KR100485947B1 - β-1,3-글루칸 검출용 조성물, 그것의 제조방법 및 그것을이용한 β-1,3-글루칸 검출 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료내에 존재하는 극미량의 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물 및 그것을 제조하는 방법 및 β-1,3-글루칸 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 체액, 또는 곤충의 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물인 시료를 컬럼 크로마토그래피로 정제함에 의해 제조할 수 있으며, 구체적으로는 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제 존재하에서 곤충의 체액, 또는 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물인 시료를 얻고, 얻어진 시료를 상기 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획 중 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 이용하여, 검체로부터 시료를 채취하고, 상기 시료에 본 발명에 따른 조성물과 칼슘 이온을 첨가하고, 상기 시료에서의 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정함으로써 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 β-1,3-글루칸 검출용 조성물, 그것의 제조방법 및 β-1,3-글루칸 검출용 키트에 관한 것이다.
암 환자나 장기이식 수술환자, AIDS 환자 등 면역기능이 저하된 환자에게 전신 진균 감염증이나 프로토조아와 같은 원생동물의 감염이 증가되는 사실은 의료계에서 심각한 문제로 대두되고 있으며, 이로 인한 사망률도 점점 증가되고 있다. 이러한 면역기능이 저하된 환자들에게 조기에 진균 감염 여부를 판단하여 적절한 항진균제를 투여하는 것은 매우 필요한 조치이나 현재 조기 진균 감염 여부를 판단하는 것에 어려움이 있다. 또한, 많은 AIDS 환자가 주폐포자충(Pneumocystis carinii)으로 인한 폐렴으로 사망하고 있고 최근 주폐포자충의 세포벽성분으로 β-1,3-글루칸이 존재함이 보고되고 있다 (Kottom et al., J. Biol. Chem. (2000), 275(51), pp. 40628-34).
환자 진단의 경우 면역기능이 저하된 환자의 진균 감염 여부를 진단하기 위해서는, 지금까지는 진균학적 방법 즉, 환자의 혈액을 채취하여 배양을 통해 진균의 감염 여부를 판단하고 있으나 이 방법은 배양 시간이 2-5일이 요구되어 치료시기를 맞추지 못하는 단점이 있다. 최근에 진균이 가진 항원을 이용하는 방법이나 진균의 대사산물을 이용한 진단 방법이 제시되었으나 후자의 경우 여러 대사산물을 모두 분석해야 할 뿐 아니라 진균 대사산물의 빈번한 변이 유도에 의해 그 감도나 정확도가 낮다는 문제점이 있다. 이러한 이유로 전신 진균 감염의 초기 단계에 감염 환자의 혈액중에 미량 존재하는 β-1,3-글루칸을 정확하게 인식하는 시스템을 찾기 위하여 많은 연구가 진행되었다.
한편, 가재나 어패류의 인공 양식에서 곰팡이가 양식조에 감염되면 가재나 어패류가 다량 괴사하므로 이로 인한 양식업계의 경제적 피해가 심각하다. 이러한 경우에도 진균의 감염을 초기에 진단할 수 있다면 적절한 조치를 취할 수 있어 수산 양식을 효율을 향상시킬 수 있다.
곤충에서의 멜라닌 형성은 체내에 존재하는 페놀성 물질의 산화로 시작되는데, 이 과정에 작용하는 효소인 페놀옥시데이즈는 곤충의 체내에서 평상시에는 불활성 형태인 프로페놀옥시데이즈 형태로 존재하다가 외부 이물질에 의해 활성화되는 프로페놀옥시데이즈 연쇄 반응의 최종산물의 자극에 의해 최종 활성 형태인 페놀옥시데이즈로 전환되는 것으로 알려져 있다. 이러한 프로페놀옥시데이즈의 활성화는 미생물의 세포벽 성분인 β-1,3-글루칸, 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸 등에 의하여 개시되는 것으로 보고되었다. 페놀옥시다아제 활성화 시스템은 β-1,3-글루칸, 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸이 이들과 특이적인 친화성을 나타내는 인식 단백질, 세린 프로테아제 치모겐, 프로페놀옥시데이즈를 포함하는 일련의 캐스캐이드 반응이 진행되고, 이 과정에서 프로페놀옥시다아제를 페놀옥시다아제로 활성화시키는데 세린 프로테아제 활성을 가진 프로페놀옥시다아제 활성화효소가 관여된다 (Ashida and Dohke, Insect Biochem., 10, 37-47 (1980), Ashida, J. Biol. chem., 274 (11), 7441-7453).
