DE3617753A1

DE3617753A1 - Gewebe-plasminogenaktivator, diesen enthaltende pharmazeutische formulierungen sowie ihre herstellung und ihre verwendung in der human- und veterinaermedizin

Info

Publication number: DE3617753A1
Application number: DE19863617753
Authority: DE
Inventors: Henry Cary N.C. Berger; Michael Denis Beckenham Kent Johnston
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1986-12-04
Also published as: GB2176703A; PT82647B; HUT42330A; CH664495A5; FI85334C; DK163174B; ES555352A0; ATA141186A; LU86445A1; FI862226A0; AU569429B2; BE904831A; ES8706443A1; FR2593393A1; FR2593393B1; NZ216306A; HU200695B; PT82647A; IL78937A0; SE8602404L

Description

Gewebe-Plamsinogenaktivator, diesen enthaltende pharmazeutische Formulierungen sowie ihre Herstellung und ihre Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin

Die vorliegende Erfindung betrifft den Gewebeplasminogenaktivator und insbesondere diesen enthaltende pharmazeutische Formulierungen, ihre Herstellung und ihre Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin.

ι / Man nimmt an, daß es ein dynamisches Gleichgewicht zwischen dem Enzymsystem, das in der Lage ist, Blutgerinnsel zu bilden - dem Koagulationssystem - und dem Enzymsystem, das in der Lage ist, die Blutgerinnsel aufzulösen - dem fibrinolytischen System - das ein intaktes, offenes Gefäßbett aufrecht erhält, gibt. Um den Blutverlust aufgrund einer Verletzung zu begrenzen, bilden sich Blutgerinnsel im verletzten Gefäß. Nach einer auf natürliche Weise vonstattengehenden Beseitigung der Verletzung werden die überflüssigen Blutgerinnsel durch die Wirkung des fibrinolytischen Systems aufgelöst. Gelegentlich bilden sich Blutgerinnsel ohne traumatische Verletzung, die sich in den Hauptblutgefäßen ablagern können, wodurch es zu einer teilweisen oder sogar vollständigen Verstopfung des Blutflusses kommt. Wenn dieser Fall im Herz, in der Lunge oder im Gehirn eintritt, kann das Ergebnis ein Herzinfarkt, eine Lungenembolie oder ein Schlaganfall sein. Diese Bedingungen sind in Kombination die Hauptursache von Krankheit und Tod in den industrialisierten Ländern.

Blutgerinnsel bestehen aus einem fibrösen Netzwerk, das durch das proteolytische Enzym, Plasmin, aufgelöst werden kann. Das Enzym bildet sich aus dem inaktiven Proenzym, dem Plasminogen, eine Komponente des Blutplasmas, durch die Wirkung eines Plasminogenaktivators. Es gibt zwei immunologisch verschiedene Plasminogenaktivatoren bei den Säugetieren. Einen intrinsischen Plasminogenaktivator, der auch als Urokinase bekannt ist, ein Enzym, das von der Niere produziert wird und aus dem Urin isoliert werdenkann. Dieses Enzym kann

auch aus einer Reihe von Gewebekulturen isoliert werden. Einen extrinsischen Plasminogenaktivator, der auch als Gefäß-Plasminogenaktivator und als Gewebeplasminogenaktivator (tissue plasminogen activator, t-PA) bekannt ist, und der aus einer Reihe von Gewebehomogenaten (insbesondere Humanuterus) der Zellwand von Blutgefäßen und aus einigen Zellkulturen isoliert werden kann. Zusätzlich zu diesen zwei Arten von Plasminogenaktivatoren gibt es ein bakterielles Produkt, die Streptokinase, die man aus beta-hämatolytischen Streptokokken isolieren kann. Ein Hauptnachteil, der sowohl für die Urokinase als auch für die Streptokinase gilt, ist, daß sie in der gesamten Blutbahn aktiv sind und nicht gerade an der Stelle des Blutgerinnsels. Sie können z. B. andere Blutproteine abbauen, wie beispielsweise Fibrinogen, Prothrombin, Faktor V und Faktor VIII, wodurch die Fähigkeit zur Blutgerinnselbildung vermindert wird und das Risiko einer Hämorrhagie erhöht wird. Im Gegensatz dazu, hängt die biologische Aktivität von t-PA von der Gegenwart von Fibrin ab, an das sich t-PA bindet und wo es aktiviert wird. Die maximale Aktivität entwickelt sich daher nur an der Stelle eines Blutgerinnsels, d. h. in Gegenwart des aufzulösenden Fibrin-Netzgeflechtes und dadurch wird das Risiko einer Hämorrhagie weitestgehend vermieden.

