DE3320560A1 - Metallchelat-konjugierte monoklonale antikoerper - Google Patents

Description

1 Otto A, GANSOW 7. Juni 1983

3003 Vail Ness, N.W. W 524
Washington, D.C.20008
USA

Mette Sl¹RAND

807 Harper House

Baltimore, Maryland 21210

USA S 4678 D/la

Beschreibung

Metallchelat-konjugierte monoklonale Antikörper

Die Erfindung betrifft allgemein mit Metallehelat konjugierte monoklonale Antikörper. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von mit monoklonalen Antikörpern konjugierten radioaktiven Metallehelaten zur Behandlung von zellulären Störungen,' insbesondere von Krebs.

Zur Bereitstellung therapeutischer Verfahren zur Behandlung von zellulären Störungen,"wie Krebs, wurden umfangreiche Forschungsarbeiten unternommen. Die herkömmliche Therapie umfasst chirurgische Eingriffe, Bestrahlung und Chemotherapie. Alle diese Verfahren haben den entscheidenden Nachteil, dass sie zwischen gesunden und an Krebs erkrankten Zellen nicht mit ausreichender Selektivität unterscheiden. Zur Gewährleistung der Wirksamkeit dieser Methoden müssen dabei grosse Anteile an gesundem Gewebe abgetötet oder entfernt werden« Ferner beeinträchtigt eine chemotherapeutische Behandlung das Immunsystem, so dass es häufig zu Todesfällen oder ernsthaften Erkrankungen aufgrund von Infektionen durch Pilze, Bakterien oder Viren kommt.

Die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern hat die Möglichkeit eröffnet, selektiv therapeutische oder diagnostische Mittel zu spezifischen Zielzellen zu bringen. Monoklonale Antikörper sind Immunoglobuline von gut definierter

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chemischer Struktur. Eine charakteristische Eigenschaft von monoklonalen Antikörpern ist ihre Reproduzierbarkeit der Funktion und ihre hohe Spezifität.

Für diagnostische und therapeutische Zwecke wurde radioaktives Jod, das direkt an monoklonale Antikörper gebunden ist, verwendet. Jod-131 führte bei grossen Tumoren zu gewissen therapeutischen Erfolgen, jedoch haben sich mit radioaktivem Jod markierte Antikörper als unwirksam bei der Behandlung von kleinen Tumorherden oder Metastasen erwiesen. Ferner werden spezifisch gebundene Antikörper, relativ rasch durch die Zielzellen abgebaut. Dieser Abbau führt daher zum Einbau des metabolisierten Jods in exkretorische Organe, wie Niere, Gallenblase und Leber. Versuche, Toxine durch monoklonale Antikörper zu Tumorzellen zu bringen, führten nicht zur Entwicklung von erfolgreichen therapeutischen Verfahren.

In der Literatur finden sich Hinweise darauf, dass Diäthylentriaminpentaessigsäure (DTPA) bei Bindung an Protein stabile Metallkomplexe bilden kann; vgl. Krejcarek et al., Biochem. & Biophys. Res. Commun., Bd. 77 (1977), S. 581. Khaw et al., Science, Bd. 209 (1980), S. 295 berichten über die in vivo-Abbildung von Zielzellen mit gemäss dem Verfahren von Krejcarek hergestellten polyklonalen Antikörpern, die mit radioaktivem Metall-DTPA konjugiert sind. Trotz Trennung von freiem und cheliertem Metall von den Metallchelat-konjugierten polyklonalen Antikörpern durch Gelchromatographie und Dialyse zeigen die in dieser Arbeit enthaltenen ^-Abbildungen, dass ein hoher Anteil des radioaktiven Metalls

^O in der Leber lokalisiert ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes therapeutisches Mittel zur Behandlung von Zellstörungen unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern bereitzustellen. Dabei sollen erkrankte Zellen selektiv eine letale Bestrahlungsdosis erhalten, während gesunde Zellen wenig oder gar nicht zerstört werden sollen. Insbesondere soll mit diesen Mitteln eine Behandlung von kleinen Tumorherden und Metastasen er-

möglicht werden. Sehliesslich sollen die erfindungsgemässen Mittel so beschaffen sein, dass die radioaktiven Metalle in vivo selektiv an die gewünschte Zielstelle gebracht werden, wobei ein erheblicher Einbau von radioaktivem Metall in gesunde Körperorgane vermieden werden soll.

Erfindufrgsgemäss werden zur Behandlung von zellulären Störungen raonoklonale Antikörper, die mit einem Chelat eines radioaktiven Metalls konjugiert sind, verwendet, wobei es sich bed dem radioaktiven Metall um ein oi-Teilchen emittierendes Metallnuklid handelt. Eine Ausführungsform der erfindungsgemässen Verwendung besteht darin, dass man die Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper in eine Körperflüssigkeit einführt, wobei es sich bei dem konjugierten Chelat um ein Derivat von Diäthylentriaminpentaessigsäüre handelt und wobei dieses Konjugat im wesentlichen frei von zufällig gebundenen Ionen dieses Metalls ist und in ihm im wesentlichen die gesamte Aktivität und Selektivität der Antikörper erhalten ist. Eine derartige Verwendungsart eignet sich sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Zwecke. Erfindungsgemäss wird auch ein Verfahren zur Herstellung von mit Metallchelaten konjugierten monoklonalsn Antikörpern bereitgestellt, wobei es sich bei dem Metall um ein ^-emittierendes radioaktives Metall handelt.

Dabei wird das mit dem Antikörper konjugierte Metallchelat über eine Chromatographiesäule gegeben, die eine oder mehrere Schichten aus der Gruppe ionenretardierende Harze, Anionenaustauscherharze, Kationenaustauscherharze und chelatbildende Ionenaustauscherharze und eine Schlussschicht, die eine grössen-

^ου fraktionierende Matrix aufweist, enthält.

Erfindungsgemäss werden mit Metallchelaten konjugierte monoklonale Antikörper für therapeutische Methoden, insbesondere für in vivo-Methoden, verwendet.

Wie bereits angedeutet, werden erfindungsgemäss ferner auch mit Metallchelaten konjugierte Antikörper bereitgestellt, in denen die biologische Aktivität und Spezifität der Anti-

körper erhalten ist und die im wesentlichen frei von auf zufällige Weise gebundenen Metallen sind. Die Bindung von auf zufällige Weise gebundenen Metallen ist nicht stabil. Dies führt dazu, dass diese Metalle frei werden und in das Blut eintreten können. In das Blut freigesetzte Metalle können durch Trans ferrin oder andere metallbindende Proteine (wie Ferritin), die im Blut vorhanden sind, gebunden können. Derartige gebundene Metalle verbleiben über eine beträchtlich lange Zeit hinweg im Kreislaufsystem und werden durch das retikuloendotheliale System (RES) beseitigt. Eine derartige Clearance führt zu einer Konzentration des Metalls in Leber und Milz. Es ist offensichtlich, dass eine willkürliche, lang anhaltende Zirkulation von radioaktiven Metallen im Körper oder eine Konzentration von radioaktiven Metallen in Leber und Milz in hohem Mass unerwünscht sind. Erfindungsgemäss lassen sich diese schwerwiegenden Probleme beseitigen.

Monoklonale Antikörper sind Immunoglobuline von gut definierter chemischer Struktur, im Gegensatz zu polyklonalen Antikörpern, die heterogene Gemische von Immunoglobulinen darstellen. Ein charakteristisches Merkmal von monoklonalen Antikörpern ist ihre Reproduzierbarkeit von Funktion und Spezifität. Derartige Antikörper lassen sich für eine Reihe von Zielantigenen, einschliesslich Tumorzellen, entwickeln. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind Gegenstand ausführlicher Erörterungen; vgl. "Monoclonal Antibodies", Hrsg. R.H. Kennett, T.J. McKearn und K.B. Bechtol und US-PS 4 196 265. Die Auswahl von monoklonalen

Antikörpern für die praktische Anwendung der Erfindung hängt vom Verwendungszweck der mit Metallchelaten konjugierten monoklonalen Antikörper ab. Die entsprechende Auawahl bleibt dem Fachmann überlassen.