Ashida 등은 누에나방의 유충에서 분리한 체액이 펩티도글리칸 또는 β-1,3-글루칸과 반응하여 N-α-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스터를 가수분해 하는 에스터라제, 프로페놀옥시데이즈 활성화 효소 및 페놀옥시데이즈를 활성화 시킨다고 보고하였다 (Insect Biochem, vol.16, No.3, pp. 539-545, 1986).
완전변태 곤충의 생체 내에는 프로페놀옥시데이즈가 존재하며, β-1,3-글루칸 또는 리포폴리사카라이드에 의해 활성화되는 캐스케이드반응에 의해 페놀옥시데이즈로 활성화된다. 일련의 캐스케이드 단계로 이루어지는 이 반응 시스템은 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 혹은 자신의 혈구 세포의 탈과립화반응에 의해 유도되는 내부인자 등에 의하여 쉽게 활성화되어 페놀옥시데이즈로 변화되어 카테콜아민류를 이용하여 멜라닌을 형성해 버린다. 따라서 이 반응 시스템을 생체 외로 분리하기 어려웠다.
Ashida 등은 미국특허 4,970,152에서 엔도톡신과는 반응하지 않고 펩티도글리칸 및 β-1,3-글루칸과는 반응하는 누에의 플라즈마로부터 얻은 조성물을 이용하여 펩티도글리칸 또는 β-1,3-글루칸을 검출하는 방법을 제시하였다. 이 특허에서는 친화 크로마토그래프에 의해 펩티도글리칸과 반응하는 단백질을 제거함으로써 β-1,3-글루칸을 특이적으로 인식하는 조성물을 제공하였는데, 조성물에서 페놀옥시데이즈의 활성을 측정하거나 프로페놀옥시데이즈 활성화효소의 활성을 측정함으로써 β-1,3-글루칸의 측정하였다.
Ashida 등은 Eur. J. Biochem, 188, 507-515(1990) 모기 유충으로부터 분리한, β-1,3-글루칸을 인식하는 조성물을 제시하면서 프로페놀옥시데이즈의 활성에 2가 이온이 중요한 역활을 한다고 밝혔다.
미국특허 5,266,461에는 리물러스(Limulus) 혈구 혼합물로부터 분리한, β-1,3-글루칸을 인식하는 조성물이 제시되었다. 그러나 리물러스는 희귀동물로 대부분의 국가에서 자연보호동물로 지정되어 있다는 문제점이 있다.
한국특허출원 2001-3036에서는 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 활성을 나타내는 β-1,3-글루칸 검출용 조성물을 제공하였다.
Lee et al., Eur. J. Biochem., 254, 50-57 (1998)에서는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자가 프로페놀옥시데이즈 활성화에 직접 관여하고 세린프로테아제의 성질을 가진다고 보고하였다.
한국특허 217964호에서는 β-1,3-글루칸 검출을 위한 프로페놀옥시다제 활성화 효소의 활성 측정법 및 이의 용도에 대해 제시하고 있으나 액체크로마토그래피를 이용하여 측정하였고 β-1,3-글루칸 검출감도가 높지 않다.
본 발명은 β-1,3-글루칸 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 β-1,3-글루칸 검출용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 β-1,3-글루칸 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명은 β-1,3-글루칸 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 시료내의 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 조성물, 그것을 제조하는 방법 및 그것을 이용한 β-1,3-글루칸 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 페놀옥시데이즈 시스템은 곤충 내에 존재하는, β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈가 페놀옥시데이즈로 활성화되는 시스템을 의미하고, 그 활성화에는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자가 관여한다.
본 발명에서 페놀옥시데이즈 조성물은 페놀옥시데이즈 시스템 성분의 전부 또는 일부를 포함하며, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 활성이나 프로페놀옥시데이즈 활성화인자(PPAF) 활성을 나타내는 조성물을 의미한다.
본 발명은 칼슘 존재하에서, β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시다아제 활성화인자 활성을 나타내는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 곤충의 페놀옥시데이즈 시스템 전부 또는 일부를 포함하며, 그 예로 프로페놀옥시데이즈나 프로페놀옥시데이즈 활성화인자(PPAF)를 포함한다.
본 발명의 프로페놀옥시데이즈 활성화인자는 프로페놀옥시데이즈를 페놀옥시데이즈로 활성화시키는 효소를 말한다.
