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DE69838067T2 - Farbkodierung und in situ abfrage von matrix-gekoppelten chemischen verbindungen - Google Patents

Farbkodierung und in situ abfrage von matrix-gekoppelten chemischen verbindungen Download PDF

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DE69838067T2
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DE
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beads
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compound
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DE69838067T
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DE69838067D1 (de
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Michael Fanwood Seul
Richard H. North Brunswick EBRIGHT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rutgers State University of New Jersey
Bioarray Solutions Ltd
Original Assignee
Rutgers State University of New Jersey
Bioarray Solutions Ltd
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Publication date
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der analytischen Chemie.
  • Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine hochparallele Art des Präsentierens und Sondierens multipler chemischer Verbindungen mit Anwendungen für die kombinatorische Bibliothek-Synthese, Screening mit ultrahohem Durchsatz und diagnostische Assays für multiple Agenzien und Sensoren. Die vorliegende Erfindung stellt mehrere Farbcodes vor, um Sammlungen von Trägerpartikeln wie kolloidale Kügelchen zu markieren; außerdem beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur in situ-Abfrage von Kügelchen oder Sammlungen von Kügelchen mit Hilfe der Mehrfarben-Fluoreszenzabbildung und Spektralanalyse einzelner Kügelchen, um die chemischen Identitäten von auf den Kügelchen verankerten Verbindungen festzustellen. Das Codieren von Kügelchen mittels einfacher und erweiterter einfacher Farbcodes sowie mittels binärer und erweiterter binärer Farbcodes kann durch die Messung der Größe und Form der Kügelchen oder anderer chemisch-physikalischer Eigenschaften wie die im Kern der Kügelchen vorliegende Polarisierbarkeit erweitert werden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • 1-Chemische Festphasen-Bibliotheken
  • Ein aufkeimendes Paradigma für Leit-Entdeckungen in der pharmazeutischen und damit zusammenhängenden Industrie, wie Biotechnologie für die Landwirtschaft, ist das Zusammensetzen neuer synthetischer Verbindungsbibliotheken mit Hilfe neuer Verfahren der „kombinatorischen" Festphasen-Synthese. Kombinatorische Chemie bezieht sich auf einen Satz von Strategien für die parallele Synthese und das Testen multipler Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen, entweder in Lösung oder in festen Trägern in Form kugelförmiger Harze („Kügelchen"). Im Allgemeinen bringt eine kombinatorische Synthese mit M Vorläufern in jedem von N Reaktionsschritten M^N Verbindungen. Zum Beispiel produziert eine kombinatorische Synthese 4^N Oligonukleotide in N Schritten, die jeweils 4 Oligonukleotid-Vorläufer verwenden; ebenso produziert eine kombinatorische Synthese von N Schritten, in denen jeweils 20 Aminosäure-Vorläufer verwendet werden, 20^N Oligopeptide.
  • 1.1 – Chemische Bibliotheken mit einem Kügelchen/einer Verbindung
  • Eine Anwendung der kombinatorischen Synthese, die geeignet ist, um sehr große chemische Bibliotheken zu produzieren, basiert auf festen Trägern in Form von Harzen in Kugelform („Kügelchen") und kodiert Reaktionsschritte in einer Strategie des „Trennens, Koppelns und Rekombinierens" („divide, couple and recombine", DCR) (1), die auch als „Harz-Spaltungs"-Synthese bezeichnet wird. Die resultierenden chemischen Bibliotheken mit „einem Kügelchen/einer Verbindung" enthalten 10^6 bis 10^8 Verbindungen. Diese Bibliotheken werden gescreent, indem eine große Vielzahl von chemischen und biochemischen Assays durchgeführt wird, um einzelne Verbindungen zu identifizieren, die eine positive Antwort hervorrufen. Die chemische Identität derartiger Verbindungen kann mittels direkter Analyse bestimmt werden.
  • Zwei Verfahren der direkten Analyse sind das Mikro-Sequenzieren und die Massenspektrometrie. Beide Verfahren erfordern die physikalische Isolierung von Synthesekügelchen, die Verbindungen von Interesse aufweisen, und beide erfordern eine separate chemische Analyse auf Basis von erheblichen Mengen an Verbindung – einige zehn bis einige hundert Picomol. Das Mikro-Sequenzieren, das auf Bibliotheken von Oligopeptiden und Oligonukleotiden beschränkt ist, unterscheidet nicht zwischen Stereoisomeren. Mit der Massenspektrometrie ist es nicht möglich, zwischen Vorläufern gleicher Masse, wie D- und L-Aminosäuren oder Leucin und Isoleucin zu unterscheiden. Das Erfordernis einer direkten chemischen Analyse für eine erhebliche Menge an Verbindung diktiert die Verwendung von großkugeligen Harzen (ein typischer Kügelchendurchmesser beträgt 130 μm), um sicherzustellen, dass picomolare Mengen jeder Verbindung gewonnen werden können, auch wenn es immer wünschenswerter wird, ein Screening der Verbindungsbibliothek mit hohem Durchsatz in verkleinerten Umgebungen durchzuführen, um die erforderlichen Mengen an Probe und Reagenzien zu reduzieren und den Durchsatz zu erhöhen.
  • 1.2 – Chemische Bibliotheken mit einem codierten Kügelchen/einer Komponente
  • Ein Ansatz zur Überwindung der erheblichen Einschränkungen standardmäßiger chemischer Bibliotheken mit einem Kügelchen/einer Verbindung besteht darin, chemische Verbindungsidentitäten zu kodieren. Dies erleichtert die Identifizierung von Verbindungen, die nicht für die direkte Bestimmung mittels Micro-Sequenzierung oder Massenspektrometrie geeignet sind. Ein Kodierungsverfahren verwendet die Co-Synthese von Peptiden und Oligonukleotiden, um die Identität von nicht sequenzierbaren Syntheseprodukten darzustellen (Nikolaiev et al., „Peptide-Encoding for Structure Determination of Non-Sequenceable Polymers Within Libraries Synthesized and Tested an Solid-Phase Supports", Peptides Res. 6, 161 (1993)). Ein zweites Verfahren, das mit einer größeren Vielfalt chemischer Reaktionsbedingungen kompatibel ist, verwendet einen Satz von Anhang-Molekülen (tagging molecules), um die Reaktionsgeschichten von Kügelchen aufzuzeichnen.
  • Eine Anwendung des letzteren Verfahrens verwendet einen Satz von vor-synthetisierten, chromatographisch unterscheidbaren molekularen Tags T1, T2, ..., TM, um einen chemischen binären Code zu erstellen. Im Stand der Technik sind molekulare Tags strukturell verwandte Moleküle (2), die an Hand ihrer charakteristischen gaschromatographischen Retentionszeiten identifiziert werden können (Still et al., „Complex combinatorial libraries encoded with tags", U.S. Patent No. 5,565,324 ).
  • Bei jedem Schritt der DCR-Synthese wird jedem abgeteilten Aliquot ein einzigartiger Tag aus dem Satz zugesetzt, um die Reaktion aufzuzeichnen, die mit diesem Aliquot durchgeführt wird. Dieses Konzept kann an Hand der Untersuchung der Schritte einer zweistufigen Synthese dargestellt werden, wobei in Stufe 1 die Reagenzien R1 1, R1 2 und R1 3 und in Stufe 2 die Reagenzien R2 1, R2 2 und R2 3 verwendet werden, um neun Produkte zu ergeben. Die Reagenzien der ersten Stufe sind an Hand ihrer binären Adressen 01(R1 1), 10(R1 2) und 11(R1 3) einzigartig identifiziert, und die Reagenzien der zweiten Stufe sind an Hand der binären Adressen 01(R2 1), 10(R2 2) und 11(R2 3) einzigartig identifiziert. Jede binäre Adresse wird chemisch an Hand eines Satzes molekularer Tags dargestellt: T1 (wobei 01 in Stufe 1 R1 1 darstellt), T2 (wobei 10 in Stufe 1 R1 2 darstellt) und T2T1 (wobei 11 in Stufe 1 R1 3 darstellt) und analog mit T3 (wobei 01 in Stufe 2 R2 1 darstellt), T4 (wobei 10 in Stufe 2 R2 2 darstellt) und T4T3 (wobei 11 in Stufe 2 R2 3 darstellt).
  • Eine Abfolge von Reaktionsschritten wird aufgezeichnet, indem einfach binäre Adressen verknüpft werden. So würde 11.01, von rechts nach links gelesen, die Abfolge „Reagens R2 3 in Stufe 2, Reagens R1 1 in Stufe 1" bezeichnen. Die chemische Darstellung dieser Abfolge lautet T4T3.T1, und das Vorhandensein dieses speziellen Satzes von Tags auf dem Kügelchen zeigt die chemische Identität des auf den Kügelchen verankerten Syntheseprodukts an. Diese Strategie ist leicht auf größere Reaktionen zu verallgemeinern. Zum Beispiel können 7 Reagenzien, die in jedem Reaktionsschritt verwendet werden sollen, an Hand der binären Adressen 001(R1 1), 010(R1 2), ..., 111(R1 7) einzigartig identifiziert werden. Diese Tag-Strategie des Standes der Technik ist zwar besser als Verfahren nach dem Prinzip „ein unkodiertes Kügelchen/eine Verbindung", sie weist aber dennoch drei Einschränkungen auf. Erstens müssen einzelne Kügelchen von Interesse physisch vom Rest abgetrennt werden; ferner müssen molekulare Tags chemisch oder photochemisch vom Kügelchen abgespalten werden, und die abgespaltenen Tags müssen gesammelt werden; und schließlich muss eine chemische Analyse (z.B. Gaschromatographie) durchgeführt werden. Diese zahlreichen zeit- und arbeitsintensiven Arbeiten nehmen viel vom erhöhten Durchsatz wieder weg, der durch die Strategie der DCR-Synthese gewonnen wurde.
  • 1.3 Screening und Optimierung der Leitverbindung
  • Die hohe Spezifität der typischen biologischen Substrat-Ziel-Interaktionen impliziert, dass die große Mehrheit der Verbindungen in einer Bibliothek für ein bestimmtes Ziel inaktiv ist. Daher besteht die Aufgabe des Screenings darin, jene wenigen Verbindungen in der Bibliothek zu identifizieren, die bei der Bindung oder in funktionellen Assays Aktivität aufweisen. Übliche Ziele beinhalten Enzyme und Rezeptoren sowie Nukleinsäuren.
  • Um das rasche Screening und Scoring einer ganzen Bibliothek synthetischer Verbindungen anzuwenden, die in der Praxis 10^4 bis 10^8 Verbindungen enthält, sind systematische Screening-Verfahren erforderlich, wenn diese Aufgabe innerhalb eines vertretbaren Zeitrahmens erledigt werden soll. Es sind mehrere Assay-Formate beschrieben worden, um das Screening von kombinatorischen Bibliotheken auf Kügelchen-Basis zu implementieren. Diese beinhalten: Reaktion einer Sammlung von Kügelchen, die unter dem Einfluss der Schwerkraft absetzen gelassen werden, mit einem Enzym-markierten oder Fluorophor-markierten Zielmolekül, gefolgt von visuellem Nachweis (Lam et al., „A new type of synthetic Peptide library for identifying ligand-binding activity", Nature 354 (1991)); Inkubation von Kügelchen mit radioaktiv markierten Zielmolekülen und folgender Agarose-Immobilisierung von Kügelchen und autoradiographischer Nachweis (Kassarjian, Schellenberger and Turck, „Screening of Synthetic Peptide Libraries with Radio-labeled Acceptor Molecules", Peptide Res. 6, 129 (1993)); und teilweise Freisetzung von Verbindungen von Kügelchen zum Testen in der Lösungsphase (Salmon et al., „Discovery of biologically active peptides in random libraries: Solution-Phase testing after staged orthogonal release from resin beads", Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90, 11708 (1993)).
  • WO95/32425 stellt ein Verfahren zur Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken unter Verwendung eines Verfahrens zum Codieren kombinatorischer Bibliotheken mit Fluorophor-markierten Kügelchen zur Verfügung. Gemäß diesem Verfahren wird eine erste kombinatorische Bibliothek hergestellt, indem ein Satz von Reaktionen an Kügelchen mit Tags durchgeführt wird, um ein codiertes erstes Register (d.h. Schritt in der Synthesesequenz) zu erhalten. Unter Verwendung ähnlicher Reaktionsschritte wird eine zweite kombinatorische Bibliothek hergestellt, wobei jedoch die Kügelchen mit Tags vor der ersten Reaktionssequenz kombiniert und getrennt und vor der zweiten Reaktionssequenz sortiert werden. Weitere Bibliotheken werden wie die zweite Bibliothek hergestellt, außer, dass der Schritt des Sortierens bei jeder weiteren Bibliothek vor einem anderen Register stattfindet. WO95/32425 lehrt also nur das individuelle Markieren des ersten Schrittes und das physische Abtrennen der Kügelchen, um jede modifizierte kombinatorische Bibliothek zu identifizieren.
  • Nederlof et al., Cytometry, 13, 839-845 (1992) lehrt die Verwendung der Verhältnis-Markierung (ratio labelling) als einen Weg, die Anzahl der gleichzeitig nachweisbaren Sonden über die sieben bisher verwendeten hinaus zu erhöhen. Bei diesem Ansatz werden Verhältnis-markierte Sonden an Hand des Verhältnisses der Farbintensität, nicht nur der speziellen verwendeten Farben, identifiziert. Die Fluoreszenz-Verhältnisse werden gemessen und als zusätzliche codierende Farben verwendet. Dieses Verfahren erfordert die doppelte Markierung von Sonden mit verschiedenen Verhältnisses von Markern. Das Verfahren ist nicht speziell auf synthetische kombinatorische Bibliotheken ausgerichtet. Daher ist das Gebiet von Nederlofs Verfahren der Nachweis multipler DNA/RNA-Sequenzen durch Hybridisierung in situ und ist daher für das Gebiet der Codierung synthetischer chemischer Bibliotheken nicht relevant.
