DE10211457A1

DE10211457A1 - Verwendung von Hyaluronatlyase zur Behandlung von Myokardinfarkten

Info

Publication number: DE10211457A1
Application number: DE2002111457
Authority: DE
Inventors: Michael Wolfram; Joerg-Hermann Ozegowski; Peter-Juergen Mueller
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2003-09-25

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft bzw. ein aus diesem Enzym hergestelltes kleineres aktives Fragment und von pharmazeutischen Formulierungen, enthaltend dieses Enzym oder Fragment zur Therapie der Folgen eines Herzinfarktes. Das Enzym wird als Injektionspräparat bzw. Perfusionslösung zur Therapie von Herzinfarkten und Reperfusionssyndromen, zur Behandlung pektanginöser Beschwerden und von Myokardinfarkten sowie zur Kardioprotektion unter und nach invasiven, chirurgischen bzw. diagnostischen Eingriffen am Herzen, z. B. Bypass-Operationen, Implantationen von Klappenprothesen, Schrittmacherversorgungen oder Koronarangiographien eingesetzt. Bei der Behandlung wird die Hyaluronatlyase intravenös injiziert oder mit Hilfe eines Katheters appliziert.

Description

Die Erfindung betrifft die Therapie des Myokardinfarkts mit einem neuen Wirkstoff. Der vorgeschlagene Wirkstoff besitzt Glukosaminoglykan-spaltende Aktivität und ist vor allem durch bevorzugten Abbau von Hyaluronsäure charakterisiert. Zu den Glukosaminoglykanen gehören neben der Hyaluronsäure Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Heparansulfat. Diese kommen im Gewebe aller Vertebraten vor. Hyaluronsäure ist besonders in der interzellulären Matrix der Haut und des Knorpelgewebes sowie in Körperflüssigkeiten, wie Kammerwasser der Augen und Gelenkflüssigkeit vorhanden. Zusammen mit den anderen Glukosaminoglykanen ist Hyaluronsäure Bestandteil der Wände von Blutgefäßen, insbesondere auch atheromatöser Ablagerungen bzw. Plaques auf Arterieninnenwänden. Hyaluronsäure hat die Eigenschaft, Wasser unter Bildung viskoser, hydrokolloider Lösungen zu binden oder mit basischen Proteinen schwerlösliche Polyelektrolytkomplexe zu bilden. Sie besteht aus Glukuronsäure und azetyliertem Glukosamin, die durch β-(1-3)-glycosidische Bindungen verbunden sind. Diese Disaccharideinheiten sind wiederum miteinander durch glycosidische β-(1-4)-Bindungen verbunden. Hyaluronsäure wird durch Hyaluronidasen gespalten.
Der Begriff Hyaluronidasen beschreibt nicht korrekt drei unterschiedlich wirkende Typen hyaluronsäurespaltender Enzyme (Ludowieg J: The mechanisms of hyaluronidases. J Biol Chem 236, S. 333-339, 1961). Es sind einmal die Endohydrolasen, die die β-(1-4)-Bindungen hydrolytisch spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die Hyaluronidase aus Rinderhoden. Diese Hyaluronat-Glycanhydrolasen (Hyaluronoglucosaminidasen/E.C. 3.2.1.35) spalten neben den Bindungen der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glukosaminoglykane. Einen weiteren Typ stellt die Endo-β-Hyaluronoglucuronidase (E.C. 3.2.1.36) aus dem Blutegel dar, welche die β-(1-3)-Bindung hochspezifisch spaltet. Der dritte Enzymtyp, die Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.2.1.), spaltet Hyaluronsäure in der β-(1-4)-Bindung nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung einer Doppelbindung in (4-5)-Stellung an der Glukuronsäure. Hyaluronatlyasen sind häufig mikrobieller Herkunft. Sie werden beispielsweise in Streptomyceten und in anderen Bakterien gefunden. Ihr gemeinsames Merkmal ist ihre hohe Spezifität gegenüber Hyaluronsäure. Andere Glukosaminoglykane werden in der Regel in einem vernachlässigbaren Ausmaß gespalten (Ozegowski JH, Günther E, Reichardt W: Purification and characterization of hyaluronidase from Streptococcus agalactiae. Zbl Bakt 280, S. 497-506, 1994/Ohya, T. and Kaneko, Y.: Novel hyaluronidase from Malke H: The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate - completion of the sequence and expression analysis. Biochim Biophys Acta 1398 (1), S. 86-98, 1998).
