DE3331017C2

DE3331017C2 - Verfahren zur Unterscheidung verschiedenartiger Zell-Subpopulationen

Info

Publication number: DE3331017C2
Application number: DE3331017A
Authority: DE
Inventors: Mack Jett Sunnyvale Calif. Fulwyler
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1982-08-30
Filing date: 1983-08-27
Publication date: 1986-05-28
Also published as: FR2532431A1; GB2126341A; US4499052A; JPS5960261A; GB2126341B; GB8322581D0; JPH0447265B2; DE3331017A1; FR2532431B1

Abstract

Ein Verfahren zur Unterscheidung verschiedenartiger Subpopulationen von Zellen in einer einzigen Probe von Zellen mannigfacher Art umfaßt das Markieren von Teilchen mit zwei oder mehr Markierungsmitteln. Diese Teilchen werden in mehreren unterschiedlichen vorgewählten Verhältnissen der genannten Mittel im Bereich zwischen null Prozent und hundert Prozent jedes Mittels markiert. Jedes dieser Mittel besitzt eine unterscheidende quantifizierbare charakteristische Markierungseigenschaft. Die unterschiedlich markierten Teilchen werden mit Zellen vermischt, von denen vermutet wird, daß sie spezifische Rezeptoren für die unterschiedlich markierten Substanzen besitzen. Jede Zelle wird zur Bestimmung des Verhältnisses von jeweils zwei mit jeder Zelle verbundenen identifizierbaren Markierungseigenschaften analysiert, so daß jede Zelle in eine Kategorie der Subpopulation eingeordnet werden kann, wenn ihr Verhältnis der Markierungseigenschaften zu einem der vorgewählten Verhältnisse der Markierungsmittel in Beziehung steht. Eine Apparatur zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterscheidung verschiedenartiger Subpopulationen von Teilchen und insbesondere ein Verfahren zur gleichzeitigen Unterscheidung und Zählung verschiedenartiger Subpopulationen von Zellen, die mit verschiedenen Fluorochromen markiert sind.

Die gegenwärtig bekannten und verfügbaren Verfahren unter Verwendung von Durchfluß-Cytometern und vergleichbaren besonderen Nachweisgeräten zielen auf einen Nachweis zweier Zell-Subpopulationen in einer Mischung über eine Zwei-Kanal-Messung ab. Beispielsweise sind Verfahren unter Verwendung von Geräten bekannt, die mit zwei verschiedenen Fluoreszenzmitteln markierte Zellen in Verbindung mit den betreffenden Fluoreszenz-Kanälen nachzuweisen imstande sind. In den Geräten dieser Art ist für den Nachweis jeder mit Fluorochrom behandelten Zelle in der Zellmischung der analysierten Probe ein vollständiger Fluoreszenz-Kanal

so einschließlich der elektrischen Schaltung und der Fluoreszenz-Detektoren erforderlich. Infolgedessen ist zum Nachweise verschiedenartiger Zell-Subpopulationen in einer Probe mit Hilfe der Durchfluß-Cytometrie unter Benutzung der üblichen bekannten Geräte eine äquivalente Anzahl von Fluoreszenz-Kanälen nötig. Eine weitere Einschränkung des genannten Verfahrens ist dadurch gegeben, daß die Eigenart des Anregungs- und Emissionsverhaltens der Fluorochrome es erschwert, mehr als zwei Fluorochrome, die an Proteine anlagerungsfähig sind und Emissionen bei hinreichend weit voneinander entfernten Wellenlängen liefern, einzusetzen. Einige repräsentative Geräte, die sich der herkömmlichen Durchfluß-Cytometrie bedienen, sind in den US-PSen 41 98 160, 37 38 759 und 38 64 571 sowie in »A Proposal for an Automatic Multi-parameter Analyzer for Cells (AMAC)« von Robert C. Leif, in »Automated Cell Identification and Cell Sorting«, herausgegeben von George L Wied, Academic Press, New York

1970, Seiten 131-159, beschrieben.

In der US-PS 42 84 412 wird ein Verfahren zur Identifizierung und Zählung spezifischer Blutzellen offenbart Dabei werden Blutproben mit Antikörpern inkubiert, die sich selektiv an bestimmte Blutzellen anlagern und mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Der Farbstoff wird durch Lichtzufuhr angeregt, und die Fluoreszenzmission, die von den markierten Zellen ausgeht, wird nach herkömmlichen Methoden bestimmt Dabei ist jedoch für jedes Fluoreszenzsignal in den verwendeten Apparaturen ein separater Fluoreszenzkanal vorzusehen, was die Anwendbarkeit des offenbarten Verfahrens drastisch einschränkt, wenn man einen zumutbaren apparativen Aufwand zugrundelegt.

