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WO2016163782A1 - 펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브 및 그의 이용 - Google Patents

펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브 및 그의 이용 Download PDF

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Publication number
WO2016163782A1
WO2016163782A1 PCT/KR2016/003662 KR2016003662W WO2016163782A1 WO 2016163782 A1 WO2016163782 A1 WO 2016163782A1 KR 2016003662 W KR2016003662 W KR 2016003662W WO 2016163782 A1 WO2016163782 A1 WO 2016163782A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
probe
bacteria
quencher
peptidoglycan
binding protein
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/003662
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정봉현
임은경
박경숙
최종민
Original Assignee
재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 filed Critical 재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority to US15/563,713 priority Critical patent/US10634674B2/en
Publication of WO2016163782A1 publication Critical patent/WO2016163782A1/ko

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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a probe for detecting bacteria using a peptidoglycan binding protein.
  • the present invention also relates to a method for producing a bacterial detection probe using the peptidoglycan binding protein.
  • the present invention also relates to a method for detecting bacteria using the probe.
  • beer not only contains alcohol, high taste components, carbon dioxide, but also has a low pH and a very low concentration of oxygen, which does not provide a suitable environment for microorganisms to inhabit.
  • some microorganisms are detected in beer.
  • These microorganisms are classified as beer harmful microorganisms, such as beer harmful microorganisms not only cause beer turbidity, but also cause beer deterioration, and further causes various diseases caused by bacterial contamination.
  • Peptidoglycan is a component of the bacterial cell wall and is a glycoprotein polymer comprising N-acetylmuramic acid or N-glycosylmuramic acid and D-amino acid which forms a thin layer inside the outer membrane of the cell wall. Therefore, it is possible to detect and measure peptidoglycan and apply it to the stability test of medicines, microbiological test of water and food, and diagnosis of infectious diseases.
  • US Pat. No. 4,970,152 describes specifically detecting peptidoglycan by removing proteins reacting with beta-1,3-glucan from the plasma solution of silkworm moth larvae.
  • the composition requires the addition of calcium ions for the phenol oxidase activity to be exerted by the peptidoglycan. That is, according to U.S. Patent 4,970,152, when collecting bodily fluids of insects, phenol oxidase is inhibited by calcium ions to obtain phenol oxidase composition, and calcium ions are added in order to cause color development using peptidoglycan as a substrate. It is required.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop an effective bacterial detection system that specifically binds to a peptidoglycan of bacteria to generate a fluorescent signal, thus completing the bacterial detection probe of the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a probe for detecting bacteria using the peptidoglycan binding protein.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a bacterial detection probe using the peptidoglycan binding protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for detecting bacteria using the probe.
  • the present invention provides a probe for detecting bacteria, including a peptidoglycan binding protein (PGBP), a fluorescent material and a quencher.
  • PGBP peptidoglycan binding protein
  • the "peptidoglycan binding protein” is a protein containing a peptidoglycan binding domain capable of binding to a peptidoglycan and is not limited in kind.
  • a probe was prepared using a peptidoglycan binding protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the fluorescent material is a material that generates fluorescence when it is physically separated from the quencher, and does not limit its kind.
  • Fluorescent materials include molecules, metal ions, complexes, organic dyes, conductors, semiconductors, insulators, quantum dots, and quantum wires that emit in an excited state.
  • fluorescent material examples include fluorescent proteins such as enhanced green fluorescent protein (EGFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), enhanced blue fluorescent protein (EBFP), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), and red fluorescent protein (RFP).
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • EBFP enhanced blue fluorescent protein
  • EYFP enhanced yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • examples of the fluorescent material include pyrene or derivatives thereof, cyanine, Cy series, Alexa Fluor series, BODIPY series, DY series, rhodamine or Derivatives thereof, fluorescein or derivatives thereof, coumarin or derivatives thereof, acridine homodimer or derivatives thereof, acridine orange or derivatives thereof, 7-amino liquid 7-aminoactinomycin D (7-AAD) or derivatives thereof, Actinomycin D or derivatives thereof, ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) or derivatives thereof , DAPI or its derivatives, Dihydroethidium or its derivatives, Ethidium bromide or its derivatives, Ethidium homodimer-1 or its derivatives, Ethidium homo Dimer 2 (EthD-2) or derivatives thereof, Ethidium monoazide or derivatives thereof, Hexidium iodide or derivatives thereof, bisbenzimide (Hoechs), flu
  • a quantum dot may be used as the fluorescent material.
  • the quantum dot is a particle having a center of nano-sized II-IV or III-V semiconductor particles, and a shell composed of a core having a size of about 2-10 nm and mainly ZnS. shell), even in the same material, the fluorescence wavelength varies depending on the size of the particles, thereby obtaining fluorescence in various wavelength bands.
  • the II-VI or III-V compound constituting the quantum dot is CdSe, CdSe / ZnS, CdTe / CdS, CdTe / CdTe, ZnSe / ZnS, ZnTe / ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP / ZnS and HgTe It may be selected from the group consisting of, it may be in the form of a single core (core) or core (core) / shell (shell).
  • TAMRA was used as the fluorescent material.
  • quencher includes a quencher, absorber, and the like, which means a material that absorbs energy or light from a fluorescent material or a light source.
  • the quencher may be an absorbing protein, an absorbing molecule, metal nanoparticles, carbon particles, or the like.
  • Black Hole Quencher-1 (BHQ-1), Dabsil (DABCYL), Eclipse, TAMRA, QSY-7, Black Hole Quencher-2 , BHQ-2), Black Hole Quencher-3 (Black Hole Quencher-3, BHQ-3) can be any one selected from the group consisting of, as long as it can absorb the energy or light emitted by the label Is not limited.