Allgemein ist bekannt, dass Applikation von Hyaluronidasen tierischer Herkunft, speziell der bovinen testikulären Hyaluronidase, den Schaden reduzieren, der durch einen Herzinfarkt entsteht (Repa I, Garnic JD, Hollenberg NK: Myocardial infarction treated with two lymphagogues, calcium dobesilate (CLS 2210) and hyaluronidase - a coded, placebo-controlled animal study. J Cardiovasc Pharmacol 16, S. 286-291, 1990). Rinderhodenhyaluronidase hat einen förderlichen Effekt auf den kollateralen Blutfluß in das ischämische Gewebe (Askenazi J, Hillis LD, Diaz PE et al.: The effects of hyaluronidase on coronary blood flow following coronary artery occlusion in the dog. Circ Res 40, S. 566-571, 1977/Premaratne S, Watanabe BI, LaPenna WF, et al.: Effects of hyaluronidase on reducing myocardial infarct size in a baboon model of ischemia-reperfusion injury. J Surg Res 58, S. 205-210, 1995).
Es wird vermutet, dass eine Behandlung mit Hyaluronidase tierischer Herkunft die postischämische Genesung der Herzfunktion durch eine Vergrößerung des Herz- Lymph-Volumens verbessert (Yotsumoto G, Moriyama Y, Yamaoka A et al.: Experimental study of cardiac lymph dynamics and edema formation in ischemia/reperfusion injury-with reference to the effect of hyaluronidase. Angiology 49, S. 299-305, 1998).
Durch die Fähigkeit, Wasser zu binden, trägt die interstitielle Akkumulation von Hyaluronsäure zum interstitiellen Ödem im infarzierten Herzmuskelgewebe bei. Interstitielle Ödeme beeinflussen wahrscheinlich elektromechanische Charakteristiken des Myokards, ermöglichen aufgrund des Kontaktverlustes zwischen Muskelzellen Reentry-Phänomene und führen so zu Tachykardien bis hin zum Kammerflimmern. Desweiteren verursachen Ödeme erhöhten extrazellulären Druck und stören die Mikrozirkulation des Myokards durch eine veränderte Herzwand-Compliance. Durch Abbau der Hyaluronsäure begrenzt bovine testikuläre Hyaluronidase den zellulären Schaden während der myokardialen Ischämie (Waldenstrom A, Martinussen HJ, Gerdin B et al.: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin Invest 88, S. 1622-1628, 1991).
Presselt (WO 00/39290) schlägt die Behandlung atheromatöser Gefäßkrankheiten von Mensch und Tier mit Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft vor. Injektionspräparate für intravenöse und intraarterielle Applikationen werden für die Behandlung der Ursache von Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebralen Infarkten, zerebralen Thrombosen, Koronarthrombosen und kardialen Infarkten als Folge atheromatöser Plaquebildung eingesetzt. Das Enzym wirkt der Entstehung atheromatöser Plaques entgegen bzw. löst diese bei längerer Anwendung auf. Gemäß diesem Schutzrecht kann mit Hyaluronatlyase der auslösenden Ursache des Herzinfarktes, der athermatösen Plaquebildung, die eine Vorbedingung für den nachfolgenden akuten Verschluß des Gefäßes durch einen Blutthrombus ist, entgegengewirkt werden. Der Herzinfarkt wird hierbei als normale Gefäßkrankheit interpretiert, deren Behandlung als Therapie der atherosklerotischer Veränderungen bzw. Plaquebildung zu verstehen ist. Diese Darstellung wird jedoch der komplexen Pathophysiologie eines Herzinfarktes und dessen lebensbedrohlicher Folgen bei weitem nicht gerecht. Ausgelöst durch Plaque- bzw. nachfolgender Thrombusbildung entstehen nach dem Gefäßverschluß sehr schnell Myokardläsionen und -nekrosen, die aus einer Unterbrechung oder einer kritischen Verminderung der Sauerstoffzufuhr im Herzmuskel resultieren und weitgehend irreversiblen Charakter haben. Der irreversible Zustand tritt insbesondere dann verstärkt auf, wenn der Gefäßverschluß nicht innerhalb weniger Stunden durch therapeutische Maßnahmen wie der Injektion von antithrombisch wirkende Mitteln aufgehoben wird. Die weitgehend irreversible Folgesymptomatik sind neben irreversiblen Herzmuskelnekrosen später dann Narbenbildung verbunden mit Funktionsverlust des Herzmuskels sowie in ungünstigen Fällen der Eintritt des Todes. Wegen der akuten Lebensbedrohung ist deshalb eine spezifische, insbesondere eine sehr schnell wirkende Therapie gegen die Folgesymptomatik notwendig. Durch eine spezifische Therapie sollte das Ausmaß der Schädigung begrenzt bzw. der Schaden zumindestens teilweise reversibel gestaltet werden. Der relativ langsam wirkende Plaque-Abbau bei auftretender Folgesymptomatik entsprechend der von Presselt (WO 00/39290) vorgeschlagenen Anwendung von Hyaluronatlyase ist hierfür bei weitem nicht ausreichend.
