LU86445A1 - Composition d'activateur tissulaire du plasminogene - Google Patents

Description

> i l

Composition d'activateur tissulaire du plasminogène.

«

La présente invention concerne l'activateur tissulaire du plasminogène et, en particulier, des compositions pharmaceutiques contenant l'activateur tissulaire du plasminogène, leur préparation et leur utilisation en médecine humaine et vétérinaire.

On admet qu'il existe un équilibre dynamique » 1

K

entre le système enzymatique capable de former les caillots de sang, à savoir le système de coagulation, et le système enzymatique capable de dissoudre les caillots de sang, à savoir le système fibrinolytique, qui maintient la perméabilité du système vasculaire intact. Pour limiter la perte de sang après une blessure, des caillots de sang se forment dans les vaisseaux atteints. Après la guérison naturelle de la blessure, les caillots de sang superflus sont dissous sous l'effet du système fibrinolytique. A l'occasion, des caillots de sang se forment en 1'absence de traumatisme et peuvent se loger dans des vaisseaux sanguins importants, conduisant à une interruption partielle ou même totale de l'écoulement du sang. Lorsqu'il en est ainsi dans le coeur, les poumons ou le cerveau, le résultat peut être un infarctus du myocarde, un embole pulmonaire ou une congestion cérébrale. Ces conditions associées constituent la cause principale de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés.

Les caillots de sang consistent en un réseau fibreux qui est capable d'être dissous par la plasmine qui est une enzyme protéolytique. Cette enzyme est issue de la proenzyme inactive ou plasminogène, qui est un constituant du plasma du sang, sous l'action d'un activateur du plasminogène. Il existe chez les mammifères deux activateurs du plasminogène qui sont immuno-logiquement distincts. L'activateur intrinsèque du plasminogène, dit aussi urokinase, est une enzyme produite par les reins et peut être isolée de l'urine. Elle peut s'obtenir aussi à partir de différentes cultures de tissu. L'activateur extrinsèque du plasminogène, dit aussi activateur vasculaire du plasminogène ou activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), peut être isolé de nombreux produits d'homogénéisation de tissus (notamment l'utérus humain), de la paroi des

CD.YD.F - 2 - A747B

% cellules vasculaires et de certaines cultures de cellules. En plus de ces deux variétés d'activateur du plasminogène, il existe aussi un produit bactérien, à savoir la Streptokinase, obtenue à partir de streptocoques bêta-hémolytiques. Un inconvénient majeur de l'urokinase et de la Streptokinase est qu'elles sont actives dans toute la circulation et non uniquement au site d'un caillot de sang. Par exemple, elles peuvent détruire d'autres protéines du sang, comme le fibrinogène, la prothrombine, le facteur V et le facteur VIII, réduisant ainsi l'aptitude du sang à coaguler et augmentant donc le risque d'hémorragie. Au contraire, l'activité biologique du t-PA dépend de la présence de la fibrine à laquelle il se combine et où il est activé. Une activité maximale est donc acquise uniquement au site d'un caillot de sang, c'est-à-dire en présence du réseau de fibrine à dissoudre, ce qui affaiblit beaucoup le risque d'hémorragie.

La voie principale d'administration t-PA est la perfusion intravasculaire, ce qui nécessite donc que le t-PA soit présent à l'état de solution parentérale. Il est généralement souhaitable qu'une solution parentérale contienne son principe actif en concentration élevée. Il en est ainsi parce que le médecin ou le vétérinaire peut alors obtenir la concentration requise dans une situation donnée quelconque simplement en diluant la solution avec un supplément de solvant. De plus, il n'est pas souhaitable d'administrer un volume important de solution à un patient atteint de troubles cardiaques ou rénaux, parce que le coeur ou les reins pourraient se trouver sollicités encore davantage. Le volume doit donc être maintenu au minimum par l'utilisation d'une composition plus concentrée. D'autre part, toute solution parentérale de ce genre doit être stable dans le sens qu'il ne peut y avoir de tendance notable

CD.YD.F - 3 - A747B

à la précipitation du principe actif hors de la solution, ni lors de la conservation, ni lors d'une dilution quelconque.

