämocoel wurde durch eine subkutane Nadel, die an der Verbindung des fünften und sechsten Abdominalsegments eingeführt wurde, physiologische Kochsalzlösung in der Menge des halben Körpergewichts und mit einem Gehalt von 20 mMol Rohrzucker oder 6 ug/ml von Rohrzucker gereinigtem Rohrzuckerfaktor injiziert. Nach der Injektion wurde der Larvenkörper mit einem feinen Faden am hinteren Teil des fünften Abdominalsegments festgebunden, um ein Austreten der injizierten Kochsalzlösung zu verhindern. Nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur für 20 Minuten wurde zum Ablaufenlassen an dem dritten Abdominalsegment ein Bein abgetrennt. Die gesammelte Hämolymphe wurde für 5 Minuten bei 1.500 g bei einer niedrigen Temperatur (etwa 4 ºC) zum Abtrennen der Hämozyten zentrifugiert. Der Überstand in einer Menge von etwa 100 ml wurde bei einer niedrigen Temperatur für 2 Tage gegen 3 Liter eines 0,01 M Tris-Malat-Puffers (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15 M KCl) dialysiert, um das gewünschte Seidenraupenplasma zu ergeben.
    • Vergleichsbeispiel 2 Herstellung von Peptidoglykan
  • Es wurden Zellwandungen von Micrococcus luteus ATCC 4698 in 150 ml kaltem Wasser suspendiert und 0,6 g/ml Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 mm zugesetzt. Es wurde bei 0 ºC eine Ultraschallbehandlung ausgeführt, um die Zellwandungen auf zubrechen. Nach dem Entfernen der Glaskügelchen wurde für 10 Minuten bei 2.200 g zum Abtrennen eines Niederschlags zentrifugiert, gefolgt von einem Zentrifugieren des Überstandes für 45 Minuten bei 20.000 g. Der erhaltene Niederschlag wurde in 150 ml einer 1 M NaCl-Lösung suspendiert, wonach durch Zentrifugieren bei 2.200 g ... 20.000 g Fraktionen gesammelt wurden, um ein Rohpräparat von Zellwandungen zu erhalten.
  • Das erhaltene Rohpräparat von Zellwandungen wurde in 80 ml Wasser suspendiert, für 20 Minuten bei 100 ºC erhitzt, gekühlt, mit 140 ml 2M Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 5,9) und 10 mg Ribonuclease zugesetzt und für 3 Stunden bei 37 ºC inkubiert. Sodann wurde für 1 Stunde bei 20.000 g zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag in 50 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 7,5 mit einem Gehalt von 20 mMol MgCl&sub2;, 1 mMol CaCl&sub2; und 7 mg DNase I (hergestellt von der Sigma Chem. Co., Ltd.) suspendiert und für 3 Stunden bei 37 ºC inkubiert. Danach wurde für 1 Stunde bei 20.000 g zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag in 1.000 ml einer 0,4%igen Natriumdodecylsulfat-Lösung suspendiert und bei Raumtemperatur für 1 Stunden stehen gelassen. Sodann wurde der Niederschlag sechsmal mit destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von einer Gefriertrocknung, um ein gereinigtes Zellwandpräparat zu ergeben.
  • Das erhaltene reine Zellwandpräparat wurde in 0,1N HCl suspendiert und bei 60 ºC für 24 Stunden stehen gelassen. Sodann wurde für 1 Stunde bei 20.000 g zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag mit destilliertem Wasser gewaschen und einer Gefriertrocknungunterzogen, um Peptidoglykan zu ergeben.
    • Vergleichsbeispiel 3 Vorbereitung der Säule mit Curdlan-Kügelchen
  • Zu 9 g Curdlan-Pulver (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden 270 ml reines Wasser gegeben und umgerührt, um eine Aufschlämmung zu erhalten. Nach dem Zusatz von 30 ml 1N NaOH zu der Aufschlämmung wurde das Curdlan aufgelöst, um eine wäßrige Natriumhydroxid-Lösung von Curdlan zu ergeben. Es wurden in ein 8 l-Becherglas 1.200 ml Toluol und 6 g des grenzflächenaktiven Mittels Emalex HC-80 (ein Warenzeichen, mit Polyoxyethylen gehärtetes Rizinusölderivat, hergestellt von der Nihon Emulsion Co., Ltd.) gegeben und dazu tropfenweise die wäßrige Narium-hydroxid- Lösung des Curdlans bei Raumtemperatur unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 800 U/min und unter Verwendung eines Mischers vom Schneckentyp zugesetzt. Die so erhaltene Curdlan-Dispersion wurde zu einer 2.000 ml Toluol und 1.000 ml Essigsäure enthaltenden Flüssigkeit unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 800 u/min zugesetzt. Nach dem Rühren für 1 Stunde ließ man die resultierenden Curdlan- Dispersion für etwa 8 Stunden zum Absetzen der erzeugten Kügelchen stehen. Das Lösemittel wurde durch Dekantieren entfernt. Der erhaltene Niederschlag wurde 5 mal mit 8 Liter reinem Wasser gewaschen, um ihn pH-neutral zu machen und das organische Lösemittel vollständig zu entfernen und 240 ml Curdlan-Kügelchen zu erhalten.