Es gibt viele Fälle, in denen es wünschenswert ist, mehrere verschiedenartige Zell-Subpopulationen aus einer Mischprobe nachzuweisen. Wie jedoch bereits im Vorstehenden angedeutet ist, liegt einer der Nachteile der herkömmlichen Verfahren darin, daß für eine Vielzahl von Fluorochromen für die Markierung der Zellen auch Geräte mit einer entsprechenden Zahl von Fluoreszenz-Kanälen für die Überwachung der spezifischen spektralen Eigenschaften der einzelnen Fluorochrome eingesetzt werden müßten. Überdies steht eine genügende Anzahl an Fluorochromen gegenwärtig nicht zur Verfügung. Es ist nicht zu leugnen, daß sich hierdurch große Probleme ergeben. Wenngleich angestrebt wird, viele verschiedenartige Zell-Subpopulationen in einer Mischprobe nachzuweisen und auch zu zählen, ist es noch mehr erwünscht, die Zahl der eingesetzten Fluorochrome und ebenso auch die Zahl der Fluoreszenz-Kanäle in den verwendeten Geräten und damit die Zahl der zugehörigen Schaltungen möglichst klein zu machen. Im Sinne dieser Zielsetzung richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Lösung dieses Problems, wobei gleichzeitig dem Bedürfnis nach der Bestimmung vieler verschiedenartiger Zeil-Subpopuiationen in einer Mischprobe Rechnung getragen wird.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Unterscheidung verschiedenartiger Zell-Subpopulationen durch Markierung von Antikörper-Proteinen mit Fluorochromen, Kombination der markierten Antikörper-Proteine mit einer Probe von Zellen, in denen spezifische Rezeptoren für die markierten Antikörper-Proteine vermutet werden, Anwendung von Durchflußcytometrie-Terhniken unter Bereitstelteig von Anregungsenergie, um die Fluorochrome anzuregen, und Analyse der Zellen aufgrund der emittierten Fluroeszenz, wonach die Zellen klassifiziert werden können, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Antikörper-Proteine mit zwei Fäuorochromen in mehreren unterschiedlichen vorgewähi'en Verhältnissen der beiden Fluorochrome im Bereich zwischen null Prozent und hundert Prozent jedes der Fluorochrome markiert, wobei jedes der Fluorochrome ein charakteristisches Emissionsspektrum besitzt, eine Mischung der unterschiedlich markierten Antikörper-Proteine bildet, die Mischung in bekannter Weise mit einer Probe von Zellen kombiniert, in denen spezifische Rezeptoren für die unterschiedlich markierten Antikörper-Proteine vermutet werden, unter Anwendung von Durchflußcytometrie-Techniken Anregungsenergie zumindest im Bereich der Anregungswellenlänge der verwendeten Fluorochrome für diese mit zwei Fluorochromen in mehreren unterschiedlichen vorgewählten Mengenverhältnissen der Fluorochrome markierten Zellen bereitstellt, um beide Typen der Fluorochrome anzuregen, jede Zelle in bekannter Weise zur Bestimmung der von den beiden angeregten Fluorochromen emittierten Fluoreszenz und zur Ermittlung des Verhältnisses der Fluoreszenz-Emissionen analysiert, und jede Zelle durch die Kategorie der Subpopulation klassifiziert, wenn sie in Beziehung zu einem der vorgewählten Verhältnisse der markierten Antikörper-Proteine steht

Eine Apparatur zur Unterscheidung verschiedenartiger Subpopulationen von Teilchen aus einer Probe während der Bewegung derselben in einem Flüssigkeitsstrom ist im wesentlichen aus der US-PS 39 16 205 bekannt. Die Teilchen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unterschieden werden sollen, sind mit zwei oder mehr verschiedenartigen Markierungsmitteln markiert, die unterscheidende und quantifizierbare Eigenschäften besitzen. Die Apparatur enthält eine Vorrichtung zum getrennten Nachweis der mit jedem Teilchen verbundenen quantifizierbaren Eigenschaft und zur Bestimmung der Verhältnisse von jeweils zwei dieser quantifizierbaren Eigenschaften. Ebenfalls vorgesehen ist eine Vorrichtung zum Aufzeichnen der Verhältnisse, so daß die Teilchen in eine Mehrziüi von Subpopulatons-Kategorien eingeordnet werden können.

Die Apparatur unterscheidet und zählt gleichzeitig die verschiedenartigen Subpopulationen von Zei'en, die mit zwei oder mehr verschiedenen Fluorochromen markiert si.-id. Mittel zur Anregung der Fluorochrome auf jeder Zelle während ihres Durchflusses durch eine Flüssigkeitsleitung sind vorgesehen. Die Apparatur enthält weiterhin Einrichtungen zum getrennten Nachweis der Menge der Fluoreszenz, die von den beiden unterschiedlichen Fluorochromen, die mit jeder Zelle verbunden sind, emittiert wird, und zur Bestimmung der Verhältnisse der Mengen der Fluoreszenzstrahlung der beiden Fluorochrome. Weiterhin gibt es noch eine Vorrichtung zur Anzeige der Verhältnisse, so daß die Zellen in eine Mehrzahl von Subpopulations-Kategorien eingeordnet und gezählt werden können.