Gottlieb (US 3,708,575) schlägt vor, Gefäßkrankheiten des Menschen wie Herzarrhythmien, Thrembosen, kardiale und zerebrale Infarkte mit Hyaluronidase aus Tierhoden (Molmasse 120.000 D) in hohen Dosierungen von 20.000 bis 1.000.000 IU pro Injektion zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intravenös, intraarteriell oder intrathekal injiziert. Das Enzym wurde aus Rinderhoden gewonnen. Irrtümlicherweise wird die bovine testikuläre Hyaluronidase im Patenttitel als Glucuronoglycosaminoglycan-Hyaluronatlyase geführt, obwohl aus der Erfindungsbeschreibung und der zitierten Literatur eindeutig hervorgeht, dass es sich um ein Enzym aus Rinderhoden handelt. Eine Hyaluronidase mit der Spaltungsspezifität einer Lyase ist jedoch in Tierhoden nicht nachweisbar. Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität deutet ebenfalls auf eine Hyaluronidase und nicht auf eine Hyaluronatlyase hin. Auch bezieht sich die angewendete Methode zur Messung der spezifischen Aktivität auf eine Vorschrift zur Bestimmung von Hyaluronidasen.
Der Einsatz testikulärer Hyaluronidasen ist aus Gründen der relativ geringen und bei mehrfacher Verwendung sehr schnell nachlassenden Wirkung sowie aufgrund der zunehmenden Gefahr der Übertragung von infektiösem Material eingeschränkt. Darüber hinaus erfordert die Reinigung der Hyaluronidasen aus Gewebemazeraten mit einem naturgemäß hohen Anteil an Fremdproteinen und lipoiden Verbindungen einen hohen Reinigungsaufwand, sodass hochaktive Präparate nicht herstellbar sind. Es gibt außerdem Hinweise, dass die relativ geringe Wirkung der Hyaluronidase aus Rindertestes auf die ausgeprägte Inhibition des Enzyms durch sulfatierte Glukosaminoglykane wie Heparin oder heparinähnliche Glukosaminoglykane, die in der extrazellulären Matrix von Säugern vorhanden sind, zurückzuführen ist.
Die Erfindung hatte zum Ziel, ein Mittel für die Therapie akuter ischämischer Episoden des Herzmuskels zu finden, welches dafür besser geeignet ist als bovine testikuläre Hyaluronidasen, für deren Gabe mehr als 9 Stunden nach den ersten Symptomen eines Herzinfarktes kein signifikanter Nutzen nachgewiesen werden konnte (MILIS Study Group: Hyaluronidase therapy for acute myocardial infarction - results of a randomized, blinded, multicenter trial. Am J Cardiol 57, S. 1236-1243, 1986).
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, einen Wirkstoff für die Therapie der Herzmuskelischämie aufzufinden bzw. die lebensbedrohlichen Folgen des Infarktes mit einem schnell einsetzenden Heilerfolg zu therapieren. Er soll die angeführten Nachteile der testikulären Hyaluronidase bzw. von Hyaluronidasen tierischer Herkunft nicht oder lediglich in geringerem Maß aufweisen. Es soll bei Verwendung des Wirkstoffs auf Grund seiner nicht-tierischen Herkunft keine Gefährdung durch eventuelle Infektionen entstehen.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass mikrobielle Hyaluronatlyasen bzw. ihre Fragmente, die nach ihrem Spaltmechanismus als Lyasen der Enzymklassifikationsnummer E.C. 4.2.2.1 zugerechnet werden, insbesondere die durch den Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, insbesondere der serologischen Gruppen B bzw. C, bevorzugt der Arten Streptococcus agalactiae und besonders aus Streptococcus equisimilis bei Fermentation in die Kulturflüssigkeit exkretierte Hyaluronatlyasen oder durch einen transgenen Mikroorganismus gebildeten Hyaluronatlyase, unter anderem zu einer intensiven und schnellen Reduktion des postischämischen Schadens am Myokard führen.
Der enzymatische Wirkstoff spaltet, anders als testikuläre Hyaluronidasen bzw. andere Hyaluronidasen tierischer Herkunft, Hyaluronsäure nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung von ungesättigten Spaltprodukten. Im Gegensatz dazu spalten Hyaluronidasen tierischer Herkunft (E.C. 3.2.1.35/36) die Hyaluronsäure hydrolytisch bei Anlagerung von Wasser unter Bildung gesättigter Spaltprodukte. Die Hyaluronatlyasen unterscheiden sich von tierischen Hyaluronidasen weiterhin durch die Aminosäuresequenzen sowie die Isoelektrischen Punkte (IP).
Demgemäß betrifft die Erfindung die Verwendung mikrobieller Hyaluronatlyase und der aus ihr hergestellten aktiven Fragmente zur schnellen Behandlung von postinfarktioneller Myokarditis und Myokardischämie. Bevorzugt werden die mikrobielle Hyaluronatlyase und die aus ihr hergestellten aktiven Fragmente für die Kardioprotektion unter und nach invasiven, chirurgischen bzw. diagnostischen Eingriffen am Herzen, z. B. Bypass-Operationen, Implantationen von Klappenprothesen, Schrittmacherversorgungen oder Koronarangiographien, zur Vermeidung von Reperfusionssyndromen sowie bei pectanginösen Beschwerden und akuten Myokardinfarkten appliziert.
