SE462893B - Vattenhaltig parenteral loesning av vaevnadsplasminogenaktivator och saett foer framstaellning av den - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 C)"\ FJ CT; \O U« E 2 ur många vävnadshomogenater (främst människans livmoder), den vaskulära cellväggen och ur vissa cellkulturer.

Förutom dessa två typer av plasminogenaktivatorer finns också en bakteriell produkt, streptokinas, som framställs från beta-hemolytiska streptokocker. En huvudnackdel med såväl urokinas och streptokinas är att de är aktiva över hela cirkulationskretsen och icke endast vid stället för ett blodkoagel. De kan exempelvis förstöra andra blodproteiner, såsom fib- rinogen, protrombin, faktor V och faktor VIII, var- igenom blodlevringsförmågan reduceras och risken för blödning ökar. I motsats härtill är den biologiska aktiviteten av t-PA i beroende av närvaron av fibrin, till vilket den binds och där den aktiveras. Maximal aktivitet framkallas sålunda endast vid stället för ett blodkoagel, dvs i närvaro av fibrinnätverket som skall lösas upp, varigenom risken för blödning väsent- ligt minskas.

Huvudsättet att administrera t-PA är intravaskulär infusion, vilket alltså kräver en parenteral lösning med t-PA. Det är generellt önskvärt att en parenteral lösning innehåller en hög medikamentkoncentration.

Detta har sin anledning i att läkaren eller veterinären då i varje situation kan få den önskade koncentrationen helt enkelt genom att spä ut lösningen med lösningsmedel eller medium. Därutöver är det otillrådligt att admi- nistrera en stor volym av lösning till en patient som har hjärt- eller njurdefekter, eftersom detta skulle sätta hjärtat eller njurarna under en ännu större påkänning. Volymen bör därför hållas så liten som möjligt genom användning av mera koncentrerade sammansättningar. Samtidigt bör den parenterala lös- ningen vara stabil i så måtto att medikamentet icke har någon väsentlig tendens att fällas ut ur lösningen, vare sig under lagring eller under en utspädningsope- ration.

Flera parenterala lösningar av t-PA har beskrivits 10 15 20 25 30 35 4» Cß G3 QD U! 3 i generella termer i EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-ll2 122, EP-A-ll3 319, EP-A-123 304, japansk patentpublikation 57-120523 (ansökan 56-6936) och japansk patentpublikation 58-65218 (ansökan 56-163145).

Sammansättningarna är vattenhaltiga saltlösningar av t-PA, där pH är ungefär neutral, och är förknippade med nackdelen att lösligheten av t-PA i sådana lös- ningar är låg i frånvaro av en ökning i jonkoncentra- tionen. Följaktligen har sammansättningarna antingen låg koncentration med avseende på t-PA, vilket i vissa situationer kräver administrering av oönskvärt stora lösningsvolymer till en patient, eller hypertonisk karaktär, något som vid administrering kan vara för- ödande för de röda blodkropparna.

Det har nu visat sig att lösligheten av t-PA i en vattenhaltig parenteral lösning kan ökas om lös- ningens pH ligger inom ett surt område, och att vid administrering surheten av en sådan lösning icke skapar några väsentliga fysiologiska problem. Följaktligen skapar föreliggande uppfinning en vattenhaltig paren- teral lösning av t-PA, vars pH är från 2 till 5.