  • Speiche, Ballard & Ward, Nature Genetics, 12, 368 (1996) beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung komplexer chromosomaler Karyo-Typen unter Verwendung von Multi-Fluoreszenz-Hybridisierung in situ. Anstatt Verhältnis- und Doppel-Markierungen zu verwenden wie Nederlof, verwenden Speiche et al. Einen Satz von sechs fluoreszierenden Farbstoffen mit Spektralemissions-Peaks, die über den Bereich der photometrischen Antwort verteilt sind, um 27 kombinatorisch markierte Sonden sichtbar zu machen. Speiche et al. offenbaren kein Verfahren zur Codierung synthetischer kombinatorischer Bibliotheken.
  • Still et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 90, 10922-926 (1993) offenbaren ein Verfahren zur Synthese kombinatorischer Bibliotheken mit Tags unter Verwendung eines binären Codes, der auf verschiedenen elektrophoren Tags basiert. Dieses Verfahren erfordert die Verwendung von photo-spaltbaren molekularen Tags, die verschieden substitutierte Aryl-Anteile umfassen, die über eine aliphatische Kohlenwasserstoffkette von variabler Länge verbunden sind, wodurch die Tags, wenn sie abgespalten werden, mittels Kapillar-Gaschromatographie mit elektrochemischem Nachweis distinkt trennbar sind. Bei diesem Verfahren wird kein Farb-Nachweis verwendet. Das Verfahren erfordert auch das Abspalten vom festen Träger, um die Sequenz zu analysieren. In einer damit in Zusammenhang stehenden Arbeit ( U.S. 5,721,099 ) offenbaren Still et al. Verfahren zur Herstellung codierter kombinatorischer Bibliotheken, aber auch dieses Verfahren erfordert die Abspaltung der Identifikations-Tags vor der Analyse der codierten Reaktionsgeschichte. Im Gegensatz dazu stellt die vorliegende Erfindung einen in situ-Ansatz zur Abfrage codierter kombinatorischer Bibliotheken zur Verfügung und stellt einen Fortschritt gegenüber den herkömmlichen Verfahren zur Codierung von Bibliotheken dar. Der Erfolg der vorliegenden Erfindung ist angesichts der früheren Ansätze unerwartet, da für eine Spektralanalyse, die in heterogenen Medien durchgeführt wird, Streuphänomene zu erwarten gewesen wären, die Spektralsignale an das Rauschen abgeben, was zu praktischen Schwierigkeiten beim genauen Nachweis der in relativer Häufigkeit vorhandenen Informationen für Fluorophor-Tags führt. Die vorliegende Methodik zeigt zum ersten Mal einen Weg auf, um diese praktischen Probleme beim Codieren in situ und der Abfrage von kombinatorischen Bibliotheken zu lösen.
  • II – Multi-Agent Monitoring und Diagnostik
  • Diagnostische Panels weisen multiple Chemien auf, um unbekannte Lösungen auf das Vorhandensein multipler Agenzien zu screenen. Die Blutgruppen-Spezifität wird zum Beispiel dadurch bestimmt, dass eine unbekannte Blutprobe auf ein Panel von oberflächengebundenen Antikörpern getüpfelt wird, deren Anordnung im Panel ihre Antigen-Spezifität widerspiegelt. Die Antigen-Bindung an einen bestimmten Fleck im Panel zeigt die chemische Identität des Antigens an und verstärkt die Blutgruppe. Eine weitere Umsetzung des gleichen Konzepts der Darstellung mehrerer diagnostischer Sonden in einem räumlich codierten Panel oder einer Anordnung beinhaltet das Screening von Mutationen mittels eines Assays, mit dem auf Hybridisierungen von DNA an einem einer großen Anzahl von in Frage kommenden passenden Strängen getestet wird, die schachbrettartig in bekannten Positionen auf einem ebenen Substrat platziert werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass Tröpfchen, die distinkte Sonden enthalten, abgegeben werden, oder es kann die in situ-Synthese von Oligonukleotidsträngen verschiedener Zusammensetzung beinhalten.
  • Räumliches Codieren hängt vom Herstellungsverfahren des Panels oder der Anordnung ab, um die chemische Identität zu wahren, was zusätzlich Zeit und Geld kostet. In dem Maße, in dem die Anzahl der Felder des Schachbretts zunimmt, steigt auch die Herausforderung, die erforderliche Anordnung herzustellen. Außerdem müssen die Sonden immobilisiert werden – üblicherweise mittels Adhäsion an der Oberfläche eines ebenen Substrats – um die Integrität des räumlichen Codierungsschemas zu erhalten. In der Praxis kann dieses Assayformat problematisch sein: Die Akkumulation der Proben kann langsam sein, und die Zugänglichkeit der Sonden kann eingeschränkt sein.
  • III – Derzeitige Anwendungen des Mehrfarben-Fluoreszenznachweises
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für die in situ-Abfrage und das Entfalten (deconvolution) kombinatorischer Bibliotheken auf Basis von Kügelchen unter Verwendung von Mehrfarben-Fluoreszenz-Abbildung und Spektralanalyse. Jüngste Anwendungen der Mehrfarben-Fluoreszenz-Spektroskopie auf das Sequenzieren von DNA und das Chromosomenfärben stellen Anforderungen an die Empfindlichkeit und Wellenlängen-Selektivität, die über jene hinausgehen, die in herkömmlichen Anwendungen, wie der Bestimmung von Verhältnissen von Fluoreszenzintensitäten, zu finden sind.
  • Im Zusammenhang mit dem Sequenzieren von DNA sind verschiedene Konfigurationen für den raschen Nachweis der Vierfarb-Fluoreszenz beschrieben worden. Diese beinhalten einen gewidmeten Photomultiplier-Röhrendetektor für jede Emissionswellenlänge, mit entsprechenden Sätzen von Strahlenteilern in der optischen Bahn, um räumlich getrennte Strahlen zu erzeugen; einen einzelnen Detektor und ein rotierendes Filterrad, um den gewünschten Satz von Wellenlängen in einem multiplexen Aufzeichnungsmodus auszuwählen; oder eine dispergierende Anordnung, die auf einem Prisma oder Gitter beruht, um das von mehreren Fluorophoren emittierte Licht anhand der Wellenlänge zu teilen. Diese Konfigurationen nützen jüngste Fortschritte in der Technologie ladungsgekoppelter Vorrichtungen (charge-coupled device, CCD) aus, um Spektren auf einer integrierenden Linie einer rechteckigen CCD-Anordnung aufzuzeichnen (Karger et al., „Multiwavelength fluorescence detection for DNA sequencing using capillary electrophoresis", Nucl. Acids Res. 19, 4955 (1991)).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zur Konstruktion mehrerer Farbcodes zum Zwecke der exklusiven Markierung von Mitgliedern einer Gruppe von Kügelchen oder äquivalenten Gegenständen („Kügelchen"), um die chemische Identität der Kügelchen und so die Identität von an die Kügelchen gekoppelten chemischen Verbindungen zu erhalten. Diese Farbcodes basieren auf einem Satz von codierenden Fluorophoren mit unterscheidbaren Wellenlängen, Lebensdauern im Erregungszustand und Intensitätsniveaus, wobei das Letztere durch die Anpassung der Häufigkeit des Farbstoffs gesteuert wird. Genauer gesagt beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Codierung und in situ-Abfrage eines Satzes von distinkten Chemien auf Basis von Kügelchen.
  • Binäre und erweiterte binäre Farbcodes bieten eine große Codierungskapazität und stellen eine allgemeine Strategie zur Codierung von Reaktionsgeschichten mit mehreren Schritten dar, wie jene, die bei Synthesestrategien nach dem Prinzip „Trennen-Koppeln-Rekombinieren" (divide, couple, recombine, DCR) für kombinatorische chemische Bibliotheken anzutreffen sind, wie sie hier geschildert und diskutiert werden.
  • Einfache und erweiterte einfache Farbcodes bieten eine effiziente Strategie, um einen kleineren Satz distinkter Chemien zu codieren, wie sie für Panels typisch sind, die multiple Ziele oder Sonden in biochemischen Assays einschließlich diagnostische und Umgebungstests mit mehreren Agenzien und anderen biochemischen Assays aufweisen.
  • Alle Farbcodes können erweitert werden, indem man die unterscheidbaren Merkmale der Kügelchen, wie die Form und Größe oder andere geeignete chemisch-physikalischen Parameter variiert, die mit den Kernen der Kügelchen assoziiert sind, wie z.B. die Polarisierbarkeit.
  • Die Identität der Verbindung, die an einem speziellen Kügelchen verankert ist, wird in situ durch optisches Sondieren einzelner Kügelchen bestimmt, um den Farbcode zu lesen, wie hier beschrieben ist. Dies stellt die Identifizierung von auf den Kügelchen verankerten chemischen Verbindungen sicher, ohne dass eine physische Abtrennung erforderlich wäre, und ohne dass eine separate chemische Analyse erfolgen muss.
  • Die Codierungsstrategie der vorliegenden Erfindung ist mit allen Formaten der kombinatorischen Synthese und des Screening auf Basis von Kügelchen kompatibel, die bisher beschrieben worden sind. Eine bevorzugte Anwendung, die den Vorteil hat, dass sie die Verkleinerung und Automatisierung des Screenings und Decodierens ermöglicht, beruht auf ebenen Anordnungen von Kügelchen, die angrenzend an eine ebene Elektrodenoberfläche gebildet, aufrechterhalten und manipuliert werden können.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung, die oben in der kurzen Erläuterung diskutiert sind, werden leichter verständlich, wenn man sie zusammen mit der folgenden detaillierten Beschreibung einer Ausführungsform, die so zu verstehen ist, dass sie nur zur Erläuterung dient, und den dazugehörigen Zeichnungen betrachtet, die Aspekte dieser Ausführungsform widerspiegeln, worin:
  • 1 eine Darstellung der kombinatorischen Synthese nach dem Prinzip „Teilen-Koppeln-Rekombinieren" ist;
  • 2 eine Darstellung der Markierung einzelnder Synthesekügelchen mit chemischen Tags („bar codes") ist. Beispiele für Molekülstrukturen, die für derartige Tags verwendet werden, werden ebenfalls dargestellt: verschiedene Tags werden durch Variation von n und Ar erzeugt;
  • 3 eine Darstellung von zwei alternativen Verfahren zur Platzierung der Fluorophor- oder Chromophor-Tags (F) auf Synthesekügelchen ist;
  • 4 eine Darstellung der binären Farbcodierung mit Fluorophoren Y, B, G und R ist. Das Beispiel zählt codierte Populationen von Kügelchen auf, die mittels kombinatorischer Peptidsynthese unter Verwendung der Reagenzien R1 1, R1 2, R1 3 und R1 4 in Stufe 1 und der Reagenzien R2 1, R2 2, R2 3 und R2 4 in Stufe 2 hergestellt werden (siehe auch Tabelle I);
  • 5 eine Darstellung der Emissionsspektren der CyDye-Familie von im Handel erhältlichen fluoreszierenden Farbstoffen ist, deren Spektralcharakteristika in der zur Figur gehörenden Tabelle zusammengefasst sind (Amersham LIFE SCIENCE, Catalog of Multicolor Fluorescent Reagents, 1995, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen ist);
  • 6 eine Darstellung einer willkürlichen Kügelchenanordnung ist, die nach dem einfachen Farbcode (simple color code) SCC (l = 1, m = 5) codiert ist;
  • 7 eine Darstellung eines Mehrfarben-Fluoreszenz-Mikroskops mit integrierter Spektralanalyse ist, basierend auf der Dispersionsoptik.
  • 8 eine Darstellung mehrerer Geometrien von Mehrfarben-Fluoreszenz-Abbildung und Spektrometrie ist.
  • 9 eine Darstellung eines Beispiels eines festen Trägers mit einer Hydroxy-funktionalen Gruppe an seiner Oberfläche ist, modifiziert mit einem Linker, der in einem mehrstufigen Verfahren gebildet wurde, das die Entfernung einer Mmt-Schutzgruppe und die darauffolgende Umsetzung mit einem aktivierten Ester eines fluoreszierenden Farbstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Implementierung der Farbcodes
  • Die erfindungsgemäße Strategie des Farbcodierens bietet ein Verfahren, um einen Satz von Fluorophoren – oder, allgemeiner gesagt, von Chromophoren – auf jedem Kügelchen zu platzieren, um die chemische Identität der Verbindung auf diesem Kügelchen einzigartig zu codieren. Genauer gesagt werden bei jedem Kopplungsschritt im Zuge der DCR-kombinatorischen Synthese an jedes Kügelchen ein oder mehrere Fluorophore angehängt. Die Decodierung basiert auf der Bestimmung der relativen Häufigkeit von Fluorophoren auf einem Kügelchen von Interesse mittels optischer Abfrage in situ.
  • Fluorophore können auf zwei Arten zugesetzt werden. Beim ersten Verfahren wird das Fluorophor direkt einer kleinen Fraktion der entstehenden Verbindungen zugesetzt, wodurch die weitere Synthese dieser Fraktion von entstehender Verbindung terminiert wird (3A). Beim zweiten Verfahren wird die Markierung kovalent an reservierte Reaktionsstellen angehängt, die nicht die entstehende Verbindung sind, um sicherzustellen, dass Vorläufer nicht durch das Markieren terminiert werden (3B). Beim ersten Verfahren und bei den meisten Anwendungen des zweiten Verfahrens ist die Menge x des Fluorophoren, die jedem Kügelchen zugesetzt wird, unterstöchiometrisch in Bezug auf die entstehende Verbindung, wobei x typischerweise im Bereich von 0,001 bis 0,1 Mol-Äquivalente entstehender Verbindung auf dem Kügelchen ist. Drei Faktoren bestimmen die Wahl von x. Erstens darf die Dichte von Tags auf den Kügelchen nicht materiell die Synthese und die folgenden Screening-Assays stören. Zweitens muss die Dichte von Tags auf den Kügelchen ausreichend niedrig bleiben, um Komplikationen durch Fluoreszenz-Energie-Übertragung zu vermeiden. Drittens müssen markierte Stellen in ausreichender Anzahl vorhanden sein, um die Erfordernisse der Signalerkennung und Unterscheidung zu erfüllen, wie hier beschrieben ist.