Die Antikörper werden im allgemeinen in einer wässrigen Lösung, die eine ionische Verbindung enthält, belassen. Sehr häufig wird physiologische Kochsalzlösung für diesen Zweck eingesetzt. Weitere ionische Lösungen, zum Beispiel

!solche fflit einem Gehalt an Natrium- oder Kaliumphosphat, Natriumcarbonat und dergleichen, sind dem Fachmann geläufig und können ebenfalls verwendet werden.

Es können verschiedenste organische chelatbildende Mittel oder Liganden mit monoklonalen Antikörpern konjugiert werden. Organische Liganden zur Konjugation mit monoklonalen Antikörpern können aus einer Reihe von natürlichen oder synthetischen Verbindungen der folgenden Art ausgewählt werden:

Amine, Porphyrine, Aminocarbonsäuren, Iminocarbonsäuren, Äther, thiole, Phenole, Glykole, Alkohole, Polyamine, PoIyamincarbonsäuren, Polyimincarbonsäuren, Aminopolycarbonsäuren, Iminopoiycarbonsäuren, Nitrilocarbonsäuren, Dinitrilocarbonsäuren, Polynitrilocarbonsäuren, Athylendiamintetraacetate,

!5 Diäthylentriaminpenta- oder -tetraacetate, Polyäther, PoIythiole, Cryptanden, Polyätherphenolate, Polyätherthiole, Äther von Thioglykolen oder Alkoholen, Polyaminphenole, sowie sämtliche weitere acylischen, macrocyclischen, cyclischen, macrobicyclischen oder polycyclischen oder ähnliche Liganden, die hochstabile Metallchelate oder -cryptate bilden. Offensichtlich hängt die Wahl des Liganden von dem zu chelierenden Metall ab und bleibt dem Fachmann überlassen.

Der bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung verwendete Ligand besitzt eine nichtmetallgebundene organische funktionelle Gruppe, die zur Bindung an den monoklonalen Antikörper geeignet ist. Als funktionelle Gruppen kommen Carbonsäuregruppen, diazotierbare Amingruppen, Suceinimidester, Anhydride, gemischte Anhydride, Benzimidate, Nitrene, Isothiocyanate,

Azide, Sulfonamide, Bromacetamide, Jodacetamide, Carbodiimide, Sulfonylchloride, Hydrazide, Thioglykole oder beliebige reaktive funktionelle Gruppen, die in der Fachwelt als biomolekulare konjugierende oder kuppelnde Mittel bekannt sind, in Frage»

Erfindungsgemäss wird vorzugsweise ein Derivat von Diäthylentriaminpentaessigsäure (DTPA) verwendet. Es wurde festgestellt, dass DTPA-Liganden Metallionen fest binden und dass das DTPA-

Derivat (nachstehend als Chelat bezeichnet) ein mit monoklonalen Antikörpern konjugiertes Chelat bildet, das sowohl im Hinblick auf die Metall-Chelat-Bindung als auch auf das Chelat-Antikörper-Konjugat hochstabil ist. Diese Eigenschaften sind sehr wichtig, insbesondere bei in vivo-Anwendungszwecken. Setzt beispielsweise das Chelat nach Einbringen in das Blut Metallionen frei, so besteht bei diesen Ionen die Tendenz, eine Bindung mit Transferrin oder dergleichen einzugehen und dadurch allgemein im Kreislaufsystem des Körpers verteilt zu werden. Ausserdem besteht bei diesen Ionen die Tendenz, dass sie letztlich in Organen, wie Leber und Milz, sich anreichern und dort verbleiben. Diese Effekte haben je nach Toxizität des Metalls und dessen Radioaktivität schwerwiegende Konsequenzen. Bildet das Chelat kein hochstabiles Konjugat mit dem Antikörper, so erfolgt eine beträchtliche Verringerung der Menge des an die Zielstelle gebrachten Metalls. Dadurch ergibt sich eine entsprechende Wirkungsminderung.

Bei der Herstellung der erfindungsgemässen mit Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper ist es wichtig, eine Kontamination des Metalls durch Quellen von aussen zu ver-• meiden. Die Laboratoriumsgeräte sollten daher aus Kunststoff oder Glas sein, die von exogenen Metallen gereinigt sind.

Sämtliche Vorratslösungen sind metallfrei zu machen, beispielsweise durch Säulenchromatographie mit einem geeigneten Harz.

Nachstehend wird die Erfindung in bezug auf das DTPA-Chelat

näher beschrieben. Das bevorzugte Chelat wird aus einem Aminsalz von DTPA hergestellt. Der Ausdruck Amin ist allgemein zu verstehen und umfasst primäre, sekundäre und tertiäre Amine, die DTPA vollständig deprotonieren. Die Auswahl eines entsprechenden Amins ist dem Fachmann überlassen. Die Wirksamkeit von Aminen (unter Einschluss von Ammoniak) lässt sich leicht bestimmen. Ein besonders bevorzugtes Amin ist Triäthylamin. Mindestens etwa 5 Äquivalente des Aijjins werden zu einer wässrigen DTPA-Lösung gegeben. Sodann wird bis zur

- η

vollständigen Umsetzung erwärmt. Durch die Umsetzung wird ein Pentakis-(amin)-DTPA-SaIz gemäss folgender Gleichung gebildet, wobei es sich bei dem Am in um Triäthylamin handelt:

5 (CH_QCH_O)_N + DTPA —» /~(CH₀CH₀-),N7_rDTPA

Festes DTPA-Aminsalz lässt sich durch Eindampfen oder Gefriertrocknen der Lösung zur Entfernung von Wasser und überschüssigem Amin gewinnen. Das tatsächliche Chelat ist ein DTPA-Derivat» Eine funktioneile Gruppe wird an DTPA addiert und das DTPA wird über diese Gruppe an die Amingruppen des monoklonalen Antikörpers gebunden. Zur Herstellung des erfindungsgemäss verwendeten Chelats werden Ester von Halogenameisensäure mit dem DTPA-Aminsalz umgesetzt. Unter Halogenameisensäureester ist ein Ester der allgemeinen Formel

XC(O)-Oi-R zu verstehen, wobei X Halogen, vorzugsweise ein Chlorid^ und R eine beliebige geeignete funktioneile Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe mit höchstens etwa 6 Kohlenstoffatomen, bedeutet. Die Auswahl von R und X ist dem Fachmann

überlassen, wobei die Stabilität des Chelats und eine steri-20

sehe Hinderung bei der Umsetzung des Chelats mit dem monoklonalen Antikörper in Betracht zu ziehen sind. Ein bevorzugter Ester ist Isobutylchlorformiat.

Beispielsweise werden etwa äquimolare Mengen an Halogen-25

ameisensäureester und DTPA-Aminsalz in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie reinem, trockenem Acetonitril gelöst, Ein überschuss an Halogenameisensäureester ist zu vermeiden, da er eine Metallchelatbildungsstelle am modifizierten DTPA-

Liganden blockiert. Die Reaktionstemperatur ist im allge-30

meinen nicht kritisch und kann so gewählt werden, dass ein Salz entsteht, das entweder teilweise oder im wesentlichen vollständig ausfällt. Die Umsetzung wird vorzugsweise bei Temperaturen durchgeführt, die ausreichend nieder sind, dass „ im wesentlichen das gesamte, als Nebenprodukt der Reaktion gebildete Halogenaminsalz ausgefällt wird. Handelt es sich beim eingesetzten Amin um Triäthylamin und beim Ester um einen Ester von Chlorameisensäureester, so sollte die Temperatur im Bereich von etwa -20 bis etwa -70⁰C liegen.