  • Die Kügelchen wurden klassiert und diejenigen mit einer Teilchengröße von 50 ... 100 Mikrometer (mittlere Teilchengröße: etwa 80 Mikrometer) mit 0,01M Tris-Malat-Puffer (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15M KCl und 1 mMol EDTA; nachfolgend bezeichnet als "TMB") äquilibriert und in eine Säule (1,3 cm Durchmesser und 2,3 cm Länge) gepackt, um eine Säule mit Curdlan-Kügelchen zu erhalten.
    • Beispiel 1
  • Es wurden Seidenraupenlarven (Bombyx mori) des fünften Larvenstadiums für 10 Minuten auf Eis anästhesiert. Am dritten Abdominalsegment wurde ein Bein abgetrennt und auslaufende Hämolymphe in 10 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung getropft, die 2 mMol p-APMSF enthielt, und gesammelt. Aus 25 Seidenraupenlarven wurden etwa 15 ml Hämolymphe erhalten. Daraus wurden etwa 25 ml einer verdünnten Hämolymphen-Lösung erhalten. Die verdünnte Hämolymphen-Lösung wurde für 5 Minuten bei 1.500 g zentrifugiert, um Hämozyten zu entfernen. Zu 25 ml des resultierenden Überstandes wurden 37,5 ml gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung zugesetzt, um eine 60%ige gesättigte Ammoniumsulfat-Suspension zu erhalten, die für 20 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert wurde, um einen Niederschlag zu liefern. Dieser Niederschlag wurde in 27 ml 0,01M Tris-Malat-Puffer (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15M Nacl) aufgelöst, 0,1 ml einer 200 mMol p-APMSF-Lösung zugesetzt und viermal gegen 1 Liter eines 0,01M Tris-Malat-Puffer (pH 6,5, mit einem Gehalt von 0,15M NaCl) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde für 20 Minuten bei 10.000 g und niedrigen Temperaturen zentrifugiert, um das gewünschte Seidenraupenplasma zu ergeben.
  • Die gleichen Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn anstelle von p-APMSF NPGB verwendet wurde.
    • Beispiel 2
  • Es wurden Seidenraupenlarven (Bombyx mori) im fünften Larvenstadium für 10 Minuten auf Eis anästhesiert. In das Hämocoel wurde an der Verbindung des fünften und sechsten Abdominalsegments 0,09%ige NaCl-Lösung injiziert, die 2 mMol p-APMSF enthielt. Nach der Injektion wurde der Larvenkörper mit einem feinen Faden am hinteren Teil des fünften Abdominalsegments festgebunden, um ein Austreten der injizierten Kochsalzlösung zu verhindern. Sodann wurde am dritten Abdominalsegment ein Bein abgetrennt, um eine austretende Körperflüssigkeit (Hämolymphe) zu sammeln. Die gesammelte Hämolymphe wurde für 5 Minuten bei 1.500 g und niedrigen Temperaturen zentrifugiert, um Hämatozyten zu entfernen. Zu 10 ml des erhaltenen überstandes wurden 0,05 ml einer 200 mM p-APMSF- Lösung zugesetzt und für 20 Minuten bei 10.000 g und niedrigen Temperaturen zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine mit 0,01M Tris-Malat-Puffer (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15M NaCl) äquilibrierten Sephatex G-25-Säule (2,5 cm Durchmesser und 25 cm Länge) geschickt. Nach dem Sammeln der Peaks von Protein, das in das Porenvolumen der Säule eluiert wurde, wurde das gewünschte Seidenraupenplasma erhalten.