Un certain nombre de solutions parentérales de t-PA ont été décrites en termes généraux dans les documents EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112 122, EP-A-113 319, EP-A-123 304, la publication de brevet japonais 57-120523 (demande 56-6936) et la publication de brevet japonais 58-65218 (demande 56-163145). Ces compositions sont des solutions aqueuses salines de t-PA dont le pH est à peu près neutre et dont l'inconvénient est que la solubilité du t-PA dans ces solutions est faible en 1'absence d'augmentation de la concentration ionique. Par conséquent, les compositions ont de faibles concentrations en t-PA, ce qui nécessite parfois d'administrer à un patient des volumes exagérément importants de solution, ou bien sont hypertoniques et peuvent nuire aux globules rouges lorsqu'elles sont administrées.

La Demanderesse a découvert à présent que la solubilité du t-PA dans une solution parentérale aqueuse peut être améliorée si le pH de la solution se situe dans le domaine acide et que lors de l'administration, l'acidité d'une telle solution ne suscite pas d'inconvénients physiologiques notables. Par conséquent, l'invention a pour objet une solution parentérale aqueuse de t-PA dont le pH est de 2 à 5.

En conséquence de la meilleure solubilité du t-PA, la solution parentérale conforme à l'invention peut avoir des concentrations élevées en t-PA sans aucun risque notable que le t-PA précipite hors de la solution. La Demanderesse a découvert, en outre, que la concentration du t-PA dans une telle solution peut être abaissée aisément par dilution avec de l'eau dont le pH est à la neutralité ou dans le domaine acide â nouveau

CD.YD.F - 4 - A747B

sans risque sensible qu'il y ait précipitation du t-PA. La présente invention a donc pour objet une solution parentérale stable qui offre une plus grande souplesse de manipulation et d'usage aux médecins et vétérinaires.

Le t-PA à utiliser conformément à l'invention peut être toute protéine bioactive correspondant sensiblement à du t-PA de mammifère et spécialement du t-PA humain et comprend les formes avec et sans glycosylation. Il peut être du t-PA monocaténaire ou bica-ténaire ou un mélange de ceux-ci, comme décrit dans le document EP-A-112 122 et, dans le cas du t-PA humain complètement glocosylé, il a un poids moléculaire apparent sur gel de polyacrylamide d'environ 70.000 et un point isoélectrique entre 7,5 et 8,0. De préférence, le t-PA présente une activité spécifique d'environ 500.000 Ul/mg (Unités Internationales par mg), l'Unité Internationale étant une unité d'activité telle que définie par WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, Londres, NW3 6RB, G.B.).

La séquence des aminoacides du t-PA correspond de préférence sensiblement à celle indiquée à la Fig. 1. La séquence est donc identique à celle de la Fig. 1 comprend une ou plusieurs délétions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'aminoacides d'origine allélique ou autre, la séquence résultante ayant au moins 80% et de préférence 90% d'homologie avec la séquence de la Fig. 1 et conservant sensiblement les propriétés biologiques et immunologiques de la protéine. En particulier, la séquence du t-PA est identique à celle de la Fig. 1 ou est la même séquence, mais dont l'aminoacide â la 245ême position à partir de la N-terminaison de la sérine est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence

CD.YD.F - 5 - A747B

étant éventuellement amputée de l'un quelconque des trois premiers aminoacides ou comprenant éventuellement une préséquence de Gly-Ala-Arg supplémentaire N-terminale du polypeptide.

La séquence des aminoacides indiquée à la Fig. 1 comprend trente-cinq restes de cystéine et est donc à même de former dix-sept ponts disulfure. Sur base de l'analogie avec d'autres protéines dont la structure a été déterminée plus dans le détail, la structure postulée pour la séquence (résultant de la formation des ponts disulfure) entre l'aminoacide à la 90ème position et la C-terminaison de proline est indiquée a la Fig. 2. La structure de la région N-terminale est moins certaine, bien que diverses propositions aient été avancées (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273? et Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 81, 5355-5359). Les particularités les plus importantes de la structure du t-PA sont les deux régions en anneau (entre les 92ème et 173ème aminoacides et entre les 180ème et 261ème aminoacides), qui sont responsables de la liaison de la protéine sur la fibrine, et la région de sérine protéase qui comprend la majeure partie de la chaîne B et qui est responsable de l'activation du plasminogène. Les aminoacides d'une importance spéciale dans les sérine protéases sont la triade catalytique, His/Asp/Ser. Dans le t-PA, ceux-ci apparaissent aux 322ème, 371ème et 463ème positions. Le pont disulfure entre les restes de cystéine aux positions 264 et 395 est important aussi parce qu'il maintient les chaînes A et B assemblées dans la forme bicaténaire du t-PA.