  • N-Acetylmuramic acid NAA
  • N-Acetyl-D-glucosamine NAG
  • N-acetylmuramic acid or N-acetylglucosamine It may be linked to the peptidoglycan through.
  • the peptidoglycan binding protein and quencher ratio in the probe may be 1: 1 to 40 (v / v), preferably 1: 5 to 20 (v / v), but is not limited thereto.
  • the kind of bacteria that the probe according to the present invention can detect is not limited.
  • the bacteria may be Gram-negative bacteria or Gram-positive bacteria.
  • the Gram-negative bacteria are Escherichia coli, E. coli, Helicobcater, Hemophilus, Neisseria, Cyano bacteria, Klebsiella , Acetobacter, Enterobacter, Chlamydia, Vibrio, Pseudomona, Salmonella, Thiobacter, Borrelia, Burkholderia ), Serratia, Treponema, and the like.
  • Gram-positive bacteria examples include Bacillus, Nocardia, Clostridium, Propionibacterium, Actinomyces, Enterococcus, Corynebacterium (Cornyebacterium), Listeria, Lactobacillus, Gardnerella, Mycobacterium, Mycoplasma, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus Streptococcus), including all bacteria having peptidoglycan.
  • FIG. 6 The operating principle of the probe according to the present invention is shown in FIG. In addition, the location of the peptidoglycan layer in bacteria and the operating principle of the probe according to the present invention are shown in FIG. 6.
  • the present invention comprises the steps of binding a fluorescent molecule (S1) peptidoglycan binding protein; (S2) preparing a quencher in which N-acetylmuramic acid or N-acetylglucosamine is bound; (S3) a method for producing a bacterial detection probe comprising binding a peptidoglycan binding protein to which a fluorescent molecule of S1 is bound, and a quencher to which N-acetylmuramic acid or N-acetylglucosamine of S2 is bound to provide.
  • S1 fluorescent molecule
  • S3 a method for producing a bacterial detection probe comprising binding a peptidoglycan binding protein to which a fluorescent molecule of S1 is bound, and a quencher to which N-acetylmuramic acid or N-acetylglucosamine of S2 is bound to provide.
  • the step (S1) is a step of preparing a peptidoglycan binding protein to which the fluorescent molecules are bound. Said step is to disperse and mix N ⁇ , N ⁇ -bis (carboxymethyl) -L-lysine hydrate (N ⁇ , N ⁇ -Bis (Carboxymethyl) -L-lysine hydrate) and TAMRA-NHS in (S1-1) buffer ; (S1-2) mixing nickel chloride with the reactant of (S1-1); (S1-3) mixing the peptidoglycan binding protein to the (S1-2) reactant; And (S1-4) purifying the peptidoglycan binding protein to which TAMRA is bound.
  • Mixing of the (S1-1) may be performed for 12 hours to 48 hours.
  • Mixing of the (S1-2) may be performed for 30 minutes to 2 hours.
  • Mixing of the (S1-3) may be performed for 12 hours to 48 hours.
  • step (S2) is a step of preparing a quencher in which N-acetylmuramic acid or N-acetylglucosamine is bound.
  • Said step comprises the steps of dispersing and mixing (S2-1) N-acetylmuramic acid or N-acetylglucosamine, EDC and sulfo-NHS in a buffer;
  • (S2-2) may include the step of reacting by mixing the BHQ2-amine (BHQ2-Amine) to the (S2-1) reactant. Mixing of the (S2-1) may be performed for 6 hours to 24 hours. The reaction of (S2-2) may be performed for 6 hours to 48 hours.
  • step (S3) is a step of interconnecting the peptidoglycan binding protein to which the fluorescent molecules are bound, and the quencher to which N-acetylmuramic acid or N-acetylglucosamine is bound.
  • Step (S3) comprises the steps of (S3-1) combining the reactant of S1 and the reactant of S2; And (S3-2) may comprise the step of purifying the reaction of the (S3-1). Combination of the (S3-1) may be performed for 12 hours to 48 hours.
  • the bacteria detection probe according to the present invention can specifically detect bacteria. That is, the probe according to the present invention can clearly distinguish between yeast and bacteria, and can detect both Gram-negative or Gram-positive bacteria, and it is expected that the probe can be used in various fields as a probe for detecting bacteria.
  • the bacterium can be detected by only confirming whether the fluorescence is developed without the treatment of a separate enzyme, and thus it is possible to detect the bacteria simply and quickly. In particular, it is expected to be effectively used in the food industry where rapid bacterial detection is required.
  • the present invention provides a method for detecting bacteria using the probe.
  • the present invention provides a method for detecting bacteria, comprising the step of treating the probe with a sample.
  • the sample is not limited in kind.
  • the sample is a composition containing or suspected of containing microorganisms and capable of performing the analysis, and may be a sample taken from any one or more of liquid, soil, air, food, waste, flora and fauna and flora and fauna.
  • the liquid may be characterized in that the beverage, liquor, water, blood, urine, tears, sweat, saliva, lymph and cerebrospinal fluid, and the water is precipitation, river water, lake and rainwater And the like, and waste includes sewage, wastewater, and the like, and the fauna and flora include a human body.
  • the flora and fauna tissue may include tissues such as mucous membrane, skin, skin, hair, scales, eyeball, tongue, cheek, hoof, beak, snout, foot, hand, mouth, nipple, ear, nose and the like.
  • the fluorescence of the fluorescent material is suppressed by the quencher, and the probe is combined with the peptidoglycan of the bacteria to develop fluorescence.