In den Rahmen der vorliegenden Erfindung fällt auch die Bestimmung der Verhältnisse von fluoreszierenden Teilchen mit ähnlichen Emissionseigenschaften, jedoch un'erschiedlichen Anregungseigenschaften. Verschiedene Lichtquellen für die Anregung können dafür erforderlich sein, während nur ein Fluoreszenz-Detektor eingesetzt zu werden braucht. Gemäß der vorliegenden Erfindung können auch Verhältnisse der Fluoreszenzen solcher Teilchen bestimmt werden, die sich sowohl in bezug auf ihre Emissionseigenschaften als auch in bezug auf ihre Anregungseigenschaften unterscheiden.

Mit Hilfe der Prinzipien der vorliegenden Erfindung werden eine Reihe von Vorteilen und Zielen erreicht. In erster Linie ermöglicht die vorliegende Erfindung die Analyse und Bestimmung verschiedenartiger Subpopulationen von Teilchen ouer Zellen in größerer Quantität als der durch die eingesetzten Fluorochrome gegebenen Zahl. Weiterhin ist die Zahl der bestimmbaren Zell-Subpopulationen größer als die Zahl der eingesetzten Fluoreszenz-Nachweiskanäle und damit verbundenen elektronischen Schaltungen. Im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung benötigt ein an sich bekanntes, einfach gebautes Instrument nur zwei Fluoreszenz-Kanäle, die zum Nachweis charakteristischer Emissionsspektra zweier unterschiedlicher Fluorochrome befähigt sind. Bei der Analyse in der wie oben beschriebenen Apparatur werden Zell-Subpopulationen dadurch unterschieden, daß das Verhä'fnis der beiden mit jeder Zelle verbundenen Fluorochrome unter Einsatz von nur zwei Fluoreszenz-Kanälen bestimmt wird, von denen jeder auf den Nachweis des charakteristischen Emissions-

spektrums der Fluorochrome zielt. Mittels eines Verhältnisses können viele Subpopulationen von Zellen, die mit nur zwei unterscheidbaren Fluorochromen oder anderen Markierungsmitteln markiert sind, bestimmt werden. Darüber hinaus können mittels der Techniken der Durchfluß-Cytometrie. an die bei der vorliegenden Erfindung gedacht wird, verschiedenartige Zell-Subpopulationen in rascher Abfolge in einer einzigen Zellprobe nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht nicht nur den Nachweis verschiedenartiger Zell-Subpopulationen. sondern sorgt auch für die gleichzeitige Zählung der so nachgewiesenen Zellen. Da die Messung auf einem Verhältnis von Signalen beruht, die für jede einzelne Zelle oder jedes einzelne Teilchen nachgewiesen wurden, erfolgt die Unterscheidung aufgrund des Verhältnis-Parameters, der unabhängig ist von der Menge der Fluorcszenz-Markierungsmittel, die an eine Zelle gebunden ist. Außerdem überlappen sich die Verteilungen der Zeii-Subpopuiationen nicht gegenseitig, wodurch fehlerhafte oder ungenaue Ergebnisse vermieden werden. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß es auch möglich ist. die nicht-spezifische Bindung fluoreszierender Mittel an Teilchen nachzuweisen.

F i g. 1 zeigt eine im wesentlichen aus der US-PS 39 16 205 bekannte schematische Darstellung einer Cytometer-Apparatur zum Nachweis zweier Fluoreszenz-Eigenschaften einzelner Teilchen, die sich in einem Flüssigkeitsstrom von der Probenquelle her bewegen.

F i g. 2 zeigt eine graphische Darstellung mehrerer verschiedenartiger Teilchen-Subpopulationen, die mittels einer Technik der Unterscheidung der Verhältniszahlen gemäß den Grundzügen der vorliegenden Erfindung bestimmt wurden.

Im folgenden wird das Verfahren anhand einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielhaft beschrieben.

F' ^σ ^ zsi^t die schernstische Darstellen** der im wesentlichen bekannten Cytometer-Apparatur 10 zum Nachweis von Zellen oder anderen Teilchen mit speziellen Parametern. Bevor irgendweiche Teilchen in der Nachweisapparatur 10 analysiert werden, werden sie mi; mehreren Markierungsmitteln behandelt, die quantifizierbare Markierungseigenschaften besitzen, vorzugsweise solche, die voneinander verschieden sind. Beispielsweise ist es bei Tests, in denen Zellen zu klassifizieren sind, besonders vorteilhaft, mit Antikörper-Proteinen zu arbeiten. Im allgemeinen werden diese Antikörper-Proteine mit zwei Markierungsmitteln, vorzugsweise Fluorochromen, markiert, obwohi drei oder mehr solcher Mittel eingesetzt werden können. Jedes Fluorochrom besitzt tin charakteristisches Emissions- und/ oder <\nregungsspektrum in spezifisch definierten Farbbändern. Die Fluorochrome werden an Antikörper-Proteine in solcher Weise gebunden, daß die Zahlen dieser Proteine, die mit jedem Fluorochrom markiert sind, ein bekanntes Verhältnis biiden. Durch Markieren verschiedener Antikörper-Proteine, die jeweils spezifisch sind für Rezeptoren an einem bestimmten Zeil-Typ, mit verschiedenen Fluorochrom-Verhältnissep kann eine Mehrzahl solcher unterschiedlich markierter Antikörper miteinander vermischt und mit einer Zeil-Population in einer Mischprobe zur Reaktion gebracht werden. Jeder Antikörper mit einem bekannten Verhältnis der an ihn gebundenen Fluorochrome bindet sich dann an die Zellen, die einen spezifischen Rezeptor für ihn besitzen, und markiert dadurch Zell-Subpopulationen. Nach Beendigung dieser Behandlung und damit der Markierung spezifischer Zeil-Subpopulationen wird die Zeltprobe in eine Probenquelle 12 gegeben, die mit der Nachweisapparatur 10 in Verbindung steht, wie aus Fig. 1 zu ersehen ist.