    • Beispiel 3 (1) Vorbereitung der mit Peptidoglykan gekoppelten Sepharose 4B-Säule
  • Das in Vergleichsbeispiel 2 in einer Menge von 153 mg erhaltene gereinigte Peptidoglykan wurde in 153 ml 80 mM Ammoniumacetat suspendiert und 1,5 mg Eiklar-Lysozym zugesetzt. Nach dem Erhitzen für 5 Minuten bei 45 ºC unter Rühren wurde für 2 Stunden bei 37 ºC digeriert. Sodann wurde die Reaktionslösung mit einem Millopor-Filter (HAWPO 4700) filtriert und das Filtrat einer Gefriertrocknung unterzogen. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in 6 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde in einer Menge von 5,5 ml unter Anwendung einer Sephadex G-50 SF- Säule (Eluat: eine 50 mM Ammoniumcarbonat-Lösung; Säule 2,5 cm Durchmesser und 90 cm Länge; Elutionsrate: 15 ml/h) einer Gelfiltration unterzogen. Die mittleren Teile der aktiven Fraktionen von reduzierendem Zucker, die durch den Aufschluß erzeugt wurden, wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in 6,3 ml 0,1M Natriumcarbonat-Puffer (pH 10) aufgelöst, um eine Peptidoglykan-Lösung zu ergeben. Die Peptidoglykan-Lösung wurde mit 2,7 g CNBr-aktivierter Sepharose 4B (hergestellt von der Pharmacia Fine Chemicals) entsprechend der konventionellen Methode umgesetzt, um mit Sepharose 4B gekoppeltes Peptidoglykan zu ergeben.
  • Das auf diese Weise mit Peptidoglykan gekoppelte Sepharose 4B wurde in eine Säule (0,6 cm Durchmesser und 1,7 cm Länge) gepackt und mit TMB äquilibriert, um eine PG-Säule zu ergeben.
    • (2) Zubereitung von β-G-Reagens
  • Zu dem im Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Seidenraupenplasma wurde eine 100 mM EDTA-Lösung (pH 6,5) zugesetzt, um die End-Konzentration von EDTA auf 1 mM einzustellen. Es wurden 15 ml der resultierenden Lösung mit der PG-Säule behandelt, die vorstehend unter (1) (Eluat: TMB; Elutionsrate: 6 ml/h) erhalten wurde. Das unmittelbar nach dem Ausgießen der Probe in einer Menge von 12 ml erhaltene Eluat wurde gesammelt, um ein β-G-Reagens zu ergeben.
    • 3) Messung der Aktivierung von Zvmogenen (inaktive Formen von BAEEase. PPAE und PO) durch Zymosan β-1,3-Glunan) oder PG in β-G-Reagens oder Seidenraupenplasma [Meßverfahren]
  • Zu 200 Mikroliter des im Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Seidenraupenplasmas oder dem unter (2) erhaltenen β-G- Reagens wurden 20 Mikroliter einer 80 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt und unter gründlichem Mischen zum Reagieren bei 25 ºC ferner 1 mg/ml Zymosan-Lösung oder 1 mg/ml PG-Lösung zugesetzt. Der Reaktionslösung wurde in Intervallen zum Messen des Aktivierungsgrades von PO- oder des BAEEase-Aktivitätswertes Proben entnommen.
    • 1. Messung der PO-Aktivität
  • Zu 1 ml einer Substratlösung (ein 0,1M Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 4 mMol 4-Methylcatecin und 8 mMol 4- Hydroxyprolinethylester, pH 6,0) wurden 10 Mikroliter einer Probe (der vorgenannten Reaktionslösung) zugesetzt und für 10 Minuten bei 30 ºC reagieren gelassen. Sodann wurde das Absorptionsmaß von dem erzeugten Chinonfarbstoff bei 520 nm gemessen, um den Aktivitätsgrad von PO zu erhalten.
  • Fig. 1 zeigt Anderungen des Absorptionsmaßes bei 520 nm in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, wenn man verschiedene Proben mit der Substratlösung reagieren läßt. In Fig. 1 sind die Änderungen der Absorptionsmaße dargestellt durch die Kurve - - im Fall der Reaktion von Zymosan mit dem β-G- Reagens, durch die Kurve - - im Fall der Reaktion von PG mit dem β-G-Reagens, durch die Kurve -ο- im Fall der Reaktion von Zymosan mit dem Seidenraupenplasma und durch die Kurve - Δ- im Fall der Reaktion von PG mit dem Seidenraupenplasma.