  • the bacteria detection probe according to the present invention can specifically detect bacteria. That is, the probe according to the present invention can clearly distinguish between yeast and bacteria, and can detect both Gram-negative or Gram-positive bacteria, and it is expected that the probe can be used in various fields as a probe for detecting bacteria.
  • the bacterium can be detected by only confirming whether the fluorescence is developed without the treatment of a separate enzyme, and thus it is possible to detect the bacteria simply and quickly. In particular, it is expected to be effectively used in the food industry where rapid bacterial detection is required.
  • FIG. 1 is a view illustrating the operating principle of the bacteria detection probe according to the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the purification result of the produced protein for bacterial detection.
  • Figure 3 is a diagram confirming the fluorescent color by treating the probe according to the invention to a sample containing peptidoglycan.
  • FIG. 4 is a diagram confirming whether the probe according to the present invention specifically detects bacteria.
  • 5 is a diagram showing that the fluorescence signal before and after peptidoglycan treatment increases as the ratio of quencher volume in the probe increases.
  • FIG. 6 shows the location of the peptidoglycan layer in bacteria and the method of operation of the probe according to the invention.
  • An expression vector pET21a-eGFP-PGBP-1a (GP) or pET21a-PGBP-1a-eGFP (PG) was prepared in which peptidoglycan binding protein (PGBP) and eGFP were expressed as fusion proteins.
  • the resulting expression vector was transfected into E. coli BL21 (DE3), a recombinant E. coli bacterium, and the resulting transformants were inoculated into LB liquid medium containing 50 ⁇ l / ml of ampicillin and cultured to 0.6 OD at 37 ° C.
  • eGFP-PGBP-1a SEQ ID NO: 2
  • PGBP-1a-eGFP SEQ ID NO: 3
  • Step 1 In order to bind fluorescent molecules to the recombinant protein obtained in Example 1, first, N ⁇ , N ⁇ -bis (carboxymethyl) -L-lysine hydrate (N ⁇ , N ⁇ -Bis (Carboxymethyl) -L-lysine hydrate) (5 mg) was dispersed in Phosphate buffer saline (PBS) (5 ml), and TAMRA-NHS (6.7 mg) was dispersed and mixed for 24 hours. Then, nickel chloride (9.6 mg) was added to the reaction mixture and mixed for 1 hour. Then, recombinant protein PG or GP (10 ⁇ l, 0.5 mg / ml) was added thereto and mixed for 24 hours. Subsequently, excess reactants were removed using Centricon (MWCO: 10000 Da).
  • Step 2-1 (Quencher-NAA): Dispersion of N-acetylmuramic acid (NAA) (3 mg), EDC (2.4 mg), sulfo-NHS (1.4 mg) in MES buffer (2 ml) Mixed. Then BHQ2-amine (5.8 mg) was added and mixed for at least 12 hours.
  • Step 2-2 Quantifying N-acetylglucosamine (NAG) (2.5 mg) in DMF (10 ml), CDI (5.5 mg) was mixed. Then BHQ2-amine (6.5 mg) was added and mixed for at least 12 hours.
  • Step 3 TAMRA-GP or TAMRA-PG made in Step 1 and Quencher-NAA in Step 2-1 or Quencher-NAG in Step 2-2 were combined for 24 hours, respectively, and TAMRA-GP: Quencher-NAA, TAMRA- GP: Quencher-NAG, TAMRA-PG: Quencher-NAA, TAMRA-PG: Quencher-NAG were prepared. After preparation, unbound reactants were removed using Centricon (MWCO: 10000 Da).
  • Example 2 After 12% acylamide gel was made 1 mm thick, 20 ⁇ L (0.13 mg / mL) of the recombinant protein expressed in Example 1 was loaded into the gel, and then run at 120 V for 1.5 hours. I was. It was stained using Coomassie brilliant blue. Protein expression was confirmed using a marker for molecular weight confirmation, and the results are shown in FIG. 2. As shown in FIG. 2, a recombinant protein for detecting purified bacteria of about 40 kDa size was identified.
  • Yeast species S. Cerevisiae Sacharomyces cerevisiae
  • bacteria S. Aureus was incubated, and the CFU number of the bacteria was measured by measuring the OD value at 600 nm.
  • Each bacterium was loaded into a 96 well plate at a concentration of 10 6-10 1 CFU / well at 100 ⁇ l and the probes were then treated. The probe concentration treated was 5 ⁇ g on a protein basis. After shaking the reaction mixture of the probe and bacteria for 1 hour, the fluorescence wavelength was measured at an absorption wavelength of 547 nm and 576 nm according to the fluorescence characteristics of TAMRA, and the results are shown in FIG. 4.
  • S. cerevisiae was a yeast species and did not detect a fluorescence intensity because there was no peptidoglycan layer.
  • the fluorescence intensity was increased by the probe of the present invention.
  • the detection effect was confirmed at a minimum number of 10 4 CFU / well. Through this, it is possible to effectively check whether the bacteria are detected through the probe of the present invention.
  • the bacterial S. Aureus was incubated with the probe prepared in the step of Example 2.
  • Bacteria 10 5 CFU / mL were prepared by measuring the OD value at 600 nm.
  • the bacteria were loaded into a 96 well plate at 100 ⁇ l, and then treated with the same concentration of probe as in Experiment 2.
  • the fluorescence wavelength was measured at 547 nm at an absorption wavelength of 576 nm and measured for about 30 minutes every 1.5 minutes (90 seconds). The results are shown in FIG.