Das schnelle Eintreten der Wirkung wird durch die Anwendung von Aktivitäten bis zu 1.000.000 IU/kg Körpergewicht (KG) erreicht. Die Applizierung derartig hoher Aktivitäten wurde bisher nicht vorgeschlagen, u. a. auch deshalb, weil so hohe Enzymaktivitäten nicht in wirtschaftlicher Weise herstellbar waren. Insofern ist die beobachtete Wirkung überraschend. Die Applizierung der wirkstoffhaltigen galenischen Formulierung in hohen Dosen erfolgt erfindungsgemäß durch intravenöse Injektion oder über einen Herzkatheter. Die Verwendung der mikrobiellen Hyaluronatlyasen in den vorgeschlagenen hohen Dosen zeigt keine negativen Auswirkungen auf den Gesundheitszustand von Versuchstieren.
Die Hyaluronalyase-Aktivität für die prophylaktische Nutzung liegt zwischen 100 IU/kg Körpergewicht (KG) und 1.000.000 IU/kg KG, bevorzugt 1000 IU/kg KG bis 500.000 IU/kg KG. Die Verwendung dieser relativ hohen Aktivitäten pro Dosis führt zu der schnellen Neutralisierung der lebensbedrohlichen Folgen des Myokardinfarktes.
Vorteilhaft an dem vorgeschlagenen Wirkstoff ist, dass er in den für die Anwendung notwendigen hohen Aktivitäten als entscheidende Voraussetzungen für eine wirksame Therapie, auf einfachem Weg herstellbar ist.
Es hat sich somit gezeigt, dass mikrobielle Hyaluronatlyasen, die eine bisher nicht zur Behandlung der lebensbedrohlichen Folgen von Herzinfarkten eingesetzte Enzymgruppe darstellen, in der vorgeschlagenen hohen Dosierung eine schnelle kardioprotektive Wirkung entfalten, indem sie die schädigende Wirkung der Ischämie auf die myokardialen Zellmembranen verringern. Kammerflimmern bzw. andere tachykarde Herzrhythmusstörungen, die regelhaft vor allem in den ersten Stunden des Infarktes als Ausdruck der elektrischen Instabilität auftreten und wesentlich für die hohe Sterblichkeit verantwortlich sind, werden verhindert sowie Herzmuskelnekrosen und Narbenbildung reduziert.
Die beobachteten kardioprotektiven Effekte der Hyaluronatlyase sind in der Literatur bisher nicht beschrieben worden. In den bisher publizierten Studien wurden allerdings auch keine bakteriellen Hyaluronatlyasen, sondern Hyaluronidasen tierischer Herkunft, vorallem Rinderhodenhyaluronidasen, verwendet. Dieser überraschende Vorteil der mikrobiellen Hyaluronatlyase gegenüber testikulärer Hyaluronidase ist über eine Erhöhung des Herzlymphvolumens nicht hinreichend zu begründen und nur multifaktoriell erklärbar. Die Kardioprotektion durch Hyaluronatlyase ist unabhängig von antiatherogenen oder antiatheromatösen Effekten des Enzyms und auch in Abwesenheit atherosklerotischer Gefäßveränderungen nachweisbar. Der herausragenden kardioprotektiven Wirkung der Hyaluronatlyase liegt ein neuer, bisher unbekannter Wirkmechanismus zugrunde.
Die bei Myokardinfarkt auftretenden interstitiellen Ödeme steigern den extrazellulären Druck und stören die Mikrozirkulation des Herzmuskels. Die parallel freigesetzten Enzyme akkumulieren in der Herzlymphe. Deren Volumen nimmt infolge des Infarktereignisses graduell zu. Dagegen ist im ischämischen Gewebe, bevor myokardiale Nekrosen entstehen können, eine Reduktion der Lymph-Füllung zu beobachten. Dieser Mechanismus des Lymphverschlusses bzw. -kollapses spielt offenbar eine wesentliche Rolle in der Pathophysiologie des Herzinfarktes. Reduzierte Lymphdrainage verursacht die lokale Akkumulation von potentiell toxischen Produkten, die zu einer lokalen Schädigung beitragen können.
Im Gegensatz zur Aktivität der testikulären Hyaluronidase wird die Aktivität von Hyaluronatlyase aus Streptococcus equisimilis durch sulfatierte Glukosaminoglykane, wie beispielsweise der sulfatierten Hyaluronsäure oder Heparin, kaum inhibiert. Diese ebenfalls überraschende Eigenschaft der Hyaluronatlyasen ist für die Behandlung von Herzinfarkten von Vorteil, da keine Gewebe-Inaktivatoren auf der Basis sulfatierter Glukosaminoglykane die Hyaluronatlyase-Aktivität inhibieren und somit die Wirkung des Enzyms unterdrücken könnten.