Der Hauptverabreichungsweg für t-PA erfolgt durch intravaskuläre Infusion, demzufolge die Formulierung von t-PA als parenterale Lösung erforderlich ist. Im allgemeinen ist es wünschenswert, daß eine parenterale Lösung eine hohe Konzentration des Mittels enthält. Dies deswegen, weil der Arzt oder der Tierarzt dann die erforderliche Konzentration in jeder möglichen Situation einfach durch Verdünnung der Lösung mit zusätzlichem Lösungsmittel oder Medium erhalten kann. Zusätzlich ist es nicht zu empfehlen, ein großes Volumen einer Lösung einem Patienten mit einer Herz- oder Nierenstörung zu verabreichen, da dadurch das Herz oder die Nieren zusätzlich belastet werden. Daher sollte das Volumen durch Verwendung einer konzentrierten Formulierung auf ein Minimum beschränkt werden. Gleichzeitig sollte jede parenterale Lösung in dem Sinne dem Sinne stabil sein, daß das Mittel keine wesentliche Tendenz für

eine Ausfällung aus der Lösung weder während der Lagerung noch während des Verdünngungsvorganges aufweist.

Eine Anzahl von parenteralen t-PA-Lösungen wurden allgemein in der EP-A-41766, EP-A-93619, EP-A-112122, EP-A-113319, EP-A-123304, der japanischen Patentveröffentlichung 57-120523 (Anmeldung 56-6936) und der japanischen Patentveröffentlichung 58-65218 (Anmeldung 56-163145) beschrieben. Die Formulierungen enthalten wäßrige Salzlösungen von t-PA, worin der pH-Wert etwa neutral ist, weisen jedoch leider den Nachteil auf, daß die Löslichkeit von t-PA in solchen Lösungen in Abwesenheit einer Erhöhung bezüglich der Ionenkonzentration gering ist. Folglich enthalten die Formulierungen entweder niedrige t-PA-Konzentrationen, wodurch es in einigen Situationen erforderlich ist, unerwünscht große Volumina der Lösung dem Patienten zu verabreichen, oder sie sind hypertonisch, was bei Verabreichung nachteilige Wirkungen auf die roten Blutzellen haben kann.

Es wurde nun gefunden, daß die Löslichkeit von t-PA in wäßrigen parenteralen Lösungen verbessert werden kann, wenn der pH-Wert der Lösung innerhalb des sauren Bereichs liegt und daß bei Verabreichung die Acidität einer solchen Lösung keine wesentlichen physiologischen Probleme bereitet. Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung eine wäßrige parenterale t-PA-Lösung, worin der pH-Wert 2 bis 5 ist, zur Verfügung gestellt.

Als Ergebnis der verbesserten Löslichkeit von t-PA können in der erfindungsgemäßen t-PA-Lösung hohe Konzentrationen an t-PA erreicht werden, ohne wesentliches Risiko, daß das t-PA aus der Lösung ausfällt. Zusätzlich wurde gefunden, daß die Konzentration von t-PA in solchen Lösungen leicht durch Verdünnung mit Wasser mit einem neutralen oder sauren pH-Wert vermindert werden kann, ohne wesentliches Risiko der Ausfällung von t-PA. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine stabile parenterale Lösung zur Verfugung, die eine größere Flexibilität bezüglich ihrer Handhabung und der Verwendung durch Ärzte und Veterinärmediziner erlaubt.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete t-PA kann jedes bioaktive Protein sein, daß im wesentlichen Säugetier t-PA und insbesondere humanem t-PA entspricht und umfaßt weiterhin Formen mit und ohne Glycosilierung. Es kann sich dabei um ein- oder zwei-Ketten t-PA, eine Mischung derselben, wie in der EP-A-112122 beschrieben, handeln und im Fall des vollständig glycosilierten humanen t-PA besitzt dieses ein Molekulargewicht im Polyacrylamidgel von etwa 70 000 und einen isoelektrischen Punkt zwischen 7,5 und 8,0. Vorzugsweise besitzt das t-PA eine spezifische Aktivität von etwa 500 000 IU/ mg (International Units/mg, die internationale Einheit ist eine Aktivitätseinheit, wie sie von der WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW3 6RB, U.K., definiert wurde).

