DE69123099T2

DE69123099T2 - Vibrio-produzierte Protease enthaltende Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung in Debridement und Wundheilung

Info

Publication number: DE69123099T2
Application number: DE69123099T
Authority: DE
Inventors: Donald Richard Durham; Donald Zane Fortney
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1990-08-15
Filing date: 1991-07-29
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2011-07-30
Also published as: EP0472011B1; GR3022412T3; EP0472011A1; DE69123099D1; JP3253108B2; ATE145139T1; CA2046802A1; JPH05178761A; CA2046802C; US5505943A; NZ238954A; ES2094171T3; DK0472011T3

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine Continuation-in-part- Anmeldung der ebenfalls anhängigen, am 15. August 1990 eingereichten Us-Patentanmeldung Nr. 567 884.

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Débridement-Zusammensetzungen (debriding cmpositions) und Verfahren unter Verwendung derartiger Zusammensetzungen zum Débridement und/oder zur Wundheilung, die bestimmte Proteasen enthalten, welche durch Mikroorganismen der Gattung Vibrio produziert wurden. Insbesondere ist die Protease in der Lage, nekrotisches Gewebe wirksam abzubauen, während das lebensfähige, lebende Gewebe nicht wesentlich geschädigt wird. Die Protease weist ferner wundheilende Eigenschaften auf.