Till följd av den ökade lösligheten av t-PA är den parenterala lösningen enligt uppfinningen i stånd att få högre koncentrationer med avseende på t-PA utan någon väsentlig risk för att t-PA faller ut ur lösningen. Vidare har det visat sig att koncentratio- nen av t-PA i en sådan lösning lätt kan minskas genom utspädning med vatten med neutralt eller surt pH, även här utan någon väsentlig risk för att t-PA faller ut. Föreliggande uppfinning skapar därför en stabil parenteral lösning som medger större flexibilitet i hantering och användning av läkare och veterinä- rer. t-PA som används i föreliggande uppfinning kan vara ett godtyckligt, bioaktivt protein som väsentligen motsvarar mammalisk, och i synnerhet human, t-PA och innefattar former med och utan glykosylering. Den kan 10 15 20 25 30 35 4 vara en- eller tvâkedjig t-PA, eller en blandning härav, såsom beskrivs i EP-A-112 122 och, när det gäller fullständigt glykosylerad human t-PA, den har en skenbar molekylvikt på polyakrylamidgeler på ca 70 000 och en isoelektrisk punkt på mellan 7,5 och 8,0. Företrädesvis har t-PA:n en specifik aktivitet på ca 500 000 IU/mg (International Units/mg, där International Unit är en enhet för aktivitet definie- rad av WHO, National Institute for Biological Standars and Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW2 6RB, U.K).

Aminosyrasekvensen av t-PA motsvarar, företrädes- vis, väsentligen sekvensen i fig l. Sekvensen är sålunda identisk med den i fig l eller innehåller en eller fler aminosyradeletioner, -substitutioner, -insertioner, - inversioner eller -additioner av alleliskt ursprung eller annat, varvid den resulterande sekvensen har åtminstone 80% och företrädesvis 90% homologi med sekvensen i fig 1 och kvarhåller väsentligen proteinets biologiska och immunologiska egenskaper. I synnerhet är t-PA sekvensen identisk med sekvensen i fig 1 eller har samma sekvens men med aminosyran i position 245 från serinets N-terminal varande valin i stället för metionin, varvid varje sekvens valfritt kan sakna någon av de första tre aminosyrorna eller valfritt har en ytterligare polypeptid N-terminal presekvens av Gly-Ala-Arg.

Aminosyrasekvensen i fig l har trettiofem cystein- rester och sålunda potential för bildning av sjutton disulfidbryggor. Baserat på analogi med andra proteiner vars struktur har bestämts mera i detalj, visas i fig 2 den postulerade strukturen för sekvensen (här- rörande från disulfidbindningen) mellan aminosyran i position 90 och prolinets C-terminal. Strukturen av det N-terminala området är mindre säker, ehuru vissa förslag har blivit framlagda (Progress in Fib- rinolysis, 1983, Q, 269-273; och Proc. Natl. Acad. Sci., 10 15 20 25 30 35 fv '* É' oïfo 4.62 5 1984, ål, 5355-5359). De viktigaste särdragen hos strukturen av t-PA är de två kringelområdena (mellan 92:a och l73:e aminosyrorna och mellan de l80:a och 26l:a aminosyrorna) som sörjer för bindningen av protei- net till fibrin, och serinproteasområdet, som innehåller huvuddelen av B-kedjan och som ansvarar för aktiveringen av plasminogen. Aminosyrorna av speciell betydelse i serinproteaser är den katalytiska triaden, His/Asp/Ser.

I t-PA uppträder dessa i positionerna 322, 371 och 463. Disulfidbryggan mellan 264:e och 395:e cystein- aminosyraresterna är också viktig, i det att den hop- håller A och B-kedjorna i den tvåkedjiga formen av t-PA.

I fig l och 2 har de konventionella en- och tre- bokstavskoderna använts för aminosyraresterna enligt följande: Asp D Asparaginsyra Ile I Isoleucin Thr T Treonin Leu L Leucin Ser S Serin Tyr Y Tyrosin Glu E Glutaminsyra Phe F Fenylalanin Pro P Prolin His H Histidin Gly G Glycin Lys K Lysin Ala A Alanin Arg R Arginin Cys C Cystein Trp W Tryptofan Val V Valin Gln Q Glutamin Met M Metionin Asn N Asparagin t-PA:n kan erhållas enligt vilken som helst av de procedurer som beskrivs eller är kända inom området.