또한 본 발명은 β-1,3-글루칸을 바람직하게는 20pg/ml까지 검출할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
이와 같이 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있는 본 발명의 조성물은 개체에 캔디다와 같은 진균의 감염 여부, 주폐포자충과 같은 프로토조아의 감염 여부를 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 곤충은 체내에 페놀옥시데이즈 시스템을 가지고 있는 곤충을 의미하며, 완전변태 곤충이 바람직하다. 예로는 딱정벌레목(Coleoptesra), 나비목 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 딱정벌레목으로서 거저리과, 풍뎅이과 등을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 칼슘 존재하에서, β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 β-1,3-글루칸에 의해 진행되는 캐스캐이드 반응을 이용한 것으로써 페놀옥시데이즈 활성 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내므로, 페놀옥시데이즈 활성을 측정하거나 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정함으로써 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법은 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물을 시료로 사용하고, 분리 공정 중 칼슘 이온의 생리적 작용을 차단함으로써 β-1,3-글루칸에 의해 활성화되는 페놀옥시데이즈 조성물을 페놀옥시데이즈 활성 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정하여 분리할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 방법은 곤충의 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물인 시료를 얻고, 얻어진 시료를 상기 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획 중 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 활성 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법의 또다른 예는, 곤충의 플라즈마를 상기 플라즈마 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획에 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 혈구 용혈물을 첨가하고, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 활성 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 방법에서 필요한 경우, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화 인자 활성을 나타내는 분획에 혈구 용혈물을 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명에서는 곤충에 존재하는 페놀옥시데이즈 시스템이 β-1,3-글루칸에 의해 활성화될 뿐 아니라, 칼슘 이온에 의해서도 활성화된다. 따라서 곤충으로부터 페놀옥시데이즈 시스템을 분리하기 위해서는 β-1,3-글루칸 뿐 아니라 칼슘 이온에 의한 활성화를 억제하는 것이 필요하다. 이를 바탕으로 본 발명은 곤충 체액 또는 플라즈마와 혈구용혈물로부터, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제 존재하에서 곤충으로부터 체액 또는 플라즈마와 혈구 용혈물인 시료를 얻고, 얻어진 시료를 상기 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획 중 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화 인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 방법에서, 바람직하게는 곤충으로부터 시료를 채취할 때, 체액 응고를 억제할 수 있는 항응고 완충액을 사용한다. 항응고 완충액은 곤충의 체액 응고를 억제할 수 있는 완충액이면 모두 사용할 수 있으며, 특히 사이트레이트 완충액이 바람직하며 시료에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명자들은 곤충의 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물을 시료로 사용함으로써, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 특이적으로 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 조성물을 얻을 수 있음을 밝혔다. 본 발명의 조성물은 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물로부터 β-1,3-글루칸을 20pg/ml까지 검출할 수 있다. 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물은 곤충의 체액을 취한 후 플라즈마와 혈구를 분리하고 분리된 혈구를 용혈시켜 플라즈마에 혼합하거나, 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 형구 용혈물을 부분 정제된 플라즈마에 첨가하여 얻을 수 있다. 또 다른 방법으로, 체액 내의 혈구를 분리하지 않고 그대로 일부 또는 전부의 혈구를 용혈시켜 얻을 수 있다. 예를 들어 체액 또는 분리한 혈구를 초음파분쇄 (sonication)하거나 고속원심분리함에 의해 혈구를 용혈시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서 시료를 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액로 처리하여 분획을 얻는 공정은 예를 들어 컬럼 크로마토그래피에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서 시료 채취 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제로써, 종래에 알려져 있는 킬레이팅제는 특별한 한정없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 EDTA, EGTA, 사이트르산 등을 사용할 수 있다. 킬레이팅제의 양은 대상 곤충 시료나 컬럼의 종류, 사용 용매 등 분리 공정 조건에 따라 달라질 수 있으며, 곤충 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 양이면 된다. 따라서 이 분야의 통상의 전문가들은 과도한 실험 없이 킬레이팅제의 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 제조방법에서 사용할 수 있는 용매 또는 완충액의 종류는 특별히 한정되지 않으나, pH가 6.5 이하인 것이 바람직하다. pH가 6.5보다 높은 경우 페놀옥시데이즈 캐스캐이드 반응의 한 성분인 세린 프로테이즈가 활성화되어 프로페놀옥시데이즈를 페놀옥시데이즈로 활성화시켜버리므로 본 발명에 따른 조성물을 얻기 어렵다.
본 발명에서 곤충 시료를 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액로 처리하는 방법의 한 예는 컬럼 크로마토그래피로, 레진을 충진시킨 컬럼에 곤충 시료를 로딩한 후 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액로 용출시켜 분획을 얻을 수 있다. 본 발명에서는 친화크로마토그래피와 같은 별도의 까다로운 정제과정없이 컬럼 크로마토그래피를 수행함에 의해 β-1,3-글루칸을 20pg/ml까지 특이적으로 검출할 수 조성물을 정제할 수 있다.