Hintergrund der Erfindung

Die Heilung von Wunden ist ein komplexer Vorgang, welcher häufig durch die Anwesenheit von nicht-lebensfähigem, nekrotischen Gewebe im Wundbereich weiter kompliziert wird. Das Débridement ist der Vorgang des Entfernens des nicht-lebensfähigen Gewebes aus einer Wunde, um eine Infektion zu verhindern und eine Heilung zu erleichtern.
Beträchtliche Anstrengungen sind unternommen worden, um Materialien aufzufinden, die in der Lage sind, zwischen lebensfähigem und nicht-lebensfähigem Gewebe zu unterscheiden. Das Auffinden von Materialien, die devitalisiertes Gewebe abbauen, nicht aber lebensfähiges Gewebe angreifen würden, würde es ermöglichen, das devitalisierte Gewebe ohne chirurgischen Eingriff zu entfernen. Es wäre ein nützliches therapeutisches Mittel bei nahezu sämtlichen Krankheitsverläufen, bei denen es erforderlich ist, topisch devitalisiertes Gewebe aus dem lebensfähigen Organismus zu entfernen, wie bei Verbrennungen, Dekubitalgeschwüren, Drucknekrosen, Schnitt-, traumatischen und pyogenen Wunden, sowie bei sekundären Geschwüren aufgrund einer peripheren Gefäßerkrankung.
Ein Bereich, dem eine beträchtliche Aufmerksamkeit gewidmet worden ist, ist die Verwendung von proteolytischen Enzymen und anderen Chemikalien zur Herbeiführung eines frühzeitigen Débridements von Schorfgewebe, welches aufgrund von Verbrennungen entsteht. Ein derartiges devitalisiertes Gewebe ist ein ausgezeichnetes Kulturmedium und die Hauptquelle der Septikämie als unmittelbare Todesursache bei den meisten Patienten mit schweren Verbrennungen.
Bei Verletzungen wird das devitalisierte Gewebe als Schorf bezeichnet. Der Schorf bei Verbrennungen ist eine komplexe Mischung aus getrocknetem Blut, eitrigen Exsudaten und denaturierten Proteinen, die normalerweise in den epidermalen und dermalen Hautschichten gefunden werden. Die im Schorf gefundenen denaturierten Proteine sind hauptsächlich Kollagen, Elastin, Fibrin, Hämoglobin und andere koagulierte Proteine.
Das Kollagen umfaßt etwa 75 % des Trockengewichts der Haut und ist der Hauptbestandteil der nekrotischen Zelltrümmer und des Schorfs. Das nekrotische Gewebe ist mit der Wundoberfläche durch Stränge aus halb-lebensfähigem, beeinträchtigtem Kollagen verankert, dessen schützende Mukopolysaccharidschicht beschädigt oder zerstört worden ist. Diese Stränge, die als eine Schicht von weißlichen, persistenten mikroskopischen Fibrillen in Erscheinung treten, sind als 'Kollagenmoos' bezeichnet worden; sie müssen vollständig eliminiert werden, damit das nekrotische Material von seiner Basis abgetrennt werden kann. Dieses vollständige Débridement erlaubt dann die Entwicklung von Granulations gewebe.
Damit ein proteolytisches Enzym als Débridement-Mittel insbesondere für Verbrennungen bestens geeignet ist, ist es wünschenswert, daß die Protease zwischen lebensfähigem und nicht-lebensfähigem Gewebe unterscheiden kann. Ferner sollte sie eine große Vielzahl von im Schorf gefundenen denaturierten Proteinen schnell und gründlich hydrolysieren können sowie bei physiologischem pH-Wert und bei physiologischer Temperatur arbeiten und mit zusätzlichen Therapien (z.B. Reinigungsmitteln, topischen Antibiotika) kompatibel sein. Schließlich sollte sie die normale Wundheilung nicht beeinträchtigen oder eine Hauttransplantation verkomplizieren, und sie sollte in zahlreichen Formulierungen und über einen weiten Temperaturbereich stabil bleiben. Eine Reihe von proteolytischen Enzympräparaten sind als Débridement-Mittel mit unterschiedlichem Erfolg eingesetzt worden.
Subtilisin, der aktive Bestandteil der Travase -Salbe (Constantine et al., EP-0 498 532), ist ein Präparat, welches proteolytische Enzyme enthält, die aus sterilen Filtraten von Bacillus subtilis erhalten worden sind, und repräsentiert ein anderes bekanntes enzymatisches Débridement-Mittel (Garrett, Clinical Medicine (1969), 76:11-15; und US-Patent Nr. 3 409 719). Crikelair (US-Patent Nr. 4 276 281) beschreibt die Verwendung von Elastase, einer vom Pankreas abgeleiteten Serinprotease, als enzymatisches Débridement-Mittel. Klein et al. (US-Patent Nr. 4 329 430) beschreiben eine von Bromelin abgeleitete proteolytische Enzymmischung, die zum Abbau, zur Dissektion und zur Abtrennung von nicht-lebensfähigem, devitalisierten Gewebe geeignet ist. Schmitt (US-Patent Nr. 3 983 209) lehrt die Behandlung von Verbrennungen bei Tieren durch Auftragen von Enzymen auf die Oberfläche einer Brandwunde, um ein Débridement von Schorf und von nekrotischem Gewebe herbeizuführen. Die offenbarten Enzyme schließen Papain, Trypsin, Lysozym, Streptokinase, Fibrinolysin, Pinguinain, Travase und Bromelain in einem spezifizierten hydrophoben Polymer ein. Die proteolytischen Enzyme wurden über langgestreckte Zeiträume durch Bioerosion langsam freigesetzt.
Merkel (US-Patent Nr. 3 677 900) offenbart, daß Kollagenasen, insbesondere solche, die von einer Vibrio-Spezies produziert werden, als Débridement-Mittel geeignet sind. Die Kollagenase nach Merkel ist jedoch ein Enzym, welches in der Lage ist, natives, nicht-denaturiertes Kollagen unter physiologischen Bedingungen des pH-Wertes und der Temperatur abzubauen, und welches nicht durch Serum inhibiert wird. Die Kollagenase von Merkel kann demgemäß wahrscheinlich nicht zwischen lebensfähigem und nicht-lebensfähigem Gewebe unterscheiden. Auch weisen die Kollagenasen eine sehr enge Substratspezifität auf. Ferner ist über die Kollagenase berichtet worden, daß sie lebensfähigem Hautgewebe signifikante Schäden zuführt, wodurch die Entwicklung von Granulationsgewebe und die Wundreifung reduziert werden (Hamit et al., Ann. Surg. (1960) 151:589).
Ferner ist im Hinblick auf proteolytische Enzyme spekuliert worden, daß sie zur Verhinderung von chirurgischen Adhäsionen geeignet sind (Ellis, Br. J. Surg. (1982) 69:241-243). Adhäsionen sind gekennzeichnet durch fibrinöse Bildungen, die sich innerhalb weniger Stunden nach operationsbedingtem Trauma entwickeln und durch das Einwandern von Fibroblasten und Blutkapillaren organisiert werden, um etablierte fibröse Adhäsionen zu bilden. Intra-abdominale Adhäsionen sind nach größerem operativen Eingriff in das Abdomen nahezu unvermeidlich. Diese Adhäsionen erfordern im Falle einer erneuten Operation im Bereich des Abdomens eine langwierige Dissektion mit dem Risiko einer viszeralen Schädigung, und sie können einen Darmverschluß auslösen. Zahlreiche Proteinpräparate sind mit unterschiedlichem Erfolg versuchsweise angewendet worden, um chirurgische Adhäsionen zu verhindern, einschließlich Heparin, Kortikosteroide, Antihistamine, Plasmin, Streptokinase, Dextran, und Gewebeplasminogenaktivator (Doody et al., Fertil and Steril (1989) 51:509-512), wobei sich kein Mittel als übereinstimmend wirksam erwiesen hat.