Dans les Fig. 1 et 2, les codes conventionnels à une et trois lettres ont été utilisés pour les restes des aminoacides comme indiqué ci-après :

Asp D Acide aspartique Ile I Isoleucine

Thr T Thréonine Leu L Leucine

CD.YD.F - 6 - A747B

Ser S Sérine Tyr Y Tyrosine

Glu E Acide glutamique Phe F Phénylalanine

Pro P Proline His H Histidine

Gly G Glycine Lys K Lysine

Ala A Alanine Arg R Arginine

Cys C Cystéine Trp W Tryptophane

Val V Valine Gin Q Glutamine

Met M Méthionine Asn N Asparagine

Le t-PA peut être obtenu suivant l'un quelconque des procédés décrits ou déjà connus. Par exemple, il peut être obtenu au départ d'une lignée de cellules normales ou néoplasiques du type décrit dans Biochimica et Biophysica Acta, 1970, 580, 140-153; EP-A-41 766 ou EP-A-113 319. Il est cependant préféré que le t-PA soit obtenu à partir d'une lignée de cellules transformées ou transfectées mises en culture, obtenue suivant la technique de l'ADN recombinant ainsi qu'il est décrit, par exemple dans EP-A-93 619; EP-A-117 059 ou EP-A-117 060. Il est particulièrement préféré d'utiliser pour la production du t-PA des cellules d'ovaire de hamster de Chine (cellules CHO) qui s'obtiennent de la façon décrite dans Molecular and Cellular Biology, 1985 5(7), 1750-1759. De cette façon, le gène cloné est cotransfecté avec le gène codant pour la dihydrofolate réductase (dhfr) dans des cellules CHO dhfr“. Les transformants exprimant dhfr sont sélectionnés sur des milieux exempts de nucléosides et sont exposés à des concentrations croissantes de méthotrexate. Les gènes dhfr et t-PA sont ainsi coampli fiés et conduisent à une lignée cellulaire stable capable d'exprimer des teneurs élevées de t-PA.

Le t-PA est de préférence purifié suivant l'un quelconque des modes opératoires décrits ou déjà connus tels que ceux décrits dans Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6),

CD.YD.F - 7 - A747B

1998-2003? ibid., 1981, 256(13), 7035-7041; Eur. J. Biochenu, 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766? EP-A-113 319 ou GB-A-2 122 219.

Il ne semble pas exister de limite supérieure â la solubilité du t-PA dans la solution parentérale. Aux concentrations fort élevées, par exemple supérieures à 150.000.000 UI par ml (Unités Internationales par ml), la solution devient simplement visqueuse sans aucune précipitation notable du t-PA. La concentration du t-PA dans la solution parentérale peut donc varier dans de larges limites, par exemple de 50.000 à 50.000.000 UI par ml. Pour tirer l'avantage maximal de la présente invention, il est préféré que la concentration du t-PA soit supérieure à 100.000 UI par ml, plus spécialement supérieure à 500.000 UI par ml et, en particulier, supérieure à 1.0000.000 UI par ml. Il est le plus particulièrement préféré que la concentration du t-PA soit d'environ 5.000.000 UI par ml.

La limite supérieure du pH de la solution parentérale est de préférence de 4,5. En fait, le pH se situe de préférence dans l'intervalle de 2,5 à 4,0 et plus avantageusement de 2,8 à 3,5 et est le plus avantageusement d'environ 3,0. Le pH souhaité de la solution parentérale est avantageusement établi au moyen d'un acide inorganique ou organique physiologiquement acceptable. Des exemples pour un tel acide sont notamment l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide nitrique, outre l'acide citrique, l'acide tartrique et l'acide benzènesulfonique. Parmi ces composés, l'acide chlorhydrique est préféré.

Bien que l'un ou l'autre cosolvant physiologiquement acceptable puisse éventuellement être présent en plus de l'eau, il est préféré que le milieu pour la solution parentérale soit entièrement ou sensiblement aqueux.

