JP2002116209A

JP2002116209A - ペプチドグリカン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカン含有試料の処理剤及び処理方法

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Publication number: JP2002116209A
Application number: JP2000311164A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Asahi; 信雄朝日; Tomoko Tanaka; 知子田中
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2002-04-19

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中の共存物質による測定への影響を抑制
し、高感度且つ高回収率に測定が行えるペプチドグリカ
ン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカン含有試料の処
理剤及び処理方法、並びに該試料中のＰＧ又は／及びβ
Ｇの測定方法の提供。【解決手段】キレート剤を含んで成る、ペプチドグリ
カン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカン含有試料の
処理剤及びこれを用いた該試料の処理方法、並びに該キ
レート剤の存在下に行う、試料中のペプチドグリカン又
は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカンの測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、キレート剤を含ん
で成る、ペプチドグリカン（以下ＰＧと略記する。)又
は（１→３）β−Ｄ−グルカン（以下βＧと略記す
る。）含有試料の処理剤及び処理方法、並びに該試料中
のＰＧ又は／及びβＧの測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＰＧは、Ｎ−アセチルムラミン酸又はＮ
−グリコリルムラミン酸とＤ−アミノ酸を含む糖タンパ
クであり、細菌の細胞壁成分として菌の形状の保持に重
要な働きをしている。また、エンドトキシン（以下、Ｅ
Ｔと略記する。）がグラム陰性菌のみに存在するのに対
して、ＰＧはグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に存在
し、グラム陽性菌では細胞壁の最外殻に分厚い層を、グ
ラム陰性菌では外膜の内側に薄い層を形成している。Ｅ
ＴもＰＧも持っていない古細菌（例えばメタン細菌、高
度好酸性好熱菌等）を除くと、殆どの原核生物がＰＧを
その細胞壁に持っている。一方、哺乳動物等の真核生物
の細胞成分中にはＰＧは存在しないため、ＰＧが存在す
るところには細菌が存在すると考えられる。

【０００３】また、βＧは、酵母やカビの細胞壁の骨格
構成物、多くの担子菌子実体（キノコ）の主要な多糖成
分、血液透析に使用する膜等からの溶出成分等としてそ
の存在が知られている物質である。βＧの生物活性はＥ
Ｔほど明らかではないものの、これを測定することによ
って真菌症の早期診断や真菌による医療用具の汚染の検
出を行うことができると考えられている。

【０００４】従ってＰＧ及びβＧの測定は、これらを細
胞壁の構成成分としている細菌類、藍藻類等の微生物の
微量検出に有用であり、医薬品等の安全性試験、水や食
品等の微生物試験、感染症の診断等への応用が期待され
ている。

【０００５】ＰＧ及びβＧの測定方法としては、昆虫体
液を用いる方法（特公平7ー114707号）等が報告されてい
る。昆虫体液中にはＰＧやβＧにより活性化される酵素
が存在し、試料中のＰＧやβＧによって活性化され、メ
ラニンを生成する（Biochemical and Biophysical Rese
arch Communications Vol.113, No.2, 1983 pp562-56
8）。

【０００６】昆虫体液は、各種細菌由来のＰＧ及びβＧ
に強く反応するが、グラム陰性菌の細胞壁成分であるＥ
Ｔには殆ど反応しない。そこで、この反応を利用すれ
ば、リムルス試薬によるＥＴ検査では検出できなかった
グラム陽性菌感染症を含めた診断を可能とすることが考
えられる。また、ＥＴに反応するリムルス試薬と、ＰＧ
及びβＧに反応する昆虫体液の併用で、試料中の微生物
の種類を予測できる可能性が考えられる。

【０００７】しかしながら、例えば血漿や血清等の体液
中には、昆虫体液の反応に影響を及ぼす、酵素の活性化
阻害因子等の成分が存在する。そこでこれらの試料中の
ＰＧ又は／及びβＧを上記昆虫体液を用いて測定するに
は、該試料を適当な方法で処理して、試料中に含まれる
これらの成分による影響を防止する必要がある。

【０００８】上記目的で、現在主に使用されている処理
方法としては、過塩素酸法（H.タムラら、Throm.Res.,2
7, 51-57, 1982等）、新過塩素酸法（吉田昌男ら、エン
ドトキシン研究の新しい展開, 織田敏次監修, 羊土社,
35, 1986等）等の酸・アルカリ処理、希釈加熱法（M.S.
クーハ゜ーストックら, Lancet, １, 1272, 1985）等による処理
方法が挙げられるが、これらの方法は種々の問題を有し
ており、必ずしも好ましい方法とは言い難い。

【０００９】例えば過塩素酸法は、血漿に過塩素酸を加
え、37℃で20分間加温し、変性物の沈澱を3000 rpm、15
分間遠心して除去した後、その上清に水酸化ナトリウム
を加えて中和し、測定に供する方法である。この処理法
は、操作が煩雑であることや、生じる沈澱中にＰＧやβ
Ｇの一部が取り込まれこれらの回収率が低下する場合が
ある等の問題点が指摘されている。

【００１０】また、新過塩素酸法は、血漿に水酸化ナト
リウムを加え37℃で5分間加温したものに、過塩素酸を
加え37℃で10分間加温した後、生じた沈澱を水酸化ナト
リウムで溶解し、得られた溶液にトリス緩衝液を加えて
pＨを補正して測定に供する方法である。この処理方法
も過塩素酸法同様、操作が煩雑であると言う問題を有し
ている。

【００１１】これに対し、希釈加熱法は、血漿を蒸留水
で10倍に希釈し、100℃10分間加熱後、測定に供すると
いう方法で、操作が簡単であり、最も有効な方法ではあ
る。しかし、血漿へのＰＧ又は／及び又はβＧ添加回収
試験を行った時に、回収率が低い場合が多いという問題
点がある。また、昆虫体液とβＧ又は／及びβＧとの反
応に影響を及ぼさないようにするためには、試料を数百
倍に希釈する必要もあり、ＰＧ又は／及びβＧを高感度
に測定することが困難であるという問題点も有してい
た。

【００１２】上記の方法以外にも、Tween80添加法とい
う処理方法が報告されている（福井博ら、第８回エンド
トキシン臨床研究会記録, 羊土社, 59-66, 1989）。こ
の方法は、血漿を希釈、加熱した後、界面活性剤である
Tween80を終濃度が１％となるように添加し、氷冷下で
超音波処理機で５分間撹拌し測定に供する方法である。
この方法も操作がやや煩雑になる上に、超音波処理機と
いう特殊な装置が必要となるという問題点を有してい
る。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の如き
状況に鑑みなされたもので、簡便な操作により実施可能
で、且つＰＧ又は／及びβＧの回収率が良好で、しかも
ＰＧ又は／及びβＧの測定を高感度に行える、ＰＧ又は
／及びβＧ含有試料（主として血漿、血清等）の処理剤
及びこれを用いる処理方法、並びに該試料中のＰＧ又は
／及びβＧの測定方法を提供することをその目的とす
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明はキレート剤を含
んで成る、ＰＧ又は／及びβＧ含有試料の処理剤の発明
である。また、本発明はキレート剤を含んで成る、ＰＧ
又は／及びβＧ測定に於ける、試料中に含有される他成
分による影響回避剤の発明である。更に、本発明はＰＧ
又は／及びβＧ含有試料にキレート剤を共存させること
を特徴とする、該試料の処理方法の発明である。更にま
た本発明は、キレート剤の存在下に行う、試料中のＰＧ
又は／及びβＧの測定方法の発明である。また、本発明
は、キレート剤の存在下に、試料を、昆虫体液由来のＰ
Ｇ又は／及びβＧ測定用試薬（以下、昆虫体液由来試薬
と略記する。）と反応させることを特徴とする、試料中
に存在するＰＧ又は／及びβＧの測定方法の発明であ
る。