Obgleich andere proteolytische Mittel bekannt sind, die mit Débridement- und Anti-Adhäsions-Eigenschaften in Zusammenhang gebracht werden, haben sich viele dieser Mittel als unwirksam und eine lokale oder systemische Toxizität hervorrufend erwiesen. Keines der vorhergehenden proteolytischen Mittel verfügt über die überlegenen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung, einschließlich Débridement-Eigenschaften und die Fähigkeit zur Förderung der Wundheilung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Behandlung von Wunden, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen topischen Träger, der mit einer wirksamen Menge einer Protease vermischt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einer extrazellulären neutralen Protease, welche durch Kultivierung eines zur Gattung Vibrio gehörenden Mikroorganismus produziert wurde und durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:
i. hydrolysiert Komponenten von nekrotischem Gewebe einschließlich denaturiertes Kollagen, Elastin und Fibrin,
ii. hydrolysiert im wesentlichen kein natives Gewebe in vivo, und
iii. zeigt im Falle der Aufbewahrung bei 25 ºC in einer topischen Formulierung stabile Aktivität.
(b) einer Protease, die von rekombinanten Wirtszellen exprimiert wird, welche mit einem Expressionsvektor für die Protease (a) transformiert oder transfiziert worden sind; und
(c) Mutanten und Hybriden der Proteasen (a) und (b), die durch die Eigenschaften (i) bis (iii) gekennzeichnet sind.
Ferner werden die Vibrio-Protease umfassende Zusammensetzungen bereitgestellt zum Débridement von Wunden durch Kontaktieren einer Wunde mit einer wirksamen Menge derartiger Zusammensetzungen.
Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von Zusammensetzungen, die als Medikament zum Débridement von Wunden geeignet sind, wobei der aktive Inhaltsstoff eine Protease ist, die aus dem Vibrio-Stamm Vibrio proteolyticus ATCC 53559 isoliert wird. Ferner verfügt die Protease über eine DNA-Sequenz, wie sie in Figur 1 (SEQ ID NO. 1) dargestellt ist.
Ein weiteres Ziel liegt in der Bereitstellung von Zusammensetzungen zum Débridement von Wunden, bei denen der pharmazeutisch verträgliche topische Träger entweder hydrophob oder hydrophil ist. Hydrophile Formulierungen sind besonders bevorzugt. Die Zusammensetzungen zeigen im Falle der Lagerung bei 25 ºC eine wesentliche Enzymstabilität. Das Enzym zeigt im Falle der Aufbewahrung bei 25 ºC in einer topischen Formulierung etwa 80 % bis etwa 95 % Aktivität.
Ein weiteres Ziel liegt in der Bereitstellung von Zusammensetzungen, die aufgrund ihrer Débridement-Wirkungen bei einer großen Bandbreite von Wunden nützlich sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Behandlung von Brandwunden vollständiger und partieller Dicke; das Débridement von ulzerösen Läsionen, insbesondere Druck- (Dekubital-)Geschwüren und varikösen, Stauungs- und trophischen Ulzera; die Präparation von Hauttransplantationsstellen und allgemeinen chirurgischen Wunden wie Amputations-, Schnitt-, traumatischen und pyogenen Wunden; die Behandlung von Vaginitis, Zervizitis, Zirkumzisionen, Episiotomie, Pilonidalzystenwunden, Karbunkeln, Sonnenbrand, Erfrierungsschaden und Kataraktnarbengewebe.
Ein weiteres Ziel der Erfindung liegt in der Bereitstellung von Zusammensetzungen mit Wundheilungseigenschaften und in der Offenbarung ihrer pharmazeutischen Verwendung. Die Wundheilungseigenschaften schließen die Fähigkeit zur Beschleunigung der Heilung einer Wunde und auch die Fähigkeit ein, die Wundheilung zu verbessern (d.h. das Ansprechen auf einen taktilen Reiz aufrechtzuerhalten, geringere Narbenbildung, verbesserte Neovaskularisierung, etc.). Die Wundheilungseigenschaften schließen die Verhinderung von Adhäsionen ein, die durch chirurgische oder andere Wunden hervorgerufen werden. Die Wundheilung kann in vier wesentliche Abschnitte unterteilt werden: Entzündung, Angiogenese, Kollagenablagerung und Epithelialisierung. Sämtliche Abschnitte spielen bei der Heilung aller Wunden eine Rolle. Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen die Fähigkeit, eine Kontraktur der Wunde hervorzurufen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figur 1 (3 Seiten) ist eine Darstellung der DNA-Sequenz d&s Vibriolysin-Gens (SEQ ID NO. 1). Die dargestellte DNA-Sequenz umfaßt einen Teil eines 6,7 kb großen HindIII-Fragments des Gens von Vibrio proteolyticus (beschrieben im US-Patent Nr. 4 966 846), das für Vibriolysin kodiert). Es existiert ein offener Leserahmen ungefähr von den Basen 249-2078, in welchem die für Vibriolysin kodierende DNA-Region gefunden wird.
In der Figur 2 werden die Fähigkeiten von Vibriolysin, Travase und Kollagenase hinsichtlich der Wirkung auf das Substrat Fibrin verglichen.
In der Figur 3 werden die Fähigkeiten von Vibriolysin, Travase und Kollagenase hinsichtlich der Wirkung auf das Substrat denaturiertes Kollagen verglichen.
In Figur 4 werden die Fähigkeiten von Vibriolysin und Travase hinsichtlich der Wirkung auf das Substrat Elastin verglichen.
In der Figur 5 wird die Halbwertsstabilität einer hydrophilen Vibriolysin-Formulierung mit derjenigen einer hydrophilen/hydrophoben Travase-Formulierung bei 25 ºC verglichen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Proteasen sind gekennzeichnet durch eine Kombination von Eigenschaften, die sie zu idealen Kandidaten zur Verwendung beim Débridement von Wunden und bei heilenden Anwendungsformen machen. Im Wege der Veranschaulichung, nicht aber der Beschränkung, schließen derartige Eigenschaften ein:
i. Hydrolyse von Komponenten des nekrotischen Gewebes einschließlich denaturiertes Kollagen, Elastin und Fibrin;
ii. im wesentlichen keine Hydrolyse nativen Gewebes in vivo; und
iii. zeigt im Falle der Aufbewahrung bei 25 ºC in einer topischen Formulierung eine stabile Aktivität.
Die erfindungsgemäßen Proteasen sind in der Lage, zwischen lebensfähigem und nicht-lebensfähigem, nekrotischen Gewebe zu unterscheiden, und sie sind auch über ausgedehnte Zeiträume in Formulierungen aktiv, die für andere Proteasen ungeeignet sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung und der anhängenden Ansprüche werden die zuvor genannten Eigenschaften der erfindungsgemäßen Proteasen wie folgt bestimmt: Für die anfänglichen in vitro-Wirksamkeitsstudien über die erfindungsgemäßen Proteasen wurden mit Schorf assoziierte Gerüstproteine (z.B. denaturiertes Kollagen, Fibrin, denaturiertes Elastin) und natives Gewebe einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen. Zum Vergleich wurden die von Bacillus subtilis abgeleiteten Proteasen (Sutilaine) eingesetzt. Diese Proteasen werden in einer hydrophoben Grundlage formuliert und sind im Handel als Travase - Salbe erhältlich (Boots-Flint Laboratories, Morton Grove, IL). Die Proteasen aus der Travase-Salbe wurden entsprechend der Beschreibung in den offiziellen Monographien der United States Pharmacopoeia XXII (1990; S. 1306) extrahiert und werden vorliegend als Travase-Proteasen bezeichnet. Zur Ermittlung der Hydrolyse eines jeden Substrats wurden jeder Reaktionsmischung Vibriolysin und Travase-Proteasen auf der Grundlage äquivalenter Aktivitätseinheiten zugegeben, wie sie durch den nachfolgend beschriebenen Azocasein-Assay bestimmt wurden.