Die mikrobiellen Hyaluronatlyasen werden für ihre erfinderische Verwendung in Form von galenischen Formulierungen eingesetzt. Sie enthalten als Injektionspräparat beispielsweise eine isotonische wässrige Lösung einer hochgereinigten mikrobiellen Hyaluronatlyase mit Konzentrationen bis zu 2.000.000 IU/ml und in Injektionspräparaten übliche Hilfsstoffe. Das Enzymprotein der Hyaluronatlyase wird vorteilhaft in Form eines lagerstabilen Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, beispielsweise in Glasampullen abgefüllt, eingesetzt. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von gefriergetrocknetem Wirkstoff. Als stabilisierende Zusätze können beispielsweise Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidin, Aminosäure, Albumine und deren Hydrolysate oder Gelatine und deren Hydrolysate eingesetzt werden. Vor der Applizierung wird der Feststoff in physiologischer Kochsalzlösung zu einer isotonischen Injektionsformulierung gelöst.
Die Enzymaktivtät einer Ampulle liegt nach Auffüllen mit physiologischer Kochsalzlösung zwischen 1000 und 2.000.000 IU/ml. Für den Einsatz eines Katheters werden enzymhaltige Lösungen angewendet, die 50 IU/ml bis 1.000.000 IU/ml Hyaluronatlyase enthalten und eine ähnliche Zusammensetzung wie die Injektionslösungen aufweisen.
Die Herstellung der in der Injektions- bzw. Katheterformulierung eingesetzten mikrobiellen Hyaluronatlyasen kann beispielsweise hinsichtlich Reihenfolge und Auswahl der Reinigungsschritte in einer den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränkenden Weise wie folgt durchgeführt werden.
Ohne damit die Erfindung auf die Hyaluronatlyase oder ihres Fragmentes auf einen bestimmten Mikroorganismus festzulegen, wird die Erfindung am Beispiel des Enzyms aus dem allgemein zugänglichen Streptococcus agalactiae erläutert. Die gebildete Hyaluronatlyase besitzt einen Isoelektrischen Punkt von etwa IP = 8,6 sowie eine Molmasse von etwa 116.000 D und wirkt als Endoglycanase. Durch nachfolgend aufgeführte Reinigungsverfahren wird die Hyaluronatlyase als ein hochgereinigtes Enzym für Injektionszwecke gewonnen oder die gereinigte Hyaluronatlyase mit einer spezifisch wirkenden Protease zu einem Fragment umgesetzt. Als spezifisch wirkende Protease kann, ohne die Erfindung einzuschränken, beispielsweise die saure Metalloprotease MO/2 (DD 270924) eingesetzt werden, die aus dem Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus AP40 gewonnen werden kann. Diese Protease besitzt eine Molmasse von etwa 14 kD und einen Isoelektrischen Punkt zwischen IP = 3,85 bis 4,0.
Die Herstellung der hochreinen Hyaluronatlyase und des hochgereinigtes Fragments in einer für die Behandlung geeigneten Form kann beispielhaft in Bezug auf die Reihenfolge als auch die Auswahl der Reinigungsschritte in einer nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränkenden Weise wie nachfolgend durchgeführt werden.
Die Fermentation des Mikroorganismus, z. B. eines der oben genannten, erfolgt in einem gerührten Fermenter unter pH-Konstanthaltung bei einer Azidität von pH 6,5 bis 7,5. Die während der Fermentation gebildete Milchsäure wird durch Zugabe von verdünnter Natronlauge neutralisiert. Das Medium besteht aus anorganischen Salzen, Hefehydrolysat, wahlweise Kaseinpepton oder Sojapepton sowie Glukose. Nach etwa 20-stündiger Fermentation werden die Zellen separiert. Die Zellmasse wird durch Mikrofiltration durch Filtermodule mit einer Porenweite von beispielsweise 0,45 µm abgetrennt und verworfen.
Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Die Ausschlussgrenze (cut off) des Ultrafilter-Moduls liegt bei 80.000 D. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die an sich bekannten Reinigungsmethoden unterworfen wird.
Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Die Ausschlußgrenze des Ultrafilter-Moduls liegt zwischen 30 bis 50 kD. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden muss, bevor sie als Injektionspräparat verwendet werden kann. Durch die Reinigungsschritte und Verwendung pyrogenfreier Hilfsstoffe wird Pyrogenfreiheit des Injektionspräparats erreicht.
Nach Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40% wird das Enzym an Phenylsepharose adsorbiert. Anschließend erfolgt die Desorption mit einer neutralen gepufferten wässrigen Lösung, die 25% Ammoniumsulfat, bezogen auf 100% Sättigung, enthält. Die Lösung wird nach einem Dialyseschritt zur Entfernung von Verunreinigungen mit Q-Sepharose (Pharmacia) versetzt. Anschließend erfolgt eine spezifische Adsorption an einen Farbstoff, z. B. Aminophenyloxaminsäure.