【００１５】即ち、本発明者らは、ＰＧ又は／及びβＧ
測定に影響を及ぼす成分（以下、測定阻害因子と略記す
る場合がある。）を含む血漿や血清等の試料中のＰＧ又
は／及びβＧを測定する際に有効で、上記成分による影
響を除去し得、且つ簡便な操作により実施可能で、更に
ＰＧ又は／及びβＧの回収率の良好な該試料の処理方法
を開発すべく鋭意研究の途上、試料中に予め試料中にキ
レート剤を存在させることにより、従来法と同等若しく
はそれ以上に試料中のＰＧ又は／及びβＧの回収率が向
上すること、更には、該方法によれば、単に緩衝剤溶液
のみで希釈加熱処理した場合には測定時に非特異的な濁
りの生ずる検体についても、非特異的な濁りが生じなく
なること等を見出し、本発明を完成するに到った。

【００１６】本発明に於いて用いられるキレート剤は、
本発明の方法により処理した試料を用いて、昆虫体液由
来試薬と、ＰＧ又は／及びβＧとを反応させる際に、当
該反応を阻害又は促進する性質を有さないものであっ
て、該反応時に非特異的な濁りを生じさせることのない
ものであれば特に限定されないが、その金属配位原子が
硫黄原子、窒素原子又は酸素原子であるもの、中でも窒
素原子又は酸素原子であるものが好ましい。

【００１７】具体的には、例えば下記一般式［Ｉ］

【００１８】

【化７】

【００１９】［式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₄及びＲ₅は夫々独立
して水素原子又は、水酸基，カルボキシル基若しくはホ
スホン酸基を置換基として有するアルキル基（但し、Ｒ
₁とＲ₂が共に水素原子である場合を除く。）を表し、Ｒ
₃はカルボキシル基又は

【００２０】

【化８】

【００２１】〔但し、Ｒ₆及びＲ₇は夫々独立して水素原
子、又はカルボキシル基若しくはホスホン酸基を置換基
として有するアルキル基を表す。〕を表す。ｍは１〜３
の整数を示す。ｎは０又は１を示す。］で表される化合
物が好ましい。式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ4〜Ｒ7に於ける、カ
ルボキシル基若しくはホスホン酸基を置換基として有す
るアルキル基のアルキル基としては、直鎖状、分枝状、
環状のいずれでもよいが、炭素数が１〜６の低級アルキ
ル基が好ましい。具体的には、例えばメチル基、エチル
基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソ
ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチ
ル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、n-ヘキシル
基, イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル
基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ
る。これらの中でも炭素数１〜６の直鎖状の低級アルキ
ル基が好ましく、特にメチル基、エチル基が好ましい。

【００２２】Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₄〜Ｒ₇に於ける、アルキル基
の置換基であるカルボキシル基若しくはホスホン酸基は
当該アルキル基の末端（ω-位）に置換している場合が
好ましく、その置換基の数は、アルキル基一個当たり、
１〜２、より好ましくは１である。又、上記のような置
換基を有するアルキル基の総数は上記一般式［Ｉ］で示
される化合物一分子当たり通常２〜６である。

【００２３】一般式［Ｉ］で表されるキレート剤の具体
例としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、
エチレンジアミン二プロピオン酸（EDDP）、エチレンジ
アミン二酢酸（EDDA）、ニトリロ三プロピオン酸（NT
P）、エチレンジアミン-N,N-ビス(メチレンホスホン酸)
（EDDPO)、エチレンジアミンテトラキス(メチレンホス
ホン)酸（EDTPO）、N、N-ビス（2-ヒドロキシエチル）グ
リシン（DHEG）、トリエチレンテトラミン六酢酸（TTH
A）等が挙げられる。その中でもEDDP、EDDA、NTP、TTHA
が好ましく、特にEDDP、EDDA、TTHAが好ましい。

【００２４】また、一般式［Ｉ］で示されるキレート剤
以外のキレート剤として、8-キノリノール又はベンゾイ
ルアセトン等も、本発明に使用可能である。これらのキ
レート剤は単独で用いても、適宜組み合わせて用いても
何れにてもよい。

【００２５】本発明に係るＰＧ又は／及びβＧ含有試料
の処理方法を実施するには、例えば以下の如く行えばよ
い。即ち、本発明に係るキレート剤を所定濃度となるよ
うに、ＰＧ又は／及びβＧ含有試料中に共存させればよ
い。

【００２６】ＰＧ又は／及びβＧを含む試料中にキレー
ト剤を共存させる方法としては、例えば以下の方法が挙
げられる。

【００２７】１)該キレート剤を試料に適当量添加、溶
解する方法。２）該キレート剤を含む溶液を試料に適当量添加する方
法（試料を適宜希釈する方法。）３）該キレート剤を含む溶液で試料の凍結乾燥品を溶解
する方法。

【００２８】上記方法に於いて用いられるキレート剤の
使用濃度としては、キレート剤の種類や、処理する試料
により異なり、試料中のＰＧ又は／及びβＧの測定に影
響を及ぼす他成分の影響を防止し得る濃度であって、昆
虫体液由来試薬とＰＧ又は／及びβＧとの反応を阻害も
促進もしない濃度であれば、特に限定されない。通常
は、試料を処理する際の溶液中の濃度として、0.01〜10
0mM、好ましくは0.1〜20mM、更に好ましくは0.2〜10mM
の範囲から適宜選択して用いられる。

【００２９】これらキレート剤は、夫々単独で用いても
充分に効果があるが、適宜２種以上組み合わせて用いて
も良い。

【００３０】上記方法に於いて用いられるキレート剤
は、当然のことながらＰＧ及びβＧの測定に影響を与え
る量のＰＧやβＧを含んでいてはならない。そのために
は、ＰＧ及びβＧの含有量の少ないものを選択するか、
或は、これらを含んだものを使用する場合は、予めフィ
ルターなどを通しＰＧ及びβＧを除去する必要がある。

【００３１】この場合に使用可能なフィルターとして
は、例えばゼータポア膜（キュノ(株)社商品名）、ウル
チポア（日本ポール社商品名）、ベイオダイン（日本ポ
ール社商品名）等のナイロン６６製フィルター、例えば
ＰＴＦＥ膜（日東電工(株)製）等のポリテトラフルオロ
エチレンフィルター等が挙げられる。また、これらフィ
ルターのポアサイズとしては特に限定されないが、例え
ば0.2〜0.65μmのものが挙げられる。

【００３２】ＰＧ及びβＧの除去をゼータポア膜等に通
すことにより行うのであれば、例えば上記した如きキレ
ート剤を適当な濃度の溶液とした後、ゼータポア膜を支
持体にセットし、濾過すればよい。尚、キレート剤溶液
としては、目的濃度の溶液とした後に上記の条件で濾過
処理したものでもよい。

【００３３】また、上記２）の方法による場合、キレー
ト剤溶液による試料の希釈倍率としては、特に限定され
ないが、その後更に加熱処理する場合であって、試料が
血漿等の場合には、希釈倍率が低すぎると、血漿蛋白質
の変性等で試料を希釈した液の粘性が上がったり、該液
中に沈殿が生じる等の問題が生じたり、希釈倍率が高す
ぎるとＰＧ又は／及びβＧを適切に検出し得なくなる等
の問題が生じる場合があるので、通常２〜400倍、好ま
しくは40〜100倍程度である。