A. Azocasein-Hydrolyse

Azocasein ist ein leicht erhältliches Protein, welches als Standard zur Messung der Protease-Aktivität eingesetzt wird. Eine Proteaseprobe wird 10 Minuten lang bei 37 ºC in 50 mM Tris- HCl-Puffer (pH-Wert 7,4) enthaltend 1,0 mg/ml Azocasein (Sulfanilamidazocasein, Sigma Corp., St. Louis, MO) in einem Endvolumen von 0,5 ml inkubiert. Am Ende dieser Inkubationsdauer werden 0,5 ml einer 10%igen (Gew./Vol.) Trichloressigsäure zugegeben und sofort vermischt, und die resultierende Mischung wird anschließend 10 Minuten lang auf Eis aufbewahrt. Die Mischung wird sodann zentrifugiert, und die optische Dichte des resultierenden Überstandes wird bei 420 nm gegenüber einem Leerwert bestimmt, welcher entweder kein Enzym oder inaktiviertes Enzym in der gepufferten Azocaseinlösung enthält. Eine Aktivitätseinheit wird definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um eine Veränderung in der Absorption bei 420 nm von 2,5 hervorzurufen.

B. Ninhydrin-Assay

Die unspezifische Hydrolyse zahlreicher Substrate, die aus der Freisetzung von Peptiden und freien Aminosäen resultiert, wurde durch die Ninhydrin-Methode gemessen (Moore und Stein, J. Biol. Chem. (1948) 176:367), wie beschrieben in einer Modifikation des Verfahrens von Mandl et al. (J. Clin. Invest. (1953) 32:1323). 50 bis 100 µl einer geklärten Hydrolyseprobe wurden einer 1,0 ml Mischung zugegeben, die 0,5 ml 4 % Ninhydrin in Methylcellulose und 0,5 ml 0,2 M Zitronensäure enthielt (pH-Wert 5,0, enthaltend 7,1 mM Zinnchlorid). Die Lösung wurde 20 Minuten lang gekocht und anschließend in einem Eisbad abgekühlt. 50 µl wurden 1,0 ml 50 % n-Propanöl zugegeben, und die Absorption der Lösung wurde in einem Spektrophotometer von Shimadzu bei 600 nm gegen einen Wasser-Leerwert abgelesen. Leucin wurde als Referenzstandard eingesetzt.

Klinische Eigenschaften der Protease

Die erfindungsgemäßen Proteasen sind gut geeignet zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden, und sie sind insbesondere geeignet bei dem Débridement von Wunden und anderen Anwendungen zur Wundheilung. Die Eigenschaften können durch eine Reihe von Testsituationen demonstriert werden, einschließlich Tierversuche und klinische Studien am Menschen. Der am häufigsten angewendete Assay betrifft eine Brandwunde partieller Dicke bei Schweinen, beschrieben von Mertz et al. (Journal Surgical Research (1990) 48:245-248). Bei diesem Assay kann die formulierte Protease mit zahlreichen Kontrollen verglichen werden, um die Wirksamkeit zu ermitteln.
Beim Débridement von Wunden wird die Wirksamkeit neben anderen Indikationen bestimmt durch Abwesenheit, Erweichung oder Lösung von Schorf; Nicht-Hydrolyse von lebensfähigen Gewebekomponenten; und/oder Nicht-Irritation der Wunde. Bei der topischen Wundheilung wird die Wirksamkeit neben anderen Indikationen bestimmt durch Wundkontraktion, beschleunigte Heilung und/oder verbesserte Heilung (d.h. Aufrechterhaltung des Ansprechens auf einen taktilen Reiz, geringere Narbenbildung, verbesserte Neovaskularisierung, etc.).
Die wundheilenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Proteasen sind nicht nur auf topische Anwendungen beschränkt. Die wundheilenden Eigenschaften können die Verhinderung und möglicherweise die Behandlung von Adhäsionen einschließen, die durch chirurgische oder andere Wunden hervorgerufen wurden.
Wie bereits zuvor ausgeführt wurde, sind Adhäsionen Bündel von Fibrin und Kollagen, die sich anfänglich als fibrinöse Formationen, gewöhnlich im Abdomen, nach operationsbedingtem oder anderem Trauma entwickeln. Obgleich die meisten Adhäsionen nicht zu einer klinischen Morbidität führen, ist deren Rolle als ein Verursacher des Dünndarmverschlusses und der Infertilität bekannt.
In experimentellen Modellen können Adhäsionen durch thermisches oder mechanisches Traume, Ischämie, Entzündung oder Fremdmaterialien induziert werden. Ein gut bekanntes Modell zur Bestimmung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Protease bei der Reduktion einer Adhäsionsbildung ist das Modell eines Kaninchen- Uterinhorns (Doody et al., Fertil & Steril (1989) 51:509-512). Die Bestimmung der Wirksamkeit erfolgt in diesem Modell durch reduzierte Adhäsionsquantität und/oder reduzierte Adhäsionsdichte gegenüber Kontrollen.