Vor der näheren Erläuterung der Arbeitsweise gemaß der vorliegenden Erfindung ist allgemein festzuhalten, daß die beiden Fluorochrome oder andere Markierungsmittel, wenn sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auf die aufnehmenden Substanzen wie etwa die Antikörper-Proteine in verschiedenen, vorgewählten Mengenverhältnissen aufgebracht werden können. Diese Mengenverhältnisse liegen im Bereich zwischen null Prozent und hundert Prozent jedes der Fluorochrome, d. h. auf einem Antikörper-Protein kann das Fluorochrom des ersl-en Typs vollständig fehlen, während sich auf demselben Antikörper-Protein einhundert Prozent eines Fluorochroms des zweiten Typs befinden. Selbstverständlich fallen die verschiedenen Verhältnisse der beiden Fluorochrome, die zwischen den beiden Extremwerten von null Prozent und hundert Prozent liegen, in den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Weiterhin sollten die gegenwärtigen cytometrischen Techniken den Nachweis von wenigstens fünf verschiedenen Zell-Subpopulationen mit Hilfe des Verfahrens und der Apparatur, wie sie hier beschrieben werden, ermöglichen. Es ist jedoch ausdrücklich darauf hinzuweisen, daß mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens und der im wesentlichen bekannten Apparatur am.ii mehr als fünf Zell-Subpopulationen unterschieden werden können, wobei jedoch für die Messung von mehr als fünf Verhältnissen möglicherweise die Qualität der Signale nicht mehr ganz so hoch ist. Weiterhin erhöht die Verwendung von drei oder mehr Fluorochromen in signifikanter Weise die Anzahl der voneinander unterscheidbaren Verhältnisse, die mittels der vorliegenden Erfindung ermöglicht wird.

Hinsichtlich der Einzelheiten der in der F i g. 1 dargestellten Nachweisapparatur 10 enthält die Prcbenqueüe 12 die Substanzen, etwa Zellen, die mit den verschiedenen Markierungsmitieln, etwa Fluorochromen, in mehreren verschiedenen vorgewählten Verhältnissen behandelt wurden. In der folgenden Diskussion werden, lediglich beispielhaft und zum Zweck der Beschreibung, zwei solche Fluorochrome für die Behandlung der Zellen eingesetzt. Die behandelten Zellen 14 werden in einem Strom eines fließfähigen Mediums, vorzugsweise einzeln, zu einem Sensor-Bereich 15 und durch diesen hindurchgeführt, der etwa aus einer Öffnung besteht, die den Nachweis der optischen Eigenschaften der Zellen ermöglicht. Sensor-Elemente sind in cytometrischen Durchfluß-Apparatur en wohlbekannt; eine derartige Sensor-Anordnung ist offenbart in einem Artikel von R.A.Thomas et al, »Combined Optical and Electronic Analysis of Cells with AMAC Transducers«, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 25 (No. 7), Seiten 827—835 (1977). Während jede der behandelten Zellen 14 die Sensor-Region 15 durchläuft, trifft Licht von einer Lichtquelle 16 auf die Zellen. Die Lichtquelle 16 versorgt die Zellen mit Licht. Als Lichtquellen 16 in Betracht kommen Laser, Quecksilber- oder Xenon-Bogenlampen oder dergleichen, die befähigt sind, eine Anzahl Linien über einen weiten Bereich von Farbgebieten hinweg zu emittieren. Im übrigen muß das Licht von der Lichtquelle 16 in der beschriebenen Ausführungsform ausreichend sein, um die Anregung der beiden verschiedenen zur Behandlung der Zeilen 14 verwendeten Fiuorochrome zu bewirken. Wenn das Licht auf jede der Zellen 14 trifft, werden die daran gebundenen Fluorochrome angeregt und setzen dadurch einen Mechanis-

mus zur Unterscheidung der Fluoreszenzeigenschaften der einzelnen Zellen in Gang. Es ist anzumerken, daß bei Verwendung von Fluorochromen mit verschiedenen Anregungsbereichen es erforderlich sein kann, mehr als eine Lichtquelle einzusetzen, um die ungleichen Anregungswellenlängen zu überdecken.