【００３４】本発明に於いて、本発明に係るキレート剤
を含有させる溶液としては、昆虫体液由来試薬と、ＰＧ
及びβＧとの反応を阻害も促進もしないものであれば特
に限定されず、例えば蒸留水、緩衝液等が挙げられる。
緩衝液を構成する緩衝剤としては、通常この分野で用い
られるものは全て使用可能であり、具体的には、例えば
リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス緩衝剤、グッドの
緩衝剤等が挙げられ、その使用濃度は、通常この分野に
於ける使用濃度範囲から適宜選択すればよい。

【００３５】尚、本発明の処理方法により一旦処理を行
った試料についてＰＧ又は／及びβＧの測定を行う場合
には、昆虫体液由来試薬と試料との反応時のキレート剤
の濃度が上記した如き濃度よりも低くなっていても何ら
差し支えない。

【００３６】本発明の処理方法に於いて、加熱可能な試
料について行う場合は、加熱処理を併用することにより
更に効果的にＰＧ又は／及びβＧ測定時への影響を抑制
することができる。特に、血漿や血清等のように測定阻
害因子等を含む試料中のβＧ又は／及びＰＧを、昆虫体
液由来試薬を用いて測定する場合、測定阻害因子等によ
る影響を除去するための処理方法として加熱処理を併用
することが望ましい。加熱処理は、キレート剤を共存
（添加）させながら行うよりも、キレート剤を共存させ
た後に行う方が、効果が高い場合が多いので望ましい。
キレート剤の濃度は、加熱処理時に上記した如き濃度範
囲になっていればよい。尚、加熱処理に於ける加熱温度
としては、特に限定されないが、通常60〜220℃、好ま
しくは70〜100℃程度であり、加熱時間としては、特に
限定されないが、通常３〜60分間、好ましくは５〜15分
間程度である。また、加熱方法としては、上記した如き
加熱条件で試料の加熱を行える方法であればどのような
方法でもよいが、例えばインキュベーターによる加熱方
法、オートクレーブによる加熱方法等が好ましい。

【００３７】本発明の処理方法によれば、希釈倍率をお
さえながら加熱処理を行うことができ、また試料中の測
定阻害因子等の影響を完全に除くことができるので、本
発明の抑制方法は極めて有効且つ経済的な方法である。

【００３８】本発明の処理方法により処理した試料中の
βＧ又は／及びＰＧ量を測定する場合に用いられる試薬
としては、例えば以下のようなものが挙げられる。即
ち、先ず、βＧ又は／及びＰＧを測定するための試薬と
しては、例えば昆虫の体液成分から調製されたβＧ又は
／及びＰＧと特異的に反応する試薬が挙げられる。

【００３９】βＧを測定するための試薬としては、例え
ば昆虫の体液成分から調製されたβＧと特異的に反応す
る試薬や、例えばリムルス属（Limulus），タキプレウ
ス属（Tachypleus），或いはカルシノスコルピウス属
（Carcinoscorpius）に属するカブトガニの血球成分を
含みβＧとは反応するがエンドトキシンとは反応しない
性質を有する試薬が挙げられる。尚、これら試薬は、目
視にてβＧの存在を確認できる試薬（例えば合成基質を
用いる試薬等）でも良い。これら試薬は市販されている
ものを適宜使用してもよいし、また公知の方法（特開昭
63-141598号）により自製したものを使用してもよい。

【００４０】ＰＧを測定するための試薬としては、例え
ば昆虫の体液成分から調製されたＰＧに対して特異的な
試薬等が挙げられ、市販されているものを適宜使用して
もよいし、また公知の方法（特開昭63-141599号）によ
り自製したものを使用してもよい。

【００４１】昆虫体液（ヘモリンパ、hemolymphとも言
う。）の得られる昆虫としては、特に制限はないが、な
るべく大型のもので飼育方法の確立しているものが望ま
しく、例えば、タバコスズメガ，ハチミツガ，セクロピ
ア蚕，カイコガ（Bombyx mori）等の、鱗翅類、センチ
ニクバエ，イエバエ等の双翅類、トノサマバッタ，エン
マコオロギ等の直翅類、センノキカミキリ等の甲虫類等
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。入
手の容易さからいうと、例えば、錦秋鐘和等のカイコ
ガ，クワゴ，オオクワゴモドキ，カギバモドキ等のカイ
コガ科の昆虫が挙げられる。また、昆虫体液を得るに
は、成虫を用いても幼虫を用いても良いが、体液の採取
の容易さからすれば、幼虫が望ましい。尚、カイコガの
一種である錦秋鐘和の幼虫として、は５周令の幼虫（Si
lkworm）が好ましい。

【００４２】上記した如き昆虫から体液を得る方法とし
ては、例えば、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウ
キビ因子（サトウキビに含まれるグルコース，アミノ酸
などからなる高分子物質）を不純物として含むショ糖、
トウキビ因子そのもの、或いは例えば(p−アミジノフェ
ニル)メタンスルホニルフルオリド（p−APMSF）、フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ジイソ
プロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、p−ニトロフェニ
ル p'−グアニジノベンゾエート（ＮＰＧＢ）、ジヒド
ロキシクロロメチルクマリン（ＤＣＣ）等のセリンプロ
テアーゼインヒビター等を含む生理食塩水を体腔に注射
し、その後しばらく放置して、体腔より昆虫体液を集め
る方法、上記した如きセリンプロテアーゼインヒビター
等を含む昆虫体液と等張な溶液に昆虫体液を添加して採
取する方法（Ashida,M.,Insect Biochem., 11, 57-65,
1981、特開平1-14266号公報）等が挙げられる。このよ
うにして得られた昆虫体液は、通常遠心分離処理して血
球を除き、その後透析して用いられる。尚、要すれば適
当なカラムクロマトグラフィーにより更に精製して用い
てもよい。また、昆虫体液由来試薬は市販されているも
の（例えば、ＳＬＰ^TM試薬セット、和光純薬工業(株)
製）を使用しても良い。

【００４３】また、これから、βＧ測定用試薬を得よう
とする場合には、上記昆虫体液中より、ＰＧと反応して
酵素活性を発現する（或は発現を誘引する）物質を除去
すれば、これをβＧと特異的に反応する試薬とすること
ができる。また、ＰＧ測定用試薬を得ようとする場合に
は、上記昆虫体液中よりβＧと反応して酵素活性を発現
する（或は発現を誘引する）物質を除去すれば、これを
ＰＧと特異的に反応する試薬とすることができる。上記
血漿中からＰＧと反応して酵素活性を発現する（或は発
現を誘引する）物質又はβＧと反応して酵素活性を発現
する（或は発現を誘引する）物質を除去する方法として
は、一般に生化学の分野で用いられている分離精製法が
いずれも挙げられるが、ＰＧと反応して酵素活性を発現
する（或は発現を誘引する）物質を除去する場合にはＰ
Ｇを結合させた担体を、また、βＧと反応して酵素活性
を発現する（或は発現を誘引する）物質を除去する場合
にはβＧを結合させた担体を用いるアフィニティークロ
マトグラフィーにより極めて容易に且つ効率よく行うこ
とができる。

【００４４】尚、昆虫体液由来試薬は、通常これにβＧ
やＰＧと反応した結果活性化される酵素の基質であって
該酵素の作用により適当な色素等（蛍光性、発光性のも
のでも可。）を生じる物質（所謂合成基質を含む。）等
を添加して使用される。

【００４５】これら自体公知の測定法に於いて用いられ
るその他の試薬類としては、例えば３，４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン（ドーパ），合成基質等の測定する
酵素の基質、共役酵素、補酵素等、要すれば、発色剤、
賦活剤、安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性
の測定法として自体公知の方法に於いて使用される試薬
類が挙げられる。