Die Aminosäuresequenz des t-PA stimmt vorzugsweise mit der in Figur 1 gezeigten überein. Die Sequenz ist daher zu der in Figur 1 gezeigten identisch oder enthält eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen allelischen Ursprungs oder sonst besitzt die erhaltene Sequenz mindestens 80 % und vorzugsweise 90 % Homologie mit der Sequenz der Figur 1 und behält im wesentlichen die gleichen biologischen und immunologischen Eigenschaften des Proteins. Insbesondere ist die t-PA-Sequenz der in Figur 1 dargestellten Sequenz identisch oder mit der Aminosäure Valin anstelle von Methionin der Position 245 vom Serin N-terminalen Ende, wobei jede Sequenz ggf. ohne irgendeine der ersten drei Aminosäuren vorliegt oder ggf. ein zusätzliches Polypeptid mit der Sequenz Gly-Ala-Arg, die dem N-terminalen Ende als Präsequenz vorgeschaltet ist, aufweist.

Die in Figur I dargestellte Aminosäuresequenz zeigt 35 Cysteinreste und folglich besitzt sie die Möglichkeit zur Bildung von 17 Disulfidbrücken. Aufgrund einer Analogie mit anderen Proteinen, deren Struktur detaillierter bestimmt wurde, kann man für die Sequenz (ergibt sich aus der Bildung der Disulfidbrücken) zwischen der Aminosäure in der Position 90 und dem Prolin C-Ende, die in Figur 2 gezeigt Struktur postulieren. Die Struktur des N-terminalen Bereichs

ist weniger sicher, obwohl einige Vorschläge gemacht wurden (Progress in Febrinolysis, 1983, 6, 269-273; und Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 81, 5355-5359). Die wichtigsten Merkmale der t-PA-Struktur sind die zwei "Schleifen"-Bereiche (zwischen den Aminosäuren 92 und 173 und zwischen den Aminosäuren 180 und 261), die für die Bindung des Proteins an Fibrin verantwortlich sind und die Serinproteaseregion, die den Hauptteil der B-Kette ausmacht und die für die Aktivierung von Plasminogen verantwortlich ist. Die Aminosäuren von spezieller Wichtigkeit in Serinproteasen sind das katalytische Dreiergespann His/Asp/Ser. Im t-PA kommen diese an der Position 322, 371 und 463 vor. Die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinaminosäureresten in Position 264 und 395 ist gleichfalls wichtig, da sie die A- und B-Ketten in der zwei-Ketten-Form des t-PA zusammenhält.

In der Figur 1 und 2 wurden die üblichen 3 Buchstaben-Codes für die Aminosäurereste, wie folgt, verwendet:

He I Isoleucin

Leu L Leucin

Tyr Y Tyrosin

Phe F Phenylalanin

His H Histidin

Lys K Lysin

Arg R Arginin

Trp W Tryptophan

Gin Q Glutamin

Met M Methionin Asn N Asparagin

Deas t-PA kann man durch irgendein im Stand der Technik bekanntes oder beschriebenes Verfahren erhalten. Z. B. kann man t-PA aus einer normalen oder neoplastischen Zellinie derart, wie sie in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41766 oder EP-A-113319 beschrieben wurde, erhalten. Vorzuziehen ist es jedoch, daß man das t-PA aus einer kultivierten, transformierten oder durch Transfektion gewonnen Zellinie, die man unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie, wie beispielsweise in der EP-A-93619, EP-A-117059 oder

Asp	C	Asparaginsäure
Thr	T	Threonin
Ser	S	Serin
GIu	E	Glutaminsäure
Pro	P	Prolin
GIy	G	Glycin
AIa	A	Alanin
Cys	C	Cystein
VaI	V	Valin

EP-A-117060 beschrieben, erhalten hat, gewinnt. Insbesondere ist es bevorzugt, daß man Chinese Hamster Ovary (CHO)-ZeIlen zur Produktion von t-PA verwendet und daß man diese auf die Weise herstellt, wie sie in Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759 beschrieben wurde. In diesem Verfahren wird das geklonte Gen zusammen mit dem Gen, das die Dihydrofulatreductase (dhfr) codiert, in dhfr" CHO-ZeIlen cotransferiert. Die transformierten Zellen, die dhfr exprimieren, werden auf einem Medium, das nukleosidfrei ist, selektiert und steigenden Konzentrationen Methotrexat ausgesetzt. Die dhfr und t-PA-Gene werden auf diese Weise co-amplifiziert, was zu einer stabilen Zellinie führt, die in der Lage ist, hohe Konzentrationen an t-PA zu exprimieren.