Belässt man die Temperatur in diesem Bereich, wird die Gleichgewichtsreaktion auf die rechte Seite verlagert, was eine hohe Ausbeute an gemischtem Carboxycarbonsäureanhydrid von DTPA gemäss folgender Gleichung ergibt:

X-C(O)-O-R + [(CH,CH₉),N] _SDTPA v-

O O

[(CH-CHJ-N] .DTPA-C .C-O-R + [(CH-CH₉LNH] X O

Führt man die vorstehende Reaktion im angegebenen Temperaturbereich durch, so kann eine hohe Konzentration an Chelat, das im wesentlichen frei an Halogenaminsalz als Nebenprodukt ist, gebildet werden. Beispielsweise können etwa 0,25 mMol Pentakis-( triethylamin )-DTPA-salz in 0,5 ml Acetonitril gelöst werden und mit 35 ^l Isobutylchlorformiat umgesetzt werden. Nach etwa 45-minütiger Umsetzung bei -70 C kann die Lösung zur Entfennung des Niederschlags zentrifugiert werden, wobei ein flüssiger überstand verbleibt, der das gewünschte Chelat in einer Konzentration von \etwa 0,5 m enthält. Das Chelat wird vorzugsweise in die Chelat-Antikörper-Konjugationsreaktion in einer Konzentration von mindestens 0,25 m im'organischen Lösungsmittel eingeführt. Derartige Chelatkonzentrationen erlauben die Verwendung von relativ geringen Mengen an organischen Lösungsmitteln im Konjugationsreaktionsgemisch, überschüssige Mengen an organischem Lösungsmittel im'Reaktionsgemisch sind zu vermeiden, da das Lösungsmittel nachteilige Wirkungen im Hinblick auf die biologische Aktivität und Spezifität des Antikörpers hervorrufen kann.

Der mit dem Chelat konjugierte monoklonale Antikörper wird gebildet, indem man das Chelat im organischen Lösungsmittel zu einer wässrigen Kochsalzlösung des Antikörpers gibt. Es ist wichtig, die Reaktion von modifiziertem DTPA und Antikörper bei einem pH-Wert von nicht mehr als etwa 7,2 durchzuführen. Die Chelät-Antikörper-Reaktion konkurriert mit der

Zersetzung des Chelats, die durch dessen Umsetzung mit Wasser hervorgerufen wird. Ist der pH-Wert jedoch zu nieder, unterliegt das Chelat einer säurekatalysierten Zersetzung, wodurch die biologische.Aktivität und die Spezifität des Antikörpers verringert werden. Der pH-Wert liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 6,0 bis etwa. 7,2 und insbesondere möglichst nahe bei 7,0* In diesem Bereich ist die Reaktion des DTPA-Chelats mit Wasser weniger schädlich für die Chelat-Antikörper-Reaktion.
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Die vorstehende Erörterung wurde auf DTPA konzentriert. Es liegt jedoch im Bereich des Fachwissens, andere Konjugate unter Verwendung anderer Liganden zu bilden; vgl. zum Beispiel Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 73 (1976), S. 3803. 15

Um die maximale biologische. Aktivität des Antikörpers zu erhalten, ist die Verwendung von starken Säuren oder Basen zur Einstellung des pH-Werts bei der Herstellung von Chelat-^Antikörper-Produkten zu vermeiden. Die Verwendung von starken Säuren oder Basen kann eine lokalisierte Denaturierung in der Lösung hervorrufen. Der pH-Wert kann in der wässrigen Lösung des monoklonaleri Antikörpers durch Zusatz eines geeigneten Puffers kontrolliert werden. Beispielsweise kann NaHCO- in einer Konzentration von etwa 0,1 η

*5 verwendet werden. Andere Puffer, wie MES (2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure) sind bekannt und können ebenfalls verwendet werden. Die Wahl eines entsprechenden Puffers bleibt dem Fachmann überlassen.

Wird die Chelatlösung zur wässrigen Antikörperlösung gegeben, sollen beide Lösungen eine Temperatur von etwa 0⁰C aufweisen. Die Temperatur der Lösung soll im Reaktionsverlauf im allgemeinen etwa 4°C nicht übersteigen. Bei Anwendung von Temperaturen im Bereich von etwa 0 bis etwa 4°C besteht die Möglichkeit, die Zersetzung des Antikörpers zu vermeiden und auch die Zersetzung des Chelats zu verringern. Die Umsetzungsdauer ist nicht kritisch, so lange die Reaktion bis zum Ende durchgeführt wird. Die Lösung kann über Nacht

in der Kälte belassen werden.

Das Mölverhältnis von Chelat zu Antikörper kann je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck für das Konjugat stark vari-5ieren. Der Wert für dieses Molverhältnis kann etwa 0,1 bis etwa 10 oder mehr betragen und liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,25 bis etwa 5. In vielen Fällen beträgt das Molverhältnis von Chelat zu Antikörper etwa 0,5 bis etwa 3·

Im allgemeinen wird bei der Umsetzung ein Chelatüberschuss verwendet, da das Chelat in der wässrigen Lösung sich bis zu einem gewissen Grad zersetzt. Die Anzahl der pro Antikörpermolekül gebundenen Chelate ist eine Funktion der Konzentration an Chelat und Antikörper im Reaktionsgemisch, wobei bei

!5 hohen Konzentrationen die Tendenz zur Bildung von mehr Chelaten pro Antikörper besteht. Ist die Menge an eingesetztem Antikörper relativ gering und wird eine relativ verdünnte Lösung verwendet, so kann ein wesentlicher Chelatüberschuss erforderlich sein. Beispielsweise kann ein molarer überschuss an Chelat von etwa 600:1 zur Umsetzung mit einer Antikörperlösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 5 bis 10 mg/ml erforderlich sein, um für etwa 1,5 gebundene Chelate pro Antikörpermolekül zu sorgen. Molare Überschüsse von nur 100:1 können jedoch ebenfalls eingesetzt werden und bewirken noch

^^eine durchschnittliche Bildung von etwa 0,5 gebundenen Chelaten pro Antikörpermolekül. Ein Zusatz von zu vielen Chelatmolekülen pro Antikörpermolekül kann die biologische Aktivität und Spezifität des Antikörpers verringern.

Ist der Zusatz des Chelats zum Antikörper beendet, so können wesentliche Mengen an zersetztem Chelat in der Lösung vorhanden sein. Dies kann bei beliebigen Chelat-Antikörper-Konjugaten der Fall sein. Das zersetzte Chelat sollte unter Erhaltung der biologischen Aktivität und Spezifität des Antikörpers entfernt werden. Hierfür kommen beispielsweise Dialyse oder Chromatographie in Frage. Gegebenenfalls kann

eine erste Dialyse gegen eine verdünnte Ascorbinsäure- und EDTA-Lösung zur Entfernung von restlichem Eisen, das

- 1 im Cheiat oder Protein vorhanden sein kann, durchgeführt werden6 Ein gereinigtes Produkt an mit Chelat konjugiertem Antikörper kann durch *i8~stündige Dialyse des Reaktionsgemische© gegen 3 mal 1 Liter einer wässrigen Lösung von etwa " 5^ C'snitf einem pH-Wert von etwa 6 mit einem Gehalt an 50 millimö'iar Citrat und 200 raillimolar Natriumchlorid und 1 ml Chelex 10Q~Harz (Bio-Rad) im Dialysegefäss gebildet werden» Eine letzte Dialyse in 1 Liter Lösung mit einem Gehalt an 10 miliimolar MES und 200 millimolar Natriumchlorid bei 4⁰C ;10un<S eitsein pH^Wert von 6 beendet die Reinigung des Proteins =

der Dialysevorgänge sind bekannt und liegen im des Wissens eines Fachmanns „

Meiasllchelatbildung wird in xtfässriger Lösung durchgeführt,

15wobei, wie bereits erwähnt» vorzugsweise die Verwendung von starken Säuren oder Basen.vermieden wird. Die Metallchelatbildimg für beliebige Chelat-Antikörper-Konjugate wird bei einem pH="Wert. durchgeführt, der die biologische Aktivität oder Spe~ - zifltät des Antikörpers nicht merklich verringert. Im allge-

'^Oflieiiaen feeträgt ein annehmbarer pH-Bereich etwa 3_S2 bis etwa 9₅ t-job.fei jedoch spezielle Antikörper einen engeren pH-Bereich

'■ erford^rlicii machen können,, Bei pH-Werten unter etwa 3_y5 wird bei vielen Metallen eine zufällige Bindung von Metallionen atf-Antikörper wesentlich behindert, so dass ein bevorzugter

25pH-Bereich häufig etwa 3,2 bis etwa 3,5 beträgt. Jedoch können spezielle Faktoren der Lösungen der zu verwendenden Metalle pH-Werte über 3_S5 ermöglichen. Die Wahl des entsprechenden Ph-Werts bleibt dem Fachmann überlassen.