Herstellung der Protease

Die erfindungsgemäßen Proteasen werden produziert durch Fermentation einer geeigneten Vibrio-Spezies in einem Nährmedium und anschließende Rückgewinnung der Protease aus der resultierenden Kulturbrühe. Die Fermentation wird aerob in z.B. einem Casein-Hydrolysat, NZ-Amin B, oder einem Sojamehl-Nährmedium enthaltend anorganische Salze wie Meersalze, Natriumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und bestimmte Spurenelemente bei einem pH-Wert von etwa 7,6 bis 8,6, vorzugsweise etwa pH-Wert 7,8, und bei einer Temperatur von etwa 25 ºC bis 30 ºC, z.B. etwa 27 ºC, durchgeführt, bis die Kultur die frühe stationäre Wachstumsphase erreicht.
Das Enzym kann anschließend aus der Fermentationsbrühe anhand herkömmlicher Verfahren gewonnen werden. Typischerweise wird die Brühe zuerst zentrifugiert oder filtriert, um den Zellanteil und unlösliches Material abzutrennen. Anschließend wird der Überstand konzentriert, z.B. durch Ultrafiltration. Das resultierende Ultrafiltrat kann als solches verwendet oder mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton oder anorganischen Salzen wie Ammoniumsulfat gefällt, nachfolgend zentrifugiert und einer Ionenaustauschchromatograpie oder Filtration zugeführt werden, um ein Enzym zu isolieren, welches für Débridement-Zusammensetzungen geeignet ist. Die Protease ist im lyophilisierten Zustand ebenfalls stabil. Zur Kultivierung des Vibrio-Mikroorganismus und zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Protease daraus können auch andere, dem Fachmann auf dem betreffenden Gebiet geläufige Verfahren angewendet werden.
Ein geeigneter Mikroorganismus zur Verwendung als Quelle für die Proteasen ist Vibrio proteolyticus, wobei ein hierfür besonders bevorzugter Stamm Vibrio proteolyticus mit der ATCC- Nr. 53559 ist. Eine lebensfähige Kultur dieses Mikroorganismus ist unwiderruflich bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, ohne Beschränkungen der Verfügbarkeit hinterlegt worden, und W.R. Grace & Co.-Conn. als Rechtsnachfolger versichern nach Erteilung eines Patents die permanente Verfügbarkeit der Kultur für die Öffentlichkeit durch die ATCC. Die DNA-Sequenz der von Vibrio proteolyticus (ATCC 53559) sezernierten Protease, vorliegend bezeichnet mit Vibriolysin, ist in Figur 1 dargestellt. Während Vibrio proteolyticus (ATCC 53559) die bevorzugte Proteasequelle umfaßt, können durch den Fachmann auf dem Gebiet leicht andere Spezies geeigneter Vibrio-Mikroorganismen identifiziert werden, indem die von ihnen unter Anwendung der oben dargelegten Verfahren produzierten Proteasen einem Screening zugeführt werden.
Zusätzlich zu der direkten Kultivierung einer Vibrio-Spezies können die erfindungsgemäßen Proteasen auch hergestellt werden, indem rekombinante Wirtszellen kultiviert werden, welche mit einem geeigneten Expressionsvektor transformiert oder transfiziert worden sind, der über ein Insert verfügt, welches das Strukturgen für die von Vibrio abgeleiteten erfindungsgemäßen Proteasen enthält. Solche vorgehensweisen können beispielsweise erwünscht sein, um die Proteaseausbeuten gegenüber den mit dem Wildtyp-Vibrio-Mikroorganismus erhaltenen zu steigern, oder um verbesserte Mutantenproteasen herzustellen.
Die Techniken zur Klonierung von Proteasen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie gut bekannt, und jegliches geeignetes Verfahren zur Klonierung kann zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteasen angewendet werden. Solche Verfahren werden z.B. beschrieben im US-Patent Nr. 4 468 464; EP-A-0 130 756; veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO 87/04461; und Loffler, Food Technology, Seiten 64-70 (Januar 1986).
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Klonierung der erfindungsgemäßen Vibrio-Proteasen ist im US-Patent Nr. 4 966 846 beschrieben. Entsprechend der Vorgehensweise dieses Patents wird zunächst eine Genbibliothek hergestellt, wobei die DNA von Vibrio-Zellen verwendet wird, von denen anhand der oben dargelegten Assays ermittelt worden ist, daß sie die erfindungsgemäßen Proteasen synthetisieren. Aus den Vibrio-Zellen wird chromosomale DNA nach bekannten Verfahren extrahiert und mit Restriktionsenzymen verdaut, um die DNA in große Fragmente zu spalten. Ein partieller Verdau mit Sau3A ist bevorzugt, obgleich andere Restriktionsenzyme (z.B. MboI, BamHI, etc.) verwendet werden können. Die DNA-Fragmente werden anschließend in Vektoren ligiert, die eine Isolierung von Klonen ermöglichen, welche das Proteaseenzym exprimieren. Ein für diesen Zweck bevorzugter Vektor ist der mit BamHI verdaute E. coli Cosmid-Vektor pHC79 (Bethesda Research Laboratories). Die rekombinanten Vektoren (d.h. pHC79-Cosmide, die DNA-Fragmente aus dem Protease-enthaltendem Genom enthalten) werden anschließend in Bakteriophagenpartikel, vorzugsweise Partikel des Bakteriophagen λ, verpackt, wodurch in den λ-Bakteriophagenpartikeln eine Genbibliothek hergestellt wird. Zur Herstellung einer Genbibliothek in Bakteriophagen wird ein Cosmid-Vektor oder λ-Vektor verwendet. In anderen Fällen können Plasmidvektoren eingesetzt werden.
Die resultierenden Bakteriophagenpartikel werden anschließend verwendet, um die DNA-Fragmente der Genbibliothek in geeignete gramnegative Wirtszellen einzuführen. Vorzugsweise werden die rekombinanten Bakteriophagenpartikel verwendet, um E. coli, wie z.B. den E. coli-Stamm HB101 zu transfizieren, obgleich gewünschtenfalls auch andere E. coli-Stämme verwendet werden können. Da E. coli-Stämme auf natürliche Weise kein extrazelluläres neutrales Proteaseenzym synthetisieren, können die E. coli-Klone in bezug auf die Anwesenheit und Expression des Proteasegens leicht durch die nachfolgend beschriebenen Assays bewertet werden.
Es ist bekannt, daß Vibrio-Kolonien, die Proteaseenzym synthetisieren, auf Milch-Agarplatten aufgrund der proteolytischen Hydrolyse der Caseinkomponente von Milch eine Klärungszone bilden. Nicht-rekombinante E. coli-Kolonien sezernieren natürlicherweise keine Protease. Demgemäß werden die erfindungsgemäßen E. coli-Klone, die das Proteasegen enthalten, leicht durch diesen Assay identifiziert. Dieser Milchklärungs-Assay wird bevorzugt für E. coli und andere Wirtsstämme angewendet, die nicht auf natürliche Weise eine extrazelluläre Protease produzieren. Andere gramnegative und grampositive Stämme können als Wirte verwendet werden.
Eine Bestätigung kann durch Anwendung anderer Protease- Assays erfolgen. Beispielsweise können Klone hinsichtlich der Expression des Proteaseenzyms bestätigt werden, indem gezeigt wird, daß die Kulturbrühen dieser Klone in der Lage sind, Substrate wie Hide powder azure, Azocoll oder N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-alanyl-phenylalaniamid (FAAPA) zu hydrolysieren. Alternativ können diese Assays im ersten Schritt angewendet werden, um die das Proteasegen enthaltenden Klone zu identifizieren.
Es ist in zweierlei Hinsicht wichtig, daß die Expression des neutralen Proteasegens in E. coli und anderen "nicht-sezernierenden" Wirten (d.h. in Wirten, die natürlicherweise keine Protease sezernieren) durch eine Zone der Klärung auf einer Milchagarplatte nachgewiesen werden kann. Zum einen ist dies ein Beweis dafür, daß das aktive, funktionelle Enzym von dem gramnegativen Wirt synthetisiert wird. Zum anderen ist das extrazelluläre Vorliegen der Protease auf den Milchagarplatten ein Beweis dafür, daß das Enzym in gewisser Weise, entweder durch Sekretion oder durch Zellyse, externalisiert wird. Da E. coli und gewisse andere gramnegative Bakterien normalerweise keine signifikanten Mengen an Proteasen in das Medium sezernieren, ist dies im Hinblick auf die Fähigkeit, Proteaseenzyme zu gewinnen, die als Ergebnis der Expression von Vibrio-Proteasegenen in diesen nicht-sezernierenden Wirten produziert worden sind, wichtig.
Mutanten und Hybride der vorstehenden Proteasen, welche im wesentlichen die bevorzugten Leistungseigenschaften behalten, können ebenfalls eingesetzt werden. Vorliegend bezieht sich der Ausdruck "Mutante" auf eine Protease, die verglichen mit Wildtyp- oder Mutterenzymen eine Veränderung in der Aminosäuresequenz aufweisen. "Hybrid" betrifft gentechnisch hergestellte Proteasen, welche Aminosäuresequenzen von zwei oder mehreren Mutterenzymen kombinieren und beiden gemeinsame Eigenschaften aufweisen.
Techniken zur Präparation von Mutantenproteasen sind dem Fachmann gut bekannt und schließen die Bestrahlung oder die chemische Behandlung eines Mikroorganismus sowie ortsgerichtete Mutagenese ein. Die Mutagenese durch Bestrahlung oder Chemikalien ist im Grunde ein zufälliger Prozeß und kann ein langwieriges Selektieren und Screening erfordern, um Mikroorganismen zu identifizieren, die Enzyme mit den erwünschten Eigenschaften produzieren. Bevorzugte Mutantenenzyme für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden demgemäß durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt. Diese Vorgehensweise beinhaltet die Modifikation des Enzymgens, so daß in dem Proteaseenzym Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen von mindestens einer Aminosäure an einer vorbestimmten Stelle produziert werden. Techniken zur ortsgerichteten Mutagenese sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und werden z.B. in der EP-A-0 130 756 sowie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 87/04461 beschrieben.
Bei einer derartigen Vorgehensweise, bekannt als Kassetten- Mutagenese, werden stumme Restriktionsstellen in das Proteasegen eingeführt, durch die das Target-Kodon oder die Target-Kodons eng flankiert werden. Doppelsträngige synthetische Oligonukleotid-Kassetten werden anschließend in die Lücke zwischen den Restriktionsstellen ligiert. Die Kassetten werden so hergestellt, daß die kodierende Sequenz in der Lücke wieder hergestellt wird und ein verändertes Kodon an dem Target-Kodon eingeführt wird.
Die Anwendung derartige Vorgehensweisen auf die Vibrio-Mutterproteasen kann erwünscht sein, um die Eigenschaften der Wildtyp- oder Mutterproteasen zu verbessern. Beispielsweise können die Methionin-, Histidin-, Cystein- oder Tryptophanreste in oder um die aktive Stelle der Protease herum ausgetauscht werden, um die Stabilität gegenüber chemischer Oxidation zu verbessern, wie vorgeschlagen von Estell et al., J. Biological Chemistry, Bd. 260, Nr, 11, Seiten 2518-2521 (1985).
Hybride der Mutter- oder Wildtyp-Proteasen können gleichermaßen hergestellt werden durch bekannte Verfahren zum Protein- Engineering, die analog zu der oben diskutierten Kassetten-Mutagenese sind, indem eine Region des Gens eines Mutterenzyms (die nicht von Vibrio abgeleitet zu sein braucht) in das Gen eines zweiten Mutterenzyms ligiert wird.