Vorzugsweise wird das t-PA unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten oder beschriebenen Verfahren, wie z. B. den, in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; 0. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13), 7035-7041; Eur. 0. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41766; EP-A-113319 oder GB-A-2122219 beschriebenen Verfahren, gereinigt.

Es scheint, daß es keine Obergrenze für die Löslichkeit des t-PA in der parenteralen Lösung gibt. Bei sehr hohen Konzentrationen, beispielsweise größer als 150 000 000 IU/ml (International Units/ml), wurde die Lösung nur viskos ohne wesentliche Ausfällung des t-PA. Die Konzentration des t-PA in der parenteralen Lösung kann deshalb zwischen weiten Grenzen variieren, beispielsweise von 50 000 bis 50 000 000 IU/ml. Um den maximalen Vorteil aus der vorliegenden Erfindung zu erhalten, ist es vorzuziehen, daß die Konzentration des t-PA größer als 100 000 IU/ml, besser größer als 500 000 IU/ml und am besten größer als 1 000 000 IU/ml ist. Am allerbesten ist es jedoch, wenn die Konzentration des t-PA etwa 5 000 000 IU/ml beträgt.

Die Obergrenze des pH-Wertes der parenteralen Lösung beträgt vorzugsweise 4,5. Tatsächlich liegt der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 2,5 bis 4,0, besser im Bereich von 2,8 bis 3,5 und beträgt am besten etwa 3,0. Der gewünschte pH-Wert der parenteralen

Lösung wird üblicherweise unter Verwendung einer physiologisch verträglichen, anorganischen oder organischen Säure erhalten. Beispiele für solche Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Zitronensäure, Weinsäure und BenzolsuIfonsäure. Aus diesen Beispielen ist die Salzsäure bevorzugt.

Obwohl einige physiologisch verträgliche Cosolventien ggf. zusätzlich zum Wasser vorhanden sein können, ist es vorzuziehen, daß das Medium für die parenterale Lösung gänzlich oder im wesentlichen ein wäßriges ist.

Oie parenterale Lösung kann hypertonisch, hypotonisch oder isotonisch mit dem Blutserum des Patienten sein. Um unerwünschte Nebeneffekte zu verhindern, ist jedoch die parenterale Lösung vorzugsweise isotonisch, obwohl kleinere Abweichungen ohne große physiologische Nachteile sind. Eine im wesentlichen isotonische, parenterale Lösung kann man durch Einschluß eines physiologisch verträglichen Mittels, das in der Lage ist, die Toniziät der Lösung auf den erwünschten Wert zu erhöhen, erreichen. Beispiele für solche Mittel sind im Stand der Technik seit langem bekannt und umfassen Dextrose (in wasserfreier oder Monohydratform) und Natriumchlorid und Mischungen davon. Die Konzentration des Mittels in der parenteral en Lösung wird natürlich von Mittel zu Mittel variieren. Im Fall von Natriumchlorid beträgt die Konzentration vorzugsweise 7 bis 10 mg/ml und am besten etwa 8,5 mg/ml, die Konzentration, die meistens als physiologische Salzlösung oder nur als physiologisches Salz bezeichnet wird. Im Fall der wasserfreien Dextrose beträgt die Konzentration vorzugsweise 30 bis 70 mg/ml und am besten etwa 50 mg/ ml. Im Falle, daß es erforderlich ist, die Konzentration des t-PA in einer im wesentlichen isotonischen, parenteralen Lösung zu reduzieren, wird die Verdünnung vorzugsweise mit einer wäßrigen Lösung desselben Mittels mit derselben Konzentration, um eine im wesentlichen isotonischen Lösung beizubehalten, durchgeführt.

Die parenterale Lösung kann ggf. Zusätze, die üblicherweise mit Formulierungen dieser Art verbunden sind, enthalten. Beispiele

COPY

umfassen humanes Serumalbumin. Da t-PA zusätzlich eine Tendenz an Glas- oder Plastikoberflächen zu adsorbieren besitzt, kann es deshalb wünschenswert sein, ein oberflächenaktives Mittel zur parenteralen Lösung zuzusetzen, um diese Adsorption zu verhindern oder zu minimieren. Beispiele für solche Mittel sind Polyoxyethylenderivate der Fettsäurepartialester von Sorbitolanhydriden, wie z. B. jene, die unter dem Handelsnamen Tween^ 80 verkauft werden.