SOErfindungsgemäss wird vorzugsweise eine schwach chelatbildende Säure oder Base als Puffer verwendet. Citronensäure oder Glycin sind geeignete Puffer= Selbstverständlich können auch andere bekannte Puffer verwendet werden. Erfindungsgemäss kommt eine Lösung von mit Chelat konjugierten Antikörpern in

35Betracht, die mit einer schwach chelatbildenden Säure oder Base als Puffer und ohne Zugabe von starken Säuren oder Basen auf den gewünschten pH-Wert eingestellt ist. Diese Lösung

wird mit einem Metallsalz versetzt. Ist das Metallsalz in Lösung, ist auch bei dieser Lösung der pH-Wert mit einem chelatbildenden Puffer eingestellt. Der pH-Wert der Metallösung kann jedoch vor deren Zugabe zu der Lösung des mit Chelat konjugierten Antikörpers mit starken Säuren oder Basen eingestellt werden,

Zur Herstellung der mit Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper können beliebige geeignete Metallsalze verwendet werden. Typische Salze sind Halogenide, z.B. Chloride, Nitrate, Perchlorate und dergl. Das Metallsalz wird in so hohen Konzentrationen eingesetzt, wie es praktikabel ist. Aufgrund der Strahlenbelastung für das die Präparate handhabende Personal ist im allgemeinen eine Beschränkung unter 1 Äquivalent Metall pro chelatbindende Stelle geboten.

Die Dauer der Umsetzung ist nicht kritisch, sofern der pH-Wert in der Nähe der äusseren pH-Grenzwerte der für den Antikörper annehmbaren pH-Werte ist. In der Nähe dieser pH-Grenzwerte liegen die Reaktionszeiten im allgemeinen unter etwa 1 Stunde und vorzugsweise bei etwa 30 Minuten oder darunter. Aus Gründen der Zeitersparnis sind im allgemeinen Reaktionszeiten innerhalb dieser Zeitspannen erwünscht. Ferner ist es bevorzugt, die Chelatbildung in Gegenwart eines wasserlöslichen, nicht-chelierbaren, biologisch unschädlichen Reduktionsmittels, wie Ascorbinsäure, durchzuführen, um zu verhindern, dass Eisenspuren der Chelatbildung unterworfen werden. Die Umsetzung wird im allgemeinen durch Zusatz von Trinatriumcitrat in ausreichender Menge, dass der pH-Wert der Lösung so weit erhöht wird, dass das Metallkonjugat nicht mehr labil ist, beendet. Es wurde festgestellt, dass die meisten DTPA-

°0 Komplexe bei einem pH-Wert um etwa 6 besonders stabil sind. Andere schwache Basen - oder Säuren, wenn die Umsetzung über einem pH-Wert von 6 verläuft - können verwendet werden, sofern sie die Antikörper nicht nachteilig beeinflussen. Die entsprechende Auswahl bleibt dem Fachmann überlassen.

Die Reaktionslösung macht im allgemeinen eine Reinigung vor deren in vivo-Verwendung erforderiich. Auch vor der in vitro-Verwendung kann eine Reinigung erforderlich sein. Nicht-

3 3 2 O

gebundenes Metall und zufällig gebundenes Metall sollten entfernt werden. Die vorliegende Erörterung bezieht sich auf zufällig gebundene Metallionen. Ein Teil des Metalls kann jedoch von den Chelaten mit unzureichender Sicherheit festgehalten werden, so dass sie in gleicher Weise wirken, wie auf zufällige Weise gebundene Metallionen.

Wird ein radioaktives Metall mit kurzer Halbwertszeit verwendet, ist es besonders wichtig, dass die Reinigungsstufe

ip so rasch wie möglich verläuft. Erfindungsgemäss kommt eine relativ rasche Reinigung unter Anwendung von Chromatographie in Frage. Diese Ausführungsform der Erfindung ist auf Chela.t-Antikörper-Konjugate allgemein anwendbar. Bei Verwendung von einem öder mehreren Ionenaustauscher-, Verzögerungs- oder chelatbildenden Harzen in Verbindung mit einer eine Grössenfraktionierung bewirkenden Matrix (z.B. einem Gel) können die Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper der Erfindung rasch und gründlich gereinigt werden.

Verschiedene Ionenaustauscherharze können allein oder in Kombination mit einem Ionenverzögerungsharz, einem Kationenaustauscherharz, einem Anionenaustauscherharz oder einem chelatbildenden Ionenaustauscherharz verwendet werden. Die Auswahl von einem oder mehreren entsprechenden Harzen sowie die Auswahl dieser Harze im Hinblick auf Vernetzung, chemische Form und Mesh-Zahl bleiben dem Fachmann überlassen.

Erfindungsgemäss verwendete Kationenaustauscherharze sind häufig stark saure Harze vom Polystyrolgeltyp (z.B. Dowex °^ 50WX8) oder andere stark saure Harze auf Nichtpolystyrolbasis, wie Zeocarb 215 (Permutit Co.). Weitere geeignete saure Harze sind schwach saure Gelpolystyrolharze, makroporöse Gelpolystyrolhärze oder makroretikuläre Carbonsäurekationenaustauscherharze. Anionenaustauscherharze umfassen stark basische Harze vom Polystyrolgeltyp (z.B. Dowex 1X8) oder weitere,weniger basische Harze wie solche vom Pyridiniumpolyraerisattyp und vom phenolischen Polyamintyp. Als chelatbildende Harze kommen Chelex 100 oder beliebige andere Harze,

bei denen es sich um ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit einem Gehalt an gepaarten Iminodiacetationen handelt (z.B. Dowex A-I), in Frage. Geeignete Verzögerungsharze sind Harze mit einem Gehalt an gepaarten Anionen- und Kationenaustauscherstellen (z.B. Bio-Rad AG 11-A8). Diese Harze werden im allgemeinen durch Polymerisation von Acrylsäure innerhalb eines stark basischen Harzes, z.B. eines Harzes mit quaternären Ammoniumgruppen in einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat-Gitter, hergestellt. Die vorstehende Erörterung umfasst nur repräsentative Beispiele für die jeweiligen Harze. Weitere derartige Harze sind bekannt. Eine Zusammenstellung von handelsüblichen Harzen mit kurzer Beschreibung ihrer Eigenschaften und Anwendungszwecke findet sich beispielsweise in der Preisliste H von Bio-Rad Laboratories, 1982. Die Auswahl und Kombination von Harzen hängen vom speziell vorliegenden Trennungsproblem ab und bleiben dem Fachmann überlassen. Diesbezüglich wird beispielsweise auf J. Khym, Analytical Ion-Exchange Procedures in Chemistry and Biology, 197*1, verwiesen.

Matrices zur Grössenfraktionierung sind ebenfalls bekannt. Beispiele hierfür sind Polyacrylamide, Agarosen, Polysaccharide und dergleichen. Besonders geeignete grössenfraktionierende Matrices sind Polysaccharidgele, z.B. Sephadex G-50-²^ Gel. Beispiele für Polyacrylamidgele sind die Gele der Reihe Bio-Gel P (Bio-Rad Laboratories). Die Wahl der grössenfraktionierenden Matrix hängt vom zu reinigenden Protein ab und bleibt dem Fachmann überlassen.

^ow In der erfindungsgemässen Praxis können verschiedene Harze als Schichten innerhalb einer Säule eingesetzt werden. Die zu reinigende Lösung kann entweder von oben nach unten oder von unten nach oben durch die Säule geleitet werden. Eine Fliessrichtung von oben nach unten stellt bei Verwendung von radioaktiven Verbindungen die bevorzugte Laboratoriumstechnik dar, da bei einem durch Gravitation bedingten Durchfluss wenige oder keine zusätzlichen Ausrüstungen oder Instrumente erforderlich sind. Die Wahl der Füllungshöhe,

Fliessgeschwindigkeit und ähnlicher Parameter bleibt dem Fachmann überlassen.

Offensichtlich werden stark geladene Metalle gelegentlich in zufälliger Weise durch den Antikörper an den ionischen Stellen entlang der Proteinoberfläche gebunden. In anderen Fällen werden in zufälliger Weise gebundene Metalle offensichtlich innerhalb der Faltungen des Antikörperproteins eingeschlossen, Diese Metalle können in die Lösung freigesetzt werden, sie können aber auch aus der Lösung in einer Art Gleichgewichtsreaktion wieder absorbiert werden. Die erfindungsgemäss zur Reinigung eingesetzten Verzögerungs- oder Ionenaustauscherharze dienen dazu, das Gleichgewicht zu verschieben und eine Entfernung der Metalle aus dem Antikörper zu ermöglichen, Beispielsweise werden bei der Passage des Antikörpers durch ein Ionenverzögerungsharz zwar die Passage der Metallionen in der Lösung, aber nicht die Passage des Proteins verzögert. In zufälliger Weise gebundene, stark geladene (+ 3 oder darüber) Metallionen werden sodann in die Lösung freigesetzt, um das Gleichgewicht wieder herzustellen. Da derartige Ionen in die Lösung abgegeben werden, sie aber dann durch das Harz verzögert werden, erfolgt eine ständige Freisetzung dieser Metallionen aus dem Antikörper.