Exempelvis kan den erhållas ur en normal eller neoplas- tisk cellinje av den typ som beskrivs i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, ägg, 140-153; EP-A-41 766 eller EP-A-113 319. Det föredrages emellertid att t-PA erhålles ur en odlad transformerad eller transfek- terad cellinje, under användning av rekombinant DNA-tek- nologi såsom denna har beskrivits t ex i EP-A-93 619; EP-A-117 059 eller EP-A-117 060. Särskilt föredrages att äggstocksceller från kinesisk hamster (CHO) an- 46 10 15 20 25 30 35 2 895 6 vänds för produktionen av t-PA och framtages på det sätt som beskrivs i Molecular and Cellular Biology, 1985, 5111, 1750-1759. På detta sätt samtransfekteras den klonade genen med genen som kodar dihydrofolatre- duktas (dhfr) till dhfr_CHO-celler. Transformanter som uttrycker dhfr utväljes på media som saknar nukleo- sider och utsättes för ökande metotrexatkoncentrationer. dhfr och t-PA-generna samförstärkes på så sätt, vilket leder till en stabil cellinje i stånd att uttrycka höga t-PA-nivåer.

Företrädesvis renas t-PA under användning av någon beskriven eller känd teknik, såsom de som beskrivs i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003, ibid, 1981, 256(l3), 7035-7041; Eur, J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 eller GB-A-2 122 219.

Det synes icke föreligga någon övre gräns för lösligheten av t-PA i den parenterala lösningen. Vid mycket höga koncentrationer, såsom högre än l50.000.000 IU/ml (International Units/ml), blir lösningen blott viskös utan någon väsentlig utfällning av t-PA. t-PA- koncentrationen i parenterallösningen kan därför varie- ra inom vida gränser, exempelvis från 50.000 till 50.000.000 IU/ml. För att vinna den maximala fördelen av föreliggande uppfinning, föredrages det att t-PA- koncentrationen är högre än 100.000 IU/ml, helst högre än 500.000 IU/ml och mest föredraget högre än 1.000.000 IU/ml.

Den övre gränsen för parenterallösningens pH är företrädesvis 4,5. Företrädesvis ligger pH inom omrâdet från 2,5 till 4,0, hellre från 2,8 till 3,5 och är helst ca 3,0. Parenterallösningens önskade pH uppnås lämpligen genom användning av en fysiologiskt acceptabel oorganisk eller organisk syra. Exempel på en sådan syra innefattar saltsyra, svavelsyra och saltpetersyra, och citronsyra, tartarsyra och bensen- sulfonsyra. Av dessa exempel föredrages saltsyra. 10 15 20 25 30 35 7 Ehuru något fysiologiskt acceptabelt sam-lösnings- medel kan valfritt föreligga jämte vatten, är det före- draget att mediet för parenterallösningen helt eller väsentligen är vattenhaltig.

Den parenterala lösningen kan vara hypertonisk, hypotonisk eller isotonisk med patientens blodserum.

För att undvika oönskade sidoeffekter är emellertid den parenterala lösningen företrädesvis isotonisk, ehuru smärre avvikelser icke har någon större fysio- logisk betydelse. En väsentligen isotonisk parenteral lösning kan erhållas genom införlivande av ett fysio- logiskt acceptabelt medel som är i stånd att höja lösningens tonicitet till den erforderliga nivån.

Exempel på sådana medel är välkända inom området och innefattar dextros (i vattenfri eller monohydratform) och natriumklorid och blandningar därav. Medlets kon- centration i den parenterala lösningen varieras natur- ligtvis från medel till medel. Vad gäller natriumklorid, är koncentrationen företrädesvis 7-10 mg/ml och helst ca 8,5 mg/ml, dvs den koncentration som ofta kallas fysiologisk saltlösning eller blott fysiologiskt salt.

När det gäller vattenfri dextros, är koncentrationen företrädesvis från 30 till 70 mg/ml, och helst ca 50 mg/ml. Om koncentrationen av t-PA i en väsentligen isotonisk parenteral lösning måste minskas, föredrages att utspädningen genomföres med hjälp av en vattenhaltig lösning av samma medel vid samma koncentration, så att en väsentligen isotonisk lösning bibehålles.