CD.YD.P - 8 - A747B

La solution parentérale peut être hypertonique, hypotonique ou isotonique par rapport au sérum du sang du patient. Toutefois, pour éviter des effets secondaires indésirables, la solution parentérale est de préférence isotonique, bien que de faibles écarts ne soient pas de grande importance physiologique. Une solution parentérale sensiblement isotonique peut être obtenue par addition d'un agent physiologiquement acceptable qui est capable d'amener la pression osmotique de la solution à la valeur souhaitée. Des exemples d'un tel agent sont bien connus et sont notamment le dextrose (sous forme anhydride ou monohydratée) et le chlorure de sodium, outre leurs mélanges. La concentration de l'agent dans la solution parentérale varie évidemment d'un agent à l'autre. Dans le cas du chlorure de sodium, la concentration est de préférence de 7 à 10 mg par ml et plus avantageusement d'environ 8,5 mg par ml, qui est celle de la solution physiologique salée ou simplement solution physiologique souvent mentionnée. Dans le cas du dextrose anhydre, la concentration est de préférence de 30 à 70 mg par ml et plus avantageusement d'environ 50 mg par ml. Au cas où la concentration du t-PA dans une solution parentérale sensiblement isotonique doit être abaissée, il est préféré d'exécuter la dilution avec une solution aqueuse du même agent a la même concentration de façon à conserver une solution sensiblement isotonique.

La solution parentérale peut facultativement contenir les additifs normalement associés à des compositions de ce genre. Un exemple en est l'albumine de sérum humain. De plus, le t-PA a tendance s'absorber sur les surfaces de verre et de matière plastique et il est dès lors souhaitable d'ajouter à la solution parentérale un agent surfactif pour prévenir ou réduire au minimum cette absorption. Des exemples d'un tel

CD.YD.F - 9 - A747B

agent sont notamment les dérivés polyoxyéthyléniques des esters partiels d'acides gras avec des anhydrides de sorbitol, comme ceux commercialisés sous la marque déposée "Tween 80".

L'un des avantages surprenants de la présente invention, en dehors de la solubilité sensiblement accrue du t-PA, est que l'utilisation d'une solution parentérale acide ayant un pH tombant entre les limites définies ici ne semble exercer aucun effet physiologique défavorable notable lors de l'administration au patient. Il semblerait que le sang en circulation soit de façon générale à même d'élever le pH de la solution jusqu'à la neutralité à peu près dès que le contact se fait, le t-PA étant réparti rapidement dans le sang qui circule. Il est cependant préféré que ce processus ne soit pas sensiblement entravé de l'une ou l'autre façon et que la solution parentérale ne contienne pas d'agent tampon puissant. Un agent tampon faible qui n'inhibe pas sensiblement le processus peut cependant être incorporé et, en effet, à un pH du domaine acide, le t-PA intervient comme s'il était son propre tampon. De plus, l'albumine du sérum humain est à même d'agir comme agent tampon faible.

En raison de la solubilité sensiblement accrue du t-PA dans la solution parentérale conforme à l'invention, il n'y a aucune nécessité d'ajouter un constituant supplémentaire quelconque, comme la lysine ou 1'ornithine ou bien un sel de celles-ci, pour augmenter la solubilité du t-PA.

La solution parentérale peut être préparée suivant les modes opératoires et techniques habituels de mise en composition pharmaceutique, au moyen de t-PA sous forme de solide ou de solution purifiée. La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'une solution aqueuse parentérale de t-PA

CD.YD.F - 10 - A747B

, t comme défini ici, suivant lequel : (i) on obtient une solution purifiée de t-PA et on échange le milieu contre un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, ou (ii) on dissout du t-PA dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, et on stérilise la solution résultante.

La purification du t-PA peut comprendre au stade final l'élution de la protéine hors d'une colonne chromatographique à l'état de solution contenant un agent tampon puissant. Comme déjà indiqué, il est préféré que la solution parentérale ne contienne pas d'agent tampon puissant et, dès lors, un moyen commode pour assurer son élimination pendant l'échange du milieu est de recourir à la dialyse. Celle-ci peut être exécutée dans un tube à dialyse ou un rein artificiel dans lequel la solution purifiée est dialysée contre un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5. Il peut être souhaitable, spécialement si la concentration du t-PA dans la solution purifiée est élevée, d'ajuster d'abord le pH de la solution de façon qu'il soit de 2 à 5. Un autre moyen pour assurer l'élimination d'un agent tampon puissant pendant l'échange du milieu est de soumettre la solution purifiée à une filtration sur gel et de développer la colonne à l'aide d'un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5.