Unterhalb dem Ionenverzögerungsharz kann eine Schicht aus Ionenaüstauscherharz verwendet werden, um die abgetrennten, ' stark geladenen Ionen fest zu binden und den Trennvorgang fortzusetzen. Da das Harz eine Verarmung der Proteinlösung an freien, stark geladenen Ionen bewirkt, wird das Gleich-■ gewicht zwischen freien und auf zufällige Weise gebundenen Metallionen wieder hergestellt. Jedoch verbleiben während dieses Vorgangs innerhalb des Chelats befindliche Metallionen beim Antikörper.

Es wurde jedoch festgestellt, dass die blosse Verwendung eines lonenverzögerungs- oder Ionenaustauscherharzes keine zufriedenstellende Entfernung von im wesentlichen sämtlichen auf zufällige Weise gebundenen Metallen bewirkt. Um die

Reinigung zu vervollständigen, wird eine grössenfraktionierende Matrix verwendet. Die Antikörperlösung, die in die Matrix gelangt, ist bereits teilweise in bezug auf freie, stark geladene Metallionen verarmt. In der grössenfraktionierenden Matrix erfolgt eine weitere Verarmung. Während der Bewegung der Lösung durch die Matrix werden die Antikörper nicht verzögert, während eine verzögerte Bewegung der Ionen stattfindet. Die aus der grössenfraktionierenden Matrix erhaltene Lösung ist im wesentlichen frei von auf zufällige Weise gebundenen Metallen. Der Gehalt an diesen lose gebundenen Metallen kann auf Werte von nicht mehr als 6 Prozent des gesamten Metallgehalts des Konjugats verringert werden, so dass mindestens etwa 94 Prozent des vom Konjugat beförderten Metalls stabil durch das Chelat gebunden sind.

Vorzugsweise sind mindestens etwa 97 Prozent der gesamten Metalle durch das Chelat gebunden. Die Erzielung von Metallgehalten, bei denen 98 Prozent oder mehr des Metalls durch das Chelat gebunden sind, ist möglich. Die Bestimmung des Gehalts an stabil gebundenem Metall kann durch Dialyse erfolgen.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung besteht in der Verwendung eines Ionenverzögerungsharzes (Bio-Rad AG 11-A8) oberhalb eines Kationenaustauscherharzes (Bio-Rad AG 50WX8) und eines Gels (Pharmacia Sephadex G-50). Bei der Reinigung von mit Technetiumchelat konjugierten monoklonalen Antikörpern ist die Säule vorzugsweise folgendermassen aufgebaut:'Ein Ionenaustauscherharz (Bio-Rad AG 11-A8) über einem Kationenaustauscherharz (Bio-Rad 50WX8) über einem Anionenaustauscher- ^ harz (Bio-Rad AG 1X8) und einem' grössenfraktionierenden Matrixgel (Pharmacia Sephadex G-50).

Beim erfindungsgemässen Verfahren wird der Antikörper in nicht-aggregierter Form zurückgehalten. Die Aggregation von Antikörpern durch Verklumpung oder Vernetzung führt zu einem Verlust an Antikörperspezifität, was unerwünscht ist. Die Aggregation kann durch übermässig hohe Antikörperkonzentrationen in einem Träger oder durch Kontakt mit Chemikalien,

die eirie Proteinvernetzung bewirken, wie Carbodiimide, hervorgerufen werden. Standardsedimentationstests, grössenfraktiöhierende Matrices oder dergleichen können dazu verwendet Werden, um festzustellen, ob eine Aggregation der Antikörper stattgefunden hat. Bei den hier erläuterten Antikörperäpezifitätstests drückt sich die Aggregation in einem Spezifitätsverlust aus.

Die Aktivität und Spezifität der erfindungsgemässen konjugierten Antikörperprodukte wird in einem Ausmass von mindestnes etwa 80 Prozent und vorzugsweise von mindestens etwa 90 Prozent, bezogen auf die Aktivität und Spezifität des zur Herstellung des Konjugats verwendeten Antikörpers, aufrechterhalten. Besonders bevorzugte Lösungen sind durch eine Antikörperaktivität und -spezifität von mindestens etwa 95 Prozent gekennzeichnet. Es sind Produkte hergestellt worden, bei denen die Aktivität und Spezifität des ursprünglichen Antikörpers praktisch unverändert geblieben ist. Die Aktivität und Spezifität der Antikörper werden routinemässig durch in vitro-Bindung der Antikörper an ein Epitop gemessen. Aktivität und Spezifität des endgültigen Antikörperprodukts können leicht bestimmt werden, indem man einfach den zuerst durchgeführten Test mit dem endgültigen konjugierten Produkt wiederholt.

Mit dem erfindungsgemässen Produkt ist eine therapeutische in viVo-Behandlung möglich, bei dem die mit dem radioaktiven Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper in den Körper eingeführt werden und eine Konzentration im Zielbe-

reich ermöglicht wird. Es gibt eine Reihe von radioaktiven Metallisotopen, die stabile DTPA-Komplexe bilden und cytotoxische <x -Teilchen emittieren. Die therapeutische Wirkung tritt auf, wenn sich die Konjugate in der Nähe oder in Kontakt mit den Zielzellen befinden und mit diesen eine Bindung eingehen. Die Abtötung der Zellen wird als direktes oder indirektes Ergebnis des Bestrahlungsvorgangs durch das radioaktive Metall, das sich in unmittelbarer Nähe zur Zelle befindet, angesehen.

Die Anwendung der erfindungsgemässen Produkte bietet verschiedene Vorteile. Zunächst wird durch die hohe Spezifität des konjugierten monoklonalen Antikörpers die gesamte Strahlungsdosis auf ein Minimum reduziert. Es muss nur so viel Strahlung angewandt werden, als für die Zielzellen erforderlich ist. Ferner werden Chelate mit radioaktiven Metallen im allgemeinen rasch aus dem Körper entfernt, sofern ein Auseinanderbrechen des konjugierten Antikörpers erfolgt. Es können kurzlebige Isotope angewandt werden, wobei die Affinitätskonstante, mit der das Isotop im DTPA-Chelat festgehalten wird, sehr hoch ist, was zu einer stabilen Bindung des Metalls führt. Da schliesslich die Menge des verwendeten radioaktiven Metalls minimal ist, ist die Str?ahlungsgefahr für Personen, die die mit dem radioaktiven Metallchelat konjugierten Antikörper herstellen und verabreichen,beträchtlich verringert.

Aufgrund der Eigenschaften des erfindungsgemäss verwendeten monoklonalen Antikörpers, der mit dem Chelat aus DTPA und radioaktivem Metall konjugiert ist, kann die Gewebeschädigung oder die Gesamtkörperdosis während der Therapie im Vergleich zu herkömmlichen Bestrahlungsbehandlungen, wie Isotopenimplantationen, äussere Bestrahlungsbehandlung und Immunoradiotherapie unter Verwendung von mit Jod-131 markierten polyklonalen oder autologen Antikörpern, beträchtlich verringert werden. Ferner können sowohl die biologischen als auch physikalischen Halbwertszeiten der auf ein Ziel gerichteten radiobiologischen Produkte kontrolliert werden, wodurch Gesamtkörperstrahlungseffekte auf einem Minimum gehalten werden.

^ou Da die Bestrahlung spezifisch auf Zelltypen (z.B. neoplastische Zellen) gerichtet ist, wird eine therapeutische Dosis spezifisch auf maligne Zellen, die entweder loaklisiert oder metastasiert sind, ausgerichtet. Die Fähigkeit des mit dem radioaktiven Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörpers zur Bereitstellung einer wirksamen Bestnahlungsdosis spezifisch für die metastasierten Zellen stellt eine einzigartige und zur Krebstherapie besonders wertvolle Wirkung dar.