  • Um die Farbcodierungsstrategie umzusetzen, nützt die vorliegende Erfindung drei Eigenschaften von Fluorophoren, um ein Alphabet von Fluorophor-Tags zu konstruieren, nämlich: Emissions-Wellenlänge, Lebensdauer im erregten Zustand und Emissionsintensität. Die Anzahl der verfügbaren Fluorophoren mit unterscheidbaren Emissionsmaxima und/oder Lebensdauern im erregten Zustand wird mit mF bezeichnet, die Anzahl der unterscheidbaren Intensitätsniveaus, die durch die Anpassung der relativen Mengen von Fluorophoren (z.B. x, 2x, 3x, ...) gesteuert werden, wird mit mI bezeichnet, und so ist die Größe des Alphabets von Fluorophor-Tags m = mF*mI. Die Oberflächen von markierten Kügelchen weisen eine Vielzahl distinkter Fluorophore auf (siehe 4). Die optische in-situ Abfrage dieser mehrfärbigen Kügelchen dient zur Aufzeichnung von Emissionsspektren, von welchen die relative Häufigkeit von Fluorophoren ermittelt wird, um den Farbcode zu entziffern, wie hier diskutiert und veranschaulicht ist.
  • Binäre Farbcodes
  • Eine Ausformung dieses Codes ist ein binärer Farbcode (Binary Color Code, BCC) unter Verwendung von mF Fluorophoren, alle mit mI = 1. Dieser BCC codiert bis zu 2^mF distinkte Verbindungen. Bei diesem BCC können sich die mF Fluorophore in ihrer Lebensdauer im erregten Zustand, ihren Emissionsmaxima oder in beidem unterscheiden. Zweckmäßigerweise werden für das folgende spezifische Beispiel Fluorophore verwendet, die sich nur in ihren Emissionsmaxima („Farben") unterscheiden. Die kombinatorische Synthese von 16 Produkten in zwei Reaktionsschritten, jeweils unter Verwendung eines Satzes von N = 4 Reagenzien, würde folgendermaßen codiert werden: Tabelle I
    Schritt 1: R1 1(00) Schritt 2: R2 1(00) Keine Farbe Keine Farbe R1 2(01)Rot R2 2(01)Blau R1 3(10)Grün R2 3(10)Gelb R1 4Rot + Grün(11) R2 4(11)Gelb + Blau
    R2 1, R1 1 00.00 NN.NN Keine Farbe R2 3, R1 1 10.00 YN.NN Y
    R2 1, R1 2 00.01 NN.NR R R2 3, R1 2 10.01 YN.NRY R
    R2 1, R1 3 00.10 NN.GN G R2 3, R1 3 10.10 YN.GN YG
    R2 1, R1 4 00.11 NN.GR GR R2 3, R1 4 10.11 YN.GR YGR
    R2 2, R1 1 01.00 NB.NN B R2 4, R1 1 11.00 YB.NN YB
    R2 2, R1 2 01.01 NB.NR BR R2 4, R1 2 11.01 YB.NR YBR
    R2 3, R1 3 01.10 NB.GN BG R2 4, R1 3 11.10 YB.GN YBG
    R2 2, R1 4 01.11 NB.GR BGR R2 4, R1 4 11.11 YB.GR YBGR
  • Die binäre Darstellung von vier Reagenzien ist R1(00), R1 2(01), R1 3(10) und R1 4(11) für die in Schritt 1 verwendeten Reagenzien und R2 1(00), R2 2(01), R2 3(10) und R2 4(11) für jene in Schritt 2. Wie oben korrespondieren Sequenzen von Reaktionsschritten mit verknüpften binären Codes, und in dem Beispiel werden alle 4^2 = 16 möglichen Sequenzen mit 4-stelligen Ketten dargestellt. Die Sequenz „Reagens R2 3 in Schritt 2, Reagens R1 4 in Schritt 1" würde also durch die Kette 10.11 (von rechts nach links zu lesen) dargestellt. Unter Verwendung eines Alphabets von vier Fluorophoren, deren Farben wie oben mit R, G, B und Y bezeichnet und zugeordnet (Y, B, G, R) werden, um 4-stellige Ketten darzustellen, werden die 2^4 möglichen Ketten (gelesen von rechts nach links) in BCC (m = 4) codiert, wie in Tabelle I und 4 zu sehen ist.
  • Eine zweite Wiedergabe des Farbcodes ist ein binärer Farbcode unter Verwendung von mF Fluorophoren mit variierenden relativen Häufigkeiten und daher variierenden Intensitäten in jedem Schritt. Der resultierende erweiterte binäre Farbcode (eXtended Binary Color Code, XBCC) codiert 2^(mF *mI) distinkte Verbindungen. Wenn zum Beispiel ein Alphabet (2G, 2R, G, R) mit nur zwei distinkten Farben verwendet wird, um 4-stellige Ketten darzustellen, werden 2^4 mögliche Ketten (von rechts nach links gelesen) in XBCC (mF = 2, mI = 2) codiert, wie in Tabelle II dargestellt ist. In dem Beispiel erfordert die Entfaltung (deconvolution) die Unterscheidung von vier distinkten Intensitätsniveaus für jedes der beiden Emissionsbande. Bei N Schritten kann die Anzahl der im erweiterten binären Farbcode XBCC (mF, mI) zu unterscheidenden Intensitätsniveaus sogar bis zu N*mI betragen. Die erreichbare Intensitätsunterscheidung wird schließlich durch das Signal-Rausch-Verhältnis beschränkt, das bei der Spektralanalyse einzelner Kügelchen erreichbar ist. Tabelle II
    Schritt 1: R1 1(00) Schritt 2: R2 1(00) Keine Farbe Keine Farbe R1 2(01)Rot R2 2(01)2Rot R1 3(10)Grün R2 3(10)2Grünn R1 4(11)Rot + Grün R2 4(11)2Rot + 2Grün
    R2 1, R1 1 00.00 NN.NN Keine Farbe R2 3, R1 1 10.00 2GN.NN GG
    R2 1, R1 2 00.01 NN.NR R R2 3, R1 2 10.01 2GN.NR GGR
    R2 1, R1 3 00.10 NN.GN G R2 3, R1 3 10.10 2GN.GN GGG
    R2 1, R1 4 00.11 NN.GR GR R2 3, R1 4 10.11 2GN.GR GGGR
    R2 2, R1 1 01.00 N2R.NN RR R3 4, R1 1 11.00 2G2R.NN GGRR
    R2 2, R1 2 01.01 N2R.NR RRR R2 4, R1 2 11.01 2G2R.NR GGRRR
    R2 2, R1 3 01.10 N2R.GN RRG R2 4, R1 3 11.10 2G2R.GN GGGRR
    R2 2, R1 4 01.11 N2R.GR RRRG R2 4, R1 4 11.11 2G2R.GR GGGRRR
  • Ein weiteres Beispiel beschreibt die Farbcodierung von Produkten, die in einer kombinatorischen Synthese unter Verwendung von 7 Reagenzien im ersten Schritt und 6 Reagenzien in jedem der letzten zwei Schritte hergestellt werden. Die Reagenzien werden als binäre Adressen R1(001), R2(010), R3(011), ..., R7(111) dargestellt. Zum einfacheren Aufschreiben lassen wir die Hochzahl für die in verschiedenen Schritten verwendeten Reagenzien (R) weg.
  • mF = 4 (Farben wie oben bezeichnet) und mI = 2. Das folgende XBCC, basierend auf einem Alphabet mit 8 Buchstaben (2Y, 2B, 2G, 2R, Y, B, G, R) und dargestellt in Tabelle III kann verwendet werden, um die 7*6*6 = 252 Syntheseprodukte zu codieren, die in der Synthese erzeugt werden. Während die Konstruktion von XBCC 9-stellige Ketten erfordern würde, um den gesamten Satz von 8^3 = 512 = 2^9 Konfigurationen darzustellen, die mit allen möglichen Verknüpfungen von 3-stelligen Ketten erzeugt werden, können die tatsächlichen 252 erforderlichen Konfigurationen dieses Beispiels in der Tat im Satz von 2^8 möglichen 8-stelligen Ketten untergebracht werden, indem man Ersetzungen vornimmt, wie im Beispiel angegeben. Sc wird also die Reaktionssequenz „Reagens 6 in Schritt 3, Reagens 1 in Schritt 2, Reagens 3 in Schritt 1" mittels XBCC (mF = 4, mI = 2) dargestellt (von rechts nach links zu lesen) als R6.R1.R3 = 2X2B.N.G = 2G2RY.N.G und entspricht daher GGGRRY. Tabelle III
    R1 000 R2 001 R3 010 R4 011 R5 100 R6 101 R7 110
    Schritt N R G GR B BR BG NICHT VERWENDET:
    1(7) BGR
    Schritt N Y 2R 2RY 2G 2GY NICHT VERWENDET:
    2(6) 2G2R, 2G2RY
    Schritt N 2B 2Y 2Y2B 2X 2X2B
    3(6)
    • Anmerkung: Machen Sie standardmäßig die folgenden Ersetzungen: 2X<-2G2R, 2X2B<-2G2RY
  • Einfache Farbcodes
  • Im Gegensatz zur komplizierten Aufgabe der Codierung von Reaktionsgeschichten in einer mehrstufigen kombinatorischen Synthese erfordern viele Anwendungen nur die Unterscheidung eines beschränkten Satzes von Chemien. Für diesen Zweck können einfache Farbcodes (Simple Color Codes, SCC) konstruiert werden. Diese Farbcodes erreichen zwar nicht die Codierkapazität der entsprechenden binären Farbcodes, sie sind jedoch in vielen Fällen absolut geeignet, wenn die chemischen Unterscheidungen von Interesse in einem einzigen Reaktionsschritt hervorgebracht werden, wie die Koppelung einer diagnostischen Sonde an ein Kügelchen. Beispiele derartiger eingeschränkter chemischer Komplexität beinhalten Abtast-Anwendungen sowie Monitoring und Diagnostik mit multiplen Agenzien.
  • Wie bei den binären Farbcodes nützt die Konstruktion einfacher Farbcodes unterscheidbare Wellenlängen, Lebensdauern und Intensitäten verfügbarer Fluorophore. Eine allgemeine Version von SCC, basierend auf insgesamt m Fluorophoren, wird unter Verwendung gleicher Mengen von 1 Fluorophoren konstruiert, um jede distinkte chemische Spezies von Interesse zu codieren, wobei gilt: 1 ≤ l ≤ m. In diesem Code ist der Satz möglicher Farbkombinationen gleich groß wie die Anzahl möglicher Konfigurationen, S_r(l, m), einer Probe der Größe l, gezogen mit Ersatz von einem Reservoir von m, S_R(l, m) – (m + l – 1)!/l!(m – l)!. Der Ersatz ermöglicht mehrere Fälle von einer Farbe in jeder Kette.
  • Wenn zum Beispiel 4 distinkte Fluorophore (m = 4) zur Verfügung stehen und Kombinationen von 3 (l = 3) – in gleicher relativer Häufigkeit – für jede distinkte chemische Spezies von Interesse verwendet werden, würde der generalisierte SCC insgesamt 20 verschiedene Konfigurationen bieten. Diese sind in Tabelle IV aufgelistet, wobei mit R, G, B und Y die Farben in einem 4-färbigen Alphabet bezeichnet sind. Der SCC (l = 3, m = 4) codiert so einzigartig die Produkte, die in einem einzigen Koppelungsschritt von bis zu 20 verschiedenen Antikörpern an Trägerkügelchen erzeugt werden; jede von 20 Reaktionsgefäßen erhält eine Mischung von drei Fluorophoren gemäß dem in Tabelle IV angeführten Satz. Das Vorhandensein mehrerer bekannter Fluorophoren bietet die Basis, um Koinzidenz-Verfahren hervorzurufen, um schwache Signale zu erkennen und zu beobachten und so die Empfindlichkeit des Assays zu erhöhen. Tabelle IV
    (R,R,R) (G,G,G) (B,B,B) (Y,Y,Y)
    (R,R,G) (G,G,B) (B,B,Y)
    (R,R,B) (G,G,Y)
    (R,R,Y)
    (R,G,G) (G,B,B) (B,Y,Y)
    (R,G,B) (G,B,Y)
    (R,G,Y)
    (R,B,B) (G,Y,Y)
    (R,B,Y)
    (R,Y,Y)
  • Es können erweiterte einfache Farbcodes (eXtended Simple Color Codes, XSCC) konstruiert werden, indem die relativen Häufigkeiten von Fluorophoren variiert werden, um einen Satz von unterscheidbaren Intensitätsniveaus für jede Fluorophoren-Spezies im Alphabet zu erzeugen. Wie XSCC ermöglicht auch XSCC die Steuerung von ml Intensitätsniveaus für jede von mF Fluorophoren-Spezies im Alphabet.
  • Besonders leicht realisierbar ist der Spezialfall von SCC und XSCC, wo l = 1 ist; nur ein einziges Fluorophore markiert jede chemische Spezies von Interesse.
  • Weitere Verbesserungen
  • Alle hier bisher diskutierten Farbcodes können durch Variieren bestimmter chemisch-physikalischer Parameter der Kügelchen weiter verbessert werden. Zum Beispiel kann die Anzahl codierter Konfigurationen jeweils einem Satz von Kügelchen angeknüpft werden, deren jeweilige Form, Durchschnittsgröße, Polarisierbarkeit oder andere chemisch-physikalische Eigenschaften ausreichend verschieden sind, um unterscheidbar zu sein. Durch die Verwendung von S verschiedenen Sätzen von Kügelchen erhöht sich die Anzahl codierter Konfigurationen, dargestellt mit XBCC(m), auf S*2^m.