    • 2. Messung der BAEEase-Aktivität
  • Zu 1 ml einer Substratlösung (enthaltend 2 mMol N-α- Benzoyl-L-argininethylester, 1 mMol NAD (Nicotinamidadenindinucleotid), 0,1 mg/ml Alkoholdehydrogenase, 0,25 Mol Tris(hydroxymethyl)aminomethan und 0,2 Mol Semicarbazid, pH 8,5), die zuvor bei 25 ºC erhitzt wurde, wurden 30 Mikroliter einer Probe (der vorgenannten Reaktionslösung) zugesetzt und zum Reagieren bei 25 ºC gründlich gemischt. Es wurde eine durch die Reaktion erzeugte Erhöhung des Absorptionsmaßes von NADH (Nicotinamidadenindinucleotid, reduzierte Form) bei 340 nm gemessen. Eine Einheit (U) von BAEEase wird als eine Menge definiert, die 1 nMol Ethanol in einer Minute unter den vorgenannten Bedingungen erzeugen kann.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Reagens Probelösung BAEEase-Aktivität (U/ml) Seidenraupenplasma β-G-Reagens Zymosan-Lösung PG-Lösung
  • Wie aus Tabelle 1 klar ersichtlich, werden die Enzyme in dem Seidenraupenplasma durch Zymosan und PG aktiviert, die Enzyme in dem β-G-Reagens jedoch werden lediglich von Zymosan nicht aber von PG aktiviert.
  • Die gleichen Ergebnisse wie vorstehend wurden erhalten, wenn die β-G-Reagenzien verwendet wurden, die unter Verwendung des in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Seidenraupenplasmas hergestellt wurden.
    • Beispiel 4 Erzeugung der Eichkurve für β-1,3-Glucan unter Verwendung von Curdlan [Meßverfahren]
  • Zu 2 ml des im Beispiel 3 (2) erhaltenen β-G-Reagens wurden 200 Mikroliter einer 80 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt und gut gemischt. Zu 10 Mikroliter der resultierenden Mischung wurden 10 ml einer Curdlan-Lösung mit einer vorbestimmten Konzentration zugesetzt und für 60 Minuten bei 30 ºC inkubiert. Sodann wurde 1 ml der gleichen Substratlösung wie in Beispiel 3 (3) zum Messen PO-Aktivität zugesetzt und für 10 Minuten bei 30 ºC reagieren gelassen, wonach eine Messung des Absorptionsmaßes bei 520 nm (gemessener Wert: Es) folgte. Der Blindwert (EBl) wurde in der gleichen Weise erhalten, wie vorstehend unter Verwendung von gereinigtem Wasser anstelle der Curdlan-Lösung beschrieben wurde.
    • [Ergebnisse]
  • Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Curdlan- Konzentration und den (ES-EBl)-Werten unter Verwendung eines logarithmischen Maßstabes sowohl für die Ordinate als auch für die Abszisse.
  • Wie aus Fig. 2 klar ersichtlich, wird eine gute Linearität erhalten.
    • Beispiel 5 Erzeugung der Eichkurve für β-1,3-Glucan unter Verwendung von Curdlan [Meßverfahren]
  • Zu 2 ml des im Beispiel 3 (2) erhaltenen β-G-Reagens wurden 200 ml einer 80 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt und gut gemischt. Zu 70 Mikroliter der resultierenden Mischung wurden 70 Mikroliter von 0,1 M Phosphatpuffer (enthalten 20 mMol L-Dopa, pH 6,0) und 70 Mikroliter einer Curdlan-Lösung mit einer vorbestimmten Konzentration zugesetzt und gründlich gemischt. Sodann wurde unter Verwendung eines Toxinometers ET-201 (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) eine Zeit (Δt) gemessen, die zum Herabsetzen der durchgelassenen Lichtmenge bei 30 ºC um 5 % benötigt wird.
    • [Ergebnisse]
  • Fig. 3 zeigt die Beziehung zwischen Δt und der Curdlan- Konzentration unter Benutzung des logarithmischen Maßstabes sowohl für die Ordinate als auch für die Abszisse.
  • Wie aus Fig. 3 klar ersichtlich, wird eine gute Linearität erhalten.
  • Wie vorstehend bereits ausgeführt, kann β-G unter Verwendung der Reagens gemessen werden, welche die Komponente enthält, die spezifisch mit β-G reagiert. Unter Verwendung einer solchen Bestimmungsmethode können der Nachweis von Kontamination mit wahren Pilzen, Untersuchungen von Blutdialysefilmen von Cellulosederivaten, Untersuchungen von reaktionsfähigen Substanzen, die in bezug auf den Limulus-Test außer Endotoxin reaktionsfähig sind, usw., präzise und mühelos ausgeführt werden.
    • Beispiel 6 (1) Zubereitung von PG-Reagens
  • Zu 5 ml des im Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Seidenraupenplasmas wurden 20 ml TMB zugesetzt und gründlich gemischt, um eine Probe zu ergeben, die mit der in Vergleichsbeispiel 3 erhaltenen Säule mit Curdlan-Kügelchen behandelt wurde. Die in einer Menge von etwa 25 ml durchgelaufene Proteinfraktion wurde in 225 ml einer gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung getropft, gefolgt von einem Rühren über Nacht. Es wurde ein Niederschlag durch Zentrifugieren (bei 16.000 g für 20 Minuten) gesammelt und sodann in 4 ml TMB aufgelöst, gefolgt von einer Dialyse gegen 500 ml TMB. Die resultierende Lösung wurde wiederum zentrifugiert (bei 16.000 g für 20 Minuten) und der Überstand zu insgesamt 5 ml mit TMB aufgefüllt, um ein PG-Reagens zu ergeben.