Erfindungsgemäss werden die mit dem Metallchelat konjugierten wQfcuki-Dfofiien Aiitä-Uünpisf,', die α in m—β tu it .Lit;* -oiiUes r&aiuahUvco Metall enthalten, zur Behandlung von zellulären Störungen verwendet. Bei den meisten Anwendungszwecken ist es erwünscht, dass das radioaktive Metall eine Halbwertszeit von weniger als etwa 4 Tage aufweist und rasch nach Emittierung der tf-Teilchen in ein stabiles Isotop zerfällt. Erfindungsgemäss bevorzugte Isotope sind Wismuth-211, Wismuth-212, Wismuth-213 und Wismuth-214. Wismuth-212 mit einer Halbwertszeit voh 60,6 Minuten wird besonders bevorzugt.

Per verwendete monoklonale Antikörper wirkt spezifisch auf die abzutötende,, erkrankte Zelle. Der Zelltod wird durch den Zerfall des radioaktiven Metalls verursacht und kann auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Zuerst kann bei Emittierung des o<-Teilchens in die Richtung der erkrankiten Zelle ein einziger Zusammenprall mit dem Zellkern cytotoxisch sein. Das .Isotop, in das das radioaktive Metall nach Emission des <tf-Teilchens zerfällt,.wird aus dem Chelat auf einer Schussbahn, die zu der Bahn des tf-Teilchens entgegengesetzt liegt, emittiert. Die gebundene Zelle kann daher noch getroffen werden, auch wenn das w-Teilchen auf einer von der Zelle entfernten Schussbahn emittiert wird. Ein einzelner Treffer durch das zerfallene Isotop in der Zellmembran kann eine irreparable Zellschädigung hervorrufen, die zum Zelltod führt. Aufgrund der relativ hohen Wirksamkeit· des <<-Te lichens kann weniger stark radioaktives Material verwendet werden. Die Selektivität des monoklonalen Antikörpers und die kurze Reichweite (wenige Zelldurchmesser)

^ov der «-Teilchen hält die Zerstörung von gesundem Gewebe in einem zellulären Bereich auf einem Minimum.

Wismuth-212 zerfällt auf zwei verschiedenen Wegen. Etwa Prozent von Wismuth-212 zerfällt durch ß-Emission zu Polonium-212, das eine Halbwertszeit von 0,3 Mikrosekunden hat. Polonium-212 zerfällt nach Emission eines c*-Teilchens mit einer Reichweite von etwa 90 ^m in stabiles Blei-208. Die restlichen 36 Prozent des Wismuths-212 zerfallen zu Thal-

lium-208 unter Emission eines «-Teilchens rait einer Reichweite von etwa 35 bis 50 um. Thallium-208 mit einer Halbwertszeit von 3 Minuten zerfällt dann unter ß-Emission zu stabilem Blei-208.

Generatoren für Bi-212 sind in der Literatur beschrieben; vgl. Gleu et al., Z. Anorg. Allgem. Chem., Bd. 290 (1957), S. 270 und Zucchini et al., Int. J. Nucl. Med. & Biol. : (Juni 1982) (eine Zusammenfassung des Manuskripts wurde beim ACS-Meeting im August 1981 in New York verteilt). Ein geeigneter Generator besteht aus Th-228 in vierwertigem Zustand, das in einem 3x5 mm-Bett aus Natriumtitanat absorbiert ist, welches sich in einer Quarzsäule oberhalb einer groben Glasfrittenscheibe, die in die Säule eingearbeitet ist, befindet. Das Titanat hält sowohl Th-228 als auch dessen Zerfallprodukt Ra-224 fest. Wird Wasser über das Titanat gegeben, so löst sich das Rn-220-Zerfallsprodukt des Ra-224-Isotops im Wasser, gelangt durch die Frittenscheibe und wird in einem mit Wasser gefüllten, 10 ml fassenden Glasbehälter gesammelt. Die wässrige Rn-220-Lösung fliesst aus dem Behälter in eine Säule von 10 ml Durchmesser, die etwa 1 ml eines stark sauren Ionenaustauscherharzes, wie Bio-Rad AG-50 WX8-Kationenaustauscherharz, enthält. Rn-220 zerfällt im wesentlichen innerhalb von 5 Minuten im Behälter zu Pb-212, das bei Passage durch das Harz absorbiert wird. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1,5 ml/min durch das Harz werden etwa 85 Prozent des gebildeten Pb-212 in der■■ Säule gesammelt, wo es zum Bi-212 Zerfallsprodukt zerfällt.

^ÖU Wenn die gewünschte Menge an Bi-212 am Harz gebildet ist, kann es gemäss üblichen Verfahren mit Säure eluiert werden. Ein brauchbares Elutionsverfahren für Pb-212 und Bi-212 besteht darin, 5 ml 2 η HCl über das Harz zu geben. Ist nur Bi-212 erwünscht, besteht eine andere Möglichkeit darin, 1,5 ml Q,5 m HCl über das Harz zu geben.

Während Metalle, die ß-Teilchen oder Auger-Elektronen emittieren, für die Therapie verwendet werden können, sind

c<-emittierende radioaktive Metalle aus mehreren Gründen bevorzugt. Zunächst weist die <*-Nucleotidstrahlung im Vergleich zur ß- oder Auger-Strahlung charakteristischerweise eine
kurze Reichweite im Gewebe und eine sehr hohe lineare Energieübertragung auf. Durch «-Strahlung kann eine Zelle bei
nur eihem Zusammenstoss mit dem Kern abgetötet werden, wobei im wesentlichen alle Zellen bei 10 oder weniger Stössen abgetötet werden. Ferner wird bei dem Zerfall ein Isotop emittiert (z.B. Tl-208 oder Pb-208 im Fall von Bi-212), das ebenfalls zum Zelltod führen kann. Die Reichweite der tx-Teilchen im
Gewebe liegt im allgemeinen unter etwa 150 ^im. Im Gegensatz dazu erfordern ß- und Auger-Teilchen Hunderte von Kerntreffern, bevor der Zelltod eintritt. Ferner liegen die Reichweiten dieser Teilchen im Gewebe in der Grössenordnung von

einigen 10 mm bis cm. Bei Verwendung von ß-Teilchen sind eine höhere Dosis und der Zerfall von wesentlich mehr radioaktiv markierten Antikörpern erforderlich, um den Zelltod zu erreichen. Somit werden spezifisch gebundene Antikörper dem
Stoffwechselabbau unterworfen, wobei ß-emittierende, radioaktive Metalle in das Blut abgegeben werden. «-Emittierende radioaktive Metalle bewirken dagegen eine relativ rasche
Abtötung, so dass weniger Antikörper durch Stoffwechselvorgänge abgebaut werden.

Die erfindungsgemässen Metallchelat-konjugierten Antikörper können in vivo in einem beliebigen geeigneten pharmakologischen Träger verabreicht werden. Wie bereits erwähnt, kann
normale physiologische Kochsalzlösung verwendet werden.
Häufig umfasst der Träger eine untergeordnete Menge eines

Trägerproteins, wie Humanserumalbumin, um den Antikörper zu stabilisieren. Die Konzentration der mit dem Metallchelat
konjugierten Antikörper in der Lösung wird entsprechend den Bedürfhissen gewählt. Konzentrationen von 0,5 mg/ml sind
leicht erreichbar. Jedoch können die Konzentrationen je nach

"° den spezifischen Anwendungsbedingungen beträchtlich variieren. Geeignete Konzentrationen an biologisch aktiven Materialien in einem Träger lassen sich nach Routineverfahren bestimmen.

Die wirksame Strahlungsdosis oder der Metallgehalt, die für einen Anwendungszweck eingesetzt werden, hängen auch von den speziellen Gegebenheiten der Anwendung ab. Bei der Behandlung von Tumoren hängt die Dosis unter anderem von der Tumorögrösse, dessen Zugänglichkeit und ähnlichen Faktoren ab. In entsprechender Weise hängt die Verwendung von mit Metallchelat konjugierten Antikörpern für diagnostische Zwecke unter anderem von der verwendeten Nachweisvorrichtung, dem Ort der zu untersuchenden Stelle und ähnlichen Faktoren ab.