Nach dem Durchgang der Zellen durch die Sensor-Regir'i werden sie in einem Gefäß 18 gesammelt. Die Zellen können mittels bekannter Arbeitsweisen des Sortierens getrennt aufgefangen werden, wodurch die Ze!!- Subpopulationen einzeln für sich gesammelt werden, auch wenn eine solche Arbeitsweise nicht abgebildet ist. Das Fluoreszenz-Licht von jeder Zelle einschließlich der Fluoreszenz von bis zu zwei Fluorochromen mit unterschiedlichen Anregungsspektren wird dann auf einen dichroitischen Spiegel 19 gerichtet. Die Aufgabe des dichroitischen Spiegels 19 besteht darin, zwei verschiedene Farben längs des Wegs des abgestrahlten Die Anzeigevorrichtung 28 umfaßt einen Bildschirm für die visuelle Beobachtung der Klassifizierung jeder einzelnen Zelle für eine bestimmte Kategorie der ZeII-Subpopulationen in graphischer Form. Die Apparatur 10 mit Elektronik und Anzeige kann zusätzlich noch so ausgelegt sein, daß Informationen über die Verhältnisse vorher in die Schaltung einprogrammiert werden können. Beispielsweise können Elektronik und Anzeige in solcher Weise vorprogrammiert werden, daß speziell

ίο definierte Fluoreszenz-Verhältnisse entlang der X-Achse des Bildschirms aufgeführt sind; hierzu wird auf F i g. 2 verwiesen. Diese Verhältnisse umfassen dann die gleichen Verhältnisse der Fluorochrome, die vorgewählt wurden für die Behandlung der Antikörper-Proteine, die für bestimmte Zelltypen spezifisch sind. Die Y-Achse des Bildschirms kann so vorprogrammiert werden, daß die Zahl der Zellen, die den speziell definierten Verhältnissen längs der X-Achse zugeordnet sind, auf

Zelle erzeugt wird, zu trennen. Auf diese Weise können die beiden verschiedenen Farben einzeln für sich analysiert werden, wodurch ein Verhältnis wie nachstehend beschrieben gebildet wird. Ein dichroitischer Spiegel 19 wird beispielsweise benutzt, um das grüne Gebiet des Farbspektrums von dem roten Gebiet zu trennen. Hierbei werden Wellenlängen der ersten Farbregion längs des Strahlengangs 20 reflektiert, während Wellenlängen der zweiten Farbregion von dem dichroitischen Spiegel 19 in Richtung des Strahlengangs 21 durchgelassen werden. Die beiden Lichtstrahlen, der von dem dichroitisch',.1 Spiegel reflektierte und der von diesem durchgelassene, werden dann von Fluoreszenz-Detektoren 22 bzw. 24 nachgewiesen, die für den Empfang der in die beiden Teilgebiete aufgespalteten Lichtenergie ausgerüstet sind. Die Fluoreszenz-Detektoren 22 und 24 können herkömmliche Photovervielfacher-Röhren sein, die optische Signale in elektrische Signale umformen. Diese elektrischen Signale werden dann in entsprechende elektronische Impuls-Verarbeitungsgeräte 25 und 26 eingegeben, in denen die elektrischen Signale zu Analysenzwecken aufbereitet werden.

Als Teil dieser Analyse wird das Verhältnis der elektrischen Signale bestimmt In der Vorrichtung 27 zur Bestimmung des Verhältnisses wird das Fluoreszenz-Signal von dem Fluoreszenz-Detektor 22 in Verhältnis gesetzt zu dem Fluoreszenz-Signal von dem Fluoreszenz-Detektor 24 oder umgekehrt. Die Vorrichtung 27 zur Bestimmung des Verhältnisses liefert dadurch einen Mechanismus zur Bestimmung der Fluoreszenz, die von den beiden angeregten Fluorochromen, die mit jeder Zelle verbunden sind, emittiert wird, und zur Ermittlung des Verhältnisses ihrer Fluoreszenz-Emissionen. Diese Information über das Verhältnis wird dann auf die Anzeigevorrichtung 28 gegeben. Die Kombination aus den Elektronik-Geräten 25 und 26, der Vorrichtung 27 zur Bestimmung des Verhältnisses und der Anzeigevorrichtung 28 besteht vorzugsweise sämtlich aus elektrischen Schaltungen, die für verschiedenartige Anzeigen, Informationsdarstellungen, Sammlung und Aufzeichnung der Verhältnisse der Fluoreszenzsignale jeder einzelnen analysierten Zelle ausgelegt sind. Die elektrischen Komponenten für die Durchführung der Analyse der die Fluoreszenz betreffenden elektrischen Signale können solche nach dem Stand der Technik sein, deren Ausstattung je nach dem Grad der Verfeinerung der Analyse und Datendarstellung verschieden sein kann. Ein derartiges elektrisches System für Fluoreszenz-Bestimmungen ist in der US-PS 38 26 364 beschrieben.