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Abstract

본 발명은 펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 프로브를 이용하여 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 박테리아 검출용 프로브는 박테리아를 특이적으로 검출할 수 있다. 즉 본 발명에 따른 상기 프로브는 효모와 박테리아를 명확히 구분할 수 있으며, 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아를 모두 검출할 수 있는 바, 범용적인 박테리아 검출용 프로브로 다방면에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 별도의 효소의 처리 없이, 형광의 발색여부만을 확인하는 것으로 박테리아를 검출할 수 있는 바, 간편하면서 신속한 박테리아의 검출이 가능하다. 특히, 신속한 박테리아 검출이 요구되는 식품업계에서 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브 및 그의 이용
본 발명은 펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 프로브를 이용하여 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일상생활 속에서 우리는 질병의 원인이 될 수 있는, 미생물로 오염된 표면에 무의식적으로 노출되어 있다. 여러 연구들에서 특정 세균으로 오염된 "위험지점"이 공중전화, 문 손잡이, 병원 대기실과 어린이 보육기관의 장난감, 열풍 손 건조기, 주방에서 사용되는 타월 및 스펀지, 일상적인 환자 간호 중에 있는 병원 직원의 손, 및 생고기와 야채를 섞는 음식 조리대 표면과 칼로부터의 교차 오염을 포함한다는 것을 보여주고 있다.
국내 내에서도 여러 지역에서 세균 오염의 발생으로 인해 아동 및 노인의 사망을 초래하였고 수많은 사람들을 질병에 걸리게 하였다. 또한, 음식물의 미생물 오염도 전 세계적으로 주요 문제이다. 살모넬라(Salmonella), 대장균(E. coli) 및 기타 음식물 유래의 세균은 매년 셀 수 없을 정도의 질병을 야기하고 있다. 급성 증상으로는 메스꺼움, 구토, 비정상적인 복통, 설사, 고열 및 두통을 포함한다. 급성 증상의 발병 이후에는 만성적인 결과가 따를 수 있다. 교차 오염은 육류, 생선 및 가금류에서 유래한 세균을 야채와 같은 비조리 음식물로 전달할 수 있기 때문에, 음식 조리대 표면의 세균 존재 여부를 간단히 검출할 수 있으면 큰 도움이 될 수 있다.
마찬가지로, 식품 가공 산업에서 미생물의 유해 수준의 검출은 가족과 소비자의 건강을 유지하는 데 있어서 매우 중요한 바, 식품 가공 산업에서는 세균의 모니터링이 중요하다. 육류 포장에서 치즈 생산에 이르는 실질적으로 모든 식품의 가공은 식품 공급의 안전성을 보장하기 위해 미생물 수준을 모니터링 하는 것을 포함한다.
특히, 맥주는 알코올과 고미성분, 이산화탄소가 포함되어 있을 뿐 아니라, pH가 낮고 산소의 농도가 매우 희박하여 미생물들이 서식하기에 적합한 환경을 제공하지 않는다. 그러나 이러한 부적합한 환경 조건에서도 일부 미생물들이 맥주에서 검출되고 있다. 이러한 미생물들은 맥주 유해 미생물로 분류되고 있는데, 상기와 같은 맥주 유해 미생물들은 맥주 혼탁을 발생시킬 뿐 아니라, 맥주의 변질을 유발하고, 나아가 세균 오염에 의한 여러 질병을 야기한다.
미생물 오염으로 인한 폐해가 식품 산업에만 국한되는 것은 아니다. 최근 수십년간 병원 및 보건 공동체가 진원지인 것이 문제가 되는 "슈퍼버그(superbug)"의 급격한 증가가 나타나고 있다. 항생제의 남용뿐만 아니라 병원의 불충분한 청결은 메티실린-내성 S. 아우레우스(S. aureus) (MRSA) 및 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 뿐만 아니라, 반코마이신-내성 장구균(enterococci) 및 다른 그람-음성 간균을 초래하였다 (Dancer, 2004). 최근 BBC의 보고에 따르면, MRSA로 인한 사망이 한해 5000명으로 추정된다고 한다. 상기 기사는 "청결은 환자의 주요 관심사이며 MRSA 문제는 점점 심각해지고 있다"고 밝혔다. 병원의 많은 환자들이 이미 면역-결핍 상태이며 따라서 감염의 위험이 더욱 크다는 것을 고려하면, 병원 환경에서 악성 세균으로 인한 위험은 보다 더욱 위협적이게 된다.
여러 종류의 검체에 미량으로 존재하는 세균은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 검출, 측정함으로써 존재를 확인할 수 있다. 펩티도글리칸은 세균 세포벽의 한 성분으로 세포벽의 외막 내부의 얇은 층을 이루는 N-아세틸무라믹산 또는 N-글리코실무라믹산과 D-아미노산을 포함하는 당단백질 폴리머이다. 따라서, 펩티도글리칸을 검출, 측정하여 의약품의 안정성 검사, 물과 식품의 미생물 검사, 감염질환의 진단에 응용할 수 있다.
펩티도글리칸을 검출하는 조성물과 방법의 한 예로, 미국특허 4,970,152호에서는 누에나방 유충의 플라즈마액으로부터 베타-1,3-글루칸과 반응하는 단백질을 제거함으로써 펩티도글리칸을 특이적으로 검출하는 조성물에 대해 보고하고 있으나, 상기 조성물은 펩티도글리칸에 의해 페놀옥시다아제 활성이 발휘되기 위해 칼슘이온의 첨가가 필요하다. 즉, 미국특허 4,970,152호에 따르면 곤충의 체액 채취시에는 칼슘 이온에 의한 페놀옥시다아제의 활성화를 억제하여 페놀옥시다아제 조성물을 얻고, 그 조성물로 펩티도글리칸을 기질로 하여 발색을 일으키기 위해서는 칼슘 이온을 첨가하는 것이 요구된다.