Le t-PA sous la forme d'un solide précipité peut être obtenu, par préférence, à partir d'une solution purifiée en ajustant le pH à environ 5,5, en refroidissant la solution jusque juste au-dessus de son point de congélation et en récoltant la protéine, par exemple, par centrifugation. Le solide précipité peut être ensuite dissous de façon classique dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5.

La stérilisation de la solution résultante

CD.YD.F - 11 - A747B

? » » a ! t L.

peut être exécutée de façon classique, par exemple par passage au filtre stérilisant.

La solution parentérale est normalement présentée dans des récipients de verre ou de matière plastique stériles et scellés. Elle peut être présentée aussi sous des formes monodoses, par exemple dans des ampoules, fioles ou dispositifs d'injection jetables, ou sous des formes multidoses, comme des flacons ou poches pour perfusion. Le volume de solution à présenter dans de tels récipients peut varier beaucoup, mais est avantageusement de 0,5 â 20 ml.

Pour stabiliser le t-PA, la solution parentérale est de préférence congelée et maintenue de -10 à -30°C.

L'activité biologique du t-PA pour dissoudre le réseau de fibrine des caillots de sang s'est traduite par son utilité dans le traitement des troubles thrombotiques (The Lancet, 7 novembre 1981, 1018-1020; ibid., 13 avril 1985, 842-847; The New England Journal of Médecine, 1984, 310(10), 609-613; et ibid., 1985 312(14), 932-936). La présente invention a dès lors pour objet un procédé pour le traitement d'un trouble thrombotique chez un mammifère, qui comprend l'administration d'une solution parentérale aqueuse de t-PA comme défini ici à ce mammifère. Par ailleurs, elle a aussi pour objet une solution parentérale aqueuse de t-PA comme défini ici à l'usage de la médecine humaine ou vétérinaire, spécialement pour le traitement d'un trouble thrombotique.

Des exemples particuliers de troubles thrombotiques sont bien connus et sont notamment l'infarctus du myocarde, la thrombose veineuse profonde, l'embole pulmonaire et la congestion cérébrale.

La voie principale d'administration de la solution parentérale est la perfusion intravasculaire,

CD.YD.F - 12 - A747B

, \ spécialement intraveineuse, mais il est concevable de recourir à d'autres voies d'administration, comme l'administration intramusculaire. Les perfusions intravasculaires sont normalement exécutées au moyen de la solution parentérale contenue dans un flacon ou une poche pour perfusion ou dans une seringue pour perfusion à fonctionnement électrique. La solution peut être injectée du flacon ou de la poche pour perfusion au patient, soit par gravité, soit au moyen d'une pompe de perfusion. Les systèmes de perfusion à alimentation par gravité n'offrent pas une maîtrise suffisante sur le débit d'administration de la solution parentérale et le recours à une pompe de perfusion est dès lors préféré, spécialement avec les solutions ayant des concentrations relativement élevées en t-PA. Il est toutefois davantage préféré d'utiliser une seringue pour perfusion à fonctionnement électrique qui permet une maîtrise encore plus précise du débit d'administration.

Une quantité efficace de t-PA pour le traitement d'un mammifère atteint d'un trouble thrombotique dépend évidemment d'un certain nombre de facteurs notamment, par exemple, l'âge et le poids du mammifère, l'affection précise nécessitant le traitement et sa gravité, outre la voie d'administration et est laissée en dernier recours à l'appréciation du médecin ou du vétérinaire. Il est cependant probable qu'une quantité efficace pour la dissolution d’un thrombus dans une artère coronaire, par exemple, se situera dans l’intervalle de 150.000 à 450.000 UI par kg de poids du corps du patient et par heure. Ainsi, chez l'être humain adulte d'un poids de 70 kg, une quantité horaire efficace sera, dans le cas général, de 10.000.000 à 30.000.000 UI, et spécialement d'environ 20.000.000 UI, cette quantité pouvant être administrée avec ou sans

CD.YD.F - 13 - A747B

, » dose d'attaque. Il est probable aussi que la dose sera inférieure pour certains états thrombotiques, comme la thrombose veineuse profonde ou la thrombose cérébrale aiguë, ou simplement pour l'entretien de la perméabilité d'une artère coronaire déjà reperfusée. Dans de tels cas, une quantité efficace sera généralement de 7.000 à 36.000 UI par kg de poids du corps du patient et par heure.