äficn jeder getragen werden. Auf diese Weise kann eine graphische

Histogramm-Darstellung der Zell-Subpopulationen, die in spezifische Kategorien eingeteilt sind, sichtbar gemacht und gewünschtenfalls aufgezeichnet werden. Wie aus F i g. 2 zu ersehen ist, sind 5 Subpopulationen von Zellen identifiziert, die spezielle Fluoreszenz-Verhältnisse aufweisen, d.h. < 1/10, 1/3, 1/1, 3/1 und > 10/1. Die Fläche unter jedem der Zelltyp-Peaks A bis fliefert die gemessene Zahl der Zellen dieses Typs. Falls erwünscht, kann die Elektronik dieser Apparatur auch so entworfen werden, daß die ungefähre Zahl der Zellen, die jeder der Subpopulationen zugeordnet sind, berechnet wird.

Somit ist festzustellen, daß infolgedessen die vorliegende Erfindung die Klassifizierung der Zell-Subpopulationen und die Zahl der Zellen in einer jeder Subpopu- !ation in Form einer Simultanbestimmung liefert, die dann dem Bedienungspersonal angezeigt werden kann. Überdies werden aufgrund der Benutzung eines Verhältnisses die Zellen mittels dieser Verhältnis-Technik unabhängig von der Menge der an eine Zelle gebundenen, mit dem Fluorochrom behandelten Antikörper voneinander unterschieden; wie aus der F i g. 2 zu entnehmen ist, überlappen sich die Verteilungen der Zell-Subpopulationen wegen des Normalisierungseffekts des Verhältnisses nicht. Bei der Erstellung dieser Klassifizierungen von Zell-Subpopulationen werden um jedes vorgewählte Verhältnis herum Fenster 30 vorgesehen, die einen Bereich für die Erstellung der spezifischen Klassifizierungen bilden. Bei der Analyse werden die Zellen, die innerhalb eines solchen Fensters 30 auf der Verhältnisskala fallen, als spezifisch markierte Zellen gewertet; Zellen, an die Fluorochrome oder andere Markierungsmittel nicht spezifisch gebunden sind, wurden Verhältnisse außerhalb der erlaubten Fenster liefern, etwa in den Talregionen 31 zwischen den Gipfeln der Kurve, wie sie aus der graphischen Darstellung der F i g. 2 zu entnehmen sind. Dementsprechend werden Zellen außerhalb der Fensterregionen 30, in den Talregionen 31, als nicht spezifisch markiert gewertet und würden elektronisch abgelehnt werden. Nieht-spezifisch markierte Zellen liefern jedoch Verhältnisse außerhalb der erlaubten Verhältnisse in den Fenstern und ermöglichen eine getrennte Zählung dieser Zellen.

Wenngleich die F i g. 2 und die allgemein beschriebene Apparatur fünf verschiedene Zell-Subpopulationen unterscheidet und klassifiziert, kann die Zahl der Zelltypen, die mittels des Verfahrens und der Apparatur gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheidbar sind, fünf übersteigen. Jedoch sollte die Signalintensität ange

messen sein, wenn dichter beieinander liegende Verhältnisse aufgelöst werden sollen, d. h. 9/1,8/1, 7/1 etc. Es ist ebenfalls darauf hinzuweisen, daß das vorliegende Verfahren dann am wirksamsten ist, wenn keine Kreuzreaktionen stattfinden, d. h. jedes Antikörper-Protein nur einen Zelltyp markiert und jeder Zelltyp zum Zwecke der Bindung nur einen einzigen Antikörper-Proteintyp annimmt.

Das Verfahren zum Nachweis und zur Unterscheidung verschiedenartiger Zell-Subpopulationen gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Ein fluoreszierendes Polymerisat wird synthetisiert, das vorwählbare Anteile zweier fluorochromatischer Monomerer, in diesem Falle Fluorescein und Rhodamin, aufweist Fluorescein emittiert Fluoreszenz-Strahlung, wenn es in der blauen Farbregion angeregt wird; andererseits emittiert Rhodamin Fluoreszenz-Strahlung, wenn es in der gelben Farbregion angeregt wird. 5 Polymerisat-Präparate werden wie folgt synthesiert:

% Fluorescein % Rhodamin blauen Fluoreszenz jeder Zelle, so wie sie durch die Nachweisapparatur hindurchbewegt wird, die Zelle als zu einem der fünf Zelltypen gehörig klassifiziert werden. Eine graphische Darstellung dieser Klassifizierung ist ähnlich derjenigen, die in der F i g. 2 dargestellt ist.

Beispiel 2

Zwei Polymer-Präparate werden eingesetzt, von denen das eine nur Fluorescein und das andere nur Rhodamin enthält. Die folgenden Präparate werden hergestellt:

15 Präparat I:

100% eines Antikörper-Proteins werden mit dein Fluorescein enthaltenden Polymeren markiert.