Für den Fall, dass der Patient zusätzlich zu den an der entsprechenden Stelle lokalisierten Antigenen zirkulierende Antigene aufweist, können die zirkulierenden Antigene vor der Behandlung entfernt werden. Eine derartige Entfernung von Antigenen kann beispielsweise durch Verwendung von unmarkierten Antikörpern oder durch "Plasmapherese, bei dem" das Serum des Patienten zur Entfernung von Antigenen behandelt wird, erreicht werden.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen, die jedoch keinerlei Beschränkung der Erfindung darstellen sollen, näher erläutert.

Beispiel 1

100 mg DTPA werden in einem Kolben ausgewogen und mit 1 ml 25

Wasser versetzt. Die Lösung wird mit 0,125 g redestilliertem Triäthylamin umgesetzt. Die Reaktionslösung wird zur vollständigen Umsetzung erwärmt. Durch Gefriertrocknen wird ein festes Produkt gewonnen.

Der gefriergetrocknete Feststoff wird in 0,5 ml reinem, wasserfreiem Acetonitril gelöst und bei etwa -20⁰C mit 35 .ul Isobutylchlorformiat versetzt und sodann auf eine Temperatur von etwa -70°C gebracht. Nach etwa 45 Minuten wird die Lö-

sung in einem Eppendorf-Reaktionsgefäss zentrifugiert. Die 35

überstehende Flüssigkeit wird gesammelt. Sie enthält das gewünschte gemischte Carboxycarbonsäureanhydrid von DTPA in einer Konzentration von etwa 0,5 m.

Der verwendete monoklonale Antikörper hat die Bezeichnung 103A5, Er wurde durch Fusion von P3X63Ag8-Mäusemyelorazellen mit isolierten Milzzellen von C56B1/6-Mäusen, die mit gereinigtem Retrovirusglykoprotein mit 70 000 Dalton (gp70) (erhalten gemäss M.Strand und J.T. August, J. Biol. Chem., Bd. 251 (1976), S. 559) immunisiert waren, erhalten. Die Fusion erfolgte gemäss M. Strand, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 77 (1980), S. 3234.

114 μΐ einer Lösung mit einem Gehalt an 2 mg monoklonalem Antikörper 103A5 in 0,1 m NaHCO-, mit einem pH-Wert von etwa 7,2 und einem Gehalt an 150 millimolar Natriumchlorid wird hergestellt und in ein Nunc-Gefäss pipettiert. Anschliessend werden 33^1 einer 0,1 m NaHCO^-Lösung vom pH-Wert 7,0 in das Gefäss gegeben. Schliesslich werden 26,4^1 des gemischten^Carboxycarbonsäureanhydrids von DTPA (0,5 m in Acetonitril) zugesetzt, nachdem die Chelat- und Antikörperlösung auf etwa 0°C gekühl·
Nacht durchgeführt.

auf etwa 0°C gekühlt worden ist. Die Reaktion wird über

Das Produkt wird zunächst bei 4 C gegen 1 Liter 30 millimolar Ascorbinsäure, 5 millimolar EDTA, 200 millimolar NaCl und 20 millimolar Natriumeitrat (pH-Wert 7,0) dialysiert. Die erhaltene Lösung wird 48 Stunden bei 4°C 3 mal gegen 1 Liter 50 millimolar Citrat, 200 millimolar Natriumchlorid (pH-Wert 6,0) und 1 ml Chelex 100-Harz (Bio-Rad) dialysiert. Schliesslich wird die erhaltene Lösung 8 Stunden gegen 1 Liter einer Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar MES und 200 millimolar Natriumchlorid (pH-Wert 6,0) dialysiert. Es werden etwa

"^ 1,7 mg an mit Chelat konjugiertem monoklonalem Antikörper gewonnen. Analoge Versuche unter Verwendung von mit C-I4 markiertem DTPA werden durchgeführt und durch Scintillationszählung analysiert. Es ergibt sich ein Gehalt von etwa 1,5 Chelaten pro Antikörpermolekül.

40 ul Indium-111-chloridlösung (New England Nuclear Corp.) werden durch Zusatz von 11,4 ^l 0,4 m Citronensäure vom pH-Wert 5,0 auf den pH-Wert 3,0 eingestellt. Eine getrennte

Lösung mit einem Gehalt an 250 ^ug mit Chelat konjugiertem monoklonalem Antikörper in einem Gesamtvolumen von 21,6^1 wird hergestellt. Die Lösung weist eine Konzentration an 200 millimolar Natriumchlorid und 10 millimolar MES bei einem pH-Wert von 6,0 auf. Die Lösung wird durch Zugabe von 6^1 0,25 m Citronensäure vom pH-Wert 3,0 auf den pH-Wert 4,6 eingestellt.

Mit Metallchelat konjugierter monoklonaler Antikörper wird hergestellt, indem man die Lösungen von Indiumchlorid und mit Chelat konjugiertem Antikörper vereinigt und etwa 30 Minuten bei Umgebungstemperatur reagieren lässt. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 25 ul einer gesättigten Trinatriumcitratlösung unter Einstellung des pH-Werts auf etwa 6 beendet.

Der mit Chelat konjugierte Antikörper wird chromatographisch an einer 9 cm langen Säule mit einem Gehalt an 1,0 ml eines Ionenverzögerungsharzes (AG11-A8 von Bio-Rad) über 1,0 ml Kationenaustauscherharz (AG-50-WX8, H⁺-Form, 200 bis 400 mesh, Bio-Rad) über 7 ml Sephadex G-50-Gel (Pharmacia) gereinigt. Eine Lösung mit einem Gehalt an 200 millimolar Natriumchlorid und 10 millimolar MES vom pH-Wert.6,0 wird als Elutionsmittel und zur vorherigen Äquilibrierung der Säule verwendet.

Das Eluat wird in Fraktionen von 0,5 ml gesammelt,. Die beiden Fraktionen mit dem grössten Proteingehalt enthalten 150 ug monoklonalen Antikörper, der mit 157,1 i-iCi Indium-111 mar- °® kiert ist. Die Dialyse bei 4°C gegen 1 Liter einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 20 millimolar MES und 200 millimolar Natriumchlorid vom pH-Wert 6,0 ergibt einen Indiumverlust von weniger als 6 Prozent. Der Antikörper behält bei in vitro-Tests im wesentlichen 100 Prozent seiner biologisehen Aktivität und Spezifität. Die in vivo-Abbildung von leukämischen Mäusen ergab, dass sich die Tumorstelle in der Milz befand. Bei Verabreichung an normale Mäuse erfolgte keine Aufnahme durch die Milz.

Beispiel 2

Ein Hybridom wird durch Fusion von P3 653-Mäusemyelomzellen mit den isolierten Milzzellen von C56B1/6-Mäusen, die mit gereinigtem, tumorassoziiertem Ferritin (isoliert aus menschlicher Milz) immunisiert worden sind, erhalten. Ein Hybridom wird isoliert, das einen Antiferritin-Antikörper der Bezeichnung 263D5 bildet. Der Antikörper ist spezifisch für Humanferritin und reagiert nicht mit Ferritin anderer Säugetierspezies.
10

Das Verfahren von Beispiel 1 wird zur Bildung eines Indium-111 enthaltenden mit DTPA konjugierten monoklonalen Antikorpers wiederholt. Eien normale physiologische Kochsalz-

. lösungj die den mit dem Metallchelat konjugierten monoklonalen

Antikörper enthält, wird normalen und leukämischen Mäusen injiziert. Sowohl bei den leukämischen als auch bei den normalen Mäusen ergibt die radiographische Abbildung, dass keine Konzentration des radioaktiv markierten Metalls erfolgt. Diese Tests zeigen, dass das Chelat in vivo sowohl

im Hinblick auf die Chelat-Antikörper-Konjugation als auch auf die Retention des radioaktiven Metalls stabil ist. Weder Milz noch Leber treten in diesen Abbildungen hervor.

Beispiel 3
'

In diesem Beispiel wird ein y/'-Teilchen emittierendes Isotop verwendet, um die selektive Lokalisation von radioaktiven Metallen (unter Einschluss von «^-Teilchen emittierenden Isotopen), die erfindungsgemäss erzielt wird, zu erläutern.