또한, 미국특허 5,747,277호에서는 SLP 시약을 보고하였으나 이것은 베타-1,3-글루칸과 펩티도글리칸을 동시에 검출하므로 펩티도글리칸에만 특이적으로 반응하지는 않는다.
따라서, 질병의 원인이 될수 있는 박테리아의 빠른 검출 및 진단을 위하여, 펩티도글리칸과 반응하여 빠르게 박테리아의 존재여부를 확인할 수 있는 검출 시스템의 개발이 시급하다.
이에 본 발명자들은 박테리아의 펩티도글리칸에 특이적으로 결합하여 형광 신호를 발생시키는 효과적인 박테리아 검출 시스템을 개발하기 위하여 예의 노력하여, 본 발명의 박테리아 검출용 프로브를 완성하기에 이르렀다.
이에 본 발명의 목적은 펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩티도글리칸 결합단백질을 이용한 박테리아 검출용 프로브를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브를 이용하여 박테리아를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펩티도글리칸 결합단백질(peptidoglycan binding protein, PGBP), 형광 물질 및 퀀쳐(quencher)를 포함하는, 박테리아 검출용 프로브를 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명에 있어서, “펩티도글리칸 결합단백질”은 펩티도글리칸에 결합할 수 있는 펩티도글리칸 결합도메인을 포함하는 단백질로서 그 종류를 제한하지 않는다. 본 발명의 구체예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티도글리칸 결합단백질을 이용하여 프로브를 제작하였다.
본 발명에 있어서, 형광물질은 퀀쳐와 물리적으로 거리가 생길 때, 형광을 발생시키는 물질로서 그 종류를 제한하지 않는다. 형광물질로는 여기상태에서 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점(quantum dot), 양자선(quantum wire) 등이 있다.
상기 형광물질의 예로서, EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein) 등의 형광단백질이 있다.
또한, 상기 형광물질의 예로서, 파이렌(Pyrene) 또는 이의 유도체, 시아닌(Cyanine, Cy) 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피(BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민 (rhodamine) 또는 이의 유도체, 플루오레신(Fluorescein) 또는 이의 유도체, 쿠마린 (coumarin) 또는 이의 유도체, 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 또는 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 또는 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 또는 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 또는 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 또는 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 또는 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 또는 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 또는 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 또는 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 또는 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 또는 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 또는 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 또는 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 또는 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 또는 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI) 또는 이의 유도체, 칼세인(Calcein) 또는 이의 유도체, 오레건 그린(Oregon Green) 또는 이의 유도체, 마그네슘 그린(Magnesium Green) 또는 이의 유도체, 칼슘 그린(Calcium Green) 또는 이의 유도체, JOE 또는 이의 유도체,, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine) 또는 이의 유도체, TRITC 또는 이의 유도체, 탐라 (N,N,N',N'-tetrametyl-6-carboxyrhodamine , TAMRA) 또는 이의 유도체, 피로닌 Y(Pyronin Y) 또는 이의 유도체, 리싸민(Lissamine) 또는 이의 유도체, ROX 또는 이의 유도체, 칼슘크림선(Calcium Crimson) 또는 이의 유도체, 텍사스 레드(Texas Red) 또는 이의 유도체, 나일 레드(Nile Red) 또는 이의 유도체, 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine) 또는 이의 유도체, 단실아마이드(dansylamide) 또는 이의 유도체, 캐스캐이드 블루(cascade blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)일 수 있다.
상기 형광물질로서 양자점이 사용될 수 있는데, 양자점은 나노크기의 Ⅱ-Ⅳ 또는 Ⅲ-Ⅴ 반도체입자가 중심을 이루고 있는 입자로, 약 2∼10nm 크기의 중심(core)과 주로 ZnS 등으로 이루어진 껍질(shell)로 구성되며, 동일한 물질이라 하더라도 입자의 크기에 따라 형광파장이 달라져 다양한 파장대의 형광을 얻을 수 있다. 상기 양자점을 이루는 Ⅱ-Ⅵ 또는 Ⅲ-Ⅴ족 화합물은 CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS 및 HgTe로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 단일 코어(core) 또는 코어(core)/쉘(shell) 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 상기 형광물질로서 TAMRA를 이용하였다.
본 명세서에서 용어, "퀀쳐"는 소광제, 흡광물질 등을 포함하며, 이는 형광물질 또는 광원으로부터 에너지 또는 빛을 흡수하는 물질을 의미한다. 퀀쳐는 흡광단백질, 흡광분자, 금속나노입자, 탄소입자 등일 수 있다. 바람직하게는 블랙 홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1), 댑실(DABCYL), 이클립스(Eclipse), 탐라(TAMRA), QSY-7, 블랙 홀 퀀쳐-2(Black Hole Quencher-2, BHQ-2), 블랙 홀 퀀쳐-3(Black Hole Quencher-3, BHQ-3)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나 표지물질에 방출되는 에너지 또는 빛을 흡수할 수 있는 한, 그 종류는 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서는 BHQ-2를 이용하였다. 상기 퀀쳐는 N-아세틸뮤라민산(N-Acetylmuramic acid, NAA) 또는 N-아세틸글루코사민(N-Acetyl-D-glucosamine, NAG)과 결합되어 있으며, N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민을 통하여 펩티도글리칸에 연결(link)되어 있을 수 있다.