Präparat 2:

75% eines Antikörper-Proteins werden mit dem Fluorescein enthaltenden Polymeren markiert, und 25% eines Antikörper-Proteins werden mit dem Rhodamin enthaltenden Polymeren markiert.

Polymer-Präparat 1 100

Polymer-Präparat 2 75

Polymer-Präparat 3 50

Polymer-Präparat 4 25

Polymer-Präparat 5 0

25

50

75

100

25

30

Antikörper-Proteine, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, der hier als Zelltyp Λ bezeichnet wird, werden dann mit dem Polymer-Präparat 1 markiert: Antikörper-Proteine, die für den ZcHtyp B spezifisch sind, werden mit dem Polymer-Präparat 2 markiert: Antikörper-Proteine, die für den Zelltyp C spezifisch sind, werden mit dem Polymer-Präparat 3 markiert; Antikörper-Proteine, die für den Zelltyp D spezifisch sind, werden mit dem Polymer-Präparat 4 markiert; und Antikörper-Proteine, die für den Zelltyp E spezifisch sind, werden mit dem Polymer-Präparat 5 markiert.

Sämtliche konjugierten (markierten) Antikörper werden gemischt, und die Mischung wird dann zu einer Zellprobe hinzugefügt. Die Zellprobe enthält Zellen, von denen angenommen wird, daß sie spezifische Rezeptoren für die verschieden markierten Antikörper besitzen. Die Zellen des Α-Typs wurden dann nur mit den Fluorochromen des Polymer-Präparats 1 markiert sein, die B-Typ-Zellen mit dem Polymer-Präparat 2, die C-Typ-Zellen mit dem Polymer-Präparat 3, die D-Typ-Zellen mit dem Polymer-Präparat 4 und die E-Typ-Zellen mit dem Polymer-Präparat 5.

Bei der Analyse in einer Apparatur, wie sie in der F i g. 1 beschrieben ist wird jede behandelte Zelle analysiert, und ihr grünes Fluorescein-Signal und ihr rotes Rhodamin-Signal werden elektrisch nachgewiesen und zu einem Verhältnis verarbeitet, wie dies in Verbindung mit der Apparatur 10 oben beschrieben wurde. Für die Zellen des A-Typs ist das Verhältnis größer als 10/1: für die Zellen des ß-Typs ist das Verhältnis 3/1; für die Zellen des C-Typs ist das Verhältnis 1/1; für die Zellen ti des D-Typs ist das Verhältnis 1/3; und für die Zellen des Ε-Typs ist das Verhältnis < 1/10. Auf diese Weise kann durch die Bestimmung des Verhältnisses der gelben zur Präparat 3:

50% eines Antikörper-Proteins werden mit dem Fluorescein enthaltenden Polymeren markiert, und 50% eines Antikörper-Proteins werden mit dem Rhodamin enthaltenden Polymeren markiert.

Präparat 4:

25% eines Antikörper-Proteins werden mit dem Fluorescein enthaltenden Polymeren markiert, und 75% eines Antikörper-Proteins werden mit dem Rhodamin enthaltenden Polymeren markiert.

Präparat 5:

100% eines Antikörper-Proteins werden mit dem Rhodamin enthaltenden Polymeren markiert.

Wenn eine Mischung dieser fünf Antikörper-Präparate zu einer gemischten Zellpopulation gegeben wird, von der angenommen wird, daß sie spezifische Rezeptoren für die unterschiedlich markierten Antikörper-Proteine enthält, nehmen die Zellen des Α-Typs nur Antikörper an. die mit dem Präparat 1 markiert sind; Zellen des ß-Typs nehmen Antikörper an, die mit dem Präparat 2 markiert sind; Zellen des C-Typs nehmen Antikörper an, die mit dem Präparat 3 markiert sind; Zellen des D-Typs nehmen Antikörper an, die mit dem Präparat 4 markiert sind; und Zellen des F-Typs nehmen Antikörper an, die mit dem Präparat 5 markiert sind. Bei der Analyse in einem Durchfluß-Cytometer wie der in der F i g. 1 dargestellten Apparatur werden Werte ähnlich denjenigen in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 3

Die Herstellungen des Beispiels 2 werden wiederholt, jedoch mit der Abweichung, daß konventionelle, mit FlTC (Fluorescein-isothiocyanat) und RITC (Rhodamin-isothiocyanat) markierte Antikörper anstelle der Fluorescein enthaltenden und Rhodamin enthaltenden Polymeren verwendet wurden. Die Ergebnisse der Analysen dieser Zellen in einem Durchfluß-Doppelfluoreszenz-Cytometer sind im wesentlichen denjenigen des Beispiels 1 ähnlich.

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Beispiel 4

Mikrokugeln werden hergestellt, die vorgewählte Verhältnisse zweier Fluorochrome mit verschiedenen Emissionseigenschaften enthalten. Mikrokugeln können hergestellt werden gemäß der US-PS 37 90 492. Die Mikrokugel-Präparate werden dann als Ersatz für die Polymer-Präparate des Beispiels 1 verwendet. Die bei der Durchfluß-Analyse erhaltenen Daten ähneln denjenigen, die in Beispiel 1 aufgeführt sind.