본 발명에서 컬럼 크로마토그래피에 사용할 수 있는 레진은 덱스트란을 원료로 하는 레진이나 비닐을 원료로 하는 레진이 바람직하다. 한 예로 세파덱스 또는 토요펄(Toyopearl)을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 β-1,3-글루칸을 특이적으로 검출할 수 있으므로 β-1,3-글루칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염의 진단에 유용하다.
따라서 본 발명은 검체에 β-1,3-글루칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염을 진단하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 검체로부터 시료를 채취하고, 상기 시료에 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 조성물과 칼슘 이온을 첨가하고, 상기 시료에서의 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정하는 것으로 이루어진다. 한 예로, 본 발명에 따른 방법에서 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 조성물은 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제 존재하에서 준비된 곤충의 플라즈마와 혈구 용혈물인 시료를 상기 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 포함하는 용매로 처리하여 얻어진 분획 중 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈를 활성화시키는 분획을 선택하여 제조되는 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 β-1,3-글루칸 검출 방법에서, 검체는 사람을 포함하는 동물이거나 생물이 서식하는 환경일 수 있다. 한 예로, 검체로부터 혈액을 채취하여 진균 감염을 진단할 수 있다. 또 다른 예로, 양식업에서는 양식장의 물을 채취하여 진균과 같이 β-1,3-글루칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염을 진단할 수 있다.
β-1,3-글루칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염 진단의 특이성을 향상시키기 위해, 필요한 경우 검체 시료에 존재할 수 있는 리포폴리사카라이드를 제거하는 전처리를 할 수 있다. 예를 들어, 검체 시료를 폴리믹신(polymyxin)과 같이 리포폴리사카라이드와 특이적으로 결합하거나 리포폴리사카라이드를 침전시킬 수 있는 물질로 처리함에 의해 리포폴리사카라이드의 영향을 제거할 수 있다.
본 발명에서 페놀옥시데이즈 활성 측정 방법은, 기존에 알려진 페놀옥시데이즈 측정 방법을 그대로 또는 변형시켜 이용할 수 있다. 한 예로 아래에 설명한 4-메틸카테콜/4-하이드록시프롤린에틸에스테르(4-MC/4-HP)를 이용한 발색 반응이나 도파민을 이용한 멜라닌 형성 반응을 이용하여 흡광도를 측정함으로써 페놀옥시데이즈 활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 프로페놀옥시데이즈 활성화인자는 P1위치에 Arg을 가지는 NH-Mec, NH-MCA, NH-pNA의 기질, X-Arg-Y 서열을 갖는 기질에서 Arg의 C-말단을 자르는 활성으로 그 역가를 측정할 수 있다 (Ashida, J. Bio. Chem., 274(11), 7441-7453 (1999), 한국특허 제 217964호). 바람직하게는 P1위치에 Arg을 가지는 NH-MCA, NH-pNA, 더욱 바람직하게는 Boc-Val-Pro-Arg-MCA 또는 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA, Boc-Val-Pro-Arg-pNA을 기질로 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 β-1,3-글루칸 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 β-1,3-글루칸 검출용 키트는 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 조성물을 함유한다. 한 예로, 본 발명에서 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 조성물은, 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제 존재하에서 준비된 곤충의 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물인 시료를 상기 시료 및 분리 공정 상에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 포함하는 용매로 처리하여 얻어진 분획 중 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈를 활성화시키는 분획을 선택하여 제조되는 조성물일 수 있고 그 조성물은 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타낸다.
본 발명에서 사용하는 완충액, 페놀옥시데이즈 및 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성 측정 방법은 다음과 같다.
항응고 완충액(pH 5.5): NaCl 15 mM, 트리소디움 사이트레이트 136 mM, 시트르산 26 mM, EDTA 20 mM
β-1,3-글루칸 용액: β-1,3-글루칸(curdlan, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10mg을 0.1N NaOH 1ml에 녹인 용액 10 μl과 20mM 트리스 완충액(pH 8.0) 990 μl을 혼합하여 만든 용액
페놀옥시데이즈 활성 측정
농도별로 희석한 β-1,3-글루칸 용액 10 μl에 페놀옥시데이즈 조성물 30 μl을 섞어 30 ℃에서 5분간 전반응시키고 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0) 437 μl와 1M CaCl2 5μl, 250 mM 4-메틸카테콜(MC) 2μl, 62.5 mM 4-하이드록시프롤린에틸에스테르(HP) 16 μl을 넣어 총량이 500 μl이 되도록 한 후 30℃에서 30분 반응시킨다. 여기에 20% 초산 500 μl을 넣어 반응을 중지시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정한다.