이 때, 프로브 내 펩티도글리칸 결합단백질과 퀀쳐 비율은 1:1 내지 40 (v/v)일 수 있으며, 바람직하게는 1:5 내지 20 (v/v)일 수 있으나 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 프로브가 검출할 수 있는 박테리아의 종류는 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 박테리아는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아일 수 있다. 상기 그람-음성 박테리아의 예는 대장균(Escherichia coli, E.coli), 헬리코 박터(Helicobcater), 헤모필루스(Hemophilus), 나이세리아(Neisseria), 시아노 박테리아(Cyano bacteria), 클럽시엘라(Klebsiella), 아세토박터(Acetobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 클라미디아(Chlamydia), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomona), 살모넬라(Salmonella), 티오박터(Thiobacter), 보렐리아(Borrelia), 부르크홀데리아(Burkholderia), 셀라티아(Serratia), 트레포네마(Treponema) 등 일 수 있다. 상기 그람-양성 박테리아의 예는 간균(Bacillus), 노카르디아(Nocardia), 클로스트리듐(Clostridium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 방선균(Actinomyces), 장내구균(Enterococcus), 코리네박테리움(Cornyebacterium), 리스테리아(Listeria), 젖산간균(Lactobacillus), 가드네렐라(Gardnerella), 미코박테리움(Mycobacterium), 미코플라스마(Mycoplasma), 포도상구균(Staphylococcus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 연쇄상구균(Streptococcus) 등이며, 펩티도글리칸을 가지고 있는 모든 박테리아가 포함된다.
본 발명에 따른 프로브의 작동원리를 도 1에 나타내었다. 또한, 박테리아에서 펩티도글리칸 층의 위치 및 본 발명에 따른 프로브의 작동원리를 도 6에 나타내었다.
또한, 본 발명은 (S1) 펩티도글리칸 결합단백질에 형광분자를 결합시키는 단계; (S2) N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민이 결합된 퀀쳐를 준비하는 단계; (S3) S1의 형광분자가 결합된 펩티도글리칸 결합단백질과, S2의 N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민이 결합된 퀀쳐를 결합시키는 단계를 포함하는 박테리아 검출용 프로브의 제조 방법을 제공한다.
상기의 단계를 구체적으로 설명하면 하기와 같다. 다만, 하기의 방법은 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 기재에 한정되는 것은 아니다.
상기 (S1) 단계는 형광분자가 결합된 펩티도글리칸 결합단백질을 제조하는 단계이다. 상기 단계는 (S1-1) 완충액에 Nα,Nα-비스(카르복시메틸)-L-라이신 하이드레이트(Nα,Nα-Bis(Carboxymethyl)-L-lysine hydrate)) 및 TAMRA-NHS를 분산하고 혼합하는 단계; (S1-2) 상기 (S1-1)의 반응물에 염화니켈(Nickel chloride)를 혼합하는 단계; (S1-3) 상기 (S1-2) 반응물에 펩티도글리칸 결합단백질을 혼합하는 단계; 및 (S1-4) TAMRA가 결합된 펩티도글리칸 결합단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (S1-1)의 혼합은 12 시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있다. 상기 (S1-2)의 혼합은 30분 내지 2시간 동안 수행될 수 있다. 상기 (S1-3)의 혼합은 12 시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있다.
또한, 상기 (S2) 단계는 N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민이 결합된 퀀쳐를 준비하는 단계이다. 상기 단계는 (S2-1) N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민, EDC 및 설포-NHS(Sulfo-NHS)를 완충액에 분산하고 혼합하는 단계; 및 (S2-2) 상기 (S2-1) 반응물에 BHQ2-아민(BHQ2-Amine)을 혼합하여 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 (S2-1)의 혼합은 6시간 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 상기 (S2-2)의 반응은 6시간 내지 48시간동안 수행될 수 있다.
또한, 상기 (S3) 단계는 형광분자가 결합된 펩티도글리칸 결합단백질과, N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민이 결합된 퀀쳐를 상호 연결하는 단계이다.
상기 (S3) 단계는 (S3-1) S1의 반응물과 S2의 반응물을 결합시키는 단계; 및 (S3-2) 상기 (S3-1)의 반응물을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 (S3-1)의 결합은 12시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 박테리아 검출용 프로브는 박테리아를 특이적으로 검출할 수 있다. 즉 본 발명에 따른 상기 프로브는 효모와 박테리아를 명확히 구분할 수 있으며, 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아를 모두 검출할 수 있는 바, 범용적인 박테리아 검출용 프로브로 다방면에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 별도의 효소의 처리 없이, 형광의 발색여부만을 확인하는 것으로 박테리아를 검출 할 수 있는 바, 간편하면서 신속한 박테리아의 검출이 가능하다. 특히, 신속한 박테리아 검출이 요구되는 식품업계에서 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명은 상기의 프로브를 이용하여 박테리아를 검출하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 상기 프로브를 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 박테리아 검출 방법을 제공한다.
상기 시료는 그 종류에 제한이 없다. 시료는 미생물을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석을 수행할 수 있는 조성물로서, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료일 수 있다. 이때, 액체는 음료수, 주류, 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프로브는 박테리아의 펩티도글리칸에 결합하기 전에는 퀀쳐에 의하여 형광물질로부터의 형광 발색이 억제되어 있다가, 박테리아의 펩티도글리칸과 결합하여 형광을 발색시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 박테리아 검출용 프로브는 박테리아를 특이적으로 검출할 수 있다. 즉 본 발명에 따른 상기 프로브는 효모와 박테리아를 명확히 구분할 수 있으며, 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아를 모두 검출할 수 있는 바, 범용적인 박테리아 검출용 프로브로 다방면에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 별도의 효소의 처리 없이, 형광의 발색여부만을 확인하는 것으로 박테리아를 검출 할 수 있는 바, 간편하면서 신속한 박테리아의 검출이 가능하다. 특히, 신속한 박테리아 검출이 요구되는 식품업계에서 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 박테리아 검출용 프로브의 작동 원리를 설명한 도이다.
도 2는 제작한 박테리아 검출용 단백질의 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 펩티도글리칸을 포함하는 시료에 본 발명에 따른 프로브를 처리하여 형광 발색을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 프로브가 박테리아를 특이적으로 검출하는 지를 확인한 도이다.
도 5는 프로브 내 퀀쳐 부피 비율이 증가함에 따라 펩티도글리칸 처리 전/후의 형광 신호가 증가됨을 확인한 도이다.
도 6은 박테리아에서의 펩티도글리칸 층의 위치 및 본 발명에 따른 프로브의 작동 방법을 도시한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 박테리아 검출용 단백질 발현 및 정제
펩티도글리칸 결합단백질(PGBP)과 eGFP가 융합 단백질로 발현되도록 하는 발현벡터 pET21a-eGFP-PGBP-1a (GP) 또는 pET21a-PGBP-1a-eGFP (PG)를 제작하였다. 제작된 발현벡터를 재조합 단백질 발현 대장균인 E. coli BL21(DE3)에 형질도입한 후 얻어진 형질전환체를 50 ㎕/㎖의 앰피실린이 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 0.6 OD까지 배양시킨 후, 1 mM 농도의 IPTG를 첨가한 다음 4시간 더 진탕 배양하여 박테리아 검출을 위한 재조합 단백질인 eGFP-PGBP-1a (서열번호2) (GP) 또는 PGBP-1a-eGFP (서열번호3) (PG)를 발현시켰다.
발현된 상기 재조합 단백질을 추출하기 위하여 원심분리하여 회수한 대장균체에 20 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.2M NaCl 완충용액을 넣어 세포를 현탁한 후, 초음파파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 불용성으로 생산되는 단백질의 효율적인 리폴딩을 위하여 먼저 8M 유레아 용액에 용해시킨 후, 금속친화성 태그인 6개의 히스티딘을 이용한 금속친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 0-500 mM 이미다졸(imidazole) 농도구배를 주어, 정제된 비활성형 재조합 단백질의 활성형으로 전환을 위해 투석막을 이용하여 1 M 아르지닌(Arginine), 2 mM EDTA, 5 mM 시스테아민(cysteamine), 0.5 mM 시스타민(cystamine)을 포함하는 50 mM Tris-HCl(pH 8.5) 리폴딩 용액으로 저온실 (4℃)에서 48 시간동안 교반하였다. 충분한 리폴딩 과정을 거친 후, 재조합 단백질은 초미세여과(molecular cut off : 10 kDa)를 이용해 최종 PBS(pH 7.4)로 버퍼 교체(buffer change) 후 1 mg/ml로 농축하였다.
실시예 2. 박테리아 검출용 프로브 제조
하기의 단계를 수행하여 본 발명의 박테리아 검출용 프로브를 제조하였다.
단계 1 (TAMRA-PG 또는 TAMRA-GP): 상기 실시예 1에서 수득한 재조합 단백질에 형광 분자를 결합하기 위하여 먼저, Nα,Nα-비스(카르복시메틸)-L-라이신 하이드레이트(Nα,Nα-Bis(Carboxymethyl)-L-lysine hydrate)) (5 mg)를 인산 완충 식염수(Phosphate buffer saline, PBS) (5 ml)에 분산시키고, TAMRA-NHS(6.7 mg)를 분산시켜 24시간 동안 혼합하였다. 그 후, 반응물에 염화니켈(9.6 mg)을 넣고 1시간 동안 혼합한 후, 재조합 단백질인 PG 또는 GP (10 μl, 0.5 mg/ml)를 넣고 24시간 동안 혼합하였다. 뒤이어, Centricon (MWCO: 10000Da)을 이용하여 과량의 반응물들을 제거하였다.
단계 2-1 (Quencher-NAA): N-아세틸뮤라민산 (NAA) (3 mg), EDC (2.4 mg), 설포-NHS (1.4 mg)을 MES 버퍼 (2 ml)에 분산 시킨 후, 이를 혼합하였다. 그 후 BHQ2-아민(5.8 mg)을 넣고 12 시간 이상 혼합하였다.
단계 2-2 (Quencher-NAG): DMF(10 ml)에 N-아세틸글루코사민 (NAG) (2.5 mg)을 분산 시킨 후, CDI(5.5 mg)를 혼합하였다. 그 후 BHQ2-아민(6.5 mg)을 넣고 12시간 이상 혼합하였다.
단계 3: 단계 1에서 만들어진 TAMRA-GP 또는 TAMRA-PG와 단계 2-1의 Quencher-NAA 또는 단계 2-2의 Quencher-NAG를 24시간 동안 각각 결합시켜, TAMRA-GP: Quencher-NAA, TAMRA-GP: Quencher-NAG, TAMRA-PG: Quencher-NAA, TAMRA-PG: Quencher-NAG 를 제조하였다. 제조 후, Centricon (MWCO: 10000Da)을 이용하여 결합되지 않은 반응물들을 제거하였다.
실험예 1. 박테리아 검출용 단백질 발현 확인
12%의 아실아마이드 겔(Acylamide gel)을 1mm 두께로 만든 뒤, 실시예 1에서 발현된 재조합 단백질 20 μL (0.13 mg/mL)을 겔에 로딩한 뒤, 120 V에서 1.5 시간동안 러닝 (running) 시켰다. 이를 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)를 이용하여 염색하였다. 분자량 확인용 마커를 이용하여 단백질 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이 약 40 kDa크기의 정제된 박테리아 검출을 위한 재조합 단백질을 확인하였다.
실험예 2. 박테리아 검출용 프로브 확인 - 이상
박테리아 검출용 프로브를 최적화 된 조건으로 개발하기 위하여, 실시예 2의 단계에서 준비된 형광-단백질(TAMRA-PG 또는 TAMRA-GP)의 형광 신호가 감소되는 최적화된 퀜칭 분자(Quencher-NAA 또는 Quencher-NAG)의 비율을 찾고자 하였다. 각 비율에 따른 조합군을 14시간 동안 혼합하였다. 그 후, 형광 신호 (ex: 547 nm, em: 576 nm)를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 퀜칭 분자의 비율이 증가함에 따라 형광 신호가 감소됨을 확인하였다.
실험예 3. 박테리아 검출용 프로브 검출능 분석
3-1. 박테리아에 대한 특이적 검출 여부 확인
본 발명에 따른 박테리아 검출용 프로브를 통하여 검출 특이성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 준비된 프로브를 사용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Yeast 종인 S. Cerevisiae(Saccharomyces cerevisiae), 박테리아인 S. Aureus를 배양한 뒤, 600 nm에서 O.D. 값 측정으로 박테리아의 CFU 수를 측정하였다. 각각의 박테리아를 96 웰 플레이트에 106 - 101 CFU/well의 농도로 100 ㎕씩 로딩한 뒤, 프로브를 처리하였다. 처리한 프로브 농도는 단백질 기준으로 5 ㎍이다. 프로브와 박테리아의 혼합액을 1시간 동안 흔들어 반응 한 뒤, TAMRA의 형광 특성에 맞게, 흡수 파장 547 nm에 형광 파장은 576 nm 으로 측정 하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, S. cerevisiae는 yeast 종으로 펩티도글리칸 층이 없어 형광 세기가 검출이 안되었으나, S. Aureus 에서는 본 발명의 프로브에 의해 형광 세기가 높이 증가함을 확인 할 수 있었다. 또한, 최소 104 CFU/well 수에서도 검출 효과를 확인 할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 프로브를 통한 박테리아의 검출 여부를 효과적으로 확인할 수 있다.
3-2. 퀀쳐 부피 비율에 따른 형광세기 측정
본 발명에 따른 박테리아 검출용 프로브의 특성을 확인하기 위하여, 실시예 2의 단계에서 준비된 프로브와 함께 박테리아 S. Aureus를 배양하였다. 600 nm 에서 O.D값을 측정하여 박테리아 105 CFU/mL 를 준비하였다. 상기 박테리아를 96 웰 플레이트에 100 ㎕로 로딩한 뒤, 실험예 2와 처리한 동일한 농도의 프로브를 처리하였다. TAMRA의 형광 특성에 맞게, 흡수 파장 547 nm에 형광 파장은 576 nm 으로 측정 하였으며, 1.5분 (90초) 마다 약 30분 동안 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 1) 검출 시간이 증가함에 따라 형광 신호의 증가를 확인 하였고, 2) 상기 실시예 2의 단계에서 준비된 프로브 내 퀀쳐 부피 비율이 증가함에 따라, 펩티도글리칸 처리 전/후의 형광 신호가 증가됨을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 펩티도글리칸 결합단백질(peptidoglycan binding protein, PGBP), 형광 물질 및 퀀쳐 (quencher)를 포함하는, 박테리아 검출용 프로브.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티도글리칸 결합단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 박테리아 검출용 프로브.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 형광 물질은 발광 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점(quantum dot), 또는 양자선(quantum wire)인 것인, 박테리아 검출용 프로브.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 퀀쳐는 블랙 홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1), 댑실(DABCYL), 이클립스(Eclipse), 탐라(TAMRA), QSY-7, 블랙 홀 퀀쳐-2(Black Hole Quencher-2, BHQ-2) 및 블랙 홀 퀀쳐-3(Black Hole Quencher-3, BHQ-3)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 박테리아 검출용 프로브.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 퀀쳐는 이에 결합된 N-아세틸뮤라민산(N-Acetylmuramic acid, NAA) 또는 N-아세틸글루코사민(N-Acetyl-D-glucosamine, NAG)에 의하여 펩티도글리칸 결합단백질에 연결된 것인, 박테리아 검출용 프로브.
  6. 청구항 1에 있어서, 펩티도글리칸 결합단백질과 퀀쳐의 혼합 비율은 1:1~40 (v/v)인 것인, 박테리아 검출용 프로브.
  7. 하기의 단계를 포함하는, 박테리아 검출용 프로브 제조 방법:
    (S1) 펩티도글리칸 결합단백질에 형광분자를 결합시키는 단계;
    (S2) N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민이 결합된 퀀쳐를 준비하는 단계;
    (S3) 상기 단계 (S1)의 형광분자가 결합된 펩티도글리칸 결합단백질과, 상기 단계 (S2)의 N-아세틸뮤라민산 또는 N-아세틸글루코사민이 결합된 퀀쳐를 결합시키는 단계.
  8. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 프로브를 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 박테리아를 검출하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 프로브는 박테리아의 펩티도글리칸에 결합하여, 형광을 발생시키는 것을 특징으로 하는, 박테리아를 검출하는 방법.
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