Den parenterala lösningen kan valfritt innehålla tillsatser som normalt är förknippade med kompositio- ner av denna typ. Exemplen inkluderar albumin från människoserum. Eftersom t-PA har en tendens att adsor- beras på glas- och plastytor, kan det vara önskvärt att inkludera ett ytaktivt medel i den parenterala lösningen, så att sådan adsorption inte sker eller nedbringas till ett minimum. Exempel på sådana medel innefattar polyoxietylenderivater av fettsyrapartial- -Iïh- 10 15 20 25 30 35 BJ OI) \O CN 8 estrar av sorbitolanhydrider, t ex den som saluföres under handelsnamnet "Tween 80".

En av de förvånande fördelarna med föreliggande uppfinning, frånsett den väsentligt ökade lösligheten av t-PA, är att användningen av en sur parenteral lösning med ett pH inom de här definierade gränserna icke synes ha några väsentliga ofördelaktiga fysio- logiska effekter på administrationen till patienten.

Det förefaller att blodströmmen generellt är i stånd att höja lösningens pH till neutralt nästan så snart som kontakt föreligger, varvid t-PA snabbt distribueras i blodströmmen. Det är emellertid föredraget att denna process icke väsentligt hindras på något sätt och att den parenterala lösningen icke innehåller något starkt buffermedel. Ett svagt buffermedel som icke väsentligt hämmar denna process kan emellertid inklu- deras och i själva verket verkar vid surt pH t-PA själv som sitt eget svaga buffermedel. Därutöver är albumin i människoserum i stånd att verka som svagt buffermedel.

Tack vare den väsentligt ökade lösligheten av t-PA i den parenterala lösningen enligt uppfinningen finns det inget behov av att inkludera något ytterligare material, såsom lysin eller ornitin eller ett salt därav, för ökning av lösligheten av t-PA.

Den parenterala lösningen kan prepareras i enlighet med konventionella farmaceutiska procedurer och tekni- ker, där t-PA används i form av en renad lösning eller i fast form. Föreliggande uppfinning erbjuder därför ett förfarande för preparation av en vattenhaltig parenteral lösning av t-PA, såsom denna definieras här, innefattande: (i) att det framtages en renad lösning av t-PA och mediet utbytes mot ett vattenhaltigt medium med pH 2-5; eller (ii) att t-PA löses i ett vattenhaltigt medium med pH 2-5; och att den resulterande lösningen steriliseras. 10 15 20 25 30 35 462 895 9 Reningen av t-PA kan inbegripa, som ett slutsteg, eluering av proteinet från en kromatografkolonn som en lösning som innehåller ett starkt buffermedel.

Såsom nämnts tidigare föredrages det att den parentera- la lösningen icke innehåller något starkt buffermedel, varför ett lämpligt medel för utförande av dess bort- tagande under mediumbytet är att dialysera. Detta kan utföras genom användning av en dialysslang eller en konstgjord njure, i vilken den renade lösningen dialyseras mot ett vattenhaltigt medium vars pH är 2-5. Det kan vara önskvärt, i synnerhet om koncentra- tionen av t-PA i den renade lösningen är hög, att först inställa lösningens pH så, att det är 2-5. Ett 'annat medel för uppnående av borttagandet av ett starkt buffermedel under mediumbyte är att underkasta den renade lösningen en gelfiltrering och att framkalla kolonnen med ett vattenhaltigt medium vars pH är 2-5. t-PA i form av ett utfällt fast ämne kan, före- trädesvis, uppnås med utgångspunkt i en renad lösning genom att pH inställes på ca 5,5, lösningen kyles till strax över dess fryspunkt, och proteinet utvinnes, exempelvis genom centrifugering. Det utfällda fasta ämnet kan sedan på konventionellt sätt upplösas i ett vattenhaltigt medium vars pH är 2-5.

Steriliseringen av den resulterande lösningen kan utföras konventionellt, exempelvis genom filter- sterilisering.

Den parenterala lösningen presenteras normalt i förseglade, sterila plast- eller glasbehàllare.