Einer der überraschenden Vorteile der vorliegenden Erfindung ist, abgesehen von der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA der, daß die Verwendung einer sauren parenteralen Lösung mit einem pH-Wert innerhalb der hier definierten Grenzen offensichtlich keine wesentlichen, physiologischen Nachteile bei der Verabreichung an den Patienten zeigt. Wahrscheinlich ist der Blutstrom im allgemeinen in der Lage, den pH-Wert der Lösung sofort nach Kontakt in den neutralen Bereich zu erhöhen, wobei das t-PA sehr schnell innerhalb des Blutstromes verteilt wird. Es ist jedoch vorzuziehen, daß dieser Prozeß im wesentlichen unbehindert abläuft und daß die parenterale Lösung keine starke Puffersubstanz enthält. Eine schwache Puffersubstanz, die diesen Prozeß nicht wesentlich behindert, kann jedoch zugegeben werden, wobei jedoch bei einem sauren pH-Wert t-PA selbst als seine eigene schwache Puffersubstanz wirkt. Auch humanes Serumalbumin ist in der Lage, als schwache Puffersubstanz zu wirken.

Aufgrund der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA in der erfindungsgemäßen parenteralen Lösung besteht keine Notwendigkeit, zusätzliches Material, wie z. B. Lysin oder Ornithin oder ein Salz davon zur Erhöhung der t-PA-Löslichkeit zuzusetzen.

Die parenterale Lösung kann in Übereinstimmung mit üblichen pharmazeutischen Formulierungsverfahren und Techniken unter Verwendung von t-PA in Form einer gereinigten Lösung oder als Feststoff hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen, parenteralen t-PA-Lösung, wie hier definiert, zur Verfügung, wobei das Verfahren enthält:

(i) Gewinnung einer gereinigten t-PA-Lösung und Austausch des Mediums gegen ein wäßriges Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5; oder

(ii) Lösung von t-PA in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 und

Sterilisieren der erhaltenen Lösung.

Die Reinigung des t-PA kann als letzten Schritt die Eluierung des Proteins von einer Chromatographiesäule in Form einer Lösung, die eine starke Puffersubstanz enthält, enthalten. Wie vorhin bemerkt, ist es vorzuziehen, daß die parenterale Lösung keine starke Puffersubstanz enthält und daher ist ein übliches Verfahren zur Entfernung der starken Puffersubstanz bei gleichzeitigem Austausch des Mediums die Verwendung einer Dialyse. Diese kann man unter Verwendung eines Dialyseschlauches oder einer künstlichen Niere, worin die gereinigte Lösung gegen wäßriges Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 dialysiert wird, durchführen. Es kann wünschenswert sein, besonders wenn die Konzentration des t-PA in der gereinigten Lösung hoch ist, als erstes den pH-Wert der Lösung einzustellen, so daß er im Bereich von 2 bis 5 liegt. Weitere Möglichkeiten, um die starke Puffersubstanz bei gleichzeitigem Mediumaustausch zu entfernen, bestehen darin, daß man die gereinigte Lösung einer Gelfiltration unterwirft, wobei man die Säule mit einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 äquilibriert.

Das t-PA in Form eines präzipitierten Feststoffes kann man vorzugsweise aus einer gereinigten Lösung durch Einstellen eines pH-Wertes von etwa 5,5, Abkühlung der Lösung bis kurz oberhalb des Gefrierpunktes und Sammeln des Proteins, beispielsweise durch Zentrifugation, erhalten. Der präzipitierte Feststoff kann anschließend in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 auf übliche Weise gelöst werden.

Die Sterilisierung der erhaltenen Lösung kann auf übliche Art und Weise, z. B. durch Filtersterilisation, durchgeführt werden.

Die parenterale Lösung liegt normalerweise in hermetisch verschlossenen, sterilen Plastik- oder Glasbehältern vor. Sie kann gleichfalls in Form einer Einzeldosis, wie z. B. in Form von Ampullen, Flaschen oder eines Wegwerfinjektionsbesteckes oder in Multidosisform, wie z. B. in Infusionsbeuteln oder Flaschen, vorliegen. Das Volumen der Lösung, das in solchen Behältern vorhanden ist, variiert in weiten Bereichen und beträgt üblicherweise 0,5 bis 20 ml.

Um das t-PA zu stabilisieren wird die parenterale Lösung vorzugsweise gefroren und bei -10 bis -30 ⁰C gelagert.