  • BCC und XSCC codieren die Identität chemischer Verbindungen gemäß der relativen Häufigkeit von Fluorophoren, die an jedes Kügelchen gekoppelt sind. Daher sind alle Permutationen einer Kette von Fluorophor-Tags äquivalent, da sie zu der gleichen relativen Häufigkeit führen. Es ist uns jedoch nicht entgangen, dass die Implementierung des Farbcodes, wobei die Markierung zur Terminierung von Verbindungen führt (siehe 3A) auch eine Aufzeichnung der Ordnung enthält, in welcher verschiedene Farbmarkierungen jedem einzelnen Kügelchen zugesetzt wurden. Daher bringt die Analyse der Molekulargewichte markierter Verbindungen die Ordnung ans Tageslicht, in welcher die Markierung erfolgte.
  • Chemische Realisierung des erweiterten binären Farbcodes
  • Die Realisierung eines chemischen Farbcodes beruht auf einem Satz („Alphabet") von chemisch aktivierten Fluorophoren mit minimal überlappenden Absorptions- und Emissionsspektren. Wir diskutieren hier den Fall des erweiterten binären Farbcodes; andere Codes können auf analoge Weise realisiert werden. Obwohl die Implementierung eines erfindungsgemäßen Farbcodes hier an Hand einer spezifischen Familie von Fluorophoren dargestellt ist, ist das Verfahren ebenso für die Implementierung mit anderen Fluorophoren und Chromophoren geeignet, deren distinkte Spektralmerkmale dazu dienen, ein Alphabet von Tags zu konstruieren, wie es hier beschrieben ist. Ein Beispiel für ein geeignetes Alphabet von sechs Farben wird von der CyDye(TM)-Familie von Indocyanin-Farbstoffen zur Verfügung gestellt, die in 5 angeführt ist.
  • Die Syntheseschritte in diesem Beispiel sind wie folgt (unter Verwendung einer standardmäßigen Fmoc Hauptketten-Schutz-Chemie (Atherton & Sheppard, „Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1989)) Tabelle V
    1) Entschützen von α-Aminogruppe
    2) Aufteilen der Harzpopulation in eine kleine Anzahl von Aliquoten
    3) Für jedes Harz-Aliquot unterstöchiometrisches Koppeln mit codierendem CyDye-aktiviertem Ester durchführen; typische Konzentration: ≈ 0,001 bis 0,1 Mol Farbstoff(e) pro Mol α-Amino.
    4) Für jedes Harz-Aliquot eine Koppelungsreaktion mit codierter Aminosäure durchführen.
    5) Harz-Aliquote zusammengeben.
    6) Schritte 1-5 für jede beliebige Position in der Aminosäuresequenz wiederholen.
  • Dieses Verfahren vermeidet die Übertragung von Fluoreszenzenergie zwischen verschiedenen Farbstoffen. Erstens inaktiviert das Markieren jeglicher Aminosäuresequenz, wie es hier beschrieben ist, diese Sequenz und beendet sie so. In der Folge wird in jede Sequenz nur ein einziger Farbstoff aufgenommen, und die Energieübertragung innerhalb der Sequenz wird vermieden. Zweitens stellen geringe Dichten von auf der Harzoberfläche immobilisierten Farbstoffen (siehe Schritt 3 oben) sicher, dass die seitlichen Abstände zwischen markierten Aminosäuresequenzen wesentlich größer sind als die relevanten Förster-Radii für eine Fluoreszenzenergieübertragung zwischen den Strängen. Dies ist eine Manifestation des bekannten Phänomens der „Pseudo-Verdünnung" bei der Festphasensynthese.
  • Die praktische Anwendbarkeit des Verfahrens in Tabelle V ist durch Markieren von standardmäßigen Kügelchenharzen für die Kombinationssynthese demonstriert worden (NovaSyn TG Aminoharz, NovaBiochem, „Combinatorial Chemistry" Catalog, San Diego, CA, 1997). Insbesondere haben wir SCC (l = 1, m = 6) sowie XSCC (l = 1, mF = 1, ml = 5) mit einzelnen Farbstoffen und mit multiplen Farbstoffen der CyDye-Serie konstruiert und gezeigt, dass Farben bereits bei einem Molverhältnis von 0,0001 mittels Fluoreszenz-Mikroskopie unterscheidbar sind. Außerdem haben wir gezeigt, dass die Farbstoffkoppelungschemie mit der Proteinsynthese kompatibel ist, wie in Tabelle V beschrieben ist.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um die Farbcodierung von kombinatorischen Aminosäure- oder Peptid-Bibliotheken zu realisieren; in Tabelle VI sind Beispiele dafür zusammengefasst. Ein geeignetes Reportersystem ist ein Anti-β-Endorphin monoklonaler Antikörper (mAb), der gegen ein Epitop in Form einer N-terminalen Aminosäuresequenz Ntes-YGGFL gerichtet ist, wobei Y Tyrosin bedeutet; die Bindung des primären Anti-β-Endorphin mAb an sein Ziel wird mit einem Kaskade-blau markierten sekundären Anti-Maus-Antikörper nachgewiesen (Erregung bei 396 nm, Emission bei 410 nm). Tabelle VI
    Binärer Farbcode (BCC) Bit 1: Cy2 Bit 3: Cy5 Bit 2: Cy3 Bit 4: Cy7 XXGFL-βAla-BBAD X = Gly, Ala, Tyr, Phe 16 = 4x4 Spezies erzeugt 16 = 2^4 Spezies erzeugt
    2-stufiger erweiterter BCC ZXXFL-βAla-BEAD 252 = 7*6*6 Spezies erzeugt
    Bit 1: Cy2 Bit 5: Cy5 Z = Gly, Ala, Glu, Lys, 256 = 2^8 Spezies codiert
    Bit 2: 2*Cy2 Bit 6: 2*Cy5 Phe, Tyr, D-Tyr
    Bit 3: Cy3 Bit 7: Cy7 X = Gly, Ala, Glu, Lys,
    Bit 4: 2*Cy3 Bit 8: 2*Cy7 Phe, Tyr
    3-stufiger erweiterter BCC XXXXL-βAla-BEAD 4096 = 8^4 Spezies erzeugt
    Bit 1: Cy2 Bit 7: Cy5 X = Gly, Ala, Ser, Asn, 4096 = 2^12 Spezies codiert
    Bit 2: 2*Cys2 Bit 8: 2*Cy5 Glu, Lys, Phe, Tyr
    Bit 3: 4*Cy2 Bit 9: 4*Cy5
    Bit 4: Cy3 Bit 10: Cy7
    Bit 5: 2*Cy3 Bit 11 2*Cy7
    Bit 6: 4*Cy3 Bit 12: 4*Cy7
  • Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren unter Bezugnahme auf Peptide und Peptid-Vorläufer dargestellt ist, ist das Verfahren ebenso für jegliche andere chemischen Vorläufer und Verbindungsklassen geeignet, die mittels kombinatorischer DCR-Synthese hergestellt worden sind (Calbiochem-NovaBiochem, „Solid Phase Organic Chemistry Handbook", San Diego, CA, 1997).
  • Die nach den geoffenbarten Verfahren hergestellten Verbindungen haben Anwendungsmöglichkeiten als therapeutische Agenzien bei der Behandlung von Bluthochdruck, Entzündungen und Analgesie. Mit den geoffenbarten Verfahren ausgewählte Enkephalin-Analoge können z.B. als schmerzstillende Arzneimitel nützlich sein. Organische Verbindungen, wie Benzodiazepine, die als Muskelentspannungsmittel nützlich sind, können auch mit den geoffenbarten Verfahren ausgewählt werden.
  • Diagnostik und Umgebungs-Monitoring multipler Agenzien
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine neue Anwendung diagnostischer Assays und Tests, die gleichzeitig nach mehreren Reagenzien und Pathogenen sondieren. Im Gegensatz zum räumlichen Codieren diagnostischer Panels im gesamten Stand der Technik können nun beliebige Zusammenstellungen mehrerer Arten von Kügelchen, die an Hand ihrer jeweiligen Farbcodes unterscheidbar sind, gemischt und parallel gehandhabt werden. Zum Beispiel kann bei der Anwendung immunodiagnostischer Assay-Formate auf Kügelchen-Basis die Farbcodierung genützt werden, wie sie hier beschrieben ist, um eine Vielzahl von spezifischen, auf Kügelchen verankerten Antikörpern zu zeigen, wobei jede Art einem bestimmten Farbcode zugeordnet ist, um nach einer Vielzahl von Agenzien in der Umgebung zu suchen.
  • Eine bevorzugte Anwendung eines diagnostischen Assays mit multiplen Agenzien verwendet beliebige Anordnungen chemisch codierter Kügelchen (6). Die Bestimmung der Blutgruppe würde zum Beispiel nur fünf verschiedene Typen von Kügelchen erfordern, eine Aufgabe, die mit SCC (l = 1, m = 5) leicht zu lösen ist. Diese Realisierung von Vorrichtungen für diagnostische Tests und Umgebungs-Monitoring würde die Verkleinerung und Integration mehrerer Tests und die automatisierte Bedienung auf Basis der Spektralablesung erleichtern.
  • In situ-Abfragen und Decodierung von farbcodierten Kügelchen
  • Die optische Anordnung in 7 bietet die Integration von zwei essentiellen Fähigkeiten: mikroskopische Fluoreszenz-Abbildung und Mehrfarben-Fluoreszenz-Analyse einzelner Kügelchen. Letztere dient dazu, die relativen Häufigkeiten mehrerer auf der Oberfläche der Kügelchen vorhandener Fluorophore zu bestimmen.
  • Die Verwendung eines Mikroskop-Objektivs mit hoher numerischer Öffnung (N.A. = 0,7) (702) dient dazu, die Sammlungseffizienz sowie die räumliche Auflösung zu maximieren. Die wesentlichsten zusätzlichen Komponenten von 7 sind: ein Lang-Pass-Filter, um kein gestreutes Erregungslicht (704) durchzulassen, einen dichromatischen Strahlenteiler (706), um die Strahlen für die Bildung des Abbilds durch die Feldlinse (708) zu teilen, und Spektralanalyse mittels Fokussierung des Lichts (mittels Linse 710) auf der spaltförmigen Öffnung eines Gitter-Monochromators (712) oder, alternativ dazu (nicht dargestellt) auf der Eintrittspupille einer optischen Faser, die mit einem Gitter-Monochromator gekoppelt ist; mehrfarbige Spektren werden mit einer CCD-Anordnung (714) aufgezeichnet. Unendlichkeit-korrigierte optische Komponenten bieten eine praktische Implementierung.
  • Während einfache Lang-Pass-Filter in DNA-Sequenzierungs-Anwendungen verwendet worden sind, um mit einer einzigen Wellenlänge zugeführtes gestreutes Erregungslicht abzuhalten, können Interferenzfilter so gestaltet werden, dass sie mehrere enge (10 nm) Pass-Bänder bei mehreren Emissionswellenlängen bieten, die für die hier diskutierte CyDye-Familie von Fluorophoren charakteristisch sind. Ähnliche Herstellungsverfahren können für den dichromatischen Spiegel verwendet werden. Diese Überlegungen sind insbesondere für eine Epifluoreszenz-Geometrie, einen Spezialfall der Reflexionsmikroskopie, relevant.
  • Zu den geeigneten instrumentellen Realisierungen der Aufnahme von Spektralinformationen von einzelnen farbcodierten Kügelchen oder Sammlungen von farbcodierten Kügelchen gehören die fließcytometrische Analyse und die Multispektralabbildung. Die letztere gestattet die Sammlung von Spektralinformationen von einzelnen oder mehreren Kügelchen im Sichtfeld eines Mikroskops oder einer anderen Abbildungsvorrichtung, wie sie in 7 angedacht ist.
  • Für die Multispektralabbildung geeignete Verfahren beinhalten: Multiplexieren distinkter Wellenlängen von einfallendem und emittiertem Licht und Belichtung mit einer Überlagerung mehrerer Wellenlängen, gefolgt von der dispersiven Abbildung mit Hilfe eines Gitters oder Prismas (siehe 7), oder gefolgt von der interferometrischen Analyse des emittierten Lichts.
  • Das erste Verfahren ist bei Verwendung passender optischer Pass-Band-Filter leicht anzuwenden; diese werden in Filterräder montiert und in der Bahn des einfallenden und emittierten Lichts eines Mikroskops positioniert. Die synchronisierte Rotation der zwei Filterräder führt passende Paare von Erregungs- und Emissionsfiltern (eine Reflexionsgeometrie erfordert auch einen geeigneten dichromatischen Spiegel) in die Lichtbahn ein, wodurch eine sich wiederholende Serie von Abbildungen bei jeder der distinkten Wellenlängen produziert wird, die für eine der Filter/Spiegel-Kombinationen ausgewählt sind. Dieses Prinzip wird zum Beispiel beim Fluorescence Imaging MicroSpectrophotometer realisiert, das von Kairos Scientific (Santa Clara, CA) entwickelt wurde.
  • Beim zweiten Verfahren werden distinkte Wellenlängen für die Belichtung mit einer Multi-Pass-Band-Filter/Spiegel-Kombination erzeugt; ein Prisma wird in die abgehende Bahn eingeführt. Diese Konfiguration erleichtert die gleichzeitige Spektralanalyse mehrerer Kügelchen, die sich in einem rechteckigen Stück des Gesichtsfelds des Mikroskops befinden. Das von Kügelchen in diese Stuck emittierte Licht wird auf den Eingangsspalt des Prismas abgebildet und in seine Spektralkomponenten zerlegt. Dieses Prinzip wird beim PARISS Imaging Spectrometer Attachment realisiert, das von LightForm (Belle Meade, NJ) entwickelt wurde. Beim dritten Verfahren wird Licht aus dem gesamten Gesichtsfeld interferometrisch analysiert: Ein filmförmiger Strahlenteiler in der Ausgangsbahn erzeugt zwei (kohärente) Lichtstrahlen, die von einem Spiegel reflektiert und rekombiniert werden. Wenn der Strahlenteiler gedreht wird, wird zwischen den beiden Lichtstrahlen eine kleine Differenz der Bahnlänge eingeführt, was zu Interferenzstreifen führt, wenn die beiden Strahlen rekombiniert werden. Diese Streifen enthalten die gesamte Spektralinformation, die in dem vom Gesichtsfeld eines Mikroskops emittierten Licht enthalten ist (Garini et al., Bioimaging 4, 65-72 (1996)). Das heißt, wenn der Strahlenteiler gedreht wird, wird für jede Position innerhalb des Gesichtsfelds ein kontinuierliches Spektrum erzeugt, was zu einer dreidimensionalen Darstellung der Daten führt. Dieses Prinzip wird im SpectraCube-System realisiert, das von Applied Spectral Imaging (Carlsbad, CA) entwickelt und vertrieben wird. Im Gegensatz zum ersten Verfahren erzeugen das zweite und dritte Verfahren ein kontinuierliches Spektrum, was die Spektralklassifikation überlappender Emissionsbande erleichtert.