Den kan också presenteras som enhetsdoser, t ex i I ampuller, provror eller engångsinjektionsanordningar, eller under flerdosformer, såsom i infusionspåsar eller -flaskor. Volymen av lösningen som skall presen- teras i sådana behållare kan varieras inom vida gränser, men är lämpligen 0,5-20 ml. H Företrädesvis fryses den parenterala lösningen och hålles vid -10 till -30°C, i och för stabilisering av t-PA. 10 15 20 25 30 35 10 t-PA:s biologiska aktivitet under upplösning av fibrinnätverket i blodkoagel har lett till dess användbarhet för behandling av trombotiska störningar (The Lancet, 7 november 1981, 1018-1020; ibid¿, 13 april 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; och ibi§¿, 1985, 312(14), 932-936). Föreliggande uppfinning erbjuder därför ett förfarande för behandling av trombotiska störningar i ett däggdjur, vilket förfarande innefattar administre- ring till däggdjuret av en vattenhaltig parenteral lösning av t-PA, såsom denna definieras här. Alternativt erbjuds också en vattenhaltig parenteral lösning av t-PA, såsom denna definieras här, för användning i human eller veterinär medicin, i synnerhet för använd- ning för behandling av en trombotisk störning.

Speciella exempel på en trombosstörning är kända inom området men innefattar myokardial infarkt, djup- ventrombos, lugnemboli och slaganfall.

Huvudvägen för administrering av den parenterala lösningen är intravaskulär, i synnerhet intravenös, infusion, ehuru även andra administrationsvägar, såsom intramuskulär administrering, kan användas. Intravasku- lära infusioner utföres normalt med den parenterala lösningen upptagen i en infusionspåse eller -flaska eller i en elektriskt styrd infusionsspruta. Lösningen kan matas från infusionspåsen eller -flaskan till patienten genom gravitetsmatning eller genom använd- ning av en infusionspump. Användningen av gravitets- infusionssystem ger icke tillräcklig kontroll över hastigheten av den parenterala lösningens administra- ß tion, varför användningen av en infusionspump föredrages, i synnerhet vid lösningar som innehåller relativt höga koncentrationer av t-PA. Helst används emellertid en elektriskt styrd infusionsspruta, som ger en ännu bättre kontroll över administreringens hastighet.

En effektiv mängd av t-PA för behandling av dägg- djur med trombotiska störningar är naturligtvis i 10 15 20 25 30 35 462 8933 ll beroende av flera faktorer, innefattande exempelvis däggdjurets ålder och vikt, det exakta tillståndet som kräver behandling och hur allvarligt tillståndet är, administreringsvägen, och fastställes i slutänden av läkaren eller veterinären. Det är emellertid san- nolikt att en effektiv mängd för lysering av koro- när-artärtromb, exempelvis, generellt ligger inom området från 150.000 - 450.000 IU/kg patientkroppsvikt per timme. För en 70 kg tung vuxen människa är så- lunda en effektiv mängd per timme generellt från l0.000.000 - 30.000.000 IU, i synnerhet ca 20.000.000 IU, och denna mängd kan administreras med eller utan en startdos. Det är också sannolikt att dosen är mindre 'för vissa trombotiska tillstånd, såsom djupventrombos och akut slaganfall, eller helt enkelt för bibehållande av patens hos en redan reperfuserad koronär artär.

I dessa situtationer är en effektiv mängd från 7000 till 36.000 IU/kg patientkroppsvikt per timme.

Följande exempel ges för belysande av föreliggande uppfinning, vilka dock inte bör anses vara begränsande för uppfinningstanken.

Exempel l En klarnad skörd av t-PA, transformerad CHO-cellinje, som skapades under använd- ning av proceduren enligt Molecular and Cellular Biology, 1985, 5111, 1750-1759, renades kromatografiskt och t-PA hopsamlades som en vattenhaltig lösning inne- hållande 0,lM natriumcitrat och 0,01% (w/V) Tween 80 vid pH 5,5. Lösningens pH injusterades på 3,0 med saltsyra och den resulterande lösningen koncentrerades erhållen från en odlad genom ultrafiltrering under användning av en H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Mill, Stonehouse, Gloucestershire, England). En koncentrerad, renad vattenhaltig lösning av t-PA (2.500.000 IU/ml), inne- hållande 0,lM natriumcitrat, 0,23M natriumklorid (här- rörande från tillsatsen av saltsyra) och 0,01% (w/v) Tween 80 och med ett pH på 3,0, erhölls på så sätt.