【００４６】本発明の測定方法に於ける反応ｐＨとして
は、測定する酵素の種類等によって異なるが、通常ｐＨ
４〜11、好ましくはｐＨ６〜９である。また、この反応
ｐＨを維持するために緩衝剤を使用しても良く、緩衝剤
としては反応に影響を与えないものであれば、種類，使
用濃度ともに特に制限されず、例えばリン酸塩，ホウ酸
塩，酢酸塩，トリス緩衝剤，グッドの緩衝剤等が挙げら
れる。

【００４７】また、反応温度及び反応時間については、
反応が進行する温度，時間であれば特に制限されず、反
応温度としては、通常０〜50℃、好ましくは４〜30℃、
反応時間としては、通常１秒〜20時間、好ましくは10分
〜４時間の範囲から適宜選択される。

【００４８】また、本測定に於いては、0.001〜1000m
M、好ましくは１〜100mMの範囲内の２価の金属イオンＣ
ａ²⁺が存在していることが望ましい。

【００４９】本発明に係るＰＧ又は／及びβＧ測定方法
は、本発明に係るキレート剤を上記した如き濃度範囲で
存在させた試料、即ち本発明の処理剤で処理した試料を
用いる以外は、自体公知のＰＧ又は／及びβＧ測定法に
準じて実施すれば良く、使用するその他の試薬類もこれ
ら自体公知の測定法に準じて適宜選択すればよい。

【００５０】自体公知のＰＧ又は／及びβＧ測定法とし
ては、例えば試料と、昆虫体液由来試薬とを混合・反応
させ、一定時間後の反応液中の例えばＮ−α−ベンゾイ
ル−Ｌ−アルギニンエチルエステル分解酵素（BAEEas
e）、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素（ＰＰＡ
Ｅ）、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）等の酵素の活性
を自体公知の測定法に従って測定し、予め濃度既知のＰ
Ｇの標準液を用いて同様の操作により作製した検量線か
らＰＧ又は／及びβＧの量を算出する方法（M.Tsuchiya
et al.FEMS Immunology and Medical Microbiology,15
(1996)129-134、特開平7-184690号公報等）、ｐｒｏＰ
Ｏが活性化されてＰＯとなる時間が試料中のＰＧ又は／
及びβＧ濃度に依存する現象を利用して、ＰＰＯ試薬と
試料とを混合した後、ＰＯによる反応生成物の量がある
一定値となるまでの時間を測定する方法（M.Tsuchiya e
t al.FEMS Immunology and Medical Microbiology, 15
(1996) 129-134等）等が挙げられる。

【００５１】通常良く用いられる手法としては、例えば
試料と上記した如き昆虫由来の試薬の適当量とを混合し
て一定時間反応させた後、反応液の色調の変化の程度を
目視にて判定し、それに基づいて溶出液中のβＧ又は／
及びＰＧ量を半定量する目視判定法や、例えばトキシノ
メーターＭＴ−３５８（和光純薬工業(株)製）、トキシ
ノメーターＥＴ−２０１（和光純薬工業(株)製）、トキ
シノメーターＥＴ−２５１（和光純薬工業(株)製）、ト
キシノメーターＥＴ−３０１（和光純薬工業(株)製）、
ＬＡＬ−５０００［ＡＣＣ(Associates of Cape Cod)社
製］、マイクロプレートリーダーＴmax（モレキュラー
デバイス社製）等の専用装置を用い、試料と上記した如
き昆虫体液由来試薬の適当量とを混合して反応を開始さ
せ、その反応の結果生じる色素量を吸光度変化として
とらえ、吸光度が予め設定した閾値に達するための時間
を活性化時間として求めるか、その反応の結果生じる
色素量を透過光量の変化としてとらえ、透過光量が予め
設定した閾値に減少するまでの時間をゲル化時間として
求めるかし、当該活性化時間又はゲル化時間を指標に溶
出液中のβＧ又は／及びＰＧ量を定量する方法、或は昆
虫体液由来試薬が活性化したときに現れるプロテアーゼ
活性を合成基質を用いて測定する合成基質法等の昆虫体
液由来試薬を用いた常法等がある。

【００５２】装置を用いて測定を行うには、例えば以下
の如き操作で行えばよい。即ち、本発明の処理剤で処理
した試料と、昆虫体液由来試薬とを混合し、一定の反応
条件で反応（例えば、０〜50℃、好ましくは４〜30℃
で、１秒〜20時間、好ましくは10分〜４時間）させ、例
えば市販のマイクロプレートリーダーThermo-Max（Mole
cular Devices社製）、トキシノメーター（和光純薬工
業(株)製）等を用いて該反応液の吸光度が予め設定した
閾値に達するまでの反応時間を測定する。得られた反応
時間の測定値と、予め既知濃度のＰＧ又はβＧを含有す
る試料を用いて同様に行って得られた、ＰＧ又は／及び
βＧ濃度と反応時間との関係を示す検量線から、試料中
のＰＧ又は／及びβＧ含有量を算出することができる。

【００５３】本発明の測定方法により測定可能な試料と
しては、試料中の微生物の有無を検出する必要があるも
のであれば特に限定されないが、例えば血漿，血清，髄
液，腹水，随液等の体液、尿等が挙げられる。中でも、
本発明は、試料中に含まれるＰＧ又は／及びβＧ以外の
共存物質が測定に影響を与え易い血漿及び血清の測定に
於いて、特に有効である。

【００５４】本発明に係るキレート剤を含んで成る、Ｐ
Ｇ又は／及びβＧ含有試料の処理剤は、上記した如き本
発明に係る１種以上のキレート剤を含有するものであ
る。

【００５５】該処理剤は、溶液又は凍結乾燥品としても
よい。溶液の場合、キレート剤の濃度としては、キレー
ト剤の種類や、処理する試料により異なり、試料の加熱
処理による影響を防止し得る濃度であって、ＰＧ又は／
及びβＧと、昆虫体液由来試薬との反応を促進も阻害も
しない濃度であれば特に限定されない。通常は0.01〜10
0mM、好ましくは0.1〜20mM、更に好ましくは0.2〜10mM
の範囲から適宜選択して用いられる。

【００５６】また、該処理剤中には、例えば燐酸緩衝
剤，グッド緩衝剤（Good's Buffers）等の緩衝剤、反応
促進剤、安定化剤、防腐剤、その他この分野で用いられ
ているものは、共存する試薬等の安定性を阻害したり、
ＰＧ又は／及びβＧの測定を阻害又は促進しないもので
あれば目的の測定に於いて通常使用されるものを含有し
ていても良。またその濃度も、通常この分野で通常用い
られる濃度範囲で用いられればよい。

【００５７】該処理剤を、ＰＧ及びβＧの測定に影響を
与える量のＰＧやβＧを除去するために、前記した如き
ゼータポア膜等の処理を前記した如き条件で行ってもよ
い。

【００５８】本発明に係るキレート剤を含んで成る、Ｐ
Ｇ又は／及びβＧ測定に於ける試料中に含有する他成分
の影響回避剤は、上記した如き本発明に係る１種以上の
キレート剤を含有するものである。

【００５９】本発明に係る試料としては、例えば血漿、
血清、尿、リンパ、髄液、胸水、腹水等が挙げられるが
これらに限定されない。中でも、血漿及び血清は、ＰＧ
又は／及びβＧ測定時に共存物質の及ぼす影響が大きい
ため、本願発明に於いて特に有効である。