  • Die Anordnungen in 8 bieten zusätzliche Flexibilität beim Abhalten von Streulicht durch die räumliche Trennung der Sammlung des einfallenden und emittierten Lichts bei der Transmissions- und Sperr-Mikroskopie, wie in 8A bzw. 8B dargestellt ist. Außerdem besteht auch hier die Möglichkeit, speziell ausgebildete Multi-Pass-Band-Interferenzfilter in der Bahn des abgegebenen Lichts zu verwenden.
  • Die Anforderungen an die Empfindlichkeit des mehrfarbigen Fluoreszenznachweissystems rühren von der Anzahl der Fluorophoren jeder Farbe her, die auf einem gewählten Kügelchen erwartet werden. Ein Kügelchen mit dem Radius R und einer Oberfläche von A = 4πR^2 beherbergt bis zu N = A/a Moleküle der Moleküloberfläche a, oder N* = xN Fluorophore. Bei a = 30A und 0,01 < x < 0,1 kann ein Kügelchen mit 10 μm Durchmesser 10^7 ≤ N* ≤ 10^8 Fluorophore tragen. Im Vergleich dazu basiert die Abbildung kleiner runder Domänen mit 10 μm Durchmesser innerhalb eines monomolekularen Films aus einem Phospholipid, das 1 Mol% eines fluoreszierenden Analogs enthält und auf eine Luft-Wasser-Grenzfläche beschränkt ist, auf einer vergleichbaren Anzahl von Fluorophoren und wird durch die Verwendung einer Silicium-verstärkten Ziel-(silicon-intensified target, SIT) Kameratechnologie leicht erreicht. Die Refraktionseigenschaft von Kügelchen in wässeriger Lösung verstärkt die Effizienz der Lichtsammlung des gesamten Systems noch weiter.
  • In situ-Abfrage und Decodierung von farbcodierten Kügelchen-Anordnungen
  • Die vorliegende Erfindung bietet eine Methodik zur Farbcodierung von Kügelchen und beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für die in situ-Abfrage und Decodierung von farcodierten Kügelchen und Sammlungen von Kügelchen mittels Mehrfarben-Fluoreszenz-Abbildung und Spektralanalyse. Dieses Verfahren ist mit allen Assayformaten für Kügelchen kompatibel, die bisher beschrieben worden sind, wie hier diskutiert ist.
  • Die Erfindung basiert auf einem Format, das eine besonders effiziente Umsetzung von Kügelchen-Assays auf der Basis der erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen bietet, und verwendet ebene Kügelchenanordnungen. Dieses Format erleichtert das hochparallele Screening der Enzymaktivität, Rezeptor-Ligand-Bindung, Antikörper-Antigen-Erkennung sowie DNA- oder RNA-Hybridisierung etc. So kann eine dicht gepackte Anordnung von Kügelchen mit 100 μm Durchmesser der Größenordnung von 10^4 Kügelchen in einem Gebiet von nur 1 cm^2 enthalten, was die Untersuchung von bis zu 10^4 Verbindungen/cm^2 in einem einzigen Pass ermöglicht. Die sofortige Bestimmung der chemischen Identitäten ermöglicht die effiziente Anwendung wiederholter Screenings, in welchen mehrere Kopien jeder Art von Kügelchen untersucht werden, um ein statistisch haltbares Ranking von Verbindungen zu erhalten, die positive Assay-Scores ergeben. Des weiteren bietet sich die Implementierung der vorliegenden Erfindung in einem ebenen Kügelchen-Anordnungsformat für die Automatisierung an. Automatisierte Operationen bringen die Herstellung ebener Kügelchen-Anordnungen mit sich, gefolgt von der Fluoreszenzabbildung der Anordnung, um die Kügelchen zu finden, die der Spektralanalyse und dem prozessbegleitenden Decodieren unterworfen werden sollen. Die intrinsische Bestimmungsempfindlichkeit der Fluoreszenz, dargestellt auf dem Niveau der Bestimmung einzelner Fluorophore, ermöglicht es, die Größe der Synthesekügelchen erheblich zu reduzieren. Dies wiederum erleichtert die Verkleinerung und den Einschluss in ein geschlossenes System mit den zusätzlichen Vorteilen der Reduktion der erforderlichen Menge synthetisierter Verbindung und der Menge Reagenzien, die im Laufe des Screenings verbraucht werden.
  • Ein Verfahren zur Bildung ebener Anordnungen von Kügelchen besteht darin, sich auf das durch die Schwerkraft hervorgerufene Absetzen der Kügelchen aus einer Suspension zu verlassen, um eine (statische) Schicht von Kügelchen oder eine Anordnung von Kügelchen-Clustern auf einem ebenen Substrat zu erzeugen. Ein zweites Verfahren verwendet dynamische ebene Anordnungen von Kügelchen, die angrenzend an ebene Oberflächen gebildet werden und in situ unter externer Kontrolle manipuliert werden, zum Beispiel durch die Licht-kontrollierte elektrokinetische Ansammlung von Partikeln in der Nähe von Oberflächen (Light-controlled Electrokinetic Assembly of Particles near Surfaces, LEAPS). LEAPS ist eine Technolgie, die die Möglichkeit bietet, auf Abruf dynamische ebene Anordnungen von Kügelchen in wässeriger Lösung zu bilden und sie in einem designierten Gebiet einer ebenen Elektrodenoberfläche zu platzieren und zu halten, wie in der ebenfalls anhängigen PCT-Anmeldung dargelegt ist, die am 24. April 1997 eingereicht wurde und den Titel „Light Controlled Electrokinetic Assembly of Particles Near Surfaces" trägt, basierend auf der vorläufigen U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 60/016,642 , eingereicht am 25. April 1996.
  • Dynamische ebene Anordnungen von Kügelchen haben zusätzliche Vorteile bei der Umsetzung automatisierter Screening-Assays in einer verkleinerten, umschlossenen Umgebung. Suspensionen von Kügelchen aus einem Synthese-Pool werden in eine Sandwich-Fließzelle geladen, wo ebene Anordnungen von Kügelchen angrenzend an die ebenen Wände der Zelle gebildet werden; Screening-Assays erfolgen in ebenem Anordnungsformat, um Leitverbindungen zu identifizieren, ohne dass ein zeitaufwändiger und fehleranfälliger Schritt einer physikalischen Abtrennung erfolgen müsste; nach der Fertigstellung des geplanten Assays werden die Anordnungen der Kügelchen auseinandergenommen und die Suspension der Kügelchen verworfen, um die Fließzelle für einen weiteren Zyklus fertig zu machen. Im Beispiel würde eine Redundanz von 10, d.h. das Vorhandensein von 10 Kopien von Kügelchen des identen Typs und Farbcodes noch immer das Screening von 1000 Verbindungen auf einmal erleichtern, würde jedoch die Qualität jeglicher pharmakokinetischer Charakterisierung erheblich verbessern. Die Vorteile der Verkleinerung würden durch die Verwendung kleiner Synthesekügelchen noch erhöht. Chemisch und physikalisch gut definierte Kügelchen im erforderlichen Größenrahmen (10 μm Durchmesser) sind von zahlreichen kommerziellen Quellen erhältlich. Die sind mittels LEAPS leicht zu manipulieren, um dynamische ebene Anordnungen von Kügelchen mit hoher Dichte zu bilden. Dies stellt sicher, dass die Screening-Assays in einem hochgradig parallelen Format an einer großen Anzahl von Proben durchgeführt werden können, und dies bietet wiederum die Basis für hochgradig wiederholendes Screening und eine robuste pharmakokinetische Charakterisierung möglicher Leitverbindungen.
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Experimentendetails besser zu verstehen sein. Ein Fachmann wird jedoch leicht bemerken, dass die diskutierten spezifischen Verfahren und Ergebnisse nur dazu dienen, die Erfindung, wie sie in den danach folgenden Ansprüchen beschrieben ist, beispielhaft darzustellen.
  • Beispiel 1
  • 1. Farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen
  • a. Herstellung von farbcodierten PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen
    • (1) Cy2 (ex = 489 nm, em = 506 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: 50 mg NovaSyn TG Amino-Mikrokügelchen (NovaBiochem; 130 μm Durchmesser, 15 μMol Amin) wurden in 10 ml DMF 30 min lang bei 25°C äquilibriert. Der Überstand wurde mittels Filtration abgetrennt, und 100 μl DMF, 1 μl TEA und 15 μl 1 mM Cy2-bisfunktionaler NHS-Ester (Amersham; 15 nMol) wurden in DMF zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h lang bei 25°C geschüttelt, 2 μl (20 μMol) n-Butylamin wurden zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde weitere 30 min bei 25°C geschüttelt. Der Überstand wurde entfernt, und die Mikrokügelchen wurden zwei Mal mit 5 ml DMF gewaschen, zwei Mal mit 5 ml Chloroform gespült und im Vakuum getrocknet.
    • (2) Cy3 (ex = 550 nm, em = 570 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: Diese Herstellung war ident mit (1), außer dass in parallelen Reaktionen 15 μl 0,001, 0,01, 0,1 und 1 mM Cy3-monofunktionaler NHS-Ester (Amersham; 0,15, 1,5 und 15 nMol) verwendet wurden, und der Schritt mit n-Butylamin wurde ausgelassen.
    • (3) Cy3,5 (ex = 581 nm, em = 596 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: Diese Herstellung war ident mit (1), außer dass 15 μl 1 mM Cy3,5-monofunktionaler NHS-Ester (Amersham; 15 nMol) verwendet wurde, und der Schritt mit n-Butylamin wurde ausgelassen.
    • (4) Cy5 (ex = 649 nm, em = 670 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: Diese Herstellung war ident mit (1), außer dass 15 μl 1 mM Cy5-monofunktionaler NHS-Ester (Amersham; 15 nMol) verwendet wurde, und der Schritt mit n-Butylamin wurde ausgelassen.
    • (5) Cy5,5 (ex = 675 nm, em = 694 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: Diese Herstellung war ident mit (1), außer dass 15 μl 1 mM Cy5,5-monofunktionaler NHS-Ester (Amersham; 15 nMol) verwendet wurde, und der Schritt mit n-Butylamin wurde ausgelassen.
    • (6) Cy7 (ex = 743 nm, em = 767 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: Diese Herstellung war ident mit (1), außer dass 15 μl 1 mM Cy7-bisfunktionaler NHS-Ester (Amersham; 15 nMol) verwendet wurde.
    • (7) Cy3/Cy5-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: Diese Herstellung war ident mit (1), außer dass sowohl Cy3-monofunktionaler NHS-Ester als auch Cy5-monofunktionaler NHS-Ester (jeweils 15 μl von 1 mM Ausgangslösung) verwendet wurden, und der Schritt mit n-Butylamin wurde ausgelassen.
    • (8) Cy2/Cy3/Cy5/Cy7-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen: Diese Herstellung war ident mit (1), außer dass Cy2-bisfunktionaler NHS-Ester, Cy3-monofunktionaler NHS-Ester, Cy5-monofunktionaler NHS-Ester und Cy7-bisfunktionaler NHS-Ester zugesetzt wurden (jeweils 15 μl von 1 mM Ausgangslösung).
  • b. Stabilität von Cy3-codierten PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen gegenüber Festphasen-Peptidsynthese-Bedingungen.
  • Cy3-codierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen wurden einem Zykluseiner Festphasen-Peptidsynthese unterworfen. 50 mg Mikrokügelchen und 5 mg Fmoc(Lys)Boc-OBT [hergestellt durch Umsetzung von 94 mg Fmoc(Lys)Boc-OH (NovaBiochem; 0,2 mMol), 48 mg DCC (Aldrich; 0,22 mMol) und 27 mg HOBT (Aldrich; 0,2 mMol) in 2 ml DMF für 0,5 h bei 25°C, Zentrifugieren bei 2000 × g für 5 min bei 25°C und Verwendung von 100 μl des Überstandes] in 100 μl DMF wurden 0,5 h lang bei 25°C geschüttelt. Die Mikrokügelchen wurden filtriert, in 100 μl 20% Piperidin in DMF 15 min lang bei 25°C suspendiert, zwei Mal mit 5 ml CHCl3 gewaschen und getrocknet. Die UV/VIS-Extinktions- und Fluoreszenz-Eigenschaften der Cy3-codierten PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen waren unverändert.
  • c. Optische Eigenschaften farbcodierter PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen
  • Auf ihre optischen Eigenschaften untersuchte Mikrokügelchen schlossen ein:
    Cy3 (ex = 550 nm, em = 570 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen mit vier verschiedenen Intensitätsniveaus, hergestellt wie in Abschnitt a-(2) oben beschrieben durch Umsetzung der Kügelchen mit 0,001, 0,01, 0,1 und 1 mM Cy3, sind mit b3-0001, b3-001, b3-01 bzw. b3-1 bezeichnet; als Gruppe werden alle Cy3-codierten PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen mit b3-x bezeichnet.
    Cy5 (ex = 649 nm, em = 670 nm)-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen, hergestellt wie in Abschnitt a-(2) oben beschrieben durch Umsetzung der Kügelchen mit 1 mM Cy5, sind mit b5-1 bezeichnet.