Les exemples ci-après illustrent l'invention et ne sont nullement à concevoir comme la limitant. EXEMPLE 1,-

On purifie par chromatographie une récolte clarifiée de t-PA, obtenue au départ d'une lignée de cellules CHO transformées mises en culture qu'on a préparée suivant le mode opératoire de Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, et on recueille le t-PA sous la forme d'une solution aqueuse contenant du citrate de sodium 0,1 M et 0,01% (p/v) de Tween 80 à un pH de 5,5. On ajuste le pH de la solution à 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique et on concentre la solution résultante par ultrafiltration sur une cartouche H-10 (Amicon Ltd, üpper Mill, Stonehouse, Gloucestershire, Angleterre). On obtient de la sorte une solution aqueuse purifiée concentrée de t-PA (2.500.000 UI par ml) contenant du citrate de sodium (0,1 M), du chlorure de sodium 0,23 M (provenant de l'addition de l'acide chlorhydrique) et 0,01% (p/v) de Tween 80 et ayant un pH de 3,0. On introduit cette solution dans un tube de dialyse opérant la coupure de poids moléculaire à environ 14.000 et on la dialyse à 4°C contre quatre quantités successives de 50 volumes de solution physiologique salée stérilisée par filtration (à 0,85% (p/v) de chlorure de sodium) contenant 0,01% (p/v) de Tween 80 et ajustée à pH 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. On poursuit la dialyse

CD.YD.F - 14 - A747B

, t à chaque stade pendant 12 heures. Après avoir recueilli la solution aqueuse hors du tube de dialyse, on la stérilise par filtration et on la dilue à 500.000 UI par ml de t-PA avec de la solution physiologique salée. On introduit la solution parentérale résultante ensuite dans des fioles en verre qu'on scelle et qu'on congèle * et conserve à -20°C.

EXEMPLE 2.-

On purifie par chromatographie une récolte clarifiée de t-PA, obtenue au départ d'une lignée de cellules CHO transformées mises en culture qu'on a préparée suivant le mode opératoire de Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, et on recueille le t-PA sous la forme d'une solution aqueuse contenant du citrate de sodium 0,17 M et 0,01% (p/v) de Tween 80 à un pH de 5,5. On ajuste le pH de la solution à 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique et on concentre la solution résultante par ultrafiltration sur une cartouche H-10 (Amicon Ltd, Upper Mill, Stonehouse, Gloucestershire, Angleterre). On purifie davantage la solution aqueuse concentrée en l'appliquant sur une colonne de filtration sur gel (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Suède) qu'on élue avec de la solution physiologique salée à 0,85% contenant 0,01% (p/v) de Tween 80 à un pH de 3,0. On obtient ainsi une solution aqueuse hautement purifiée de t-PA qu'on concentre une fois encore à l'aide d'un rein artificiel jetable. On précipite le t-PA hors de la solution en élevant le pH jusqu'à 5,5 au moyen d'hydroxyde de sodium et en maintenant la suspension à 4°C pendant 2 heures. On recueille t-PA par centrifugation à 4000 g pendant 30 minutes à 4°C. On redissout le culot de t-PA dans une solution aqueuse de chlorure de sodium (à 0,85% (p/v)) contenant 0,01% (p/v) de Tween 80 et ajustée à pH 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique. Le

CD.YD.F - 15 - A747B

, ) ♦ volume de solution physiologique utilisé est celui nécessaire pour établir une concentration en t-PA entre 7.500.000 et 10.000.000 UI par ml. On dilue cette solution de t-PA avec un supplément de solution aqueuse de chlorure de sodium (à 0,85% (p/v)) contenant 0,01% (p/v) de Tween 80 et ajustée à pH 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique et aussi avec suffisamment de solution à 10% (p/v) de mannitol dans la même solution physiologique salée acide pour arriver à des concentrations finales de 5.000.000 UI par ml de t-PA et 25 mg par ml de mannitol. On stérilise par filtration la solution résultante qu'on conditionne en aliquotes de 1 ml dans des fioles en verre qu'on congèle et conserve à -20°C. EXEMPLE 3.-

On évalue l'effet thrombolytique de la solution parentérale de 1 ' exemple 1 sur un modèle in vivo de thrombose à la veine jugulaire.

(a) Mode opératoire.