.Ru 10 15 20 25 30 35 ha G3 \D 01 12 Denna lösning placerades i en dialysslang med en mole- kylviktsgräns på ca 14.000 och dialyserades i 4°C mot fyra byten av 50 volymer av filtersteriliserad, fysiologisk saltlösning 0,85% (w/v) natriumklorid, innehållande 0,01% (w/v) Tween 80 och injusterad på pH 3,0 med koncentrerad saltsyra. Varje dialyssteg fick fortgå i 12 h. Efter utvinnande av den vattenhal- tiga lösningen från dialyspåsen filtersteriliserades denna lösning och utspäddes med fysiologisk saltlösning så att den innehöll 500.000 IU/ml t-PA. Den resulterande parenterala lösningen fylldes sedan i glasampuller, som förseglades och frystes och lagrades vid -20°C.

Exempel 2 En klarnad skörd av t-PA, erhållen från en odlad, transformerad CHO-cellinje, som skapades under använd- ningen av proceduren enligt Molecular and Cellular Biology, 1985, âill, 1750-1759, renades kromatografiskt och t-PA hopsamlades som en vattenhaltig lösning inne- hållande 0,l7M natriumcitrat och 0,01% (w/v) Tween 80 med pH 5,5. Lösningens pH inställdes på 3,0 med salt- syra och den resulterande lösningen koncentrerades genom ultrafiltrering, under användning av en H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Den koncentrerade vatten- haltiga lösningen renades ytterligare genom att den tillfördes en gelfiltreringskolonn (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sweden) och eluerades med 0,85% saltlösning, innehållande 0,01% (w/v) Tween 80 med pH på 3,0. En högrenad vattenhaltig lösning av t-PA erhölls pà så sätt, vilken koncentrerades ännu en gång under användning av en engångsnjure. t-PA utfälldes ur lösningen genom ökning av pH till 5,5 med natriumhydroxid och vidmakthâllande av suspensionen vid 4°C i 2 h. t-PA utvanns genom centrifugering vid 4000 x g i 30 min vid 4°C. t-PA pelleten återupplöstes i en vattenlösning av natriumklorid (0,85% (w/v)), innehållande 0,01% (w/v) Tween 80 och inställd på 10 15 20 25 30 Ja Jx NJ 03 \C 04 13 pH på 3,0 med saltsyra. Volymen av den använda salt- lösningen var den som erfordrades för att ge en kon- centration av t-PA på mellan 7.500.000 IU/ml och l0.000.000 IU/ml. Denna lösning av t-PA utspäddes med ytterligare vattenlösning av natriumklorid (0,85% (w/v)), innehållande 0,01% (w/v) Tween 80 och inställt på pH 3,0 med saltsyra, och även med tillräcklig mängd av en lösning av 10% (w/v) mannitol i samma sura salt- lösning, så att den gav slutkoncentrationer på 5.000.000 IU/ml av t-PA och 25 mg/ml mannitol. Den resulterande lösningen filtersteriliserades och dose- rades i volymer på 1 ml i glasampuller, som frystes och lagrades vid -20°C.

Exempel 3 Den trombolytiska effektiviteten av den parenterala lösningen enligt exempel 1 utvärderades i en in vivo-mo- dell av jugular-ventrombos. (a) Procedur: Den experimentella proceduren följde väsentligen den procedur som beskrivs av Collen et al (J. Clin.

Invest., 1983, Zl, 368-376).