    Cy3/Cy5-farbcodierte PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen, hergestellt wie in Abschnitt a-(2) oben beschrieben durch Umsetzung der Kügelchen mit 1 mM Cy3/Cy5, sind mit b35-1 bezeichnet.
  • Ein Aliquot getrockneter Mikrokügelchen wurde in DMF suspendiert und auf einer Siliciumscheibe (silicon wafer) dispergiert; DMF wurde durch sanfte Erwärmung verdampft. Alle folgenden Beobachtungen wurden an der Luft durchgeführt.
  • (1) Fluoreszenzabbildung
  • Die Beobachtungen wurden mit einem Zeiss UEM Mikroskop gemacht, das für Epifluoreszenz ausgerüstet war; es wurden Kombinationen von Erregungsfilter/dichromatischem Spiegel/Emissionsfilter, entworfen für Cy3 und Cy5 (Chroma Technologies, Brattleboro, VT) in Verbindung mit einer 100 W Halogen-Lichtquelle und Objektiven mit 10×, 25× und 40× Vergrößerung verwendet. Die Abbildungen wurden gegebenenfalls mit einer SIT-Kamera (Cohu, San Diego, CA) aufgezeichnet.
  • Alle Mikrokügelchen wiesen einen hellen Umfangs-„Ring” hoher Intensität auf, der ≤ 5% des Partikeldurchmessers entsprach, was darauf hinweist, dass die Markierung primär mit der Oberfläche jedes Partikels assoziiert war und nicht so sehr mit dem Inneren. Selbst die undeutlichsten Partikel, vom Typ b3-0001, waren mit einem 25x/0.45NA Objektiv und der SIT-Kamera leicht zu beobachten. Mikrokügelchen vom Typ b3-0001 erschienen blasser als die Mikrokügelchen vom Typ b3-001, jedoch um weniger als den erwarteten Faktor 10. Dieses Phänomen bleibt noch zu untersuchen, es könnte jedoch auf ein Löschen der Fluoreszenz hindeuten. Jeder gegebene Satz von Cy3-codierten Mikrokügelchen wies von Partikel zu Partikel Variationen in der Farbe auf: einige Partikel erschienen orange, andere gelb. Partikel vom Typ b5-1 erschienen hellrot.
  • (2) Fluoreszenzspektren
  • Um die Machbarkeit der in situ-Abfrage farbcodierter Mikrokügelchen zu demonstrieren, wurden Fluoreszenzspektren von einzelnen farbcodierten PEG-Polystyrol-Mikrokügelchen mit Hilfe eines PARISSTM Abbildungs-Spektrophotometers (Prototyp zur Verfügung gestellt von LightForm, Belle Meade, NJ) mit einem 50 μm breiten Eingangsspalt, gebogenem Prisma und Raumtemperatur CCD-Anordnung, die zur Integration auf dem Chip in der Lage war, aufgezeichnet. Das Instrument wurde auf den Kamera-Port eines Zeiss UEM Mikroskops montiert. Bei dieser Konfiguration können mehrere Kügelchen, die entlang der Längsdimension des projizierten Spalts aufgereiht sind, abgebildet und spektral analysiert werden. Es wurde nur eine ungefähre Wellenlängenkalibrierung vorgenommen.
  • Spektren, die eine Fluoreszenzintensität als eine Funktion der Wellenlänge aufwiesen, wurden für die mit Cy3 bzw. Cy5 codierten Mikrokügelchen separat erhalten und wiesen die folgenden Spektralcharakteristika auf:
    b3-x: Spektren wurden für alle Arten von Partikeln erhalten; spezifische Merkmale beinhalteten: für b3-0001: Verhältnis Signal-Rauschen (signal to noise, S/N) 2, Verhältnis Signal-Hintergrund (signal to background, S/B) ≈ 1,5; für b3-001: S/N ≈ 4, S/B ≈ 2 (mit einer CCD-Integrationszeit von ca. 10 s); ein Glätten brachte eindeutig charakteristische Spektralmerkmale zum Vorschein; für b3-1: S/N > 10;
    b5-1: Es wurden sehr reine Spektren aufgezeichnet, alle mit einer leichten Schräge in Richtung hoher Wellenlänge;
    b35-1: Es wurden sehr reine Spektren beider Markierungen aufgezeichnet, wobei zwischen den geeigneten Filtern umgeschaltet wurde, um die Betätigung eines Filterrades zu simulieren. Bei dieser Konzentration wiesen die Spektren (genommen mit 10 Mal kürzerer Integrationszeit als jene, die für b3-01 und b3-001 verwendet wurde) kein erkennbares Rauschen auf.
  • 2. Farbcodierte makroporige Polystyrol-Mikrokügelchen
  • a. Herstellung farbcodierter makroporiger Polystyrol-Mikrokügelchen
  • 50 mg Amino-Biolinker-PM1-1000 Amino-Oligoethylenglykol-funktionalisierte makroporige Polystyrol-Mikrokügelchen (Solid Phase Sciences; 35 μ Durchmesser, 7 μMol Amin) wurden in 2 ml DMF 20 min lang bei 25°C äquilibriert Der Überstand wurde durch Filtrieren entfernt, und 100 μl DMF, 1 μl TEA und 70 μl 1 mM Cy3-monofunktionaler NHS-Ester (Amersham; 70 nMol) wurden zugesetzt. Nach 1 Stunde bei 25°C unter Schütteln wurde der Überstand durch Filtrieren entfernt, und die Mikrokügelchen wurden zwei Mal mit 5 ml DMF gewaschen, zwei Mal mit 5 ml CHCl3 gewaschen und im Vakuum getrocknet.
  • b. Optische Eigenschaften farbcodierter makroporiger Polystyrol-Mikrokügelchen
  • Eine visuelle Inspektion unter Verwendung der unter Beispiel 1 beschriebenen Konfiguration zeigte erhebliche Variationen der Fluoreszenzintensität zwischen den Kügelchen.
  • 3. Farbcodierte Festglas-Mikrokügelchen („pelikuläre Mikrokügelchen")
  • a. Herstellung farbcodierter pelikulärer Mikrokügelchen
  • (1) Epoxid-funktionalisierte pelikuläre Mikrokügelchen:
  • 4 g feste Normalglas-Mikrokügelchen (Duke Scientific; 40 ±3 μ Durchmesser; 4,8 × 107 Mikrokügelchen), 7 ml Xylol, 2,34 ml 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (Aldrich; 1 mMol) und 0,117 ml Diisopropylethylamin (Aldrich; 0,7 mMol) wurden 18 h lang bei 80°C geschüttelt. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wurden die Mikrokügelchen filtriert, mit 40 ml Methanol gewaschen, mit 40 ml Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
  • (2) MMT-NH-PEG-funktionalisierte pelikuläre Mikrokügelchen:
  • Mikrokügelchen von (1) wurden in einer Lösung von 200 mg Mono-MMT-1,13-trioxotridecadiamin [0,4 mMol; hergestellt durch Mischen von 7 g MMT-Cl (Aldrich; 23 mMol) und 11,3 ml 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (Aldrich; 51 mMol) in 150 ml 1:1:1 Methylenchlor:Pyridin:Acetonitril für 18 h bei 25°C, dann Isolieren des erforderlichen Addukts mittels Chromatographie auf Silicagel] in 6 ml Xylol suspendiert. Es wurden ca. 10 mg Natriumhydrid (Aldrich; 0,4 mMol) zugesetzt, und die Suspension wurde 18 h lang bei 40°C unter einem Trockenrohr geschüttelt. Die Mikrokügelchen wurden dann filtriert und nacheinander mit 20 ml Methanol, 10 ml Wasser, 20 ml Methanol und 20 ml Chloroform gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die getrockneten Mikrokügelchen wurden durch Umsetzen mit 5% Essigsäureanhydrid, 5% 2,6-Lutidin, 8% N-Methylimidazol in 10 ml Tetrahydrofuran 1 h lang bei 25°C unter Schütteln ge-„capped", nacheinander in 2 × 5 ml Methanol, 2 × 5 ml Chloroform und 2 × 5 ml Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
  • (3) H2N-PEG-funktionalisierte pelikuläre Mikrokügelchen:
  • Mikrokügelchen aus (2) wurden 0,5 h lang bei 25°C unter Schütteln mit 1 ml 3% TFA in CH2Cl2 behandelt. Auf Basis der Quantifizierung der freigesetzten Monomethoxytrityl-Kationen (ε478 = 3,47 × 104 M–1 cm–1) waren die Ladedichten von H2N-PEG wie folgt:
    15 fMol H2N-PEG pro Mikrokügelchen
    1,1 × 1010 Moleküle H2N-PEG pro Mikrokügelchen
    0,022 Moleküle H2N-PEG pro Å2
  • Wenn man ≈ 0,04 verfügbare Silanolgruppen pro Å2 Normalglas annimmt, betrug die Aufpfropfeffizienz (grafting efficiency) 50%.
  • (4) Farbcodierte PEG-funktionalisierte pelikuläre Mikrokügelchen:
  • Zu 20 mg H2N-PEG-funktionalisierten pelikulären Mikrokügelchen (4,2 nMol Amin) wurden 97 μl DMF, 2 μl TEA und 0,8 μl 1 mM Cy3-monofunktionaler NHS-Ester (Amersham; 0,8 nMol) zugesetzt, und die erhaltene Suspension wurde 18 h lang bei 25°C geschüttelt. Die Mikrokügelchen wurden dann filtriert und nacheinander mit 5 ml DMF, 5 ml Methanol, 5 ml Chloroform und 5 ml Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Basierend auf der Quantifizierung der verbrauchten Cy3-monofunktionalen NHS-Ester (ε552 = 1,5 × 105 M–1 cm–1) waren die Ladungen der Cy3-Dichten wie folgt:
    1 fMol Cy3 pro Mikrokügelchen
    6 × 108 Moleküle Cy3 pro Mikrokügelchen
    0,001 Molekül Cy3 pro Å2
    0,07 Moleküle Cy3 pro Molekül verfügbares H2N-PEG
  • b. Optische Eigenschaften von Cy3-codierten PEG-funktionalisierten pelikulären Mikrokügelchen:
  • Eine visuelle Inspektion unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Konfiguration ergab gleichmäßig fluoreszente Mikrokügelchen.

Claims (24)

  1. Verfahren des Identifizierens einer Verbindung von Interesse in einer Bibliothek von Verbindungen, wobei jede der besagten Verbindungen an ein Kügelchen gebunden ist und durch eine einzigartige Umsetzungsfolge hergestellt wird, zusammengesetzt aus N-Umsetzungsschritten, worin N eine ganze Zahl von mindestens 1 bis etwa 100 ist, und worin jede Verbindung aus Bestandteilen hergestellt wird, wobei das Verfahren umfasst: a) Teilen einer Population von Kügelchen mit mindestens einer Art einer funktionalen Gruppe an der Oberfläche von besagtem Kügelchen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CO2H, OH, SH, NH2, NHR, CH2Cl, CH2Br und CHN2, worin R eine lineare C1-C9-Alkylgruppe darstellt, in M-Partien, worin M eine ganze Zahl von mindestens 2 bis etwa 25 ist; b) Koppeln der M-Partien von Kügelchen in einem Satz von mindestens einer Umsetzung jeweilig mit M verschiedenen Bestandteilen, um so eine Bindung mit dem Kügelchen über besagte funktionale Gruppe zu bilden, wobei besagte Bestandteile unabhängig geschützt oder ungeschützt sind; c) Zugeben zu jeder Partie, gegebenenfalls vor Kopplungsschritt b), gleichzeitig damit oder nach Schritt b), von etwa 0,001 bis etwa 0,5 Moläquivalent einer spektral unterscheidbaren, einzigartig mit jedem Bestandteil verbundenen Fluorophor-Markierung, wobei besagte Markierung durch ihre kennzeichnende(n) Anregungswellenlänge(n), Emissionswellenlänge(n), Anregungszustand-Bestand und/oder Emissionsintensität identifiziert wird, so dass besagte eine oder mehrere Markierung(en) einen Code bildet, welcher Code einzigartig mit einer Verbindung verbunden ist, worin jede Markierung aktiviert wird, um so in der Lage zu sein, entweder eine direkte Bindung an die Oberfläche des Kügelchens zu bilden, gegebenenfalls über eine funktionale Gruppe, welche gegebenenfalls geschützt ist und gleich wie oder verschieden von der an den Bestandteil gebundenen funktionalen Gruppe sein kann, oder eine indirekte Bindung über eine C1-C9 lineare oder verzweigte Alkyl-Linker-Komponente, welche gegebenenfalls durch mindestens ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom oder eine Carbonyl, (C=O)NH oder NH(C=O) Komponente unterbrochen ist, worin wenn besagte funktionale Gruppe geschützt ist, besagte funktionale Gruppe vor Bilden besagter direkter oder indirekter Bindung entschützt wird, besagter Linker an die funktionale Gruppe an der Oberfläche des Kügelchens gebunden wird; (d) Rekombinieren aller besagten M-Partien nach (b) und (c); (e) Durchführen einer Untersuchung, welche in der Lage ist anzuzeigen, dass irgend eine Verbindung in der Bibliothek eine Eigenschaft von Interesse hat; (f) Bilden einer ebenen Kügelchenanordnung von besagten Kügelchen; und (g) Decodieren des Codes, zusammengesetzt aus einer oder mehreren Markierung(en), um die mit dem Code verbundene Verbindung zu identifizieren, wobei der Decodierschritt ausgeführt wird, während die Kügelchen in der ebenen Kügelchenanordnung angeordnet sind, ohne das Kügelchen, welches die Verbindung mit der Eigenschaft von Interesse umfasst, von den anderen Kügelchen zu isolieren, und ohne irgendeine der Markierung(en) von dem Kügelchen abzutrennen, welches die Verbindung mit der Eigenschaft von Interesse umfasst, und wobei besagter Decodierschritt in-situ optische Abfrage der Markierung(en) umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin jede Fluorophor-Markierung unterstöchiometrische Menge im Vergleich zum in (b) zugegebenen Bestandteil hat.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin jede in (c) zugegebene Fluorophor-Markierung von etwa 0,001 bis etwa 0,1 Moläquivalent zu dem in (b) zugegebenen Bestandteil ist.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die optische Abfrage von jeder Fluorophor-Markierung Bestimmen ihrer relativen Häufigkeit umfasst.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin jede Fluorophor-Markierung durch kovalente Bindung an das Kügelchen gebunden ist.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Fluorophor-Markierung ein Farbstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit den folgenden chemischen Namen: 3-(ε-Carboxypentyl)-3'-ethyl-oxacarbocyanin-6,6'-disulfonsäure (Cy2TM); 1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanin-5,5'-disulfonsäure (Cy3TM); 1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3'3'-tetramethyl-3H-benz(e)indocarbocyanin-5,5',7,7'-tetrasulfonsäre (Cy3.5TM); 1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanin-5,5'-disulfonsäure (Cy5TM); 1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3',-tetramethyl-3H-benz(e)indodicarbocyanin-5,5',7,7'-tetrasulfonsäure (Cy5.5TM) ; und 1-(ε-Carboxypentyl)-1'-ethyl-3,3,3',3',-tetramethylindotricarbocyanin-5,5'-disulfonsäure (Cy7TM); und als aktiver Ester aktiviert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Succinimidyl, Sulfosuccinimidyl, p-Nitrophenol, Pentafluorphenol, HOBt und N-Hydroxypiperidyl.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Fluorophor-Markierung ein Farbstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit den folgenden chemischen Namen: 6-((4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure (BODIPY FL-XTM); 6-((4,4-Difluor-5-phenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure (BODIPY R6G-XTM); 6-((4,4-Difluor-1,3-dimethyl-5-(4-methoxyphenyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-propionyl)amino)hexansäure (BODIPY TMR-XTM); 6-(((4-(4,4-Difluor-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)phenoxy)acetyl)amino)hexansäure (BODIPY TR-XTM); 6-(((4,4-Difluor-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexansäure, (BODIPY 630/650-XTM); und 6-(((4,4-Difluor-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexansäure (BODIPY 650/655-XTM); und als aktiver Ester aktiviert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Succinimidyl, Sulfosuccinimidyl, p-Nitrophenol, Pentafluorphenol, HOBt und N-Hydroxypiperidyl.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Fluorophor-Markierung ein Farbstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit den folgenden chemischen Strukturen:
    Figure 00360001
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Schritt (g) unter Verwendung von Mehrfarben-Fluoreszenzabbildung- oder Spektralabbildung-Analyse durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin Schritt (g) unter Verwendung von Mehrfarben-Fluoreszenzabbildung in Kombination mit Spektralanalyse durchgeführt wird.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Fluorophor-Markierung durch Emissionsintensität durch Anpassen des Verhältnisses der relativen Mengen von jeder Fluorophor- Markierung optisch unterscheidbar ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Verhältnis 1:1, 2:1, 3:1 oder 4:1 ist.