Die biologische Aktivität des t-PA in der Auflösung des Fibrinnetzwerkes von Blutgerinnsel hat zu seiner Verwendung in der Behandlung von thrombotisehen Krankheiten geführt (The Lancet, 7. November 1981, 1018-1020; ibid., 13. April 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; und ibid., 1985, 312(14), 932-936). Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Behandlung einer thrombotisehen Krankheit in einem Säugetier zur Verfügung, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wäßrigen, parenteralen t-PA-Lösung, wie hier definiert, an ein Säugetier enthält. In der Alternative wird gleichfalls eine parenterale, wäßrige t-PA-Lösung, wie hier difiniert, zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, besonders zur Verwendung in der Behandlung einer thrombotisehen Krankheit, zur Verfügung gestellt.

Spezielle Beispiele für eine thrombotische Krankheit sind im Stand der Technik bekannt, umfassen jedoch allemal den Myokardinfarkt, die tiefe Venenthrombose, die Lungenembolie und den Schlaganfall.

Der Hauptverabreichungsweg der parenteralen Lösung ist die intravaskulare, insbesondere die intravenöse Infusion, obwohl durchaus andere denkbare Verabreichungswege, wie z. B. die intramuskuläre Verabreichung, eingesetzt werden können. Intravaskulare Infusionen

werden normalerweise mit der parenteralen Lösung in einem Infusionsbeutel oder in einer Infusionsflasche oder mit einer elektrisch gesteuerten Infusionsnadel durchgeführt. Die Lösung kann aus dem Infusionsbeutel oder der Flasche aufgrund der Schwerkraft oder durch Verwendung einer Infusionspumpe verabreicht werden. Die Verwendung von Infusionssystemen, die die Verabreichung mit der Schwerkraft beinhalten, sind nicht in der Lage, eine ausreichende Kontrolle über die Geschwindigkeit der Verabreichung der parenteralen Lösung zu geben und deshalb ist die Verwendung einer Infusionspumpe vorzuziehen, besonders mit Lösungen, die relativ hohe Konzentrationen an t-PA enthalten. Besser ist jedoch die Verwendung einer elektrisch betriebenen Infusionsnadel, die eine bessere Kontrolle der Verabreichungsgeschwindigkeit erlaubt.

Eine wirksame Menge des t-PA zur Behandlung eines Säugetiers mit einer thrombotisehen Krankheit wird natürlich von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich beispielsweise dem Alter und dem Gewicht des Säugetiers, den genauen Umständen, die die Behandlung erforderlich machen, ihrer Schwere, sowie vom Verabreichungsweg abhängen und wird letztlich im Ermessen des behandelnden Arztes oder Tierarztes liegen. In den meisten Fällen wird jedoch die wirksame Menge zur Auflösung eines koronaren Arterienthrombus im allgemeinen im Bereich von 150 000 bis 450 000 IU/kg Körpergewicht des Patienten pro Stunde betragen. Deshalb wird für einen 70 kg schweren erwachsenen Menschen die wirksame Menge pro Stunde im allgemeinen von 10 000 000 bis 30 000 000 IU, insbesondere etwa 20 000 000 IU betragen und dieser Wert kann mit oder ohne Vordosis verabreicht werden. Es ist auch wahrscheinlich, daß die Dosierung für einige thrombotische Umstände, wie beispielsweise bei der tiefen Venenthrombose und beim akuten Schlaganfall oder im Falle, daß die einfache Offenhaltung einer bereits durchflossenen Koronararterie gewährleistet sein soll, geringer sein wird. In diesen Situationen wird eine wirksame Menge im allgemeinen von 7 000 bis 36 000 IU/kg Körpergewicht des Patienten pro Stunde betragen.

Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung angeführt und sind nicht als deren Begrenzung zu denken.