Beispiel 5

Mikrokugeln ähnlich denjenigen des Beispiels 4 werden hergestellt wobei die Fluorescein enthaltenden Mikrokugeln und die Rhodamin enthaltenden Mikrokugeln als F.rsatz für die beiden in Beispiel 2 aufgeführten Polymeren verwendet wurden. Bei der Analyse in einem Durchfluß-Cytometer sind die erhaltenen Daten im wesentlichen denjenigen ähnlich, die in Beispiel 1 aufgeführt sind.

Somit macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und zur Unterscheidung von verschiedenartigen Subpopulationen von Teilchen in einer größeren Teilchenpopulation verfügbar. In vorteilhafter Weise können mehr Subpopulationen unterschieden werden, als die Zahl der in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Fluoreszenz-Mittel und der in den verwendeten Geräten vorgesehenen Fluoreszenz-Kanäle angibt. Unter Verwendung eines Verhältnisses der Fluortszenz-Signale können Teilchen-Subpopulationen nachgewiesen und klassifiziert werden, wobei gleichzeitig die Zahl der in jede der Teilchen-Subpopulationen eingeordneten Teilchen bestimmt wird. 35 Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

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50

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60

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Unterscheidung verschiedenartiger Zell-Subpopulationen durch

Markierung von Antikörper-Proteinen mit Fluorochromen;

Kombination der markierten Antikörper-Proteine mit einer Probe von Zellen, in denen spezifische Rezeptoren für die markierten Antikörper-Proteine vermutet werden;

Anwendung von Durchflußcytometrie-Techniken unter Bereitstellung von Anregungsenergie, um die Fluorochrome anzuregen; und
Analyse der Zellen aufgrund der emittierten Fluoreszenz, wonach die Zellen klassifiziert werden können;

dadurch gekennzeichnet, daß man
Antikörpe'-Proteine mit zwei Fluorochromen in mehreren unterschiedlichen vorgewählten Verhältnissen der beiden Fluorochrome im Bereich zwischen null Prozent und hundert Prozent jedes der Fluorochrome markiert, wobei jedes der Fluorochrome ein charakteristisches Emissionsspektrum besitzt;

eine Mischung der unterschiedlich markierten Antikörper-Proteine bildet;

die Mischung in bekannter Weise mit einer Probe von Zellen kombiniert, in denen spezifische Rezeptoren für die unterschiedlich markierten Antikörper-Proteine vermutet werden;

unter Anwendung von Dutihflußcytometrie-Techniken Anregungsenergie zumindest im Bereich der Anregungswellenlänge der erwendeten Fluorochrome für diese mit zwei Fluorochromen in mehreren unterschiedlichen vorgewählten Mengenverhältnissen der Fluorochrome markierten Zellen bereitstellt, um beide Typen der Fluorochrome anzuregen;

jede Zelle in bekannter Weise zur Bestimmung der von den beiden angeregten Fluorochromen emittierten Fluoreszenz und zur Ermittlung des Verhältnisses der Fluoreszenz-Emissionen analysiert; und
jede Zelle durch die Kategorie der Subpopulation klassifiziert, wenn sie in Beziehung zu einem der vorgewählten Verhältnisse der markierten Antikörper-Proteine steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Typ eines Antikörper-Proteins mit 100% des ersten Fluorochroms und 0% des zweiten Fluorochroms markiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Typ eines Antikörper-Proteins mit 100% des zweiten Fluorochroms und 0% des ersten Fluorochroms markiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper-Proteine mittels polymerer Fluorochrome markiert werden, die vorwählbare Anteile fluorochromatischer Monomerer aufweisen.

5 Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper-Proteine dadurch markiert werden, daß sie kombiniert werden mit jeweils einer Serie von Mikrokugeln, die vorgewählte Verhältnisse zweier Fluorochrome enthalten, wobei diese Fluorochrome so geartet sind, daß sie sich mit den Antikörper-Proteinen verbinden.

6. Verfahren nach Anspruch I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin die Bestimmung der angenäherten Zahl der Zellen umfaßt, die jeder Subpopulation zugeordnet sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin die Bestimmung der angenäherten Zahl der Zellen umfaßt, die unspezifisch markiert sind und nicht unter irgendeine definierte Subpopulation fallen.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Klassifizierung der Zell-Subpopulationen und die Zahlen der Zellen innerhalb oder außerhalb jeder Subpopulation simultan bestimmt und dem Bedienungspersonal visuell angezeigt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Fluorochrom statt eines charakteristischen Emissionsspektrums ein charakteristisches Anregungsspektrum besitzt, jedoch das Verhältnis der Fluoreszenz-Emissionen immer noch die Grundlage für die Analyse der markierten Zellen bildet

10. Verfahren nach Anspruch I bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper-Proteine mit mehr als zwei Fluorochromen mit unterschiedlichen Eigenschaften in vorher festgelegten Verhältnissen von jeweils zweien dieser Fluorochrome markiert sind.