    • (2) Messung der Aktivierung von Zymogenen (inaktive Formen von BAEEase. PPAE und PO) durch Zymosan (β-1,3-Glucan) oder PG in PG-Reagens oder Seidenraupenplasma [Meßverfahren]
  • Zu 200 Mikroliter des im Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Seidenraupenplasmas oder dem vorstehend unter (1) erhaltenen PG wurden 20 Mikroliter einer 80 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt und zusätzlich 20 Mikroliter einer 1 mg/ml- Zymosan-Lösung oder einer 1 mg/ml-PG-Lösung (zubereitet, indem die in Vergleichsbeispiel 2 erhaltene verwendet wurde) zugegeben und gründlich gemischt, um bei 25 ºC reagieren zu lassen. Der Reaktionslösung wurde in Intervallen zum Messen des Aktivierungsgrades von PO- oder des BAEEase- Aktivitätswertes Proben entnommen.
    • 1. Messung der PO-Aktivität
  • Zu 1 ml einer Substratlösung (ein 0,1M Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 4 nM 4-Methylcatecin und 8 mM 4-Hydroxyprolinethylester, pH 6,0) wurden 10 Mikroliter einer Probe (der vorgenannten Reaktionslösung) zugesetzt und für 10 Minuten bei 30 ºC reagieren gelassen. Sodann wurde das Absorptionsmaß von dem erzeugten Chinonfarbstoff bei 520 nm gemessen, um den Aktivitätsgrad von PO zu erhalten.
  • Fig. 4 zeigt Änderungen des Absorptionsmaßes bei 520 nm in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, wenn man verschiedene Proben mit der Substratlösung reagieren läßt. In Fig. 4 sind die Änderungen des Absorptionsmaßes dargestellt durch die Kurve - - im Fall der Reaktion von Zymosan mit dem β-G- Reagens, durch die Kurve - - im Fall der Reaktion von PG mit dem β-G-Reagens, durch die Kurve -ο- im Fall der Reaktion von Zymosan mit dem Seidenraupenplasma und durch die Kurve - Δ- im Fall der Reaktion von PG mit dem Seidenraupenplasma.
    • 2. Messung der BAEEase-Aktivität
  • Zu 1 ml einer Substratlösung (enthaltend 2 mMol N-α- Benzoyl-L-argininethylester, 1 mMol NAD (Nicotinamidadenindinucleotid), 0,1 mg/ml Alkoholdehydrogenase, 0,25 Mol Tris(hydroxymethyl)aminomethan und 0,2 Mol Semicarbazid, pH 8,5), die zuvor bei 25 ºC erhitzt wurde, wurden 30 Mikroliter einer Probe (der vorgenannten Reaktionslösung) zugesetzt und zum Reagieren bei 25 ºC gründlich gemischt. Es wurde eine durch die Reaktion erzeugte Erhöhung des Absorptionsmaßes von NADH (Nicotinamidadenindinucleotid, reduzierte Form) bei 340 nm gemessen. Eine Einheit (u) von BAEEase wird als eine Menge definiert, die 1 nMol Ethanol in einer Minute unter den vorgenannten Bedingungen erzeugen kann.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Reagens Probelösung BAEEase-Aktivität (U/ml) Seidenraupenplasma β-G-Reagens Zymosan-Lösung PG-Lösung
  • Wie aus Tabelle 2 klar ersichtlich, werden die Enzyme im Seidenraupenplasma durch Zymosan und PG aktiviert, die Enzyme in dem PG-Reagens werden jedoch lediglich aktiviert durch PG und nicht aktiviert durch Zymosan.
  • Die gleichen Ergebnisse wie vorstehend wurden erhalten, wenn die PG-Reagenzien verwendet wurden, die unter Verwendung des in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Seidenraupenplasmas hergestellt wurden.