Beispiel 1

Ein geklärter überstand von t-PA, erhalten aus einer kultivierten transformierten CHO-Zellinie, die unter Verwendung des in Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759 beschriebenen Verfahrens erhalten wurde, wurde Chromatographisch gereinigt und das t-PA als wäßrige Lösung, enthaltend 0,1 mol/1 Natriumeitrat und 0,01 % (w/v) Tweerr*80 mit einem pH-Wert von 5,5, gesammelt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 3,0 mit HCl eingestellt und die erhaltene Lösung durch Ultrafiltration unter Verwendung einer H-10 Einheit (Amicon Ltd., Upper Mill, Stonehouse, Gloustershire, England), konzentriert. Eine konzentrierte, gereinigte wäßrige Lösung von t-PA (2 500 000 IU/ml), enthaltend 0,1 mol/1 Natriumeitrat, 0,23 mol/1 Natriumchlorid (aufgrund des Zusatzes von HCl) und 0,01 % (w/v) Tween^R 80 mit einem pH-Wert von 3,0 wurde auf diese Weise erhalten. Diese Lösung wurde in einen Dialyseschlauch, Molekulargewichtsausschlußgrenze etwa 14 000, eingebracht und bei 4 ⁰C gegen 50 Volumina filtersterilisierte, physiologische Kochsalzlösung (0,85 % (w/v) Natriumchlorid), enthaltend 0,01 % (w/v) Tweerr^80 und mit einem auf 3,0 mit konzentrierter Salzsäure eingestellten pH-Wert, dialysiert. Die Lösung wurde 4 mal gewechselt. Jeder Dialyseschritt wurde für 12 Stunden durchgeführt. Nach Entnahme der wäßrigen Lösung aus dem Dyalyseschlauch wurde die Lösung filtersterilisiert und mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 500 000 IU/ml t-PA verdünnt. Die erhaltene parenterale Lösung wurde anschließend in Glasfläschchen, die hermetisch verschlossen wurden, eingefüllt, tiefgefroren und bei -20 ⁰C gelagert.

Beispiel 2

Ein geklärter überstand von t-PA, erhalten aus einer kultivierten, transformierten CHO-Zellinie, die unter Verwendung des in Molecular and Cellular Biologiy, 1985, 5(7), 1750-1759 beschriebenen Verfahrens erhalten wurde, wurde Chromatographisch gereinigt und das t-PA als wäßrige Lösung mit 0,17 mol/1 Natriumeitrat und 0,01 % (w/v) TweerF80 mit einem pH-Wert von 5,5, gesammelt. Der pH-Wert der

Lösung wurde mit Salzsäure auf 3,0 eingestellt und die erhaltene Lösung wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer H-10-Einheit (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England) konzentriert. Die konzentrierte wäßrige Lösung wurde anschließend durch Aufbringen auf eine Gelfiltrationssäule (Sephadex^G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Schweden) und durch Elution mit 0,85 $-iger Kochsalzlösung, die 0,01 % (w/v) Tweert^80 enthielt, bei einem pH-Wert von 3,0 eluiert. Auf diese Weise wurde eine hochgereinigte, wäßrige t-PA-Lösung erhalten, die noch einmal unter Verwendung einer wegwerfbaren künstlichen Niere konzentriert wurde. Das t-PA wurde aus der Lösung durch Erhöhung des pH-Wertes auf 5,5 mit Natriumhydroxid und Stehenlassen der Suspension bei 4 ⁰C für 2 Stunden ausgefällt. Das t-PA wurde durch Zentrifugation bei 4 QOO χ g für 30 Minuten bei 4 ⁰C gesammelt. Das t-PA-Pellet wurde in wäßriger Natriumchloridlösung (0,85 % (w/v)), die 0,01 % (w/v) Tweerf^eo enthielt, gelöst und der pH-Wert auf 3,0 mit HCl eingestellt. Das Volumen der verwendeten Salzlösung war jenes, das erforderlich war, um eine t-PA-Konzentration zwischen 7 500 000 IU/ml und 10 000 000 IU/ml zu ergeben. Diese t-PA-Lösung wurde weiter mit wäßriger Natriumchloridlösung (0,85 % (w/v)), die 0,01 % (w/v) Tween® 80 enthielt und deren pH-Wert auf 3,0 mit Salzsäure eingestellt wurde sowie mit ausreichender Mannitol lösung (10 %) (w/v) in der gleichen sauren Salzlösung, um eine Endkonzentration von 5 000 000 IU/ml t-PA und 25 mg/ml Mannitol zu ergeben, verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde filtersterilisiert und in Volumina von ml in Glasfläschchen verteilt, die geforen und bei -20 ⁰C gelagert wurden.

Beispiel 3

Die thrombolytische Wirksamkeit der parenteralen Lösung des Beispiels 1 wurde in einem in vivo-Modell anhand einer jugularen Venenthrombose untersucht.

(a) Methode:

Die experimentelle Durchführung folgte im wesentlichen jener

Methode, wie sie von Collen et al (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376) beschrieben wurde.