Formulierung und Verabreichung

Die Formulierungen der Débridement-Protease unter Verwendung verfügbarer Hilfs- und Trägerstoffe werden nach im Stand der Technik bekannten Standardverfahren hergestellt. Die Protease kann in Salben, Lotionen, Gele, Pasten, Schäume, Aerosole oder immobilisiert auf Kügelchen formuliert werden. Die Protease kann auch in einem Wundverband, -pflaster oder in einer Wundgaze immobilisiert werden. Die Enzymformulierungen können entweder hydrophil oder hydrophob sein. Beispiele für hydrophobe Grundlagen schließen Paraffinmineralöl ein, und hydrophile Grundlagen schließen Petrolatum-Propylen-Wasser-Grundlagen ein. Hydrophile Formulierungen sind bevorzugt, insbesondere, wenn das Enzym in der Formulierung während der Lagerung bei Raumtemperatur stabil ist. Die Gründe für die Bevorzugung schließen unter anderem ein, daß die Temperatur des Präparates vor der Verabreichung auf die Wunde nicht erhöht zu werden braucht. Wichtiger ist, daß die Enzyme in einer hydrophilen Salbe für die Hydrolyse von nekrotischem Gewebe zugänglicher sind, und daß die Salbe im Gegensatz zu einer hydrophoben Grundlage leicht durch Waschen mit Kochsalzlösung von der Wunde entfernt werden kann. Zusätzliche Wirkstoffe einschließlich Antibiotika, Feuchthaltemittel, Desoxyribonukleasen, Fibronektin, Wachstumsfaktoren wie Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), die transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGF-1 und IGF-2), und/oder Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) und dergleichen, können gewünschtenfalls in die Formulierung eingeschlossen werden.
Die topische Verabreichung ist zum Débridement von Wunden am geeignetsten, obgleich unter bestimmten Bedingungen andere Wege der Verabreichung erwünscht sein können. Topische Standardformulierungen werden eingesetzt unter Verwendung von z.B. 0,01- 10 Gew.-% Protease. Derartige Formulierungen werden 1 bis 6mal täglich auf den erkrankten Bereich aufgetragen. Die Applikation und Konzentration der Salbe oder einer anderen Formulierung hängt natürlich von der Schwere und der Art der Wunde sowie von der Natur des Individuums ab.
Eine topische Verabreichung ist ebenfalls geeignet, um die Vaskularisierung und Heilung von traumatisiertem Gewebe zu stimulieren. Die Substrate schließen Verbrennungen, Knochenbrüche, chirurgische Schürfwunden wie solche bei plastischer Chirurgie, Schnittverletzungen, Rißwunden, Druckgeschwüre, langsam heilende Geschwüre, Tendonitis, Bursitis, Vaginitis, Zervizitis, Zirkumzisionen, Episiotomie, Pilonidalzystenwunden, Karbunkel, Sonnenbrand und Erfrierungsschaden ein.
Eine lokale oder möglicherweise systemische Verabreichung ist geeignet zur Verhinderung oder möglicherweise zur Behandlung von Adhäsionen, die durch chirurgische oder andere Wunden verursacht sind. Eine lokale Verabreichung kann mittels Injektion, subkutanem Implantat oder durch eine langsam freisetzende Formulierung erfolgen, die in direkter Nähe zum Target implantiert wird. Die Implantation ist insbesondere unter chirurgischen Bedingungen direkt ausführbar. Langsamfreisetzende Formulierungen können bekanntermaßen in Polymere formuliert werden. Die Konzentration der Protease in der Formulierung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Schwere der Erkrankung und der Geschwindigkeit, mit der die Protease aus dem Polymer freigesetzt wird.
Die folgenden Abkürzungen sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung der Erfindung verwendet worden:
HBO&sub3; - Borsäure
CaCl&sub2; - Calciumchlorid
CaSO&sub4; - Calciumsulfat
cm - Zentimeter
CuSO&sub4; - Kupfersulfat
ºC - Grad Celsius
g - Gramm
I.M. - intramuskulär
kb - Kilobasenpaare
MgSO&sub4; - Magnesiumsulfat
MnCl&sub2; - Manganchlorid
mg - Milligramm
ml - Milliliter
mm - Millimeter
mM - millimolar
M - molar
mS - Millisemen
nm - Nanometer
O.D. - optische Dichte
% - Prozent
K&sub2;HPO&sub4; - Kaliumphosphat
NaOH - Natriumhydroxid
Na&sub2;MoO&sub3; - Natriummolybdat
Na&sub2;SO&sub4; - Natriumsulfat
H&sub2;O - Wasser
Gew./Vol. - Gewicht zu Volumen
ZnSO&sub4; - Zinksulfat

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele dienen der spezifischen Veranschaulichung der Ausführung der vorliegenden Erfindung, sie sollen jedoch in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung beschränken.

Beispiel 1 Herstellung von Vibriolysin

V. proteolyticus ATCC 53559 wurde in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung (g oder ml pro Liter) kultiviert: NZ- Amin B, 40; Na&sub2;SO&sub4;, 25; Dextrose, 10; K&sub2;HPO&sub4;, 4; MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,4; Darastil-8270 (Dearborn), 0,1 ml und 6,1 ml einer Spurenelementelösung. Die Lösung von Spurenelementen umfaßt (Gramm pro Liter) die folgenden: ZnSO4 7H&sub2;O, 18,29; MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 18,86; CaSO&sub4; 2H&sub2;O, 0,91 g, HBO&sub3;, 0,07; und Na&sub2;MoO&sub4; 2H&sub2;O, 0,04. Vor der Sterilisierung wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.
V. proteolyticus wurde entweder in 1,5 oder 10 Liter Fermentern kultiviert. Die das zuvor genannte Medium enthaltenden Fermenter wurden mit 1 % (Vol./Vol.) Kultur inokuliert, die durch Kultivierung von V. proteolyticus in Schüttelkolben, die Medium mit derselben Zusammensetzung enthielten, für eine Zeitdauer von 20 Stunden erhalten wurden. Die Fermentationen erfolgten bei 28 ºC, 1000-1250 UpM und bei einer Belüftung von 1,0 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute. Der pH-Wert der Fermentation wurde durch automatische Zugabe eines Säure- und Basentitrationsmittels auf einem pH-Wert von 7,8 gehalten.
Das Wachstum von V. proteolyticus wurde überwacht durch Messung der optischen Dichte bei 640 nm, und die Proteaseaktivität wurde überwacht durch den zuvor beschriebenen Azocasein-Assay. Während der frühen stationären Wachstumsphase der Fermentation erreicht die Produktprotease Titer von ungefähr 85.200 bis 127.800 Azocasein-Einheiten/Liter, was anhand des zuvor beschriebenen Azocasein-Assays gemessen wurde. Die Kulturbrühe wurde geernted durch Zentrifugation, um den Zellanteil abzutrennen.
Der die proteolytische Aktivität enthaltende Überstand wurde konzentriert unter Verwendung eines Amicon SlOY10 spiral wound filter (Amicon Corp., Lexington, MA). Das Konzentrat wurde mit 10 mM Tris-Puffer enthaltend 1 mM CaCl&sub2; diafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Retentats ungefähr 1 mS betrug und der pH-Wert neutral war. Dieses Material wurde lyophilisiert und bei -20 ºC bis zur Verwendung oder Formulierung zu einer Salbe aufbewahrt.