    • Beispiel 7 Erzeugung der Eichkurve für PG [Meßverfahren]
  • Zu 2 ml des in Beispiel 6 (1) erhaltenen PG-Reagens wurden 200 Mikroliter einer 80 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt und gut gemischt. Zu 10 Mikroliter der resultierenden Mischung wurden 10 Mikroliter der PG-Lösung mit einer vorbestimmten Konzentration zugesetzt und für 60 Minuten bei 30 ºC inkubiert. Sodann wurde 1 ml der gleichen Substratlösung zum Messen PO-Aktivität zugegeben, wie sie in Beispiel 6 (2) verwendet wurde, und weiter für 10 Minuten bei 30 ºC reagieren gelassen, gefolgt von einer Messung des Absorptionsmaßes bei 520 nm (gemessener Wert: ES). Der Blindwert (EBl) wurde in der gleichen Weise wie vorstehend erwähnt unter Verwendung von gereinigtem Wasser anstelle der PG- Lösung erhalten.
    • [Ergebnisse]
  • Fig. 5 zeigt die Beziehung zwischen der PG- Konzentration und den (ES-EBl)-Werten unter Benutzung eines logarithmischen Maßstabes sowohl für die Ordinate als auch für die Abszisse.
  • Wie aus Fig. 5 klar ersichtlich, wird gute Linearität erhalten.
    • Beispiel 8 Erzeugung der Eichkurve für PG [Meßverfahren]
  • Zu 2 ml des im Beispiel 6 (1) erhaltenen PG-Reagens wurden 200 Mikroliter einer 80 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt und gründlich gemischt. Zu 70 Mikroliter der resultierenden Mischung wurden 70 Mikroliter 0,1M Phosphatpuffer (enthaltend 20 mMol L-Dopa, pH 6,0) und 70 Mikroliter PG-Lösung mit einer vorbestimmten Konzentration zugesetzt und gründlich gemischt. Sodann wurde unter Verwendung eines Toxinometers ET-201 (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) eine Zeit (At) gemessen, die zum Herabsetzen der durchgelassenen Lichtmenge um 5 % bei 30 ºC benötigt wurde.
    • [Ergebnisse]
  • Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen Δt und der PG- Konzentration unter Benutzung des logarithmischen Maßstabes sowohl für die Ordinate als auch für die Abszisse.
  • Wie aus Fig. 6 klar ersichtlich, wird eine gute Linearität erhalten.
  • Wie bereits erwähnt, kann PG unter Verwendung des Reagens bestimmt werden, welches die Komponente enthält, die mit PG spezifisch reagieren kann. Unter Anwendung einer solchen Bestimmungsmethode kann PG präzis und mühelos bestimmt werden.

Claims (9)

1. Reagens zur Bestimmung von β-1,3-Glucan oder Peptidoglykan, umfassend eine Fraktion, die aus Plasma eines Insektes erhalten werden kann, von dem die Substanz isoliert worden ist und die sich an den andere Verbindungen bindet und mit diesen reagiert, um eine Fraktion zu hinterlasssen, die spezifisch mit der Verbindung reagieren kann, deren Bestimmung gewünscht wird.
2. Reagens nach Anspruch 1, bei welchem das Insekt ein aus den Ordnungen Lepidoptera, Diptera, Orthoptera und Coleoptera ausgewählter Vertreter ist.
3. Reagens nach Anspruch 1, bei welchem das Insekt Seidenraupenlarven sind.
4. Reagens zur Bestimmung von Peptidoglykan nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem die Substanz, die sich an β-1,3-Glucan bindet und mit diesem reagiert, mit Hilfe der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines an β- 1,3-Glucan gebundenen Trägers isoliert wurde.
5. Reagens zur Bestimmung von β-1,3-Glucan nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die Substanz, die sich mit Peptidoglykan bindet und mit diesem reagiert, mit Hilfe der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines an Peptidoglykan gebundenen Trägers isoliert wurde.
6. Verfahren zur Verwendung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Bestimmung des Peptidoglykans, wobei das Reagens eine Fraktion aufweist, die mit Peptidoglykan spezifisch reagieren kann und bei welchem Verfahren man eine Peptidoglykan aufweisende Probe mit dem Reagens reagieren läßt und entweder eine Messung der erzeugten enzymatischen Aktivität ausgeführt wird oder eine Messung der Zeit ausgeführt wird, die erforderlich ist, um eine enzymatische Aktivität auszuprägen, wobei das in der Messung verwendete Enzym eines von denen ist, die durch die Anwesenheit von Peptidoglykan aktiviert werden.
7. Verfahren zur Verwendung des Reagens von einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 zur Bestimmung des β-1,3-Glucan, wobei das Reagens eine Fraktion aufweist, die mit β-1,3- Glucan spezifisch reagieren kann und bei welchem Verfahren man eine β-1,3-Glucan aufweisende Probe mit dem Reagens reagieren läßt und entweder eine Messung der erzeugten enzymatischen Aktivität ausgeführt wird oder eine Messung der Zeit ausgeführt wird, die erforderlich ist, um eine enzymatische Aktivität auszuprägen, wobei das in der Messung verwendete Enzym eines von denen ist, die durch die Anwesenheit von β-1,3-Glucan aktiviert werden.