NH-MCA 기질을 이용한 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성 측정
β-1,3-글루칸을 0.1N NaOH 에 현탁 시키고, 50mM 트리스 완충액 (pH 7.7)으로 희석하여 기질로 사용하였다. 농도별로 희석한 β-1,3-글루칸 용액 10 μl에 페놀옥시데이즈 조성물 30 μl을 섞어 30 ℃에서 5분간 전 반응시키고 20 mM 트리스 완충액(pH 7.5) 453 μl와 1M CaCl2 5μl, 10mM Boc-Val-Pro-Arg-MCA 또는 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (Sigma사) 2 μl를 넣어 총량이 500 μl이 되도록 한 후 30℃에서 30분간 반응시킨다. 20% 아세트산 900 μl에 반응액 100ul를 넣어 반응을 중지시킨 후 380nm - 460 nm 에서 형광을 측정한다
NH-pNA 기질을 이용한 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성 측정
농도별로 희석한 베타-1.3-글루칸 용액 10ul에 페놀옥시데이즈 조성물 50ul을 섞어 30℃에서 5분간 전반응시키고 20mM 트리스 완충액(pH 8.0) 332ul, 1M CaCl2 8ul 및 1.6mM Boc-Val-Pro-Arg-pNA (Sigma사, MW : 591, 알파-트롬빈) 100ul을 넣어 총량이 500ul이 되도록 한 후 30℃에서 30분간 반응시킨다. 상기 반응액에 0.04% 소디움 니트릴과 0.48M HCl이 함유된 용액 500ul을 혼합하고 0.3% 암모니움 설페이트 500ul 및 0.07% N-(1-나프틸)디아민 2HCl 500 ul을 첨가하여 디아존 반응을 통해 발색시킨 후 545nm 에서 측정한다.
실시예 1.
딱정벌레목 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충을 얼음 위에서 마취시키고 25G 주사바늘이 연결된 5ml 멸균 주사기에 항응고 완충액을 채워 머리쪽 첫번째 마디에 찔러 유출되는 체액을 마리당 3방울씩 모았다. 채취한 체액 65ml을 203,006g 속도로 4℃에서 4시간 원심분리한 후 상등액을 필트레이션(0.45um)하여 불순물을 제거하고 60ml을 모았다. 이것을 울트라필트레이션(cut off: 10,000)하여 3ml까지 농축하였다. 토요펄(Toyopearl) HW-55S 레진을 1 x 50 cm 컬럼에 충진시키고 충분한 양의 항응고 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 농축된 시료를 로딩하고 항응고 완충액을 0.16ml/분의 속도로 흘려주면서 용출액을 3.2ml씩 모아 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 조사하면서 β-1,3-글루칸 용액을 사용한 4-MC/4-HP 발색 반응을 통해, β-1,3-글루칸이 있을 때 발색되는 분획만을 모아 1차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물을 3.2 ml을 얻었다. 얻어진 1차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물을 사용하여, Ca2+의 존재 또는 부존재 하에서 β-1,3-글루칸 검출 능력을 확인하였다.
β-1,3-글루칸 1ug 존재시, 1차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물에 대해 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 및 Boc-Val-Pro-Arg-MCA을 기질로 한 프로페놀옥시데이즈 활성화인자의 활성을 측정하였고 그 결과를 표 1에 나타낸다.
| 음성대조구 | 1차정제 PO 조성물 | 1차정제 PO 조성물 + 10mM CaCl2 | 1차정제 PO 조성물 + β-1,3-글루칸 | 1차정제 PO 조성물 + β- 1,3-글루칸 + 10mM CaCl2 | |
| Boc-Phe-Ser-Arg-MCA | 1.2 | 11.3 | 17.1 | 11.4 | 159.4 |
| Boc-Val-Pro-Arg-MCA | 1.4 | 1.8 | 89.2 | 23.5 | 575.6 |
(PO : 페놀옥시데이즈)
실시예 2.
1차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물 3.2 ml을 다시 실시예 1의 동일한 컬럼에 로딩하고, 항응고 완충액을 0.15ml/분의 속도로 흘려 주면서 용출액을 3ml씩 모아 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 조사하여 β-1,3-글루칸 용액을 사용한 4-MC/4-HP 발색 반응을 통해, β-1,3-글루칸이 있을 때 발색되는 분획만을 모아 2차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물을 얻었다. 최종 Ca2+농도를 각각 0mM과 16mM로 되도록 하고, β-1,3-글루칸 용액 500pg/ml을 함유하는 용액 200ul을 사용하여 페놀옥시데이즈 조성물로 4-MC/4-MP 발색 반응을 수행하고 반응시간에 따라 결과를 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다 (-◆- : 완충액, -■- : 페놀옥시데이즈 조성물, -▲- : 페놀옥시데이즈 조성물 + Ca2+, -×- : 페놀옥시데이즈 조성물 + Ca2+ + β-1,3-글루칸). 페놀옥시데이즈 조성물이 β-1,3-글루칸이 존재하는 경우 페놀옥시데이즈 활성을 나타냄을 알 수 있다.
2차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물의 β-1,3-글루칸의 농도에 따른 페놀옥시데이즈 활성을 측정하고 표준곡선을 정하였다. β-1,3-글루칸의 농도 0 내지 200 pg/ml 에 대해 상기의 발색반응으로 30℃에서 1시간 반응시켜서 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 농도와 활성의 상관계수가 0.9908로 나타나 극미량의 β-1,3-글루칸을 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 2차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물에 대해 β-1,3-글루칸의 0, 20, 200pg/ml 농도에서 Boc-Val-Pro-Arg-MCA을 기질로, β-1,3-글루칸의 0, 100, 200, 400pg/ml 농도에서 Boc-Val-Pro-Arg-pNA를 기질로 한 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정하였고 그 결과를 각각 도 3 및 4에 나타낸다. 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성 측정을 통해 β-1,3-글루칸을 20pg/ml까지 측정할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3.
실시예 1의 페놀옥시데이즈 조성물이 β-1,3-글루칸에 대한 특이성이 있는지를 알아보기 위해 리포폴리사카라이드와 펩티도글리칸에 대해 페놀옥시데이즈 활성을 측정하였다. 50mM 트리스 완충액(pH 7.7)에 리포폴리사카라이드(시그마사)와 펩티도글리칸(시그마사)를 각각 현탁시켜 펩티도글리칸은 그대로, 리포폴리사카라이드는 2-3분동안 초음파파쇄한 후 기질로 사용하였다. 리포폴리사카라이드 200pg/ml, 20ng/ml, 20ug/ml의 농도의 기질을 사용하여 최종 Ca2+ 농도 5mM 및 페놀옥시데이즈 조성물로 4-MC/4-MP 발색 반응을 수행하였으며 β-1,3-글루칸 20ng/ml을 기질로 사용했을 때와 비교하고 그 결과를 도 5에 나타낸다 (□: 페놀옥시데이즈 조성물 + Ca2+를 첨가한 음성대조구 (이하 A), ▨ : A + 리포폴리사카라이드 200pg/ml, ▧ : A + 리포폴리사카라이드 20ng/ml, ▤ : A + 리포폴리사카라이드 20ug/ml, ■: A + β-1,3-글루칸 20ng/ml(양성대조구)).
또한 펩티도글리칸에 대해서도 상기와 동일한 조건하에서 페놀옥시데이즈 활성을 측정하고 그 결과를 도 6에 나타낸다 (□: 페놀옥시데이즈 조성물+ Ca2+를 첨가한 음성대조구 (이하 A), ▨ : A + 펩티도글리칸 200pg/ml, ▧ : A + 펩티도글리칸 20ng/ml, ▤ : A + 펩티도글리칸 20ug/ml, ■: A + β-1,3-글루칸 20ng/ml (양성대조구)).
이와 같이 리포폴리사카라이드 및 펩티도글리칸의 고농도, 즉 20ug/ml에 대해서도, 그 반응시간을 증가시켜도 페놀옥시데이즈 활성을 나타내지 않으므로 본 발명의 페놀옥시데이즈 조성물은 β-1,3-글루칸을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
비교예 1.
딱정벌레목 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충을 얼음 위에서 마취시키고 25G 주사바늘이 연결된 5ml 멸균 주사기에 항응고 완충액을 채워 머리쪽 첫번째 마디에 찔러 유출되는 체액을 마리 당 3방울씩 모았다. 채취한 체액 85ml을 372 g로 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 플라즈마로, 침전물을 혈구세포로 얻었다. 플라즈마 65ml을 203,006 g의 속도로 4℃에서 4시간 원심분리한 후 상등액을 필트레이션(0.45 um)하여 불순물을 제거하여 60ml을 모으고, 울트라필트레이션(cut off : 10,000)하여 3ml까지 농축하였다. 토요펄 HW-55S 레진을 1 x 50 cm 컬럼에 충진 시키고 충분한 양의 항응고 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 농축된 시료를 로딩하고 항응고 완충액을 0.16ml/분의 속도로 흘려 주면서 용출액을 3.2ml씩 모아 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 조사하면서 β-1,3-글루칸 용액을 사용한 4-MC/4-HP 발색 반응을 통해, β-1,3-글루칸이 있을 때 발색되는 분획만을 모아 1차 정제된 플라즈마액을 3.2 ml을 얻었다.
한편, 침전물인 혈구세포를 취하고 항응고 완충액으로 세척하여 원심분리하여 플라즈마 부분을 제거하였다. 이를 3회 정도 반복하고 혈구세포를 완전히 파괴하기 위해서 초음파분쇄를 실시한 후 372 g로 4℃에서 5분간 원심분리하여 상등액 3ml을 혈구세포 용혈물로 얻었다.
부분정제된 플라즈마액, 혈구세포 용혈물 및 실시예 1의 체액으로부터 1차 정제된 페놀옥시데이즈 조성물의 동일 단백질 함량(400ug)에 대해 Ca2+의 존재하에서 각각의 β-1,3-글루칸(농도 2ng/ml) 검출 능력을 비교하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 그림에서 같이 체액으로부터 얻은 페놀옥시데이즈 조성물이 β-1,3-글루칸에 대해 검출능이 있음을 알 수 있다.
반면, 상기의 부분정제된 플라즈마액을 사용하여 β-1,3-글루칸의 농도에 따른 β-1,3-글루칸 검출능력을 확인하였다. 도 8에서와 같이 부분정제된 플라즈마액에 대해서는 β-1,3-글루칸과 페놀옥시데이즈 활성사이에 상관관계가 없음을 알 수 있다.
실시예 4.
한국산 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia) 유충에서 분리한 체액 50ml을 420 g 속도로 4℃에서 20분간 원심분리하여 상등액과 침전물을 각각 플라즈마와 혈구세포로 얻었다. 먼저 침전된 혈구세포 5ml에 50mM 트리스 완충액/1mM EDTA (pH 6.5) 5ml를 가하여 초음파분쇄를 실시한 후 22,000 g 속도로 4℃에서 20분간 원심 분리시켜 상등액을 혈구세포 용혈물로 사용한다.
한편, 상등액의 플라즈마 50ml을 203,006 g 속도로 4℃에서 4시간 원심분리한 후 상등액을 울트라 필트레이션(cut off: 10,000)하여 3ml까지 농축하였다. 토요펄 HW 55S 레진을 1 X 50 cm 컬럼에 충진 시키고 50mM 트리스 완충액/20mM EDTA (pH 6.5)로 평형화시킨 후 농축된 플라즈마 3ml을 로딩하였다. 50mM 트리스 완충액/20mM EDTA (pH 6.5)를 0.16 mL/분의 속도로 흘리면서, 용출액을 약 3.2mL씩 모아, 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 조사하고, 4-MC/4-HP 발색 반응을 통해 5mM Ca2+이 있을 때 발색되는 분획들을 각각 모았다. 이 분획들에 혈구용혈물과 β-1,3-글루칸의 존재하에서 페놀옥시데이즈 활성을 나타내는 분획을 모아 부분정제된 플라즈마액 (3.2ml)으로 하였다.
부분정제된 플라즈마액 (단백질함량 : 25 ug), 상기의 혈구용혈물 (단백질 함량 175ug) 및 이들의 혼합물인 페놀옥시데이즈 조성물 (단백질함량비 25ug : 175ug) 각각에 대한 β-1,3-글루칸에 대한 검출능을 측정하고 도 9에 나타내었다. 반응조건은 최종 Ca2+ 농도를 5mM로 하고, β-1,3-글루칸 농도 0.1 ug/ml을 함유하는 용액 10ul를 사용하여 30분동안 4-MC/4-HP 발색 반응을 수행하였다. 부분정제된 플라즈마액과 혈구용혈물의 혼합물이 β-1,3-글루칸이 있을 경우 페놀옥시데이즈 활성을 나타냄을 알 수 있다.
본 발명에 의해 β-1,3-글루칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염 여부를 초기에 진단할 수 있다. 면역기능이 저하된 환자들에게 조기에 β-1,3-글루칸을 세포벽 성분으로 가지는 미생물 감염 여부를 판단하여 적절한 항균제를 투여함에 의해 미생물 감염으로 인한 사망을 줄일 수 있으며, 수산 양식업 등에서 곰팡이 감염에 대해 조기에 조치를 취할 수 있어 피해를 감소시킬 수 있다.