Beispiel 2 Fibrin-Hydrolyse

Fibrin ist eine Proteinkomponente, die im Schorf von Wunden und bei der Ausbildung von Adhäsionen gefunden wird. Um die fibrinolytische Aktivität zu messen, wurde humanes Plasmafibrin (Sigma) bei 37 ºC in einem Reaktionsgefäß hydrolysiert, welches 10,0 mg Fibrin pro ml 100 mM TES (N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2- aminoethansulfonsäure)-Puffer (pH-Wert 7,5) enthaltend 0,9 % NaCl und 0,1 mM CaCl&sub2; enthielt. Die Testenzyme Vibriolysin und Travase wurden den Reaktionslösungen in einer Konzentration von 10 Einheiten/ml (Azocasein-Einheiten) unter konstantem Mischen zugegeben; Kollagenase (0,14 mg/ml, Sigma; Typ VII) wurde dem Reaktionsansatz zugegeben. Die Proben wurden periodisch entnommen und durch Anwendung des zuvor beschriebenen Ninhydrin-Assays auf freie Aminogruppen analysiert.
Die Geschwindigkeit der Hydrolyse von humanem Fibrin durch Vibriolysin war ungefähr 4mal so schnell wie die mit Travase- Proteasen festgestellte Geschwindigkeit (Figur 2). Ferner war die Hydrolyse von Fibrin extensiver. In 1 Stunde wurden 26 % des Fibrinsubstrats durch Vibriolysin hydrolysiert, wohingegen dieser Wert für die Travase-Proteasen 7,5 % betrug. Diese Daten sind im hohen Maße signifikant, da von anderen berichtet worden ist, daß Travase Fibrin im Vergleich zu anderen Schorfkomponenten am wirksamsten hydrolysiert (P.G. Shakespeare et al., Burns (1979), 6:15-20). Kollagenase zeigte wie erwartet keine Hydrolyse von Fibrin (Figur 2).

Beisiel 3 Hydrolyse von denaturiertem Kollagen

Es ist gezeigt worden, daß Schorf bei tiefen Hautverbrennungen oder Geschwüren in erster Linie aus denaturiertem Kollagen besteht, welches an lebensfähiges Gewebe gebunden ist. Demgemäß muß ein wirksames Débridement-Mittel die Kollagenkomponente von nekrotischem Gewebe verdauen. Um die Hydrolyse von Kollagen zu ermitteln, wurden zwei Kollagenquellen verwendet: humanes Plazentakollagen (Sigma, Typ IV) und Kollagen der Archillessehne von Rindern (Worthington Biochemicals). Das letztgenannte Substrat wurde 2 Minuten lang auf 100 ºC erhitzt, um das Kollagen zu denaturieren.
Im Falle der Hydrolyse von humanem Plazentakollagen enthielten die Reaktionsmischungen 2,0 mg Kollagen pro ml Tris-HCl- Puffer (pH-Wert 7,5) enthaltend 0,1 mM CaCl&sub2;. 10 Azocasein-Einheiten eines jeden Testenzyms wurden jeder Reaktionsmischung zugegeben, welche bei 37 ºC präequilibriert worden war. Kollagenase (0,14 mg/ml) wurde ebenfalls einer Reaktionsmischung zugegeben. Proben wurden periodisch entnommen, und freie Aminosäuren und kleine Peptide wurden anhand des zuvor beschriebenen Ninhydrin-Assays ermittelt.
Die Hydrolyse von humanem Plazentakollagen durch Vibriolysin und Travase-Proteasen ist in Figur 3 dargestellt. Die Daten zeigen, daß Vibriolysin gegenüber Travase-Proteasen eine überlegene Kollagen-hydrolytische Aktivität aufweist und hinsichtlich der Aktivität mit Kollagenase vergleichbar ist.
Im Falle der Hydrolyse von denaturiertem Archillessehnenkollagen enthielten die Reaktionsmischungen 10 mg Kollagen pro ml 100 mM TES-Puffer (pH-Wert 7,5) enthaltend 0,9 % NaCl und 0,1 mM CaCl&sub2;. Fünf Azocasein-Einheiten pro ml einer jeden Protease wurden den Reaktionslösungen zugegeben, die zuvor bei 37 ºC präinkubiert worden waren; 0,1 mg Worthington Kollagenase (CLSIII) wurden ebenfalls verwendet. Die Hydrolyse von Kollagen wurde als Funktion der Zeit anhand des zuvor beschriebenen Ninhydrin-Assays ermittelt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE I
Wie bereits ausgeführt worden ist, zeigte Vibriolysin verglichen mit den Travase-Proteasen eine außergewöhnliche Aktivität gegenüber Kollagen, und der Verdau von Kollagen durch Kollagenase und Vibriolysin war vergleichbar. Das erfindungsgemäße Enzym bietet aufgrund seiner Wirksamkeit beim Abbau von Kollagenfasern, aus denen das hartnäckig haftende, devitalisierte Wundgewebe zusammengesetzt ist, eine vielversprechendere Therapie zur Behandlung von Verbrennungen oder Geschwüren.

Beisiel 4 Elastin-Hydrolyse

Elastin repräsentiert eine untergeordnete Komponente der menschlichen Haut (3 %). Die Hydrolyse dieses Substrats wurde bestimmt mit Reaktionslösungen, die 6,6 mg Elastin-Kongorot (Sigma) pro ml 100 mM TES-Puffer (pH-Wert 7,5) enthaltend 0,9 % NaCl und 0,1 mM CaCl&sub2; enthielten. Enzyme (Vibriolysin und Travase) wurden Reaktionslösungen (37 ºC) in einer Konzentration von 5 Azocasein-Einheiten pro ml zugegeben; 0,75 ml umfassende Proben wurden periodisch entnommen, zu 0,5 ml 0,7 M Sorensen-Puffer (pH-Wert 6,0) zugegeben und sofort zentrifugiert. Die Absorption der Überstände wurde bei 495 nm gemessen.
Die Hydrolyse von Elastin ist in Figur 4 dargestellt. Wiederum hydrolysiert Vibriolysin diese Komponente von nekrotischem Gewebe auf Grundlage äquivalenter Einheiten ein bißchen besser als Travase-Proteasen.

Beisiel 5 Lagerbeständigkeit bei Raumtemperatur

Die Lagerbeständigkeit für Vibriolysin, vermischt mit einer hydrophoben und hydrophilen Salbe, wurde bei Raumtemperatur ( 25 ºC) ermittelt. Vibriolysinpulver wurde in einer Konzentration von 1200 Azocasein-Einheiten pro Gramm Grundlage mit (1) einer Paraffin-Mineralöl-Grundlage (hydrophob) und (2) einer Petrolatum-Propylenglykol-Wasser-Grundlage (hydrophil) vermischt. Da Travase in einer hydrophoben Salbe formuliert wird, wurde ein Teil dieses Materials mit einem Teil einer hydrophilen Salbe vermischt, um zu versuchen, die hydrophilen Bedingungen für Vibriolysin partiell zu simulieren.
Vibriolysin wurde aus der hydrophoben Salbe nach dem USP- Verfahren zur Extraktion von Travase-Proteasen extrahiert. Die hydrophile Formulierung wurde direkt mit TES-Puffer extrahiert. Die verbleibende proteolytische Aktivität wurde anschließend durch Hydrolyse von Azocasein ermittelt.
Die Lagerstabilität von Vibriolysin in einer hydrophilen Grundlage bei Raumtemperatur sowie die verbleibende Aktivität von Travase-Proteasen in der hydrophob-hydrophilen Mischzusammensetzung sind in Figur 5 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß Vibriolysin über die 60tägige Inkubationsdauer eine ausgezeichnete Stabilität aufweist (> 80 % verbleibende Aktivität). Verglichen hiermit behielten die Proteasen aus der Travase-Formulierung lediglich 43 % ihrer ursprünglichen Aktivität bei. Beide Enzyme zeigten für eine hydrophobe Grundlage bei Raumtemperatur eine vergleichbare Lagerbeständigkeit.