【００６０】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。

【００６１】

〔試薬〕

（１）ＰＧ標準液スタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aure
us）の乾燥菌体１gを、シュレイファーらの方法（Schle
ifer,K.H., and Kandler,O., Bacteriol.Rev.,36, 407-
477 (1972)）に準じて処理し、トリプシン処理細胞壁
（ＰＧ） 95mgを得た。この20mgを注射用水［大塚製薬
(株)製、ＳＬＰ試薬セット(和光純薬工業(株)製)により
ＰＧ又は／及びβＧが検出されないことを確認済み］20
mlに加え、プロテアーゼ処理により可溶化したものをＰ
Ｇ標準液とした。尚、これを使用するにあたっては、必
要に応じて注射用水［大塚製薬(株)製、ＳＬＰ試薬セッ
ト(和光純薬工業(株)製)によりＰＧ及びβＧが検出され
ないことを確認済み］で適宜希釈して用いた（ＰＧ溶
液）。 (２)ＰＧ又は／及びβＧ測定用試薬ＳＬＰ試薬は、無菌的に採取したカイコ体液を遠心分離
したカイコプラズマにCaCl₂、DOPAなどを添加し0.1mlず
つ凍結乾燥したものを用いた。 (３)Bis-Tris溶液１M Bis-Tris溶液（(株)同仁化学研究所製）を蒸留水に
て作製し、これをゼータポア膜（キュノ(株)社製）で濾
過した。尚、これを使用するに当たっては、必要に応じ
て適宜蒸留水で希釈し、ＳＬＰ試薬によりＰＧ及びβＧ
が検出されないことを確認した後に使用した。 (４)ＥＤＤＰ溶液ＥＤＤＰ（(株)同仁化学研究所製）を蒸留水に溶解し、
ゼータポア膜濾過を行った後、Bis-Tris溶液と混合し、
更に蒸留水で希釈して所定濃度のＥＤＤＰ溶液とした
（20mM Bis-Tris含有）。尚、ＳＬＰ試薬によりＰＧ及
びβＧが検出されないことを確認した後に使用した。 (５)蒸留水ＳＬＰ試薬によりＰＧ及びβＧが検出されないことを確
認した自製の蒸留水を使用した。

【００６２】〔操作〕（１）試料の前処理予め乾熱滅菌処理（250℃、２時間）したガラス製試験
管に、20mM Bis-Tris溶液（ＥＤＤＰ無添加）又はＥＤ
ＤＰ溶液１mlを分注し、ヘパリン処理した正常ヒト血漿
（ＰＧ及びβＧは含有していない）所定量を加え、血漿
を40倍希釈、又は100倍希釈したものを試料とした（試
料中のＥＤＤＰの終濃度は１mM）。該試料を90℃で10分
間加熱処理した後、直ちに氷冷して、前処理済試料とし
た。（２）ＰＧ濃度の測定前処理済試料試料900μｌに、試料中のＰＧの終濃度が
表１記載の濃度となるように、適宜希釈したＰＧ溶液 1
00μl、又は蒸留水100μlを加えたものを測定用試料と
し、この試料中のＰＧ濃度の測定を、トキシノメーター
MT-358（和光純薬工業(株)）を用いて行った。測定操作
は常法に従って以下のように行った。ＰＧ又は／及びβ
Ｇ測定用試薬（凍結乾燥品）に測定用試料を0.2ml加
え、撹拌後、30℃保温下に、該混合液の透過光量が８％
減少するまでの時間（判定時間）を測定した。

【００６３】〔結果〕血漿を40倍希釈して得られた試料
を用いた場合の結果を表１に示す。表１

【００６４】表１の結果から明らかな如く、ＰＧ濃度の
判定時間は、血漿をＥＤＤＰ溶液で希釈することにより
短縮し、検出感度が高くなることが判る。例えば、ＥＤ
ＤＰ無添加の20mM Bis-Tris溶液で40倍希釈した場合
は、１pg/mlのＰＧを含有する測定用試料については、2
00分以内にはＰＧ濃度を測定することができなかった
が、ＥＤＤＰ溶液で希釈した場合は、144分で測定する
ことができた。また、血漿を100倍希釈して得られた試
料を用いた場合の結果を表２に示す。

【００６５】表２

【００６６】表２の結果から、40倍希釈試料の場合と同
様に、100倍希釈試料についても、ＥＤＤＰ溶液で希釈
することにより、ＥＤＤＰ無添加の20mM Bis-Tris緩衝
液で希釈した場合よりも判定時間が短縮し、検出感度が
高くなることが判る。

【００６７】実施例２．〔試薬〕ＰＧ標準液、ＰＧ溶液、ＰＧ又は／及びβＧ測
定用試薬、Bis-Tris溶液、ＥＤＤＰ溶液及び蒸留水は、
実施例１で用いたものと同じものを使用した。〔操作〕（１）試料の前処理予め乾熱滅菌処理（250℃、２時間）したガラス製試験
管に、20mM Bis-Tris溶液（ＥＤＤＰ無添加）又はＥＤ
ＤＰ溶液１mlを分注し、ヘパリン処理した正常ヒト血漿
（ＰＧ及びβＧは含有していない）所定量を加え、血漿
を100倍希釈したものを試料とした（試料中のＥＤＤＰ
の終濃度は0〜2.0mM)。該試料を90℃で10分間加熱処理
した後、直ちに氷冷して、前処理済試料とした。（２）ＰＧ濃度の測定前処理済試料900μｌに、試料中のＰＧの濃度が10pg/ml
となるように、適宜希釈したＰＧ溶液を100μl加えたも
のを測定用試料（血漿由来の測定用試料）とし、この試
料中のＰＧ濃度の測定を、トキシノメーターMT-358（和
光純薬工業(株)）を用いて、実施例１と同様の操作で行
った。また、対照として正常ヒト血漿の代わりに蒸留水
を用いた以外は同様にして調製した測定用試料（蒸留水
由来の測定用試料）について同様の測定を行った。別
に、注射用水とＰＧ標準液を用いて同様の測定を行い、
ＰＧ濃度と判定時間との関係を表す検量線を作成した。

【００６８】〔結果〕図１に、蒸留水由来の測定用試料
を用いてＰＧ濃度測定を行った場合（−○−）、及び血
漿由来の測定用試料を用いてＰＧ濃度測定を行った場合
（--●--）の結果を夫々示す。図１の結果から明らかな
如く、蒸留水由来の測定用試料を用いた場合は、ＥＤＤ
Ｐの濃度に関係なく、判定時間は一定であった。これに
対し、血漿由来の測定用試料を用いた場合、ＥＤＤＰ無
添加のものについての判定時間は蒸留水由来の測定用試
料を用いた場合よりも長くなり（約90分）、ＰＧ濃度の
測定が、血漿中の共存物質の影響を受けることが判る。
そして、ＥＤＤＰ溶液で血漿を希釈した場合には、判定
時間は約70分程度に短縮され、血漿中の共存物質の影響
が抑制されたことが判る。

【００６９】次に、図１の血漿由来の測定用試料を用い
て測定を行って得られた判定時間と、作成した検量線か
らＰＧ濃度を算出し、添加したＰＧ10pg/mlに対する回
収率を計算した。結果を図２に示す。図２の結果から明
らかな如く、ＥＤＤＰ無添加の20mM Bis-Tris溶液で希
釈加熱処理を行った場合、ＰＧの回収率は３０％程度で
あったが、血漿を希釈加熱処理する際に１mM以上のＥＤ
ＤＰを含有させることにより、回収率は約７０〜８０％
に増大した。