8. Verfahren zur Herstellung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches die Schritte umfaßt:
Zusetzen einer Insektenkörperflüssigkeit zu einer Lösung, die in bezug auf die Körperflüssigkeit des Insektes isoton ist und eine Serinprotease irreversibel inhibierende Substanz enthält, und
Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz,
Isolieren der Substanz, die sich mit der anderen Verbindung bindet und mit dieser reagiert, um eine Fraktion zu hinterlasssen, die spezifisch mit der Verbindung reagieren kann, deren Bestimmung gewünscht wird.
9. Verfahren zur Herstellung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches die Schritte umfaßt
Injizieren einer isotonen Lösung des zu verwendenden Insektes in das Insekt, die eine Serinprotease irreversibel inhibierende Substanz enthält, Abtrennen eines Teils des Körpers, Sammeln einer austretenden Körperflüssigkeit und Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz,
Isolieren der Substanz, die sich an der anderen Verbindung bindet und mit dieser reagiert, um eine Fraktion zu hinterlasssen, die spezifisch mit der Verbindung reagieren kann, deren Bestimmung gewünscht wird.
DE3751109T 1986-12-03 1987-11-27 Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan. Expired - Fee Related DE3751109T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP28824486A JPH07114706B2 (ja) 1986-12-03 1986-12-03 新規測定試薬
JP28824586A JPH07114707B2 (ja) 1986-12-03 1986-12-03 新規な測定試薬

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3751109D1 DE3751109D1 (de) 1995-04-06
DE3751109T2 true DE3751109T2 (de) 1995-10-12

Family

ID=26557092

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3752307T Expired - Fee Related DE3752307T2 (de) 1986-12-03 1987-11-27 Verfahren zum Sammeln von Insekten-Körperflussigkeiten
DE3751109T Expired - Fee Related DE3751109T2 (de) 1986-12-03 1987-11-27 Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3752307T Expired - Fee Related DE3752307T2 (de) 1986-12-03 1987-11-27 Verfahren zum Sammeln von Insekten-Körperflussigkeiten

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4970152A (de)
EP (2) EP0634656B1 (de)
AT (2) ATE119204T1 (de)
DE (2) DE3752307T2 (de)
ES (1) ES2068180T3 (de)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0141685B1 (ko) * 1988-09-01 1998-07-01 야마따니 와따루 참게 아메보사이트 라이세이트 g 인자 활성화 저해제
US5681710A (en) * 1991-03-14 1997-10-28 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Reagent for determining (1→3)-β-D-glucan
US5279937A (en) * 1992-04-30 1994-01-18 Detechnology Canada Use of macroglobulins to improve the signal-to-background ratio in affinity binding assays
CA2112776C (en) * 1993-01-21 2002-11-12 Masakazu Tsuchiya Process for inhibiting activity of endotoxin
EP0657546B1 (de) * 1993-11-18 2002-03-06 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Prophenoloxidaseaktivierenden Enzyms und dessen Anwendung
CA2181325A1 (en) * 1995-07-31 1997-02-01 Masakazu Tsuchiya Process for detecting microorganisms
US6034217A (en) * 1996-09-17 2000-03-07 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Peptidoglycan recognition proteins and their production
EP0924220A3 (de) * 1997-12-16 2000-04-26 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Inhibitor für die Aktivierung eines Erkennungsproteins für beta-Glucan
KR100467165B1 (ko) * 2000-01-20 2005-01-24 주식회사 삼양제넥스 β-1,3-글루칸 검출용 조성물, 그것의 제조방법 및 그것을이용한 β-1,3-글루칸 검출 키트
AU2891401A (en) * 2000-01-20 2001-07-31 Samyang Genex Corporation Composition for detecting beta-1,3-glucan, preparation method thereof and diagnostic kit detecting beta-1,3-glucan
KR100456006B1 (ko) * 2000-08-24 2004-11-08 주식회사 삼양제넥스 페놀옥시데이즈 시스템을 구성하는 단백질 및 그것의 유전자
WO2002101083A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Samyang Genex Corporation Composition for detecting peptidoglycan, and diagnostic kit detecting peptidoglycan
KR100471308B1 (ko) * 2001-06-08 2005-03-08 주식회사 삼양제넥스 펩티도글리칸 검출용 조성물, 및 이를 이용한펩티도글리칸 검출키트
KR100485947B1 (ko) * 2001-07-14 2005-04-28 주식회사 삼양제넥스 β-1,3-글루칸 검출용 조성물, 그것의 제조방법 및 그것을이용한 β-1,3-글루칸 검출 키트
ES2330527T3 (es) * 2003-10-31 2009-12-11 Immunetics, Inc. Analisis rapido basado en peptidoglicano para deteccion de contaminacion bacteriana de plaquetas.