도 1은 갈색거저리의 체액에서 분리한 페놀옥시데이즈 조성물의, 칼슘 이온 및 β-1,3-글루칸 존재하에서의 반응시간에 따른 페놀옥시데이즈 활성 그래프이다.
도 2는 갈색거저리의 체액에서 분리한 페놀옥시데이즈 조성물의 β-1,3-글루칸 농도에 따른 페놀옥시데이즈 활성의 표준곡선이다.
도 3은 갈색거저리의 체액에서 분리한 페놀옥시데이즈 조성물에 대해 β-1,3-글루칸의 0, 20, 200pg/ml 농도에서 프로페옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정한 결과이다.
도 4는 갈색거저리의 체액에서 분리한 페놀옥시데이즈 조성물에 대해 β-1,3-글루칸의 0, 100, 200, 400pg/ml 농도에서 프로페옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정한 결과이다.
도 5은 갈색거저리의 체액에서 분리한 페놀옥시데이즈 조성물의 리포폴리사카라이드에 대한 검출의 특이성을 조사한 그래프이다.
도 6는 갈색거저리의 체액에서 분리한 페놀옥시데이즈 조성물의 펩티도글리칸에 대한 검출의 특이성을 조사한 그래프이다.
도 7는 갈색거저리의 플라즈마, 혈구용혈물, 체액에서 각각 얻은 조성물이 β-1,3-글루칸에 의해 유도되어 페놀옥시데이즈 활성을 나타내는 정도를 비교한 그래프이다.
도 8은 갈색거저리의 부분정제된 플라즈마액의 β-1,3-글루칸의 농도에 따라 나타나는 페놀옥시데이즈 활성을 관찰한 그래프이다.
도 9은 한국산 참검정풍뎅이 유충의 부분정제된 플라즈마액, 혈구용혈물 및 이들의 혼합물의 β-1,3-글루칸에 대한 페놀옥시데이즈 활성을 비교한 그래프이다.
Claims (23)
- 삭제
- 곤충의 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물인 시료를 얻고, 얻어진 시료를 상기 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획 중 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어지는, 칼슘 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 β-1,3-글루칸 검출용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 곤충이 딱정벌레목 곤충인 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 딱정벌레목 곤충이 거저리과 또는 풍뎅이과 곤충인 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 분획이 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어지는 분획인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 컬럼 크로마토그래피가 있는 덱스트란을 원료로 하는 레진 또는 비닐을 원료로 하는 레진으로 충진된 것인 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획에 혈구 용혈물을 추가로 첨가하는 것으로 이루어지는 조성물.
- 삭제
- 곤충의 플라즈마를 상기 플라즈마 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획에 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 혈구 용혈물을 첨가하고, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어지는, 칼슘 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 β-1,3-글루칸 검출용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 곤충이 딱정벌레목 곤충인 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 딱정벌레목 곤충이 거저리과 또는 풍뎅이과 곤충인 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 분획이 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어지는 분획인 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 컬럼 크로마토그래피가 있는 덱스트란을 원료로 하는 레진 또는 비닐을 원료로 하는 레진으로 충진된 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획에 혈구 용혈물을 추가로 첨가하는 것으로 이루어지는 조성물.
- 삭제
- 검체로부터 시료를 채취하고, 곤충의 플라즈마와 혈구 용혈물의 혼합물인 시료를 얻고, 얻어진 시료를 상기 시료 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻은 후 얻어진 분획 중 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어지는, 칼슘 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 β-1,3-글루칸 검출용 조성물과 칼슘을 상기 채취한 시료에 첨가하고, 상기 시료에서의 프로페놀옥시데이즈 활성을 측정하는 것으로 이루어지는, β-1,3-글루칸 검출방법.
- 검체로부터 시료를 채취하고, 곤충의 플라즈마를 상기 플라즈마 및 분리 공정에 존재하는 칼슘이온을 킬레이팅하기에 충분한 킬레이팅제를 함유하는 용매 또는 완충액으로 처리하여 분획을 얻고, 얻어진 분획에 혈구 용혈물 또는 부분 정제된 혈구 용혈물을 첨가하고, 칼슘 이온 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 페놀옥시데이즈 또는 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 분획을 선택하는 것으로 이루어지는, 칼슘 존재하에서 β-1,3-글루칸에 의해 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 나타내는 β-1,3-글루칸 검출용 조성물과 칼슘을 상기 채취한 시료에 첨가하고, 상기 시료에서의 프로페놀옥시데이즈 활성화인자 활성을 측정하는 것으로 이루어지는, β-1,3-글루칸 검출방법.
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