【００７０】実施例３．〔試薬〕ＰＧ標準液、ＰＧ溶液、ＰＧ又は／及びβＧ測
定用試薬、Bis-Tris溶液、ＥＤＤＰ溶液及び蒸留水は、
実施例１で用いたものと同じものを使用した。〔操作〕（１）試料の前処理予め乾熱滅菌処理（250℃、２時間）したガラス製試験
管に、20mM Bis-Tris溶液（ＥＤＤＰ無添加）又はＥＤ
ＤＰ溶液１mlを分注し、ヘパリン処理した正常ヒト血漿
（ＰＧ及びβＧは含有していない）所定量を加え、血漿
を10〜300倍希釈したものを試料とした（試料中のＥＤ
ＤＰの終濃度は１mM）。該試料を90℃で10分間加熱処理
した後、直ちに氷冷して、前処理済試料とした。（２）ＰＧ濃度の測定前処理済試料900μｌに、試料中のＰＧの濃度が10pg/ml
となるように、適宜希釈したＰＧ溶液を100μl加えたも
のを測定用試料とし、この試料中のＰＧ濃度の測定を、
トキシノメーターMT-358（和光純薬工業(株)）を用い
て、実施例１と同様の操作で行った。また、実施例２と
同様の方法で判定時間とＰＧ濃度との関係を表す検量線
を作成し、上記測定で得られた判定時間と作成した検量
線からＰＧ濃度を算出し、添加したＰＧ10pg/mlに対す
る回収率を計算した。

【００７１】〔結果〕図３に、ＥＤＤＰ無添加の20mM B
is-Tris溶液で希釈加熱処理した測定用試料を用いてＰ
Ｇ濃度測定を行った場合（−○−）、ＥＤＤＰ溶液で希
釈加熱処理した測定用試料を用いてＰＧ濃度測定を行っ
た場合（--●--）のＰＧの回収率を夫々示す。図３より
明らかな如く、ＥＤＤＰ無添加の20mM Bis-Tris溶液で1
00倍に希釈した場合、ＰＧの回収率は約35％であった
が、ＥＤＤＰ溶液で希釈した場合には、100倍希釈した
場合であっても、65％という高い回収率が得られた。

【００７２】また、前処理済試料に100pg/mlとなるよう
にＰＧ溶液を添加したものを測定用試料とした以外は、
上記と同様に測定を行った場合の結果を、図４に示す。
図４に於いて、−○−はＥＤＤＰ無添加の測定用試料を
用いてＰＧ濃度測定を行った場合、--●--はＥＤＤＰを
含有する測定用試料を用いてＰＧ濃度測定を行った場合
のＰＧの回収率を夫々示す。図４から明らかな如く、Ｅ
ＤＤＰ無添加の20mM Bis-Tris溶液で血漿を100倍希釈し
た場合、ＰＧの回収率は57％程度、200倍以上の希釈で8
0%程度の回収率でほぼ一定となったが、ＥＤＤＰ溶液で
希釈した場合には、100倍希釈でも80％以上の回収率が
得られた。

【００７３】実施例４〔試薬〕（１）ＰＧ標準液ミクロコッカスルテウス（Micrococcus luteus）由来
のＰＧ（和光純薬工業(株)製）20mgを注射用水［大塚製
薬(株)製、ＳＬＰ試薬セット(和光純薬工業(株)製)によ
りＰＧ及びβＧが検出されないことを確認済み］20mlに
加え、超音波処理により分散させたものをＰＧ標準液と
した。尚、これを使用するにあたっては、必要に応じて
注射用水［大塚製薬(株)製、ＳＬＰ試薬セット(和光純
薬工業(株)製)によりＰＧ及びβＧが検出されないこと
を確認済み］で適宜希釈して用いた（ＰＧ溶液）。（２）ＰＧ又は／及びβＧ測定用試薬、Bis-Tris溶液及
び蒸留水は実施例１で用いたものと同じものを使用し
た。 (３)キレート剤溶液ＥＤＴＡ又はＥＤＤＰ（(株)同仁化学研究所製）を所定
濃度となるように蒸留水に溶解したもの、並びにベンゾ
イルアセトン又は８−キノリノール（和光純薬工業(株)
製）をジメチルホルムアミドに溶解したものを、夫々所
定のキレート剤濃度となるようにBis-Tris溶液と混合
し、次いでゼータポア膜濾過を行ったものをキレート剤
溶液とした（20mM Bis-Tris含有）。尚、ＳＬＰ試薬に
よりＰＧ及びβＧが検出されないことを確認した後に使
用した。

【００７４】〔操作〕（１）試料の前処理 20mM Bis-Tris溶液（キレート剤無添加のもの）又は上
記のキレート剤溶液を用いて、実施例１と同様の方法で
ヘパリン処理した正常ヒト血漿（ＰＧ及びβＧは含有し
ていない）試料を40倍希釈後、加熱処理し、前処理済試
料を得た。尚、キレート剤溶液は、試料中のキレート剤
の終濃度が１mMになるものを用いた。（２）ＰＧ濃度の測定前処理済試料900μlに、試料中のＰＧの終濃度が１ng/m
l又は100pg/mlとなるように、適宜希釈したＰＧ溶液100
μlを加えたものを測定用試料（血漿由来の測定用試
料）とし、この試料中のＰＧ濃度の測定を、トキシノメ
ーターMT-358（和光純薬工業(株)）を用いて、実施例１
と同様の操作で行った。また、対照として正常ヒト血漿
の代わりに蒸留水を用いた以外は同様にして調製した測
定用試料（蒸留水由来の測定用試料）を用いて同様の測
定を行った（標準）。別に、実施例２と同様の方法で判
定時間とＰＧ濃度との関係を表す検量線を作成し、血漿
由来の測定用試料を用いて測定を行って得られた判定時
間と、作成した検量線からＰＧ濃度を算出し、添加した
ＰＧ濃度に対する回収率を計算した。

【００７５】〔結果〕上記測定で得られた、判定時間と
回収率を表３に併せて示す。表３

【００７６】表３の結果から明らかな如く、血漿をキレ
ート剤無添加の20mM Bis−Tris溶液で希釈した場合と比
較して、本発明に係るキレート剤溶液で希釈することに
より、回収率が高くなっていることが判る。

【００７７】実施例５〔試薬〕（１）ＰＧ標準液、ＰＧ溶液、ＰＧ又は／及びβＧ測定
用試薬、Bis-Tris溶液及び蒸留水は実施例１で用いたも
のと同じものを使用した。 (２)キレート剤溶液ＥＤＤＰ、ＥＤＤＡ及びＤＨＥＧ（全て(株)同仁化学研
究所製）を、夫々所定の濃度となるようにBis-Tris溶液
に溶解し、ゼータポア膜濾過を行った後、適宜蒸留水で
希釈したものをキレート剤溶液とした（20mM Bis-Tris
含有）。尚、ＳＬＰ試薬によりＰＧ及びβＧが検出され
ないことを確認した後に使用した。〔操作〕（１）試料の前処理 20mM Bis-Tris溶液（キレート剤無添加)又は上記のキレ
ート剤溶液を用いて、実施例１と同様の方法で、ヘパリ
ン処理した正常ヒト血漿（ＰＧ及びβＧは含有していな
い）を100倍希釈後、加熱処理し、前処理済試料を得
た。尚、キレート剤溶液は、試料中のキレート剤の終濃
度が１mMになるものを用いた。（２）ＰＧ濃度の測定前処理済試料900μｌに、試料中のＰＧの終濃度が100pg
/ml又は10pg/mlとなるように、適宜希釈したＰＧ溶液を
100μl加えたものを測定用試料（血漿由来の測定用試
料）とし、この試料中のＰＧ濃度の測定を、トキシノメ
ーターMT-358（和光純薬工業(株)）を用いて、実施例１
と同様の操作で行った。また、対照として正常ヒト血漿
の代わりに蒸留水を用いた以外は同様にして調製した測
定用試料（蒸留水由来測定用試料）を用いて同様の測定
を行った（標準）。別に実施例２と同様の方法で判定時
間とＰＧ濃度との関係を表す検量線を作成し、血漿由来
の測定用試料を用いて測定を行って得られた判定時間
と、作成した検量線から、ＰＧ濃度を算出し、添加した
ＰＧ濃度に対する回収率を計算した。