Die Endreinigung kann zusammen mit der Bestimmung des Molekulargewichts in Form einer Molekulargewichtschromatografie an Superdex (Pharmacia) bestehen.
Bei Verwendung von Streptococcus equisimilis als Enzymbildner entfällt der Reinigungsschritt durch Adsorption an den Farbstoff. Dieses Enzym wirkt als Exoglycanase, sein Isoelektrischer Punkt liegt zwischen IP = 4,5 und IP = 4,8 und es wird in einem geringeren Maß als das Enzym aus Streptococcus agalactiae durch sulfatierte Glykosaminoglykane gehemmt.
Erfindungsgemäß wird das enzymatisch aktive Fragment durch Teilverdauung bzw. proteolytischen Teilabbau des Holoenzyms mit einer spaltspezifisch wirkenden Protease, welche die Peptidbindung bevorzugt an der C-terminalen Seite der aromatischen Aminosäuren spaltet, hergestellt. Die Teilverdauung des Holoenzyms zu dem Fragment erfolgt mit immobilisierter oder auch mit nicht-immobilisierter spezifischer Protease. Vorteilhaft ist an der Umsetzung mit immobilisierter Protease, dass die Verdauung gezielt und ohne Kontamination durch die Protease selbst durchgeführt werden kann. Im Fall der direkten Umsetzung mit zugesetzter Protease muß nach der Verdauung ein Inaktivierungsschritt der Protease, die Abtrennung des Proteaseproteins und eine Hochreinigung erfolgen. Das hochgereinigte Enzym oder das Enzymfragment zeigen nach Immunisierung im Kaninchen nur eine spezifische Präzipitation. Mit monoklonalen Antikörpern werden alle nachweisbaren Banden im Blot angefärbt.
Das Holoenzym besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 400.000 IU/mg und die spezifische Aktivität des Fragmentes liegt etwa zwischen 400.000 und 800.000 IU/mg. Zur Stabilisierung werden dem Enzym bzw. Fragment mindestens einer der Stabilisatoren, beispielsweise Albumin, bevorzugt Ovalbumin, und anorganische Salze zugesetzt.
Ohne die Erfindung dadurch einzuschränken, soll beispielhaft ein Weg zur Gewinnung des enyzmatische aktiven Fragmentes beschrieben werden. Erfindungsgemäß werden Proteasen zur Verdauung eingesetzt, welche die C-terminale Peptidbindung von aromatischen Aminosäuren spalten. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Metalloprotease MO/2 eingesetzt, die aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40) hergestellt wird. MO/2 ist ein Metalloenzym mit Co⁺⁺ im aktiven Zentrum (DD 270 924). Die Proteasen werden bevorzugt in gereinigter Form eingesetzt. Die Reinigung der Protease MO/2 erfolgt beispielsweise durch Chromatografie an Phenylsepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl S100 mit einem Anreicherungsfaktor von 20. Die spezifische Aktivität liegt bei 0,25 Kunitz Units/mg (U/mg), das Reaktionsmaximum bei einer Azidität von pH = 4,2 und das Reaktionstemperaturmaximum bei 65°C. Das Molekulargewicht des Enzyms, bestimmt durch SDS Gelelektrophorese und Molekulargewichtschromatografie an Sephadex G50 superfine beträgt 14.000 bis 15.000 D. Die Protease MO/2 ist eine Endopeptidase mit einem Isoelektrischen Punkt bei IP = 3,85 und einem bei IP = 3,92. Das Enzym hydrolysiert natürliche Polypeptide wie Kasein, Hämoglobin, Bovinserum, Albumin und Ovalbumin.
Vorteilhaft an der Verwendung der Protease MO/2 ist, dass das Enzym Proteine sehr spezifisch spaltet bzw. eine sehr geringe allgemeine Verdauungsaktivität gegenüber Proteinen besitzt. Das Enzym spaltet fast ausschließlich nur die Peptidbindungen des C-terminalen Restes von den aromatischen Aminosäuren. Es besitzt eine esterolytische Aktivität gegenüber N-Benzoyl-L-proline-nitroanilid und ausgeprägte milchfällende Eigenschaften. Die Eigenschaften der Milchfällung, die an der Bildung eines langzeitstabilen Kaseingels nachweisbar ist, vergleichbar mit dem Gel, welches bei der Milchfällung mit dem sehr spezifisch wirkenden Labenzym auftritt, sind als weiterer Hinweis auf die begrenzte, für die Erfindung sehr vorteilhafte Aktivität der Protease MO/2 zu werten, die Bindungen des Holoenzyms spezifisch zu spalten, ohne zu einem Abbau der Fragmente zu führen.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird die Protease MO/2 an geeignete unlösliche Immobilisierungssupporte gebunden und in dieser Form zur Spaltung des Holoenzyms eingesetzt. Vorteilhaft an dieser Vorgehensweise ist, dass auf diese Weise der Übergang gelöster Protease in die Lösungen der Fragmente verhindert wird.