Le mode opératoire expérimental est essentiellement celui décrit par Collen et collaborateurs (J. Clin. Invest., 1983, 71_, 368-376).

On laisse dégeler la solution parentérale de l'exemple 1 et on la dilue avec de la solution salée isotonique stérile ajustée à pH 3,0 contenant 0,01% de Tween 80 pour obtenir suffisamment de solution pour une perfusion de 2 heures à 500.000 UI par kg de t-PA. On effectue la perfusion au moyen d'une canule dans la veine fémorale droite. On utilise pour cette étude, trois lapins blancs de Nouvelle Zélande. On évalue le degré de thrombolyse après la perfusion.

(b) Résultats.

Le pourcentage de thrombolyse est de 22,3 + 4,2, ce qui démontre l'efficacité thrombolytique de la solution parentérale de l'exemple 1. De plus, on n'observe lors de la perfusion de cette solution aucune

CD.YD.F - 16 - A747B

, t réaction défavorable.

CD.YD.F - 17 - A747B

Claims (24)

1. Solution parentérale aqueuse de t-PA, caractérisée en ce que son pH est de 2 à 5.

2. Solution parentérale suivant la revendica- „ tion 1, caractérisée en ce que t-PA est de la forme monocaténaire ou bien de la forme bicaténaire.

3. Solution parentérale suivant la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le t-PA a la séquence des aminoacides indiquée à la Fig. 1 ou a la même séquence des aminoacides, mais dont l'aminoacide à la position 245 à partir de l'extrémité N-terminale de la sérine est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence étant éventuellement exempte de l'un quelconque des trois premiers aminoacides ou comprenant éventuellement une préséquence de Gly-Ala-Arg supplémentaire N-terminale du polypeptide.

4. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le t-PA est obtenu à partir d'une lignée de cellules transfectées ou transformées mises en culture obtenue suivant la technique de l'ADN recombinant.

5. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en = ce que la concentration du t-PA est supérieure à 100.000 UI par ml.

6. Solution parentérale suivant la revendication 5, caractérisée en ce que la concentration du t-PA est supérieure 500.000 UI par ml.

7. Solution parentérale suivant la revendication 6, caractérisée en ce que la concentration du t-PA est supérieure â 1.000.000 UI par ml.

8. Solution parentérale suivant la revendication 5, caractérisée en ce que la concentration du t-PA est d'environ 5.000.000 UI par ml. CD.YD.F - 18 - A747B ç « 1

9. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que son pH est de 2 à 4,5.

10. Solution parentérale suivant la revendication 9, caractérisée en ce que son pH est de 2,5 à 4,0.

11. Solution parentérale suivant la revendication 10, caractérisée en ce que son pH est de 2,8 à 3,5.

12. Solution parentérale suivant la revendication 11, caractérisée en ce que son pH est d'environ 3,0.

13. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le milieu est entièrement ou sensiblement aqueux.

14. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent physiologiquement acceptable qui rend la solution sensiblement isotonique par rapport au sérum du sang humain.

15. Solution parentérale suivant la revendication 14, caractérisée en ce que l'agent physiologiquement acceptable est le chlorure de sodium.

16. Solution parentérale suivant la revendication 14, caractérisée en ce que l'agent physiologiquement acceptable est le dextrose.

17. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent surfactif.

18. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est sensiblement non tamponnée.

19. Solution parentérale suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée CD.YD.P - 19 - A747B i \ ► en ce qu'elle est sensiblement exempte de lysine ou d'ornitïiine ou d'un sel de celles-ci.

20. Solution parentérale aqueuse saline de t-PA, caractérisée en ce que son pH est de 2 à 5.

21. Procédé de préparation d'une solution parentérale telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que : (i) on obtient une solution purifiée de t-PA et on échange le milieu contre un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, ou (ii) on dissout du t-PA dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, et on stérilise la solution résultante.

22. Procédé de traitement d'un trouble thrombotique chez un mammifère/ caractérisé en ce qu'on administre au mammifère une solution parentérale telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 20.

23. Solution parentérale telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 20 à l'usage de la médecine humaine et vétérinaire, spécialement pour le traitement d'un trouble thrombotique.

24. Récipient scellé d'une solution parentérale telle que définie dans 1'une quelconque des revendications 1 à 20 et 23. CD.YD.F - 20 - A747B