【００７８】〔結果〕上記測定で得られた判定時間と回
収率を表４に併せて示す。表４

【００７９】表４より明らかな如く、血漿を100倍希釈
する場合にも、本発明に係るキレート剤溶液で希釈する
ことにより、キレート剤無添加の20mM Bis-Tris溶液で
希釈した場合よりも判定時間が短縮され、回収率も高く
なることが判る。

【００８０】実施例６〔試薬〕 (１)ＰＧ標準液、ＰＧ溶液、ＰＧ又は／及びβＧ測定用
試薬、Bis-Tris溶液及び蒸留水は実施例１で用いたもの
と同じものを使用した。 (２)キレート剤溶液ＥＤＤＰ、ＮＴＰ、ＴＴＨＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰＯ、
ＥＤＴＰＯ及び本発明に係るキレート剤以外のキレート
剤として、ジエチレントリアミン-N,N,N",N"-五酢酸
（ＤＴＰＡ）、trans-1,2-ジアミノシクロヘキサン−N,
N,N',N'-四酢酸一水和物（ＣｙＤＴＡ）又はヒドロキシ
エチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）（全て(株)同仁化学研
究所製）を夫々所定濃度となるようにBis-Tris溶液に溶
解し、ゼータポア膜濾過を行った後、適宜蒸留水で希釈
したものを、キレート剤溶液とした（20mM Bis-Tris含
有）。

【００８１】〔操作〕（１）試料の前処理 20mM Bis-Tris溶液（キレート剤無添加）又は上記のキ
レート剤溶液を用いて、実施例１と同様の方法で、ヘパ
リン処理した正常ヒト血漿（ＰＧ及びβＧは含有してい
ない）を100倍希釈後、加熱処理し、前処理済試料を得
た。尚、キレート剤溶液は、試料中のキレート剤の終濃
度が１mMとなるものを用いた。（２）ＰＧ濃度の測定前処理済試料 900μｌに、試料中のＰＧの終濃度が10pg
/mlとなるように、適宜希釈したＰＧ溶液 100μlを加え
たものを測定用試料（血漿由来測定用試料）とし、この
試料中のＰＧ濃度の測定を、トキシノメーターMT-358
（和光純薬工業(株)）を用いて、実施例１と同様の操作
で行った。また、対照として正常ヒト血漿の代わりに蒸
留水を用いた以外は同様にして調製した測定用試料（蒸
留水由来測定用試料）について同様の測定を行った(標
準)。別に、実施例２と同様の方法で判定時間とＰＧ濃
度との関係を示す検量線を作成し、血漿由来の測定用試
料を用いて測定を行って得られた判定時間と作成した検
量線から、ＰＧ濃度を算出し、添加したＰＧ濃度に対す
る回収率を計算した。

【００８２】〔結果〕上記測定で得られた判定時間と回
収率を、表５に併せて示す。表５

【００８３】表５より明らかな如く、血漿由来の測定用
試料を用いた場合、本発明に係るキレート剤溶液で希釈
した方が、キレート剤無添加の20Mm Bis-Tris溶液で希
釈した場合よりも判定時間が短縮され、回収率も高くな
ることが判る。また、本発明に係るキレート剤以外のキ
レート剤としてＤＴＰＡ又はＨＩＤＡを用いた場合に
は、判定時間、回収率共に、キレート剤無添加の20mM B
is-Tris溶液を用いた場合よりむしろ悪くなった。尚、
ＣｙＤＴＡについては、回収率はキレート剤無添加で希
釈した場合よりも悪いが、判定時間は短縮され、反応が
促進されている傾向が見られた。

【００８４】実施例７．〔試薬〕 (１)βＧ標準液シイタケ（Lentinus edodes）由来の注射用レンチナン
（山之内製薬(株)製）を注射用水［大塚製薬(株)製、Ｓ
ＬＰ試薬セット(和光純薬工業(株)製)によりＰＧ及びβ
Ｇが検出されないことを確認済み］に加え、１mg／mlと
なるように調製したものをβＧ標準液とした。尚、これ
を使用するにあたっては、必要に応じて注射用水［大塚
製薬(株)製、ＳＬＰ試薬セット(和光純薬工業(株)製)に
よりＰＧ及びβＧが検出されないことを確認済み］で適
宜希釈して用いた（βＧ溶液）。 (２)ＰＧ又は／及びβＧ測定用試薬、Bis-Tris溶液、Ｅ
ＤＤＰ溶液、及び蒸留水は、実施例１で用いたものと同
じものを用いた。

【００８５】〔操作〕（１）試料の前処理 20mM Bis-Tris溶液（ＥＤＤＰ無添加）又はＥＤＤＰ溶
液を用いて、実施例１と同様の方法で、ヘパリン処理し
た正常ヒト血漿（ＰＧ及びβＧは含有していない）を10
0倍希釈後、加熱処理し、前処理済試料を得た。尚、Ｅ
ＤＤＰ溶液は、試料中のＥＤＤＰの終濃度が１mMとなる
ように加えた。（２）βＧ濃度の測定前処理済試料900μｌに、試料中のβＧ濃度が100pg/m
l、10pg/ml、又は１pg/mlとなるように希釈したβＧ溶
液100μlを加えたものを測定用試料（血漿由来測定用試
料）とし、この試料中のβＧ濃度の測定を、トキシノメ
ーターMT-358（和光純薬工業(株)）を用いて、実施例１
と同様の操作で行った。また、対照として正常ヒト血漿
の代わりに蒸留水を用いて（蒸留水由来測定用試料）同
様の測定を行った（標準）。別に、注射用水とβＧ標準
液を用いて同様の測定を行い、βＧ濃度と判定時間との
関係を表す検量線を作成し、血漿由来の測定用試料を用
いて測定を行って得られた判定時間と、作成した検量線
からβＧ濃度を算出し、添加したβＧ濃度に対する回収
率を計算した。

【００８６】〔結果〕上記測定で得られた判定時間と回
収率を表６に併せて示す。表６

【００８７】表６から明らかな如く、βＧの測定に於い
ても、血漿をＥＤＤＰ溶液で希釈することにより判定時
間が短縮され、βＧの回収率も高くなることが判る。

【００８８】

【発明の効果】以上述べたことから明らかな如く、本発
明は、ＰＧ又は／及びβＧの測定時に影響を及ぼす試料
中に存在する成分の影響を効率よく排除し、ＰＧ又は／
及びβＧを高感度に測定し得る方法を提供するものであ
り、本発明の方法によれば、従来行われていた方法より
も確実にこのような成分の影響を抑制することができ、
良好な回収率で、且つより短時間に試料中のＰＧ又は／
及びβＧの測定を行うことができるという効果を奏す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で得られた、各濃度のエチレンジアミ
ン二プロピオン酸（EDDP）を含有する測定用試料につい
てペプチドグリカン（ＰＧ）濃度測定を行った場合に得
られた、判定時間とＥＤＤＰ濃度との関係を示すもので
ある。

【図２】実施例２で得られた、各濃度のＥＤＤＰを含有
する血漿由来の測定用試料についてＰＧ濃度測定を行っ
た場合に得られた、ＰＧの回収率とＥＤＤＰ濃度との関
係を示すものである。