Beispiel 1

Wirkung bakterieller Hyaluronatlyase auf das Langendorff-Herz bei Applikation vor und nach einer künstlich induzierten globalen Ischämie

Männliche Weiße Neuseelandkaninchen wurden durch zervikale Dislokation betäubt, durch Thorakotomie das Herz entnommen und mit der Aorta an einem Perfusionsapparat befestigt. Die Perfusion erfolgte retrograd nach der Langendorff-Methodemit modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) bei konstanter Temperatur (37°C), konstantem Druck (60 mmHg) und ständiger Carbogen-Begasung. Die Zusammensetzung der basalen Perfusionslösung war: NaCl 118 mmol/l, KCl 4,7 mmol/l, CaCl₂ 2,5 mmol/l, NaHPO₄ 1,2 mmol/l, NaHCO₃ 24,9 mmol/l, MgSO₄ 1,6 mmol/l, Glukose 5,5 mmol/l, Na-Pyruvat 2,0 mmol/l und Na₂EDTA 0,5 mmol/l.
Die verwendete Hyaluronatlyaselösung wurde wie folgt hergestellt: Eine Ampulle Hyaluronatlyase entsprechend 200.000 IU wurde in eiskaltem destillierten Wasser (1 ml) und Perfusionslösung (4 ml) gelöst und sofort in 1995 ml temperierte und begaste Perfusionslösung gegeben, so dass die Konzentration 100 IU/ml betrug. Mit dieser Lösung wurde das Herz entweder vor oder nach der globalen Ischämie perfundiert.
Nach der Entnahme der Herzen wurden diese in die Perfusionsapparatur eingespannt und für 15 min mit basaler Perfusionslösung bis zum Erreichen stabiler Aktionspotentiale perfundiert. In zwei Vorversuchen, die zur Festlegung der Zeitdauer der globalen Ischämie beim Kaninchenherz dienen sollten, wurde für 10 min bzw. 12 min eine globale Ischämie durch das Abklemmen der zuströmenden Perfusionslösung ("no flow"-Bedingungen) induziert. Danach wurde erneut mit Perfusionslösung perfundiert. Da in beiden Vorversuchen keine klaren Herzrhythmusstörungen nach Reperfusion im Beobachtungszeitraum auftraten, wurde für die eigentlichen Versuche V1-V3 eine 15- minütige Dauer der globalen Ischämie festgelegt.
Es wurden folgende Versuchsansätze durchgeführt:
Versuch 1 (V1):
Kontrollbedingungen mit Puffer 15 min
Ischämie 15 min
Reperfusion mit Puffer 85 min
Versuch 2 (V2):
Kontrollbedingungen mit Puffer 15 min
100 IU/ml Hyaluronatlyase im Puffer 15 min
Ischämie 15 min
Reperfusion mit Puffer 85 min
Versuch 3 (V3):
Kontrollbedingungen mit Puffer 15 min
Ischämie 15 min
Reperfusion mit 100 IU/ml Hyaluronatlyase im Puffer 85 min
Das in jedem Versuch anfallende Eluat wurde zu definierten Zeitpunkten gesammelt und die Laktatdehydrogenase(LDH)-Aktivität bestimmt. Die LDH-Aktivität ist ein Maß für eine Herzschädigung aufgrund von Permeabilitäts- und Integritätsänderungen der kardialen Zellmembranen (LDH-Aktivität ist proportional zum Ausmaß der Herzschädigung).
Die in V1 gegebenen Bedingungen resultierten in einem irreversiblen Kammerflimmern ab der 30 Minute der Reperfusion. In V2 und V3 wurde bis zur 85. Minute kein Kammerflimmern beobachtet. Dabei war die protektive Wirkung der Hyaluronatlyase effektiver bei der Perfusion nach Ischämie (V3) mit einem perfekten Sinusrhythmus vergleichbar zu der Situation vor Ischämie. Zudem trat in der Reperfusionsphase in V3 im Gegensatz zu V2 eine Verlängerung der Aktionspotentialdauer während der gesamten Beobachtungszeit auf. Dies war in erster Linie auf eine verlängerte Depolarisation zurückzuführen und spricht für eine unmittelbare Beteiligung von Kalzium- und Kaliumkanälen.
Die gemessene LDH-Aktivität war bei den beiden Versuchen mit Hyaluronatlyase (V2 und V3) um den Faktor 20 geringer im Vergleich zum Versuch V1. Dies läßt auf eine erheblich geringere Herzschädigung durch Ischämie schließen.