US8450079B2 (en) 2003-10-31 2013-05-28 Immunetics, Inc. Method for detecting bacteria
US7598054B2 (en) * 2003-10-31 2009-10-06 Immunetics, Inc. Rapid peptidoglycan-based assay for detection of bacterial contamination of platelets
US7118857B2 (en) * 2004-02-27 2006-10-10 Baxter International Inc. Methods and compositions for detection of microbial contaminants in peritoneal dialysis solutions
EP1842069A2 (de) * 2004-12-02 2007-10-10 Charles River Laboratories, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis und/oder zur quantifizierung grampositiver bakterienkontaminanten
CU24073B1 (es) * 2011-12-27 2015-01-29 Ct De Investigación Y Desarrollo De Medicamentos Cidem COMPOSICIÓN A PARTIR DE EXTRACTO DE HEMOCITOS DE LANGOSTA PARA LA DETECCIÓN DE LIPOPOLISACÁRIDOS, PEPTIDOGLICANOS Y 1,3-ß-D-GLUCANOS
WO2016163782A1 (ko) 2015-04-08 2016-10-13 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브 및 그의 이용

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE431228B (sv) * 1981-12-17 1984-01-23 Kenneth Soderhell Sett att bestemma bakteriella endotoxin medelst profenoloxidashaltigt blodkroppslysat fran kreftdjur eller insekter och reagens herfor

Also Published As

Publication number Publication date
ATE188777T1 (de) 2000-01-15
ATE119204T1 (de) 1995-03-15
EP0270039A2 (de) 1988-06-08
US4970152A (en) 1990-11-13
DE3752307T2 (de) 2000-07-06
EP0270039B1 (de) 1995-03-01
DE3752307D1 (de) 2000-02-17
ES2068180T3 (es) 1995-04-16
DE3751109D1 (de) 1995-04-06
EP0634656A1 (de) 1995-01-18
EP0634656B1 (de) 2000-01-12
EP0270039A3 (de) 1991-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3751109T2 (de) Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan.
DE68925420T2 (de) Limulus amoebozyt-lysat g-faktor-aktivierungs inhibitor
DE69030449T2 (de) Verfahren und kit zur reinigung von nukleinsäure
DE2915082C2 (de)
DE3787445T2 (de) Verfahren zur Isolierung von langkettiger Nukleinsäure.
Norkrans Influence of Cellulolytic Enzymes from Hymenomycetes on Cellulose Preparations of Different Crystallinity.
DE68909643T2 (de) Herstellungsverfahren eines Reagenz zur Messung von Endotoxinen.
DE68929334T2 (de) Verfahren zumm Assay von Endotoxin-Konzentration
DE69123445T2 (de) Verfahren zur bestimmung von endotoxinen
DE69833675T2 (de) Faktor g reduzierte amebozyten-lysate zur nachweisung der bakteriellen endotoxinen
Boden et al. Demonstration and characterization of chitinases in the Drosophila Kc cell line
DE69836496T2 (de) Verfahren zur herstellung von beta-(1,3)-d-glukan aus pilzen
DE19645601C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Boronsäureester-Derivaten
DE69321622T2 (de) Probenvorbehandlung zum Nachweis von Endotoxin
CH670709A5 (de)
DE2823573A1 (de) Immobilisierte restrictions-endonucleasen und verfahren zum immobilisieren von restrictions-endonucleasen
EP1242816B1 (de) Chromatographiematerial und verfahren unter verwendung desselben
CH637423A5 (de) Verfahren zur extraktion von mikroorganismen und verwendung der mikroorganismen fuer ein diagnostisches mittel.
DE2722380A1 (de) In-vitro-verfahren zur raschen trennung der mm- und mb-kreatin-kinaseisoenzyme in blutplasma oder -serum
CH634923A5 (en) Process for the preparation of pili from Neisseria gonorrhoeae
EP1053345B1 (de) Verfahren zur herstellung von baccatin
DE2907228A1 (de) Immunochemische bestimmung
DE2525804C3 (de)
DE69833012T2 (de) Monoklonaler antikörper gegen alpha2-makroglobulin und dessen verwendung zum nachweis von glucan
DE3014076A1 (de) Neue heparin-fraktionen mit erhoehter antikoagulans-wirkung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee