KR100456006B1 - 페놀옥시데이즈 시스템을 구성하는 단백질 및 그것의 유전자 - Google Patents
페놀옥시데이즈 시스템을 구성하는 단백질 및 그것의 유전자 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 β-1,3-글루칸에 의한 페놀옥시데이즈의 활성화 시스템에 관여하는 단백질, 그것의 유전자 및 상기 단백질을 이용한 진균진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 단백질은 곤충에서 유래한, β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물의 한 성분으로서 그 조성물을 재구성하는데 이용될 수 있다.
Description
개방 혈관계인 곤충을 비롯한 무척추 동물은 상처를 입은 후 체액 유출 방지 및 침입하는 이물질을 제거하기 위해 빠르고 효과적인 방어 기전을 가지며 이 중 외부 이물질에 의한 멜라닌 생성 반응인 프로페놀옥시데이즈 활성화 시스템 등이 알려져 있다(Ashida, M., & Brey, P. (1998), Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects pp.135-172 Chapman & Hall, London). 프로페놀옥시데이즈 활성화 시스템에 의한 프로페놀옥시데이즈의 활성화는 진균 또는 세균의 세포벽 성분인 β-1,3-글루칸, 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸 등에 의하여 개시되는 일련의 연쇄 반응에 의해 진행되는 것으로 보고되었다.
암 환자나 장기이식 수술환자, 에이즈감염 환자 등 면역기능이 저하된 환자에게 전신 진균 감염증이 증가되는 사실은 의료계에서 심각한 문제로 대두되고 있으며, 이로 인한 사망률도 점점 증가되고 있다. 전신 진균감염의 주된 형태는 캔디디아시스(candidiasis), 아스퍼질로시스(aspergillosis) 그리고 크립토코칼 메닌지티스(cryptococcal meningitis)이다. 이와 같은 균들은 건강한 사람의 경우 체내의 면역체계에 의하여 조절되고 완전히 치유되지만 암치료나 골수이식을 받은 환자, 기관이식, 화상환자 또는 AIDS 환자와 같이 면역체계가 억제되어 있는 경우 이런 감염증과 맞서 싸울 능력을 잃어버린다. 이런 환자들은 조기에 진균감염 여부를 판단하고 적절한 항진균제를 투여하는 것이 중요하지만 현재 조기 진균 감염 여부를 판단하는 것에 어려움이 있다.
진균 감염진단 방법으로 지금까지는 환자의 혈액을 채취하여 미생물학적인동정방법으로 감염여부를 판단하고 있으나 2-5일의 배양기간이 필요하므로 치료시기를 맞추지 못하는 단점이 있다. 이를 개선하고자, 진균감염환자의 혈액 중에 존재하는 진균 세포벽 성분인 β-1,3-글루칸을 측정하여 진균 감염을 인식하는 시스템을 찾기 위하여 연구가 진행되어 왔다. 투구게(Limulus) 혈구용해물을 이용하여 엔도톡신의 방해 없이 β-1,3-글루칸을 특이적으로 검출하는 방법이 있으나 시약의 안정성이 낮다는 단점이 있다(Clinical Pathology Vol. 33, 639-644 (1985)). 국제특허공개 WO 83/02123호에는 게(Crayfish)의 혈구용해물을 이용하여 β-1,3-글루칸을 특이적으로 측정하는 방법이 기재되어 있는데 이 방법을 이용하기 위해서는 혈구용해물로부터 안티-엔도톡신 인자를 정제하여 첨가해야 하는 과정이 필수적이다.
누에, 딱정벌레, 한국산 참검정풍뎅이 등의 체액을 분리하여 β-1,3-글루칸을 특이적으로 검출하는 조성물이 알려져 있으나 관여하는 조성물과 반응의 메카니즘이 잘 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 최근 한국산 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 페놀옥시데이즈 케스케이드 반응에 관여하는 단백질 중 세린 프로테이즈 활성을 가지는 단백질, 즉 활성화된 프로페놀옥시데이즈 활성화 인자-I(활성화된 PPAF-I)의 구조를 밝혔다(European Journel of Biotechnology vol. 257, 615-619 (1998)). 또한 페놀옥시데이즈 케스케이드 반응에 관여하는 또 다른 단백질인 프로페놀옥시데이즈 및 페놀옥시데이즈의 구조를 밝혔다(Mol. Cells. Vol. 7, No. 1 90-97 (1997)). 또한 본 발명자들은 곤충의 플라즈마에서 프로페놀옥시데이즈를 포함하는, β-1,3-글루칸을 특이적으로 검출할 수 있는 조성물 및 이것을 제조하는 방법과, 이 조성물을 진균감염 진단에 이용할 수 있음을 밝혔다(한국특허출원 제2000-2547호).
그러나 일련의 캐스케이드 단계로 이루어지는 이 반응 시스템은 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 혹은 자신의 혈구 세포의 탈과립화반응에 의해 유도되는 내부인자 등에 의하여 쉽게 활성화되어 페놀옥시데이즈로 변화되어 카테콜아민류를 이용하여 멜라닌을 형성해 버리므로 이 반응 시스템을 생체 외로 분리하는데에 공정상의 어려움이 있다. 따라서 프로페놀옥시데이즈 활성 시스템을 분자수준에서 이해하기 위해서는 이 시스템을 구성하는 각각의 인자들, 그리고 이들 사이의 관계를 밝히는 것이 요구된다.
본 발명은 β-1,3-글루칸에 의해 활성화되는 진균 감염 진단용 조성물의 성분인 신규한 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 β-1,3-글루칸에 의해 활성화되는 진균 감염 진단용 조성물의 성분인 신규한 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.
도 1은 G 용액 및 혈구 용혈물에서의 β-1,3-글루칸에 의한 페놀옥시데이즈 활성을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 45kDa 단백질의 존재를 나타내는 웨스턴 블라팅 실험결과이다.
도 3은 Ca2+, 45kDa 단백질, 프로페놀옥시데이즈 및 활성이 있는 PPAF-I의 존재 여부에 따른 페놀옥시데이즈 활성화 결과이다.
도 4는 45kDa 단백질, 프로페놀옥시데이즈 및 활성이 있는 PPAF-I의 Ca2+존재 여부에 따른 45 kDa 단백질이 변화하는 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5는 활성이 있는 PPAF-I에 의한 45 kDa 단백질 변화 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 6은 45kDa 단백질이 첨가된 G용액에서의, β-1,3-글루칸에 의한 페놀옥시데이즈 활성을 나타낸다.
본 발명은 프로페놀옥시데이즈의 활성화에 관여하는, β-1,3-글루칸에 의해 활성화되는 진균 감염 진단용 조성물의 성분인 신규한 단백질, 그것의 유전자 및 그것을 이용하여 진균감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.
"아미노산 서열", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 완전한 천연의 아미노산 서열로 한정되는 것은 아니다.
"염기서열의 변이체"는 본 발명의 단백질이 가지는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 유전자 서열 중 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 염기 서열을 의미한다.
"아미노산 서열의 변이체"는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명에서 곤충은 체내에 페놀옥시데이즈 시스템을 가지고 있는 곤충을 의미하며, 완전변태 곤충이 바람직하다. 예로는 가재나 새우같은 갑각류, 딱정벌레목 등을 들 수 있고 이들의 생체 내에는 프로페놀옥시데이즈가 존재하며, β-1,3-글루칸 또는 리포폴리사카라이드에 의해 활성화되는 캐스케이드반응에 의해 페놀옥시데이즈로 활성화된다.
본 발명에서 페놀옥시데이즈 시스템은 곤충 내에 존재하는, β-1,3-글루칸의 존재에 의해 일련의 반응을 거쳐 프로페놀옥시데이즈가 페놀옥시데이즈로 활성화되는 시스템을 의미한다.
본 발명에서 페놀옥시데이즈 조성물은 페놀옥시데이즈 시스템 성분의 전부 또는 일부를 포함하며, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물을 의미한다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 잔기 1~415로 이루어지는 단백질 또는 그것의 변이체, 또는 이들의 일부에 관한 것이다.
본 발명은 페놀옥시데이즈의 활성화에 관여하는 새로운 단백질을 분리하고 그 구조를 밝혀 45kDa 단백질이 페놀옥시데이즈 시스템의 필수 성분이며 새로운 프로페놀옥시데이즈 활성화 인자임을 밝힌다. 45kDa 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분자량 약 45~50kDa 크기의 분자량을 가진다.
45kDa 단백질을 분리하기 위해서는 곤충의 체액 즉, 플라즈마 또는 혈구를 시료로 사용할 수 있다. 곤충의 체액분리 공정에서 별도의 세린프로테이즈 저해제를 첨가하는 대신 킬레이팅제가 함유된 완충액을 사용하여 혈구 응집과 흡착현상을 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 45kDa 단백질은 45kDa 단백질에 대한 항체를 얻고 이를 이용하여 다른 곤충의 체액에 존재하는 45kDa 단백질 유사 단백질을 스크링하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 45kDa 단백질은 페놀옥시데이즈 시스템 또는 이 시스템을 기초로 한, β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물의 기질을 제조하는 데 이용될 수 있다. 즉, 45kDa 단백질은 캐스캐이드 반응으로 진행되는 페놀옥시데이즈 시스템을 구성하는 한 인자로, 페놀옥시데이즈 시스템 내에서 활성화 인자인 활성화 된 PPAF-I 단백질에 의하여 절단된다. 따라서 이와 같이 인식되고 절단되는 45kDa 단백질 서열 부분을 포함하는 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물의 기질, 예를 들어 펩타이드를 디자인할 수 있다.
National center for biotechnology information (NCBI)의 단백질 서열 데이타베이스를 통해 공지의 단백질에 대한 45kDa 단백질의 호몰로지를 조사한 결과, 45kDa 단백질은 N-말단 도메인과 활성도메인의 두개의 도메인을 가진 세린 프로테이즈 유사체(homologue)이다. 45kDa 단백질에는 보통의 세린 프로테이즈에 존재하는 3개의 활성화 잔기 중 히스티딘과 아스파라진산은 그대로 존재하나 세린프로테이즈의 활성화 부위에 관여하는 세린 잔기가 글리신으로 치환되어 있는 특이한 구조를 가진다. 또, 45kDa 단백질에는 3개의 다이설파이드 결합을 만드는 6개의 시스테인이 보존되어 있고 세 개의 잠재적인 N-글리코실레이션 위치(Asn-Xaa-Ser/Thr)이 존재한다.
본 발명에서 사용된 한국산 참검정풍뎅이 유충의 체액외에, β-1,3-글루칸에 의해 활성화되는 페놀옥시데이즈 시스템을 가진 곤충의 체액에는 45kDa 단백질의 역할을 하는 유사 단백질이 있을 것으로 추측되며, 본 발명에 따른 45kDa 단백질에 대한 항체를 이용하여 다른 곤충의 체액에 존재하는 45kDa 단백질 유사 단백질을 검출, 분리할 수 있다.
45kDa 단백질은 분자생물학적 기술을 이용한 발현시스템을 이용하여, 예를 들어 45kDa 단백질 유전자를 도입한 재조합 미생물로부터 대량으로 생산할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 잔기 100~415로 이루어지는 단백질 또는 그것의 변이체, 또는 이들의 일부에 관한 것이다.
본 명세서에서 35kDa 단백질로 명명한 이 단백질은 45kDa 단백질의 N-말단쪽아미노산 서열 일부 즉, 45kDa 단백질의 Arg-99와 Glu-100 사이가 절단되어 얻어지며, 45kDa 단백질과 유사한 용도를 가진다.
시험관내 실험에서, 45kDa 단백질은 Ca2+을 첨가한 상태에서는 활성화 된 PPAF-1에 의해 절단되지 않으나, Ca2+을 첨가하지 않을 상태에서는 활성화 된 PPAF-I에 의해 35kDa으로 절단된다(도 5).
또한 본 발명은 45kDa 단백질, 그것의 변이체 또는 그것의 일부를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그것의 변이체, 또는 그것의 일부를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지며, 한 예로, 서열번호 1의 염기 40~1284인 DNA 서열로 이루어진다.
본 발명에서는 곤충의 cDNA 라이브러리를 제조하여, 정제된 45kDa 단백질을 이용하여 제조한 45kDa 단백질의 항체를 사용한 이뮤노스크리닝을 통해 45kDa 단백질의 유전자를 얻고 그 서열과 그에 의해 암호화된 아미노산의 서열을 제시한다. 얻어진 유전자는 415개의 아미노산에 해당하는 1245 개 염기의 오픈 리딩 프레임을 가지고 있다.
또한 본 발명은 35kDa 단백질, 그것의 변이체 또는 그것의 일부를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열 100~415 또는 그것의 변이체, 또는 그것의 일부를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지며, 한 예로, 서열번호1의 염기 337~1284인 DNA 서열로 이루어진다.
본 발명에 다른 45kDa 단백질 또는 35kDa 단백질, 이들의 변이체 또는 이들의 일부의 유전자는 재조합 미생물을 이용하여 45kDa 단백질 또는 35kDa 단백질, 이들의 변이체 또는 이들의 일부를 생산하는데 이용될 수 있으며, 숙주 미생물의 코돈 이용 경향을 고려하여 염기를 적절하게 변경할 수 있다.
본 발명자들은 환원 조건의 SDS-PAGE로 45kDa 단백질이 순수하게 정제된 사실을 확인할 수 있었고, 정제된 pro-PO, 정제된 활성이 있는 PPAF-I, 45 kDa 단백질들을 이용하여 페놀옥시데이즈의 활성을 조사한 결과 45 kDa 단백질이 페놀옥시데이즈 조성물중의 한 성분임을 확인하였다. 또한, 시험관내 재구성 실험에서, 정제된 프로페놀옥시데이즈와 활성화된 PPAF-I만으로는 β-1,3-글루칸 존재시에 페놀옥시데이즈의 활성이 나타나지 않고, 위 두가지 단백질과 함께 45kDa 단백질을 첨가해야만 페놀옥시데이즈의 활성이 나타남을 확임함으로써 45kDa 단백질이 페놀옥시데이즈 활성화에 직접적으로 관련되고 또한 페놀옥시데이즈 조성물을 구성하는 한 성분임을 확인하였다.
페놀옥시데이즈 조성물에, 정제된 45kDa 단백질을 첨가하면 β-1,3-글루칸에 의한 페놀옥시데이즈의 활성화 반응의 민감도가 보다 증가한다. 이를 위한 45kDa 단백질은 완전한 45kDa 단백질 또는 그것의 일부일 수 있으며, 재조합 미생물 시스템을 이용하여 대량 생산할 수 있고 45kDa 단백질을 부분 또는 완전 정제하여 사용할 수 있다. 본 발명의 35kDa 단백질 역시 이와 같은 45kDa 단백질의 효과를 발휘할 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용하는 완충액 및 페놀옥시데이즈 활성 측정 방법은 다음과 같다.
항응고 완충액 (pH 4.6): 30mM 트리소디움 시트레이트, 26mM 시트르산, 20mM EDTA, 15mM 소디움 클로라이드)
β-1,3-글루칸 용액: β-1,3-글루칸(Curdlan, Wako Pure Chemical Industries, LTd.) 1mg을 0.1N NaOH 1ml에 녹인 용액 10ul와 20mM 트리스 완충액(pH 8.0) 990ul을 혼합하여 만든 용액
항체 정제에 사용한 스킴 밀크 용액(pH 7.9): 20 mM Tris/HCl(pH 7.9) 50 ml에 스킴 밀크 2.5 g을 녹임.
항체 정제에 사용한 10× 세척완충액: Tris 100mM, EDTA 10mM, Triton X-100 1%, NaCl 1.5M
항체 정제에 사용한 세척완충액: 1× 세척 완충액 내에 스킴 밀크 0.5%, NaN32mM
TBS: Tris 20mM, NaCl 153mM
TTBS: Tris 20mM, NaCl 153mM, Tween 20 0.1%
IPTG 처리용 필터: IPTG 190.6mg, 3차 증류수 40ml
high-TBST 용액: 용액 600 ml 내에, 1M Tris-HCl(pH7.9) 30ml, NaCl 5.25 g, 20% Tween 20 15ml, 3차 증류수 잔여량
low-TBST 용액: 용액 2L 내에, 1M Tris-HCl(pH 7.9) 20ml, NaCl 17.5 g, 20%Tween 20 5ml, 3차 증류수 잔여량
3 % 젤라틴 용액: 용액 400ml 내에, 젤라틴 12g, 10% NaN3800μl , low-TBST 잔여량
1차 항혈청 용액: 정제된 항체 2 ml, 3% 젤라틴 용액 2ml, E. coli 용혈물(10 mg/ml) 60μl, 10% NaN3 60μl 3차 증류수 1.88 ml
2차 항혈청 용액: 염소 항-토끼 IgG(H=L)-AP conjugated(Bio-Rad 사) 5 μl용액 5ml 내에, 3% 젤라틴 용액 1.7ml
AP 완충액: 용액 300 ml 내에, 1M Tris-HCl(pH 9.5) 30ml, NaCl 1.74g, 1M MgSO41. 5ml, 3차 증류수 잔여량
발색반응액: AP 완충액 100 ml, 70% DMF 내의 50mg/ml NBT 1320μl, DMF 내의 50mg/ml BCIP 660μl
LB 액체 배지: 배지 1L 내에, NaCl 10g, 트립톤 10g, 효모추출물 5g, 3차 증류수 잔여량
NZY 플레이트: NaCl 5g, MgSO4.7H2O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 15 g, 3차 증류수 1L
NZY 플레이트(탑 아가): NaCl 5g, MgSO4.7H2O 2g, 효모추출물 5g, NZ 아민 10g, 박토 아가 7g, 3차 증류수 1L
SM 완충액: 용액 1L 내에, NaCl 5.8g, MgSO4.7H2O 2g, 1M Tris-HCl(pH 7.5)50ml, 2% 젤라틴 5ml, 3차 증류수 잔여량
페놀옥시데이즈 활성의 측정
β-1,3-글루칸 1ug이 포함된 20mM 트리스 완충액(pH 8.0) 85uL, G 용액(50ug 단백질) 5uL와 혈구용해물(200ug 단백질) 10ul 또는 정제된 45kDa 단백질(1 ug) 10ul를 30℃에서 10분간 전반응시키고 여기에 기질용액(CaCl25mM가 포함된 20mM 트리스 완충액(pH8.0), 4-메틸카테콜(MC) 1mM, 4-하이드록시프롤린 에틸에스테르(HP) 2mM) 400ul을 첨가한 후 30℃에서 10분간 반응시킨 후 20% 초산 500ul을 넣어 반응을 중지시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정한다. 페놀옥시데이즈의 1단위는 520nm에서 흡광도가 0.1 증가할 때의 양으로 정의한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.
실시예 1.
한국산 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphlia) 유충 약 400마리를 얼음 위에서 마취시키고 25G 주사바늘이 연결된 5ml 멸균 주사기에 항응고 완충액을 채워 1ml을 주입하고 유충의 복부를 잘라 얼음 위 시험관에 체액을 모았다. 채취한 체액을 420xg 속도로 4℃에서 10분간 원심분리하고 항응고 완충액으로 세척하여 혈구를 얻은 후 -80℃에서 보관하며 실험에 사용하였다. 혈구 약 0.5g을 5mL의 완충액 A(트리스 완충액(pH6.5 50mM + 1mM EDTA))에 현탁 후 초음파분쇄기로 5초간 5회 혈구를 파쇄하여 균질화시킨 후 4℃, 22,000Xg에서 20분간 원심분리하고 그 상등액을 혈구용해물로 사용하였다.
체액을 원심분리한 후의 상등액은 플라즈마로 얻어 1M 시트르산용액으로 pH4.6으로 조정한 후 -70℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 플라즈마 45ml을 203,006g 속도로 4℃에서 4시간 원심분리하여 얻은 상등액 40ml을 울트라필트레이션(cut off: 10,000)으로 하여 3ml로 농축하였다. 50mM 트리스-HCl/20mM EDTA 완충액(pH6.5)으로 평형화시킨 Toyopearl HW-55S 컬럼(1.4X50cm)에 로딩하였다. 50mM 트리스-HCl/20mM EDTA 완충액(pH6.5)으로 1.5mL/시간의 속도로 용출시키면서 3.5ml씩 분획하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 조사하였다. 칼슘 및 β-1,3-글루칸 용액을 첨가하였을 때 페놀옥시데이즈 활성을 나타내는 분획만을 모아 페놀옥시데이즈 조성물을 얻었으며 이를 G 용액으로 명명하였다.
실시예 2.
페놀옥시데이즈 활성화에 대한 혈구용해물의 효과를 알아보기 위하여, G 용액과 혈구용해물에 대하여 β-1,3-글루칸에 의한 페놀옥시데이즈 활성을 측정하고 그 결과를 도 1에 나타낸다(컬럼1: 기질용액(CaCl25mM, 트리스 완충액 50mM, 4-MC 1mM, 4-HP 2mM), 컬럼 2: G 용액 5ul (50ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl2함유 기질용액, 컬럼 3: 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl2함유 기질용액, 컬럼 4: G 용액 5ul (50ug 단백질) + 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl2를 함유하지 않는 기질 용액, 컬럼 5: G 용액5ul (50ug 단백질) + 혈구용해물 10ul (200ug 단백질) + β-1,3-글루칸 1ug + CaCl2함유 기질 용액)
실시예 3.
혈구용해물에서 다음과 같은 방법으로 45kDa 단백질을 분리하였다.
실시예 1에서 얻은 혈구용해물 약 3ml을 완충액 A로 평형화시킨 Blue-Sepharose 칼럼(1.0X5.2 cm)에 로딩한 후 0.2ml/min의 속도로 세척하여 세척액을 모아 한외여과 장치(컷 오프 10,000 )로 농축한다. 농축된 샘플(2ml, 단백질 50mg)을 완충액 B(트리스 완충액(pH6.5) 50mM, 1mM EDTA, 0.1NaCl)로 평형화시킨 Sephacryl S-200(1.5X120cm)에 로딩하고 같은 완충액으로 흘려 주면서 분획물을 얻었다. 각 분획물을 정제된 프로페놀옥시데이즈, 활성화 된 PPAF-I과 Ca2+이 포함된 기질에 반응시켜 페놀옥시데이즈 활성을 보이는 분획물을 모아 완충액 C (인산완충액(pH7.0) 50mM, 1.7M 암모니움 설페이트)로 평형화시킨 페닐 세파로오스 컬럼(0.5X7cm)에 로딩하고, 0.3ml/min의 속도로 암모니움 설페이트용액을 1.7~ 0M로 선형구배로 용출시켰다. 환원 상태의 SDS-PAGE로 확인하여 약 45kDa 단백질을 포함하는 분획물을 모아 한외여과장치로 농축하였다. 농축된 시료를 완충액 B로 평형화시킨 Superdex-200 FPLC 컬럼에 로딩하여 같은 완충액으로 용출시켰다. 페놀옥시데이즈 활성을 측정하여 활성을 나타내는 분획물을 모아 완충액 D(트리스 완충액(pH7.4) 20mM)로 평형화시킨 mono-Q 컬럼에 로딩한 후 0.4ml/min의 속도로 소디움 클로라이드 용액을 0~1M의 선형구배를 용출시켰다. 페놀옥시데이즈 활성을가진 분획물을 모아 환원 및 비환원 조건으로 10% SDS-PAGE를 실시한 결과 약 45kDa 위치에서 단일 띠를 나타내는 단백질을 얻었다. 실시예 4에서 순수하게 정제된 45kDa 단백질을 이용하여 토끼로부터 폴리크로날 항체를 조제하였다. 얻어진 항체를 이용한 웨스턴 블라팅 실험에 의해, 형구용해물에서 정제된 45kDa 단백질이 G 용액의 한 성분임을 확인하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. (래인 1: 사이즈 마커, 래인 2: 혈구용해물, 래인 3: G 용액, 래인 4: 분리정제된 45kDa 단백질).
정제된 45kDa 단백질을 트립신으로 잘라 부분 아미노산 서열을 결정하였다. 시료 30 ㎍을 함유하는 용액에 동일 용량의 8 M 유레아를 함유하는 0.4 M NH4HCO3완충액을 가하여 녹이고, 전체 용량의 10 %에 해당하는 양의 45 mM DTT 용액을 가하여 50 ℃에서 15분간 반응시켜 환원시킨 후, 전체 용량의 10 %에 해당하는 양의 100 mM 요도아세트아미드 용액을 가하여 실온에서 15분간 반응시켜서 환원된 시스테인 잔기를 알킬화시켰다. 이를 10 % TCA 침전법으로 침전시키고, 얻어진 단백질 잔사를 8 M 유레아를 함유하는 0.4 M NH4HCO3완충액으로 녹인 후, 트립신 2 ㎍을 가하여 37 ℃에서 13시간 반응시켜 단편화하였다. 단편화시킨 단백질들은 C18 역상 HPLC 컬럼(chemcosorb 5-ODS-H 2.1×150/W)를 이용하여 선형 농도구배 시스템[A; 0 % CH3CN in 0.06 % TFA, B; 80 % CH3CN in 0.052 % TFA]하에서 90분 동안 B용매가 90 %까지 증가되도록 하면서 1분당 0.2 ml의 유속으로 단편화된 단백질을 분리한 후, 에드만 분해법으로 부분 아미노산 서열을 다음과 같이 결정하였다.
부분 아미노산 서열
AGEWDTLTEKERLPY
PLVQADNI
FVLDQTFVXAGGE
실시예 4.
실시예 3에서 얻은 정제된 45kDa 단백질을 토끼(백색, 숫컷, 2.7kg)에 주사하여 45kDa 단백질의 항체를 얻었다.
항체 생성 여부를 확인하기 위한 실험으로는 45kDa 단백질을 환원 조건으로 10 % SDS-PAGE상에서 분리하고, 전이 완충액 내에서 280 mA로 4 ℃에서 4시간 동안 반응시켜 PVDF 멤브레인에 전이시켰다. 이 멤브레인을 TBS로 세척하고, 5 % 스킴 밀크와 1 % 말 혈청(horse serum)을 함유하는 TBS와 4 ℃에서 하룻밤 진탕 배양함으로써 비특이적 반응을 차단시킨 후, 토끼에서 분리한 항혈청을 2.5 % 스킴 밀크를 함유하는 TTBS로 100배 희석한 용액과 실온에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. TTBS로 5회 세척하고, 2차 항체(항-토끼 Ig. 서양고추냉이 퍼옥시데이즈가 링크된 당나귀 총 항체)를 TTBS로 100배 희석한 용액과 실온에서 30분간 반응시킨 후 다시 TTBS로 5회 세척하였다. Semi-dark 조건에서 ECL blot을 1분간 실시하여 발생된 형광을 필름에 감광시켰다. 이 항체는 45 kDa 단백질을 선택적으로 인식함을 확인하였다.
실시예 5.
XL-1-Blue을 LB 배지 5 ml, 20 % 말토오스 50 ㎕, 1 M-MgSO450 ㎕의 혼합액에서 37 ℃에서 진탕 배양한 후 회수한 균 침전물에 10 mM-MgSO4을 가하여 OD600이 0.5가 되도록 조정하였다. Moon et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo)116, 53~58에 기재된 방법에 따라 한국산 참검정풍뎅이 유충의 cDNA 라이브러리를 만들었다. cDNA 라이브러리 용액에 XL-1-Blue 200 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양한 후, 48 ℃로 예열된 3.5 ml의 탑 아가(top agar)와 혼합하여 그 액을 NZY 플레이트에 도포시켰다. 42 ℃에서 4시간 배양한 후 IPTG가 처리된 필터를 플레이트 위에 덮고 다시 37 ℃에서 8시간 더 배양하였다. 반응이 종결되면 4 ℃에서 20분간 방치한 후 필터를 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 건조된 필터를 high-TBST 용액으로 실온에서 10분간 세척시킨 후, 이어 low-TBST 용액으로 실온에서 10분씩 두 차례 더 세척하였다. 세척된 필터는 완전히 물기를 제거한 후 3 % 젤라틴 용액에 넣어 30분간 27 ℃에서 블라킹시킨 다음, 45kDa 단백질의 항체 용액과 2.5시간 동안 27 ℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 필터를 low-TBST 용액으로 세 차례 세척한 후 2차 항체 용액에서 27 ℃에서 30분간 반응시켰다. 이 필터를 low-TBST 용액으로 세 차례 세척시킨 후 다음과 같이 발색 반응을 수행하였다.
앞에서 제조된 필터를 AP 완충액 100ml에 50mg/ml NBT(나이트로블루 테트라졸리움 클로라이드, Bio-rad 170-6532) 1320 μl과 50 mg/ml BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트-p-톨루이딘염 Bio-rad 170-6539) 660 μl을 첨가한 발색 반응액에 담궈 발색시킨 후 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 주변과 뚜렷이 구별되어 보라색을 띄는 클론을 1차 양성 클론으로 판정하였다. 1차 양성 클론을 LB 액체 배지로 적당히 희석하여, 100개에서 200개 정도의 플라크가 생성될 것으로 예상되는 양에 XL-1-Blue (OD600=0.5) 200 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양하였다. 여기에 예열된 3 ml의 탑 아가를 가하여 NZY 플레이트에 도포하고, 이후 실험은 1차 선별과 동일하게 실시하여 양성 클론을 2차로 선별하였다.
XL-1-Blue (OD600=1.0) 200 ㎕와 2차 선별 결과 확인된 양성 플라크 용액 (2×105phage) 200 ㎕, ExAssist 헬퍼 파지 1 ㎕를 50 ml 팰콘 튜브에 넣고 37 ℃에서 15분간 배양한 후 3 ml의 LB 액체 배지를 가하고 37 ℃에서 3시간 진탕 배양시킨 다음 70 ℃에서 다시 20분간 열처리하였다. 열처리된 액을 1,000×g에서 15분간 원심분리시켜 그 상등액을 15 ml 팰콘 튜브에 취하여 4 ℃에 보관하였다.
SOLR 세포(OD600=1.0) 200 ㎕에 LB 액체 배지로 10배 희석한 파지미드를 각각 2 ㎕, 10 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15분간 진탕 배양한 후 이들 중 50 ㎕를 취하여 LB/앰피실린 플레이트에 도말하였다. 37 ℃에서 12시간 배양한 후 단일 콜로니를 취하여 50 ml 팰콘 튜브 상에 LB 액체 배지 5 ml과 앰피실린(50 mg/ml) 10 ㎕를 넣고 37 ℃에서 12시간 배양하였다. DNA 정제 키트(Promega, wizard plus sv minipreps)을 이용하여 45kDa 단백질의 유전자가 삽입된 플라즈미드를 분리하였다.
얻어진 플라즈미드 DNA 염기 서열은 자동 DNA 염기 배열 결정기기를 이용하여 5'방향과 3'방향으로부터 양 방향에서 2 중으로 DNA 염기 서열을 결정하고(서열번호 1). 그 염기서열로부터 단백질 서열을 추론하였다(서열번호 3).
실시예 6.
정제된 45kDa 단백질, 프로페놀옥시데이즈, 그리고 활성화 된 PPAF-I를 사용한 재구성 실험에서 페놀옥시데이즈 활성을 측정하였다. 프로페놀옥시데이즈와 활성화된 PPAF-I는 기존의 방법대로 정제하였다(Lee et al. (1998) Eur. J. Biochem. 254, 50~57, Kwon et al. (1997) Mol. Cells. 7(1). 90-97). Ca2+, 45kDa 단백질, 프로페놀옥시데이즈, 활성이 있는 PPAF-I의 존재 여부에 따른 페놀옥시데이즈 활성화 결과를 도 3에 나타낸다(컬럼 1: 기질용액, 컬럼 2: 프로페놀옥시데이즈 2ug, 컬럼 3: 45kDa 단백질 1ug, 컬럼 4: PPAF-I 1ug, 컬럼 5: 프로페놀옥시데이즈 2ug + 45kDa 단백질 1ug, 컬럼 6: 프로페놀옥시데이즈 2ug + PPAF-I 1ug, 컬럼 7: 45kDa 단백질 1ug + PPAF-I 1ug, 컬럼 8: 프로페놀옥시데이즈 2ug + 45kDa 단백질 1ug + PPAF-I 1ug(CaCl2첨가안함), 컬럼 9: 프로페놀옥시데이즈 2ug + 45kDa 단백질 1ug + PPAF-I 1ug). 45kDa 단백질을 프로페올옥시데이즈, 활성화된 PPAF-I와 반응시켰을 때 Ca2+의 농도와는 관련없이 페놀옥시데이즈 활성을 나타내었으나(컬럼 8과 9), 프로페놀옥시데이즈를 45kDa 단백질 또는 활성화된 PPAF-I중 어느 하나만과 반응을 시켰을 때는 페놀옥시데이즈 활성이 관찰되지 않았다(컬럼 6과 7).
페놀옥시데이즈 활성을 나타내는 위 반응 혼합물을 환원조건하에서 전기영동한 결과를 도 4에 나타낸다((A), 래인 1: 프로페놀옥시데이즈(2ug), 래인 2: 45kDa 단백질(2ug), 래인 3: PPAF-I (2ug), 래인 4: Ca2+을 첨가하지 않고 프로페놀옥시데이즈(2ug), 45kDa 단백질 (2ug) 및 PPAF-I(2ug)을 30℃에서 60분간 반응시킴, (B)는 Ca2+을 첨가한 상태에서 같은 조건으로 반응시킴). 45kDa 단백질은 Ca2+이 없는 상태에서 반응되었을 때 35kDa의 크기로 잘림을 알 수 있다.
실시예 7.
35kDa 단백질의 생성을 확인하기 위하여, 활성화된 PPAF-I과 45kDa 단백질을 Ca2+를 첨가 또는 첨가하지 않은 상태에서 반응시킨 후 전기영동을 실시하고 그 결과를 도 5에 나타낸다((A), 래인 1: 45kDa 단백질 (2ug), 래인 2: PPAF-I (2ug), 래인 3: Ca2+을 첨가하지 않고 45kDa 단백질 (2ug) 및 PPAF-I (2ug)을 30℃에서 60분간 반응시킴, (B) Ca2+을 첨가한 상태에서 같은 조건으로 반응시킴). 45kDa 단백질은 Ca2+이 없는 상태에서 활성화 된 PPAF-I에 의해 35kDa의 크기로 잘림을 알 수 있다. 절단된 35kDa 단백질을 전기영동하여 PVDF막에 전이시킨 후 아미노산 서열을 결정한 결과 45kDa 단백질이 Arg-99와 Glu-100 사이가 절단되었음을 확인하였다.
실시예 8.
β-1,3-글루칸 용액에 G용액과 정제된 45kDa 단백질을 첨가하면 증가된 페놀옥시데이즈의 활성을 얻을 수 있었다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
본 발명에 따른 단백질은 곤충에서 페놀옥시데이즈 활성화 인자중 하나이고 진균 감염증 진단에 유효한 조성물의 일부이다. 본 발명의 단백질은 진균 감염 진단 조성물의 제조에 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 유전자를 이용하여 진균 감염 진단 조성물 제조에 필요한 단백질을 대량으로 생산할 수 있다.
<110> Samyang Genex Co. Ltd. <120> Component of phenoloxidase system and gene coding the same <130> I-117 <160> 3 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 1437 <212> DNA <213> Holotrichia diomphalia <220> <221> CDS <222> (40)..(1284) <400> 1 gggctgcagg aatcggcacc agcgaaacct cctttagca atg aaa cgc ttg ttc 54 Met Lys Arg Leu Phe 1 5 gtt ata act gcc ttt ttt cta ttc ggc gct gaa gcc caa aat agc gtt 102 Val Ile Thr Ala Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala Gln Asn Ser Val 10 15 20 att gat gcg gca gtc gtg aat ata ttt gga aac gct tcc gag tac ata 150 Ile Asp Ala Ala Val Val Asn Ile Phe Gly Asn Ala Ser Glu Tyr Ile 25 30 35 cca cct ggc tac gaa ata gtc acc aag gct cct tta gga gcc cta aca 198 Pro Pro Gly Tyr Glu Ile Val Thr Lys Ala Pro Leu Gly Ala Leu Thr 40 45 50 gcc tta ccc aga tgt gga acg ggt gcc gat caa ggc aaa aaa gtg tgt 246 Ala Leu Pro Arg Cys Gly Thr Gly Ala Asp Gln Gly Lys Lys Val Cys 55 60 65 att gtt tat cat aga tgc gat gga gtc acg aat aca gta aca cca gaa 294 Ile Val Tyr His Arg Cys Asp Gly Val Thr Asn Thr Val Thr Pro Glu 70 75 80 85 gaa gtt ata aac acc aca gga gaa ggc att ttc gat atc agg gaa aac 342 Glu Val Ile Asn Thr Thr Gly Glu Gly Ile Phe Asp Ile Arg Glu Asn 90 95 100 gcc aat gaa tgc gaa agc tat ttg gac gtg tgt tgt ggc ctc cca gaa 390 Ala Asn Glu Cys Glu Ser Tyr Leu Asp Val Cys Cys Gly Leu Pro Glu 105 110 115 ggc ggt gta ttg cca act cct tcg ccc act cct cca gta gta cca gtt 438 Gly Gly Val Leu Pro Thr Pro Ser Pro Thr Pro Pro Val Val Pro Val 120 125 130 ctg aaa ccg agc ttc tgc ggc atc agg aac gaa cgt ggt ttg gac ttt 486 Leu Lys Pro Ser Phe Cys Gly Ile Arg Asn Glu Arg Gly Leu Asp Phe 135 140 145 aaa ata aca ggt cag acc aat gag gcc gaa tat ggg gaa ttt ccg tgg 534 Lys Ile Thr Gly Gln Thr Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Phe Pro Trp 150 155 160 165 atg gtg gca gta ttg aaa gcc aac gtt att ccc ggt tct ggg gaa gag 582 Met Val Ala Val Leu Lys Ala Asn Val Ile Pro Gly Ser Gly Glu Glu 170 175 180 caa ttg gta tgc ggg gga tcc ttg atc gct cca agc gtt gta tta act 630 Gln Leu Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala Pro Ser Val Val Leu Thr 185 190 195 gga gct cat tgc gtc aat agt tac caa agc aac tta gac gcc atc aaa 678 Gly Ala His Cys Val Asn Ser Tyr Gln Ser Asn Leu Asp Ala Ile Lys 200 205 210 att cgt gca ggc gaa tgg gac acc cta acc gaa aag gaa cga ctg cca 726 Ile Arg Ala Gly Glu Trp Asp Thr Leu Thr Glu Lys Glu Arg Leu Pro 215 220 225 tac caa gaa agg aaa atc aga caa gtg atc atc cac agt aac ttc aac 774 Tyr Gln Glu Arg Lys Ile Arg Gln Val Ile Ile His Ser Asn Phe Asn 230 235 240 245 cct aag acc gtc gta aac gat gtc gcc tta tta ctg ctg gat agg cca 822 Pro Lys Thr Val Val Asn Asp Val Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Pro 250 255 260 ctc gtt caa gcc gat aac atc gga acg att tgc tta cct cag caa agc 870 Leu Val Gln Ala Asp Asn Ile Gly Thr Ile Cys Leu Pro Gln Gln Ser 265 270 275 cag ata ttc gat tcc aca gaa tgt ttc gcc agt gga tgg gga aag aag 918 Gln Ile Phe Asp Ser Thr Glu Cys Phe Ala Ser Gly Trp Gly Lys Lys 280 285 290 gaa ttc gga agc aga cat aga tat tca aat atc ttg aag aaa atc caa 966 Glu Phe Gly Ser Arg His Arg Tyr Ser Asn Ile Leu 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- 서열번호 3의 아미노산 잔기 100~415로 이루어지는 단백질.
- 서열번호 3의 아미노산 잔기 1~415로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
- 서열번호 3의 아미노산 잔기 100~415로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
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| Molecular cloning of cDNA for pro-phenol-oxidase-activating factor 1, a serine protease is induced by lipopolysaccharide or 1,3-beta-glucan in coleopteran insect, Holotrichia diomphalia larvae" Eur.J.Biochem. 257, 615-621(1998) 초록 * |
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