  13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verbindung von Interesse ein Oligonucleotid oder Nucleinsäure umfasst.
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin N eine ganze Zahl von mindestens 4 bis etwa 12 ist.
  15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Kügelchen aus einem Material zusammengesetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polyethylen, Cellulose, Polyacrylat, Polyacrylamid, Silica und Glas.
  16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Code ein binärer Code, ein erweiterter binärer Code oder ein einfacher Code ist.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Eigenschaft von Interesse eine Bindungsaffinität einer Verbindung an einen Rezeptor ist, die Untersuchung durchgeführt wird durch Bestimmen einer physikalischen Antwort auf Bindung durch: (a) zuerst Beimischen mit der Bibliothek von Verbindungen einer Lösung aus einem gekennzeichneten Rezeptor, um so gekennzeichnete Rezeptorbindung an mindestens eine an ein Kügelchen gebundene Verbindung zu ergeben; (b) Entfernen der Lösung von dem Kügelchen; (c) gegebenenfalls Waschen des Kügelchens, um so nicht-gebundenen gekennzeichneten Rezeptor im Wesentlichen zu entfernen; und (d) Messen der physikalischen Antwort infolge von gebundenem gekennzeichneten Rezeptor, um so die Bindungsaffinität zu bestimmen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, worin der Rezeptor durch einen fluoreszierenden Farbstoff, einen farbigen Farbstoff, ein Radioisotop oder ein Enzym gekennzeichnet ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die physikalische Antwort Fluoreszenz-Emission, optische Absorption oder Radioaktivität ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Untersuchung durch Abspalten von Verbindungen von dem Kügelchen während des Erlaubens von Diffusion durch Lösung und Bindung an Rezeptoren durchgeführt wird, wobei besagte Rezeptoren in der Nähe zu jedem Kügelchen angeordnet sind.
  21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Decodierschritt (g) die Schritte umfasst: (i) Sammeln von spektralen Fluoreszenzdaten für jedes jeweilige Kügelchen, um so die jeweilige Häufigkeit der daran gebundenen Markierung(en) zu bestimmen; und (ii) Analysieren der gesammelten spektralen Fluoreszenzdaten durch Vergleichen der jeweiligen relativen Häufigkeiten der in (i) bestimmten Markierung(en), um so die einzigartige Umsetzungsfolge für den Bestandteil zu bestimmen, um dadurch die Verbindung mit der Eigenschaft von Interesse zu identifizieren.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, worin spektrale Fluoreszenzdaten gesammelt werden durch: (a) Bilden einer statischen ebenen Anordnung oder einer dynamischen ebenen Anordnung von Kügelchen; und (b) Erhalten einer Fluoreszenzabbildung für jedes Kügelchen.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die ebene Anordnung von Kügelchen angrenzend an die ebenen Wände einer Sandwich-Fließzelle gebildet und durch Licht-kontrollierte elektrokinetische Mittel kontrolliert wird.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, worin spektrale Fluoreszenzdaten für die Kügelchenanordnung durch anfängliches Bilden einer räumlich codierten Anordnung von Kügelchen an der Grenzfläche zwischen einer Elektrode und einer Elektrolytlösung gesammelt werden, umfassend die folgenden Schritte: (i) Vorsehen einer Elektrode und einer Elektrolytlösung; (ii) Vorsehen multipler Arten von Kügelchen, wobei jede Art in Übereinstimmung mit chemisch oder physikalisch unterscheidbaren Kügelchenkennzeichen in einem von einer Vielzahl an Reservoirs gelagert wird, wobei jedes Reservoir eine Vielzahl von ähnlich-artigen Kügelchen enthält, suspendiert in besagter Elektrolytlösung; (iii) Vorsehen besagter Reservoirs in Form einer mxn-Gitteranordnung; (iv) Mustern besagter Elektrode, um mxn-Kammern entsprechend dem besagten mxn-Gitter von Reservoirs zu definieren; (v) Ablegen von mxn-Tröpfchen von besagten mxn-Reservoirs auf besagte entsprechende mxn-Kammern, wobei jedes besagte Tröpfchen aus einem der besagten Reservoirs stammt und auf eine der besagten mxn-Kammern beschränkt bleibt und jedes besagte Tröpfchen mindestens ein Kügelchen enthält; (vi) Positionieren einer oberen Elektrode über besagten Tröpfchen, um so gleichzeitig jedes besagte Tröpfchen zu kontaktieren; (vii) Erzeugen eines elektrischen Felds zwischen besagter oberen Elektrode und besagten mxn-Tröpfchen; (viii) Verwenden des besagten elektrischen Felds, um eine Kügelchenanordnung in jeder der besagten mxn-Kammern zu bilden, wobei jede besagte Kügelchenanordnung räumlich auf eins von besagten mxn-Tröpfchen beschränkt bleibt; (ix) Beleuchten der besagten mxn-Kammern auf besagter gemusterter Elektrode mit einem vorbestimmten Lichtmuster, um die Position von besagten Kügelchenanordnungen in Übereinstimmung mit besagtem vorbestimmten Lichtmuster und dem Muster von mxn-Kammern beizubehalten; und (x) Positionieren von besagter oberer Elektrode näher an besagte Elektrode, dadurch Verschmelzen besagter mxn-Tröpfchen in eine kontinuierliche flüssige Phase, während jede von besagten mxn-Kügelchenanordnungen in einer der entsprechenden mxn-Kammern beibehalten wird.
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Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
DE69737883T2 (de) 1996-04-25 2008-03-06 Bioarray Solutions Ltd. Licht-regulierte, elektrokinetische zusammensetzung von partikeln an oberflächen
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US6406845B1 (en) 1997-05-05 2002-06-18 Trustees Of Tuft College Fiber optic biosensor for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sample
AU736321B2 (en) 1997-05-23 2001-07-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
AU756945B2 (en) 1997-05-23 2003-01-30 Bioarray Solutions Ltd Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
US6096496A (en) * 1997-06-19 2000-08-01 Frankel; Robert D. Supports incorporating vertical cavity emitting lasers and tracking apparatus for use in combinatorial synthesis
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
US7348181B2 (en) 1997-10-06 2008-03-25 Trustees Of Tufts College Self-encoding sensor with microspheres
US6210910B1 (en) 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
GB9808783D0 (en) * 1998-04-25 1998-06-24 Central Research Lab Ltd Labelling of small articles
EP2045334A1 (de) 1998-06-24 2009-04-08 Illumina, Inc. Dekodierung von Arraysensoren mit Mikrosphären
DE19940749A1 (de) 1998-08-28 2000-05-18 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analyse von Polymeren
AUPP737298A0 (en) * 1998-11-30 1998-12-24 University Of Queensland, The Combinatorial libraries
US7612020B2 (en) 1998-12-28 2009-11-03 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres with a hybridization chamber
US6429027B1 (en) 1998-12-28 2002-08-06 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres
US8406498B2 (en) 1999-01-25 2013-03-26 Amnis Corporation Blood and cell analysis using an imaging flow cytometer
US8131053B2 (en) 1999-01-25 2012-03-06 Amnis Corporation Detection of circulating tumor cells using imaging flow cytometry
US7450229B2 (en) 1999-01-25 2008-11-11 Amnis Corporation Methods for analyzing inter-cellular phenomena
US8885913B2 (en) 1999-01-25 2014-11-11 Amnis Corporation Detection of circulating tumor cells using imaging flow cytometry
US6846460B1 (en) 1999-01-29 2005-01-25 Illumina, Inc. Apparatus and method for separation of liquid phases of different density and for fluorous phase organic syntheses
EP1071958A1 (de) * 1999-02-17 2001-01-31 Arcaris, Inc. Screening-verfahren für substrat-ligand wechselwirkungen
AU4202400A (en) * 1999-04-09 2000-11-14 Glaxo Group Limited Encoding scheme for solid phase chemical libraries
US7253435B2 (en) 1999-04-15 2007-08-07 Millipore Corporation Particles with light-polarizing codes
AU4245900A (en) * 1999-04-15 2000-11-02 Virtual Arrays, Inc. Combinatorial chemical library supports having indicia at coding positions and methods of use
US6908737B2 (en) 1999-04-15 2005-06-21 Vitra Bioscience, Inc. Systems and methods of conducting multiplexed experiments
RU2242746C2 (ru) 1999-04-16 2004-12-20 Тиботек Н.В. Кодированный микроноситель и способ кодирования микроносителей
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
AU4710800A (en) * 1999-05-12 2000-11-21 Axys Pharmaceuticals, Inc. Methods of software driven flow sorting for reiterative synthesis cycles
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
WO2000075373A2 (en) 1999-05-20 2000-12-14 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8080380B2 (en) 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
DE19925402C2 (de) * 1999-06-02 2001-12-20 Molecular Machines & Ind Gmbh Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen
WO2001012862A2 (en) 1999-08-18 2001-02-22 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
WO2001018524A2 (en) * 1999-08-30 2001-03-15 Illumina, Inc. Methods for improving signal detection from an array
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
WO2001057269A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7361488B2 (en) 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
DE60127939T2 (de) 2000-02-07 2008-01-24 Illumina, Inc., San Diego Nukleinsäure-Nachweisverfahren mit universellem Priming
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
AU3838901A (en) 2000-02-16 2001-08-27 Illumina Inc Parallel genotyping of multiple patient samples
US7682837B2 (en) 2000-05-05 2010-03-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Devices and methods to form a randomly ordered array of magnetic beads and uses thereof
AU7299301A (en) 2000-06-21 2002-01-02 Bioarray Solutions Ltd Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US9709559B2 (en) * 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
AU2001278141B2 (en) * 2000-08-24 2005-04-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Dry powder formulation for protein labeling
US6934408B2 (en) * 2000-08-25 2005-08-23 Amnis Corporation Method and apparatus for reading reporter labeled beads
US20050090021A1 (en) * 2000-10-06 2005-04-28 Walt David R. Self-encoding sensor with microspheres
AU2002211899A1 (en) * 2000-10-12 2002-04-22 Amnis Corporation Methods for synthesizing reporter labeled beads
JP3996056B2 (ja) * 2000-10-12 2007-10-24 アムニス コーポレイション レポーターラベルビードを読み取るための方法および装置
DE50107386D1 (de) * 2000-10-17 2005-10-13 Febit Ag Verfahren und vorrichtung zur integrierten synthese und analytbestimmung an einem träger
DE10051396A1 (de) 2000-10-17 2002-04-18 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analytbestimmung an einem Träger
EP1395601A4 (de) * 2000-10-18 2006-04-12 Vitra Bioscience Inc Multiplexiertes zellanalysesystem
JP2004537712A (ja) 2000-10-18 2004-12-16 バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド 多重細胞分析システム
CA2425775C (en) 2000-10-19 2012-02-28 Tibotec Bvba Method and device for the manipulation of microcarriers for an identification purpose
JP4755755B2 (ja) * 2000-12-15 2011-08-24 独立行政法人産業技術総合研究所 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
WO2003034029A2 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
US7241629B2 (en) 2001-12-20 2007-07-10 Corning Incorporated Detectable labels, methods of manufacture and use
US7335153B2 (en) 2001-12-28 2008-02-26 Bio Array Solutions Ltd. Arrays of microparticles and methods of preparation thereof
WO2003060460A2 (en) * 2002-01-03 2003-07-24 Furka Arpad Multi-target screening
WO2003069333A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Illumina, Inc. Automated information processing in randomly ordered arrays
US6730515B2 (en) * 2002-06-11 2004-05-04 Eastman Kodak Company Micro-array calibration means
US7041453B2 (en) 2002-08-22 2006-05-09 Bioarray Solutions Ltd. Molecular constructs and methods of use for detection of biochemical reactions
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US6821744B2 (en) 2002-10-29 2004-11-23 Roche Diagnostics Operations, Inc. Method, assay, and kit for quantifying HIV protease inhibitors
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
US7255895B2 (en) * 2003-01-21 2007-08-14 Bioarray Solutions, Ltd. Method for controlling solute loading of polymer microparticles
WO2004065000A1 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Illumina Inc. Chemical reaction monitor
US7488451B2 (en) 2003-09-15 2009-02-10 Millipore Corporation Systems for particle manipulation
JP4564959B2 (ja) 2003-09-22 2010-10-20 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 生体分子に共有結合できる、複数の官能基を持つ表面固定化高分子電解質
CA2899287A1 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
WO2005071412A2 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Applera Corporation Phosphor particle coded beads
ATE538138T1 (de) 2004-03-16 2012-01-15 Amnis Corp Auf bildlicher darstellung beruhende quantifizierung molekularer translokation
US8953866B2 (en) 2004-03-16 2015-02-10 Amnis Corporation Method for imaging and differential analysis of cells
GB0407212D0 (en) * 2004-03-31 2004-05-05 Queen S Universty Of Belfast T "Label"