Den parenterala lösningen enligt exempel 1 fick töa och utspäddes med steril isotonisk saltlösning, inställd på pH 3,0 och innehållande 0,01% Tween 80, så, att den gav en tillräcklig mängd lösning för en 2 h infusion av 500.000 IU/kg t-PA. Infusion utfördes via en kanyl i den högra femorala venen. Tre vitkani- ner från Nya Zealand användes i studiet. Efter infusion uppskattades graden av trombolys. (b) Resultat: Trombolysprocenten var 22,3 den trombolytiska effekten av den parenterala lösningen enligt exempel 1. Därutöver observerades inga ofördel- X t 4,2, vilket klargör aktiga reaktioner efter infusion av denna lösning.

Claims (23)

10 15 20 30 PO 03 \O U! 14 PATENTKRAV

1. Vattenhaltig parenteral lösning av Vävnads- plasminogenaktivator, t-PA, k ä n n e t e c k n a d därav, att pH är från 2 till 5.

2. Parenteral lösning enligt kravet l, k ä n - n e t e c k n a d därav, att t-PA är antingen i en- kedjeform eller i tvåkedjeform.

3. Parenteral lösning enligt kravet 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att t-PA har amino- syrasekvensen enligt fig l eller har samma aminosyra- sekvens men med aminosyran i position 245 från seri- nets N-terminal varande valin i stället för metionin, varvid varje sekvens valfritt kan sakna någon av de första tre aminosyrorna eller valfritt har en ytter- ligare polypeptid N-terminal presekvens av Gly-Ala-Arg.

4. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att t-PA erhålles från en odlad transformerad eller trans- fekterad cellinje, skapad under användning av rekombi- nant DNA-teknologi.

5. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att koncentrationen av t-PA är högre än 100.000 IU/ml.

6. Parenteral lösning enligt kravet 5, k ä n - n e t e c k n a d därav, att koncentrationen av t-PA är högre än 500.000 IU/ml.

7. Parenteral lösning enligt kravet 6, k ä n - n e t e c k n a d därav, att koncentrationen av t-PA är högre än 1.000.000 IU/ml.

8. Parenteral lösning enligt kravet 7, k ä n - n e t e c k n a d därav, att koncentrationen av t-PA är ca 5.000.000 IU/ml.

9. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att pH är 2-4,5. 10 15 20 25 30 35 462 895 15

10. Parenteral lösning enligt kravet 9, k ä n - n e t e c k n a d därav, att pH är 2,5-4,0.

11. Parenteral lösning enligt kravet 10, k ä n - n e t e c k n a d därav, att pH är 2,8-3,5.

12. Parenteral lösning enligt kravet ll, k ä n - n e t e c k n a d därav, att pH är ca 3,0.

13. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att mediet är helt eller väsentligen vattenbaserat.

14. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar ett fysiologiskt acceptabelt medel som gör lösningen väsentligen isotoniskt med människo- blodserum.

15. Parenteral lösning enligt kravet 14, k ä n - n e t e c k n a d därav, att det fysiologiskt accep- tabla medlet är natriumklorid.

16. Parenteral lösning enligt kravet 14, k ä n - n e t e c k n a d därav, att det fysiologiskt accep- tabla medlet är dextros.

17. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar ett ytaktivt medel.

18. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är väsentligen obuffrad.

19. Parenteral lösning enligt något av de före- gående kraven, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är väsentligen fri från lysin eller ornitin eller ett salt därav. J

20. Parenteral vattenhaltig saltlösning av t-PA, k ä n n e t e c k n a d därav, att dess pH är 2-5.

21. Förfarande för preparering av en parenteral lösning, såsom denna definieras i något av kraven 1-20, k ä n n e t e c k n a t därav, (i) att en renad lösning av t-PA framtages och mediet utbytes mot ett vattenhaltigt medium med pH från 2 till 5, eller .LX 16 (ii) att t-PA upplöses i ett vattenhaltigt medium vars pH är från 2 till 5; och att den resulterande lösningen steriliseras.

22. Parenteral lösning enligt något av kraven 1-20, för användning i human och veterinär medicin, i synnerhet för användning vid behandling av trombos- störning.

23. Förseglad behållare med parenteral lösning i enlighet med något av kraven l-20 och 22. lll