【図３】実施例３で得られた、ＰＧを10pg/ml含有する
測定用試料のＰＧ濃度を測定した場合に得られた、ＰＧ
の回収率と血漿希釈倍率との関係を示すものである。

【図４】実施例３で得られた、ＰＧを100pg/ml含有する
測定用試料のＰＧ濃度を測定した場合に得られた、ＰＧ
の回収率と血漿希釈倍率との関係を示すものである。

【符号の説明】

図１に於いて、−○−は蒸留水由来の測定用試料を用い
て得られた結果を、--●--は血漿由来の測定用試料を用
いて得られた結果を夫々示す。図３に於いて、−○−は
蒸留水で希釈加熱処理した前処理試料について得られた
結果を、--●--はＥＤＤＰ溶液で希釈加熱処理した前処
理試料について得られた結果を夫々示す。図４に於い
て、−○−は蒸留水で希釈加熱処理した前処理試料につ
いて得られた結果を、--●--はＥＤＤＰ溶液で希釈加熱
処理した前処理試料について得られた結果を夫々示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 AA13 CA25 CA26 DA44 FB01 GC10 2G054 AA07 AB01 AB05 AB07 BB10 BB13 CA21 CB02 CB10 CD01 CE01 CE02 EA02 EA03 EA04 FA09 FA36 FA37 GB04 JA02 JA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キレート剤を含んで成る、ペプチドグリカ
ン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカン含有試料の処
理剤。
【請求項２】試料が血漿又は血清である、請求項１記載
の処理剤。
【請求項３】キレート剤が金属配位原子として窒素原子
又は酸素原子を有するものである、請求項１又は２記載
の処理剤。
【請求項４】キレート剤が下記一般式[Ｉ] 【化１】 [式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₄及びＲ₅は夫々独立して水素原子
又は、水酸基，カルボキシル基若しくはホスホン酸基を
置換基として有するアルキル基（但し、Ｒ₁とＲ₂が共に
水素原子である場合を除く。）を表し、Ｒ₃はカルボキ
シル基又は【化２】〔但し、Ｒ₆及びＲ₇は夫々独立して水素原子又は、又は
カルボキシル基若しくはホスホン酸基を置換基として有
するアルキル基を表す。〕を表す。また、ｍは１〜３の
整数を表し、ｎは０又は１を表す。]で表される化合物
である、請求項３記載の処理剤。
【請求項５】アルキル基が炭素数１〜６の直鎖状のもの
である請求項４記載の処理剤。
【請求項６】水酸基、カルボキシル基若しくはホスホン
酸基を置換基として有するアルキル基が、置換基として
水酸基、カルボキシル基若しくはホスホン酸基をその末
端に有する炭素数１〜６のアルキル基である請求項４記
載の処理剤。
【請求項７】アルキル基がメチル基又はエチル基である
請求項５〜６記載の処理剤。
【請求項８】一般式[Ｉ]で示されるキレート剤がエチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン二プロピ
オン酸（EDDP）、エチレンジアミン二酢酸（EDDA）、ニ
トリロ三プロピオン酸（NTP）、エチレンジアミン-N,N-
ビス(メチレンホスホン酸)（EDDPO）、エチレンジアミ
ンテトラキス(メチレンホスホン)酸（EDTPO）、N、N-ビ
ス（2-ヒドロキシエチル）グリシン（DHEG）又はトリエ
チレンテトラミン六酢酸（TTHA）である、請求項４記載
の処理剤。
【請求項９】キレート剤が8-キノリノール又はベンゾイ
ルアセトンである、請求項３記載の処理剤。
【請求項１０】キレート剤を含んで成る、ペプチドグリ
カン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカン測定に於け
る、試料中に含有される他成分による影響回避剤。
【請求項１１】ペプチドグリカン又は／及び（１→３）
β−Ｄ−グルカン含有試料にキレート剤を共存させるこ
とを特徴とする、該試料の処理方法。
【請求項１２】試料にキレート剤を共存させる方法が、
キレート剤を含む溶液と試料を混合するものである、請
求項１１記載の処理方法。
【請求項１３】キレート剤を含む溶液と試料を混合した
後、更に加熱処理する、請求項１２記載の処理方法。
【請求項１４】試料が血漿又は血清である請求項１１〜
１３記載の処理方法。
【請求項１５】キレート剤が金属配位原子として窒素原
子又は酸素原子を有するものである、請求項１１〜１４
記載の処理方法。
【請求項１６】キレート剤が下記一般式[Ｉ] 【化３】 [式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₄及びＲ₅は夫々独立して水素原子
又は、水酸基，カルボキシル基若しくはホスホン酸基を
置換基として有するアルキル基（但し、Ｒ₁とＲ₂が共に
水素原子である場合を除く。）を表し、Ｒ₃はカルボキ
シル基又は【化４】〔但し、Ｒ₆及びＲ₇は夫々独立して水素原子又は、カル
ボキシル基若しくはホスホン酸基を置換基として有する
アルキル基を表す。〕を表す。また、ｍは１〜３の整数
を表し、ｎは０又は１を表す。]で表される化合物であ
る、請求項１５記載の処理方法。
【請求項１７】一般式[Ｉ]で示されるキレート剤がEDT
A、EDDP、EDDA、NTP、EDDPO、EDTPO、DHEG及びTTHAから
選択されて成る、請求項１６記載の処理方法。
【請求項１８】キレート剤が8-キノリノール又はベンゾ
イルアセトンである、請求項１５記載の処理方法。
【請求項１９】キレート剤の存在下に行う、試料中のペ
プチドグリカン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカン
の測定方法。
【請求項２０】キレート剤の存在下に、試料を昆虫体液
由来のペプチドグリカン又は／及び（１→３）β−Ｄ−
グルカン測定用試薬と反応させることを特徴とする、試
料中に存在するペプチドグリカン又は／及び（１→３）
β−Ｄ−グルカンの測定方法。
【請求項２１】請求項１１〜１８の何れかの方法により
処理した試料について行う、該試料中のペプチドグリカ
ン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカンの測定方法。
【請求項２２】請求項１１〜１８の何れかの方法により
処理した試料を、昆虫体液由来のペプチドグリカン又は
／及び（１→３）β−Ｄ−グルカン測定用試薬と反応さ
せることを特徴とする、試料中に存在するペプチドグリ
カン又は／及び（１→３）β−Ｄ−グルカンの測定方
法。
【請求項２３】試料が血漿又は血清である、請求項２２
記載の測定方法。
【請求項２４】キレート剤が金属配位原子として窒素原
子又は酸素原子を有するものである、請求項２１又は２
２記載の測定方法。
【請求項２５】キレート剤が下記一般式[Ｉ] 【化５】 [式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₄及びＲ₅は夫々独立して水素原子
又は、水酸基，カルボキシル基若しくはホスホン酸基を
置換基として有するアルキル基（但し、Ｒ₁とＲ₂が共に
水素原子である場合を除く。）を表し、Ｒ₃はカルボキ
シル基又は【化６】〔但し、Ｒ₆及びＲ₇は夫々独立して水素原子又は、カル
ボキシル基若しくはホスホン酸基を置換基として有する
アルキル基を表す。〕を表す。また、ｍは１〜３の整数
を表し、ｎは０又は１を表す。]で表される化合物であ
る、請求項２４載の測定方法。
【請求項２６】一般式[Ｉ]で示されるキレート剤がEDT
A、EDDP、EDDA、NTP、EDDPO、EDTPO、DHEG、DHEG及びTT
HAから選択されて成る、請求項２５記載の測定方法。
【請求項２７】キレート剤が8-キノリノール又はベンゾ
イルアセトンである、請求項２５記載の測定方法。
【請求項２８】昆虫がカイコである、請求項２２記載の
測定方法。