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
US20060063159A1 (en) * 2004-09-22 2006-03-23 Applera Corporation Post-synthesis processing system for supported oligonucleotides, and method
US7560417B2 (en) 2005-01-13 2009-07-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and apparatus for parallel synthesis of chain molecules such as DNA
US7805081B2 (en) * 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
US8372839B2 (en) * 2005-11-04 2013-02-12 Rutgers, The State University Of New Jersey Bipartite inhibitors of bacterial RNA polymerase
US7995202B2 (en) * 2006-02-13 2011-08-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources
US7692783B2 (en) * 2006-02-13 2010-04-06 Pacific Biosciences Of California Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources
US7715001B2 (en) * 2006-02-13 2010-05-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources
WO2008016335A1 (en) 2006-08-03 2008-02-07 National University Of Singapore A microarray system and a process for producing microarrays
US7820983B2 (en) * 2006-09-01 2010-10-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
US8207509B2 (en) 2006-09-01 2012-06-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
US20080080059A1 (en) * 2006-09-28 2008-04-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modular optical components and systems incorporating same
EP2099957A1 (de) * 2007-01-10 2009-09-16 GE Healthcare Bio-Sciences AB Multimodale ionenaustausch-chromotographie-harze
US20100167413A1 (en) * 2007-05-10 2010-07-01 Paul Lundquist Methods and systems for analyzing fluorescent materials with reduced autofluorescence
US20080277595A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Highly multiplexed confocal detection systems and methods of using same
DE102008040513B4 (de) * 2008-07-17 2010-08-26 BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung Verwendung einer langwellig emittierenden Cyaninverbindung als NIR-Fluoreszenzstandard und Kit zur Kalibrierung von Photolumineszenzmesssystemen
CA2974241C (en) 2008-09-16 2020-01-07 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates and optical systems and methods of use thereof
GB0913258D0 (en) 2009-07-29 2009-09-02 Dynex Technologies Inc Reagent dispenser
US9523701B2 (en) 2009-07-29 2016-12-20 Dynex Technologies, Inc. Sample plate systems and methods
US8467061B2 (en) 2010-02-19 2013-06-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated analytical system and method
US8994946B2 (en) 2010-02-19 2015-03-31 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated analytical system and method
US8932989B2 (en) 2011-07-25 2015-01-13 Bioinventors & Entrepreneurs Network, Llc Sieving of nucleic acid samples
US9428799B2 (en) 2011-07-25 2016-08-30 Bioinventors & Entrepreneurs Network Llc Method for determining an allele profile of nucleic acid
US9133567B2 (en) 2011-07-25 2015-09-15 Bioinventors & Entrepreneurs Network Llc Method for determining an attribute profile of biological samples
KR101411330B1 (ko) * 2012-04-24 2014-06-25 연세대학교 산학협력단 감성 진단 칩과 그 측정장치
US9372308B1 (en) 2012-06-17 2016-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of integrated analytical devices and methods for production
US9223084B2 (en) 2012-12-18 2015-12-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Illumination of optical analytical devices
WO2014130900A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated illumination of optical analytical devices
JP6815990B2 (ja) 2014-08-27 2021-01-20 パシフィック・バイオサイエンシズ・オブ・カリフォルニア・インク． 統合分析デバイスのアレイ
US10487356B2 (en) 2015-03-16 2019-11-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated devices and systems for free-space optical coupling
CN107683340A (zh) 2015-05-07 2018-02-09 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 多处理器流水线架构
WO2016201387A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated target waveguide devices and systems for optical coupling
WO2020001560A1 (zh) * 2018-06-29 2020-01-02 成都先导药物开发股份有限公司 一种合成dna编码化合物中的反应监测方法

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3982182A (en) * 1973-08-13 1976-09-21 Coulter Electronics, Inc. Conductivity cell for particle study device
JPS5844340A (ja) * 1981-09-10 1983-03-15 Kureha Chem Ind Co Ltd 電気泳動度測定装置
US4717655A (en) * 1982-08-30 1988-01-05 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for distinguishing multiple subpopulations of cells
US4499052A (en) * 1982-08-30 1985-02-12 Becton, Dickinson And Company Apparatus for distinguishing multiple subpopulations of cells
US4994373A (en) * 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US4647544A (en) * 1984-06-25 1987-03-03 Nicoli David F Immunoassay using optical interference detection
US5354825A (en) * 1985-04-08 1994-10-11 Klainer Stanley M Surface-bound fluorescent polymers and related methods of synthesis and use
US4767205A (en) * 1986-01-28 1988-08-30 Flow Cytometry Standards Corporation Composition and method for hidden identification
US5143853A (en) * 1986-06-25 1992-09-01 Trustees Of Tufts College Absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US5254477A (en) * 1986-06-25 1993-10-19 Trustees Of Tufts College Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods
US5114864A (en) * 1986-06-25 1992-05-19 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using fluid erodible controlled release polymers for delivery of reagent formulations
US5252494A (en) * 1986-06-25 1993-10-12 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using controlled release polymers and reagent formulations held within a polymeric reaction matrix
US4822746A (en) * 1986-06-25 1989-04-18 Trustees Of Tufts College Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
ES2025556T3 (es) 1986-12-01 1992-04-01 Molecular Biosystems, Inc. Metodo del ensayo de hibridacion para detectar una secuencia diana polinucleotidica especifica.
US5132097A (en) * 1987-02-11 1992-07-21 G.D. Research Apparatus for analysis of specific binding complexes
SE458968B (sv) * 1987-06-16 1989-05-22 Wallac Oy Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser
US5132242A (en) * 1987-07-15 1992-07-21 Cheung Sau W Fluorescent microspheres and methods of using them
US5194300A (en) * 1987-07-15 1993-03-16 Cheung Sau W Methods of making fluorescent microspheres
US5807755A (en) * 1987-08-06 1998-09-15 Multilyte Limited Determination of ambient concentrations of several analytes
US5002867A (en) * 1988-04-25 1991-03-26 Macevicz Stephen C Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes
NO164622C (no) 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
US5779976A (en) * 1988-11-03 1998-07-14 Igen International, Inc. Apparatus for improved luminescence assays
FR2638848B1 (fr) * 1988-11-04 1993-01-22 Chemunex Sa Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
GB8920571D0 (en) * 1989-09-12 1989-10-25 Carr Robert J G Examination of objects of macromolecular size
US5326692B1 (en) * 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
US5723218A (en) * 1990-04-16 1998-03-03 Molecular Probes, Inc. Dipyrrometheneboron difluoride labeled flourescent microparticles
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
DE69125441T2 (de) 1990-09-28 1997-11-06 Toshiba Kawasaki Kk Verfahren zum Gennachweis
US5105305A (en) * 1991-01-10 1992-04-14 At&T Bell Laboratories Near-field scanning optical microscope using a fluorescent probe
US5250264A (en) * 1991-01-25 1993-10-05 Trustees Of Tufts College Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample
US5244636A (en) * 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5244813A (en) * 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor, apparatus, and methods for detecting an organic analyte in a fluid or vapor sample
US5320814A (en) * 1991-01-25 1994-06-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently visualizing and chemically detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
JPH06509417A (ja) * 1991-07-16 1994-10-20 トランスメッド　バイオテック　インコーポレイテッド 多重検体の同時分析の方法と構成
ATE148889T1 (de) * 1991-09-18 1997-02-15 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6048690A (en) * 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US5652059A (en) * 1991-11-20 1997-07-29 Bar Ilan University Method for attaching microspheres to a substrate
HU9201687D0 (en) 1992-05-21 1992-08-28 Arpad Furka Preparation of sets from peptid mixtures with polycomponents and their use for the identification of biologically active peptides
DE69333726T8 (de) 1992-08-28 2006-04-27 Novo Nordisk A/S Glucagonrezeptoren
US5674698A (en) * 1992-09-14 1997-10-07 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
ES2216034T3 (es) 1992-09-14 2004-10-16 Sri International Indicadores de conversion creciente destinados a ensayos biologicos y otros utilizando tecnicas de excitacion por laser.
US5565324A (en) * 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5298741A (en) * 1993-01-13 1994-03-29 Trustees Of Tufts College Thin film fiber optic sensor array and apparatus for concurrent viewing and chemical sensing of a sample
PT705279E (pt) * 1993-05-27 2003-07-31 Selectide Corp Bibliotecas em fase solida codificadas, segregadas topologicamente
US6087186A (en) * 1993-07-16 2000-07-11 Irori Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries
US5965452A (en) * 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
GB9326450D0 (en) * 1993-12-24 1994-02-23 Multilyte Ltd Binding assay
US5496997A (en) * 1994-01-03 1996-03-05 Pope; Edward J. A. Sensor incorporating an optical fiber and a solid porous inorganic microsphere
JPH07240660A (ja) * 1994-02-25 1995-09-12 Murata Mfg Co Ltd ラダー型フィルタ
US5512490A (en) * 1994-08-11 1996-04-30 Trustees Of Tufts College Optical sensor, optical sensing apparatus, and methods for detecting an analyte of interest using spectral recognition patterns
US5585069A (en) * 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
BR9607193B1 (pt) * 1995-03-10 2009-01-13 teste de eletroquimioluscÊncia multi-especÍfico de méltiplos conjuntos.
US5961923A (en) * 1995-04-25 1999-10-05 Irori Matrices with memories and uses thereof
US5690894A (en) * 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5545531A (en) * 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5728529A (en) * 1995-06-23 1998-03-17 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis
US6200737B1 (en) * 1995-08-24 2001-03-13 Trustees Of Tufts College Photodeposition method for fabricating a three-dimensional, patterned polymer microstructure
US5633724A (en) * 1995-08-29 1997-05-27 Hewlett-Packard Company Evanescent scanning of biochemical array
US5981180A (en) * 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
DE69638321D1 (de) 1995-10-11 2011-03-03 Luminex Corp Gleichzeitige mehrfachanalyse klinischer proben
US5633972A (en) * 1995-11-29 1997-05-27 Trustees Of Tufts College Superresolution imaging fiber for subwavelength light energy generation and near-field optical microscopy
US5814524A (en) * 1995-12-14 1998-09-29 Trustees Of Tufts College Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations
US6074609A (en) 1996-04-24 2000-06-13 Glaxo Wellcome Inc. Systems for arraying beads
DE69737883T2 (de) * 1996-04-25 2008-03-06 Bioarray Solutions Ltd. Licht-regulierte, elektrokinetische zusammensetzung von partikeln an oberflächen
US5989835A (en) * 1997-02-27 1999-11-23 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
KR100583053B1 (ko) 1996-08-01 2006-09-22 록타이트(아일랜드) 리미티드 입자의단층형성방법및이것으로형성된제품
US6083763A (en) * 1996-12-31 2000-07-04 Genometrix Inc. Multiplexed molecular analysis apparatus and method
US5939021A (en) * 1997-01-23 1999-08-17 Hansen; W. Peter Homogeneous binding assay
US5698736A (en) * 1997-01-31 1997-12-16 Akzo Nobel Nv High temperature, catalytic Friedel-Crafts synthesis of benzene phosphorus dichloride
US6023540A (en) * 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
AU756945B2 (en) 1997-05-23 2003-01-30 Bioarray Solutions Ltd Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
AU736321B2 (en) 1997-05-23 2001-07-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US6130101A (en) * 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
JP4357112B2 (ja) 1997-10-14 2009-11-04 ルミネックス コーポレイション 精密蛍光染色された粒子及びその製造及び使用方法
US6139831A (en) * 1998-05-28 2000-10-31 The Rockfeller University Apparatus and method for immobilizing molecules onto a substrate

Also Published As

Publication number Publication date
AU756945B2 (en) 2003-01-30
US20020090613A1 (en) 2002-07-11
AU7599698A (en) 1998-12-11
CA2291853A1 (en) 1998-11-26
US20060188943A1 (en) 2006-08-24
US20180209067A1 (en) 2018-07-26
JP4302780B2 (ja) 2009-07-29
US9945051B2 (en) 2018-04-17
US20050059063A1 (en) 2005-03-17
EP1003904B1 (de) 2007-07-11
US7083914B2 (en) 2006-08-01
EP1003904A4 (de) 2004-11-03
CA2291853C (en) 2013-01-15
WO1998053093A1 (en) 1998-11-26
JP2002506517A (ja) 2002-02-26
DE69838067D1 (de) 2007-08-23
US20080318211A9 (en) 2008-12-25
EP1003904A1 (de) 2000-05-31
US20150233934A1 (en) 2015-08-20

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