Die parenterale Lösung des Beispiels 1 wurde aufgetaut und mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 3,0, enthaltend 0,01 % Tween^80, verdünnt, um genügend Lösung für eine 2-stündige Infusion von 500 000 IU/kg t-PA zu ergeben. Die Infusion erfolgte durch eine Kanüle in die rechte Femoralvene. Drei weiße Neuseelandkaninchen wurden in dieser Studie verwendet. Nach der Infusion wurde der Grad der Thrombolyse bestimmt.

(b) Ergebnisse:

Der Thrombolyse-Prozentwert betrug 22,3 + 4,2, wodurch die thrombolytische Wirkung der parenteralen Lösung des Beispiels 1 gezeigt wurde. Weiterhin wurden keine nachteiligen Reaktionen mit der Infusion dieser Lösung beobachtet.

Claims

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1. Wäßrige parenterale t-PA-Lösung, worin der pH-Wert 2 bis 5 beträgt.

2. Parenterale Lösung nach Anspruch 1, worin das t-PA entweder in der ein-Ketten-Form oder in der zwei-Ketten-Form vorliegt.

3. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 oder 2, worin das t-PA eine Aminosäuresequenz, wie in Figur 1 beschrieben, besitzt oder die gleiche Aminosäuresequenz hat jedoch mit der Aminosäure Valin anstelle von Methionin in der Position 245 vom Serin N-terminalen Ende, wobei beide Sequenzen ggf. ohne eine der ersten drei Aminosäuren vorliegen oder ggf. ein zusätzliches Polypeptid mit der Sequenz GIy-Ala-Arg, die als Präsequenz dem N-termainal Ende vorgeschaltet ist, aufweien.

4. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 3, worin das t-PA aus einer kultivierten, transformierten oder durch Transfektion erhaltenen ZeIlinie, die man unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie erhalten hat, gewonnen wird.

5. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 4, worin die Konzentration des t-PA größer als 100 000 IU/ml ist.

6. Parenterale Lösung nach Anspruch 5, worin die t-PA-Konzentration größer als 500 000 IU/ml ist.

7. Parenterale Lösung nach Anspruch 6, worin die t-PA-Konzentration größer als 1 000 000 IU/ml ist.

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8. Parenterale Lösung nach Anspruch 7, worin die t-PA-Konzentration größer als 5 000 000 IU/ml ist.

9. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 8, worin der pH-Wert 2 bis 4,5 beträgt.

10. Parenterale Lösung nach Anspruch 9, worin der pH-Wert 2,5 bis 4,0 beträgt.

11. Parenterale Lösung nach Anspruch 10, worin der pH-Wert 2,8 bis 3,5 beträgt.

12. Parenterale Lösung nach Anspruch 11, worin der pH-Wert etwa 3 beträgt.

13. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 12, worin das Medium vollständig oder im wesentlichen wäßrig ist.

14. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 13, die ein physiologisch verträgliches Mittel enthält, das die Lösung im wesentlichen isotonisch mit dem menschlichen Blutserum macht.

15. Parenterale Lösung nach Anspruch 14, worin das physiologisch verträgliche Mittel Natriumchlorid ist.

16. Parenterale Lösung nach Anspruch 14, worin das physiologisch verträgliche Mittel Dextrose ist.

17. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 16, die ein oberflächenaktives Mittel enthält.

18. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 17, die im wesentlichen ungepuffert ist.

19. Parenterale Lösung nach Anspruch 1 bis 18, die im wesentlichen frei von Lysin oder Ornithin oder einem Salz davon ist.

20. Wäßrige, Salz-haltige parenterale t-PA-Lösung, in der der pH-Wert 2 bis 5 beträgt.

21. Verfahren zur Herstellung einer parenteralen Lösung, wie in Anspruch 1 bis 20 definiert, wobei das Verfahren enthält:

(i) Gewinnung einer gereinigten t-PA-Lösung und Austausch des Mediums gegen ein wäßriges Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5, oder

(ii) Auflösen des t-PA in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 und

Sterilisation der erhaltenen Lösung.

22. Verfahren zur Behandlung einer thrombotisehen Krankheit in einem Säugetier, wobei das Verfahren die Verabreichung einer parenteralen Lösung, wie in Anspruch 1 bis 20 definiert, an ein Säugetier enthält.

23. Parenterale Lösung, wie in Anspruch 1 bis 20 definiert, zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung einer thrombotisehen Krankheit.

24. Hermetisch verschlossener Behälter einer parenteralen Lösung, wie in Anspruch 1 bis 20 und 23 definiert.