Beispiel 2

In vivo-Wirkung intravenös applizierter bakterieller Hyaluronatlyase auf die Größe des Herzinfarktes bei anästhesierten Hunden

6 männliche Mischlingshunde (Gewicht 8,5 bis 11,5 kg) wurden mit 30 mg/kg KG Pentobarbital i. v. anästhesiert und zwecks künstlicher Beatmung intubiert. Eine linke Thorakotomie wurde im 5. Intercostalraum durchgeführt und das Herz freigelegt. Durch Ligatur der linken, vorderen, absteigenden Koronararterie wurde ein akuter Herzinfarkt induziert.
30 Minuten nach der Ligation wurden bei 3 Hunden eine Stunde kontinuierlich 500 IU/kg KG Hyaluronatlyase in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung über die Femoralvene infundiert. Zur Kontrolle erhielten die anderen drei Hunde über den gleichen Zeitraum 100 ml physiologischer Kochsalzlösung ohne Zusatz von Hyaluronatlyase.
8 Stunden nach der Ligation wurden die Hunde getötet, die Herzen isoliert, gewogen und von der Spitze zur Basis in 1 cm dicke Scheiben geschnitten. Diese wurden dann zur Abgrenzung des infarzierten vom gesunden Myokard mit gepuffertem Nitroblue- Tetrazolium gefärbt. Das Gewicht des Infarktgewebes wurde entsprechend der planimetrischen Methode nach Roberts et al. bestimmt (Roberts AJ, Jacobstein JG, Cipriano PR, Alonso DR, Combes JR, Gay WA: Effectiveness of dipyridamole in reducing the size of experimental myocardial infarction. Circulation 61, S. 228-236, 1980).
Körpergewicht und mittleres Gewicht der isolierten Herzen der Kontrolltiere unterschieden sich nicht signifikant von den Meßwerten der mit Hyaluronatlyase behandelten Hunde. Das mittlere Gewicht des infarzierten Myokards betrug in der Kontrollgruppe 11,2 ± 1,8 g. Hyaluronatlyase reduzierte das Infarktgewebe signifikant (p < 0,02) auf 3,1 ± 0,4 g. Damit bestätigte sich der kardioprotektive Effekt mikrobieller Hyaluronatlyase in vivo.

Claims

1. Verwendung einer Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon zur Behandlung von postinfarktioneller Myokarditis und Myokardischämie.

2. Verwendung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Hyaluronatlyase oder das enzymatisch aktive Fragment davon für die Kardioprotektion unter und nach invasiven, chirurgischen bzw. diagnostischen Eingriffen am Herzen, z. B. Bypass- Operationen, Implantationen von Klappenprothesen, Schrittmacherversorgungen oder Koronarangiographien, zur Vermeidung von Reperfusionssyndromen sowie bei pectanginösen Beschwerden und akuten Myokardinfarkten appliziert wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass zwischen 100 IU und 1.000.000 IU, bevorzugt zwischen 1000 IU/kg KG bis 500.000 IU/kg KG, Hyaluronatlyase-Aktivität pro kg Körpergewicht (KG) appliziert werden.

4. Verwendung nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass ein Herzkatheter angewendet wird.

5. Verwendung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Hyaluronatlyase als Holoenzym oder das enzymatisch aktive Fragment davon oder eine Mischung beider Formen in Formulierungen, die gegebenenfalls Stabilisatoren und pharmazeutisch unbedenkliche Verdünnungsmittel bzw. Träger enthalten, appliziert oder injiziert werden.

6. Verwendung nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass in den Injektionslösungen bis 2.000.000 IU/ml neben in den Injektionslösungen üblichen Stabilisatoren und pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln bzw. Trägern enthalten sind.

7. Verwendung nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, dass in der über einen Katheter zugeführten Perfusionslösung die Hyaluronatlyase in Konzentrationen zwischen 50 IU/ml und 1.000.000 IU/ml neben in den Injektionslösungen üblichen Stabilisatoren und pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln bzw. Trägern enthalten sind.

8. Verwendung nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Hyaluronatlyase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, vorzugsweise aus Streptokokken der serologischen Gruppen B bzw. C, bevorzugt aus Streptococcus agalactiae oder Streptococcus equisimilis, durch mikrobielle Fermentation gewonnen wird.