Beisiel 6 In Vivo-Studie

Zur Ermittlung der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Protease beim Débridement in vivo wurden weiße Hausschweine ausgewählt aufgrund ihrer morphologischen und funktionellen Ähnlichkeiten zwischen ihrer Haut und menschlicher Haut. Demgemäß wurde ein junges, spezifisch pathogenfreies (SPF) Schwein mit einem Gewicht von 15-20 kg 2 Wochen vor Beginn des Experiments gehalten. Das Tier wurde mit einer Grunddiät ad libitum ernährt und individuell in Versuchstiereinrichtungen mit kontrollierter Temperatur (19-21 ºC) und Licht (12 Std./12 Std. HD) gehalten. Das Versuchstier wurde vorbereitet und betäubt, bevor 96 Brandwunden auf den äußeren 2/3 des Versuchstieres gemäß Darlegung von Mertz et al. [Journal Surgical Research (1990), 48:245-248] gesetzt wurden. Die Brandwunden wurden in vier Behandlungsgruppen unterteilt und in spezifischen Zeitabständen während einer 6tägigen Untersuchungsdauer bewertet. Die Brandwunden wurden einer der folgenden Behandlungsgruppen zugeführt:
(1) Vibriolysin in Silvadene -Creme (Marion) (1200 Einheiten pro g), (2) Travase-Salbe (1200 Einheiten pro g), (3) Silvadene- Kontrollcreme, (4) keine Behandlung zur Kontrolle. Sämtliche Behandlungsgruppen wurden mit einem Tegaderm -Polyurethanverband abgedeckt, welcher gasdurchlässig und klar ist und einen Schutz vor einem äußeren mikrobiellen Angriff bietet. Die Behandlungen erfolgten unmittelbar oder verzögert, um die Verhinderung von Schorfbildung bzw. das Débridement von gehärtetem Schorf (96 Stunden nach der Verbrennung) zu ermitteln.
Bei den Kontrollgruppen dieses Experiments bildeten die Wunden, welche keine Behandlung erfahren hatten, nach 4 Tagen relativ harten Schorf, wohingegen eine Behandlung von Brandwunden mit Silvadene-Creme zu ein bißchen weicherem Schorf fuhrte.
Die an den Tagen 1, 2 und 3 mit Travase-Salbe behandelten Brandwunden entwickelten eine konkave Konfiguration, welche durch Abtasten offensichtlich war. Zusätzlich wurden um die Wunden herum während der 6tägigen Behandlungsdauer Erytheme beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Behandlung mit Travase die Tiefe der Nekrose vergrößerte und die umgebende Haut irritierte. Diese Beobachtungen stimmen mit denjenigen von Za wacki [Surgery (1974, 77:132] überein, der zeigte, daß Travase nicht nur marginal lebensfähige Zellen zerstörte, sondern das Ausmaß der Verletzung bei einer Verbrennung zweiten Grades tatsächlich vergrößert. Der Schorf von Verbrennungen, die an den letzten Tagen des Experiments (nach Schorfentwicklung) behandelt wurden, begann weich zu werden und löste das nekrotische Gewebe innerhalb von 24 Stunden der Behandlung auf. Es wurden jedoch Erytheme festgestellt.
Vibriolysin verhinderte eine signifikante Schorfbildung bei Brandwunden, die unmittelbar nach der Verletzung eine Behandlung erfuhren. Anders als bei der Behandlung mit Travase, welche zu einer Vertiefung der Wunden führte, wurden die Komponenten lebensfähigen Gewebes durch Vibriolysin-Salbe nicht hydrolysiert. In höchst signifikanter Weise zeigten die mit Vibriolysin behandelten Wunden eine durch eine kleinere Schorfgröße angezeigte Wundkontraktur. Die Behandlung der Brandwunden an den Tagen 4, 5 und 6 (nach Schorfentwicklung) führte zu einer Erweichung und Auflösung des Schorfes innerhalb von 24 Stunden, wie durch die Erweichung von Wundoberflächen, das Volumen an generierter Flüssigkeit, und die Abwesenheit von Fibrin-Krustenbildung angezeigt wurde. Ein leichtes Erythem wurde für lediglich für eine Behandlungsdauer - 4 Tage nach der Verbrennung beobachtet. Folglich ist das erfindungsgemäße Enzym anders als andere derartige Enzymprodukte ein wirksames Débridement-Mittel, welches die Wundheilung fördert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden, die mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt, welcher mit einer Protease vermischt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer extrazellulären neutralen Protease, welche durch Kultivierung von Vibrio proteolyticus ATCC 53559 produziert wurde, wobei die Protease durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:

i. hydrolysiert Komponenten von nekrotischem Gewebe einschließlich denaturiertes Kollagen, Elastin und Fibrin,

ii. hydrolysiert im wesentlichen kein natives Gewebe in vivo; und

iii. zeigt im Falle der Aufbewahrung bei 25 ºC in einer topischen Formulierung für mindestens 60 Tage eine Aktivität von 80 % bis 95 %;

(b) einer Protease, die von rekombinanten Wirtszellen exprimiert wird, welche mit einem Expressionsvektor für die Protease (a) transformiert oder transfiziert worden sind; und

(c) Mutanten und Hybriden der Proteasen (a) und (b), die durch die Eigenschaften (i) bis (iii) gekennzeichnet sind.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Protease eine DNA-Sequenz (SEQ ID NO. 1) gemäß Darstellung in Figur 1 aufweist.

3. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei der der Träger hydrophob ist.

4. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei der der Träger hydrophil ist.

5. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 4, welche ferner Antibiotika umfaßt.

6. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 5, welche ferner Mittel zur Wundheilung umfaßt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, bei der die Mittel zur Wundheilung Wachstumsfaktoren sind.

8. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 7, welche zur topischen Verabreichung geeignet ist.

9. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 7, welche zur Injektion oder Implantation geeignet ist.

10. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 9, wobei die Protease ferner durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, eine Wundkontraktur zu bewirken.

11. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 10, welche zum Débridement von Wunden geeignet ist.

12. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 10, welche zur Wundheilung geeignet ist.

13. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 10, welche zur Verhinderung oder zur Behandlung von chirurgischen Adhäsionen geeignet ist.

14. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 10, welche zur Entfernung nekrotischen Gewebes von einer Wunde geeignet ist.

15. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 10, welche zur Behandlung von Verbrennungen geeignet ist.

16. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 10, welche zur Hydrolyse von Schorf bei Brandwunden geeignet ist.