Mit Indium-111-Chelat konjugierte monoklonale Antikörper werden aus einem für menschlichen Brusttumor spezifischen Antikörper hergestellt. Das Hybridom, das den Antikörper bildet, wird durch eine Fusion von Mäusemyelom- und Mäusemilzzellen erhalten. Hybridom und Antikörper sind in Proc. Natl. Acad. Sei., Bd. 78, (1981), S.3199 beschrieben.

ooZUODÜ

Das angewandte Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie in den Beispielen 1 und 2, mit Ausnahme der nachstehenden Abänderungen. Zunächst wird die Stufe der Dialyse des mit dem Chelat konjugierten monoklonalen Antikörpers gegen Ascorbat-EDTA weggelassen. Ferner werden 10 μΐ 0,1 m Ascorbat vom pH-Wert H zu der Indium-111-Lösung gegeben, bevor diese zur wässrigen Kochsalzlösung des mit dem Chelat konjugierten monoklonalen Antikörpers gegeben wird.

Gegenüber den Verfahren von Beispiel 1 und 2 ergibt sich eine 3-fache Steigerung der Markierungswirkung. Das fertige Produkt ist mit etwa 2,1 ^uCi/^ig markiert.

10 ^g des mit Indium-111-Chelat konjugierten monoklonalen Antikörpers, die aus der Reinigungssäule erhalten werden, werden mit wässriger, phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 100 ^uI verdünnt. Der verdünnte mit Indium-111 konjugierte Antikörper wird in die Schwanzvene einer nackten, athymischen Maus, in der ein menschlicher Brusttumor gezüchtet worden ist, injiziert. Die menschlichen Brusttumorzellen exprimieren ein Antigen für den Antikörper. 72 Stunden nach der Injektion zeigt ein klares und gut definiertes mit der ^--Kamera aufgenommenes Bild die starke Lokalisation von Indium-111 im Tumorgewebe. Weder in der Leber noch in der Milz lässt sich eine ähnliche Lokalisation von Indium-111 beobachten.

Beispiel H

Die nachstehenden Tabellen zeigen, dass ein Chelat aus radio-30

aktivem Metall und DTPA im Gegensatz zu einem freien radioaktiven Metall sich nicht in Leber und Milz lokalisiert und rasch durch Nieren und Magen ausgeschieden wird. Die Aufnahme von radioaktivem Metall in Organe von normalen und

leukämischen Mäusen wird nach folgendem Verfahren bestimmt. 35

6 Wochen alte normale Mäuse und 8 Tage vorher durch Injektion von Rauscher-Leukämievirus leukämisch gemachte Mäuse erhalten eine intraperitoneale Injektion von 5 ng (5 uCi/ug) an freiem

lBi-207, mit DTPA cheliertem Bi-207 und mit DTPA cheliertem Sc-46. 18 und 24 Stunden später werden die Mäuse getötet. Das Gewicht der Organe wird ermittelt. Die in den Organen enthaltene Radioaktivität wird bestimmt. Um eine Normali-5sierung in bezug auf Unterschiede bei der Injektion, auf Körpergewicht und auf die Zeitpunkte der Organentnahme zu erreichen, wird die Menge an Radioaktivität pro Gramm Gewebe durch die Menge ah Radioaktivität pro Gramm Blut dividiert. Diese Verhältnisse sind als Ergebnisse angegeben. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I, II und III zusammengestellt.

Tabelle I

Durchschnittswerte und Standardfehler der Verhältniswerte / Blut von 5 Organen von 14 Tage alten leukämischen und normalen Mäusen 18 und 42 Stunden nach der Injektion von freiem 'Bi^a.

18 Std. . 42 Std.

Gewebe	leukämisch	0,65b	normal	0f30
25 Herz	2,35 ±	7J50H	4,0 +	0,35
Leber	31,3 +	2,03d	29,0 +	0,65
Milz	7,18 +	43,7	21,1 +	47,8
Niere	69,4 +	0,35	612,6 +	0,65
Magen	1,35 +	6,95 +

leukämisch

1,48 + 0,12 43,3 + 2,65

8,70 + 0,66 89_r3 + 9,18.

5,01 ΐ 0,43

a = injizierte Dosis =7x10 cpm pro Maus

b = etwa 0,13 Prozent der gesamten cpm im Herz

c = etwa 40 Prozent der gesamten cpm in der Leber

d = etwa 12 Prozent der gesamten cpm in der Milz

Tabelle II

Durchschnittswerte und Standardfehler der Verhältniswerte / Blut von 5 Organen von leukämischen und normalen Mäusen

207 18 Stunden nach Injektion von 'Bi-DTPA-Chelat

5	Gewebe	207	leukämisch	b	Bi-DTPAa	normal	0,21
	Herz	2,60 +	etzf 2,6°	2,45 +	1,24
	Leber • M · «1	19,12 +	37,0	10,93 +	2,0
	Milz	13,1 "+	2,44	12,4 +	26,0
	Niere	294,0 +	281,0 +	2,90
10	Magen	7,52 +	7,20. +

a = injizierte Dosis 3,8 x 10 cpm pro Maus

b = etwa 0,003 Prozent der gesamten cpm im Herz

c = etwa 0,21 Prozent der gesamten cpm in der Leber

d = etwa 0,06 Prozent der gesamten cpm in der Milz

Tabelle III

Durchschnittswerte und Standardfehler der Verhältniswerte / Blut von 5 Organen von leukämischen und normalen Mäusen 18 Stunden nach Injektion von Sc-DTPA-Chelat

⁴⁶Sc-DTPA^a Gewebe leukämisch normal

Herz 3,66 + 0,2l£ 4,49 + 0,84

Leber 9,96 _+ 0,57° 7,23 + 1,04

Milz 3,17 + 0,39^d 5.69 T 0,28

42,1 + 0,9 29,5 T 5,5

12,45+-5,43 7^76 + 2,'o6

3Oa= injizierte Dosis 5,4 χ 10 cpm pro Maus

b = etwa 0,006 Prozent der gesamten cpm im Herz

c = etwa 0,14 Prozent der gesamten cpm in der Leber

d = etwa 0,08 Prozent der gesamten cpm in der Milz

Die Daten der vorstehenden Tabellen zeigen, dass mit DTPA cheliertes Wismuth und Scandium sich im Gegensatz zu freiem Wismuth in der Leber oder Milz von Mäusen nicht anreichern. Hohe Konzentrationen von cheliertem Metall in den Nieren,

zeigen, dass dieses über den Urin beseitigt wird. Die Unterschiede in den Nierenkonzentrationen bei leukämischen und normalen Mäusen sind darauf zurückzuführen, dass leukämische Mäuse aufgrund von Stress häufig Urin ausscheiden.

5 Beispiel 5

Untersuchungen werden durchgeführt, um die Wirkung von Wis-. muth-a-Strahlung auf Säugetierzellen zu untersuchen. F-46-leukämische Zellen werden in vitro in Dulbecco-modifiziertem

Eagle-Medium mit einem Gehalt an 10 Prozent durch Wärmeeinwirkung inaktiviertem fötalem Kälberserum bis zu einer ZeIl-

5 population von 1 χ 10 in jeder Vertiefung gezüchtet. Die Zellpopulationen werden Wismuth-212 ausgesetzt, indem Serienverdünnungen (gemäss Tabelle IV) im Wachstumsmedium zugesetzt werden. Die Zellen werden sodann 96 Stunden gezüchtet. Die Anzahl der überlebenden Zellen wird ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

	Tabelle	IV	Überlebens	100
Dosis	durchschnittliche		rate (%)	116 88 97
(rad)	Anzahl der über- ,- lebenden Zellen (1O5)	Standard-	87 87 72 42 32 16
	6,9	Abweichung	9
0	8,0 6,1 . 6,7	1,4
0,2	6,0 6,0 5,0 2,9 2,2	0,5 M
1,5 3,1 6,2 12,3 24,6 49,2	0,6	2;8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,4
98,4	0,1

Aus den Daten von Tabelle IV ergibt sich unter Anwendung üblicher Berechnungsraethoden ein D -Wert (Überlebensrate 37 %) von 38,5 rad. Dies zeigt, dass Wismuth-212 stark cytotoxische, dicht ionisierende Strahlung emittiert. Vergleichsweise waren 900 rad einer schwach ionisierenden Strahlung einer Kobalt-60-Quelle zur Erzielung der gleichen Ergebnisse erforderlich. Bezüglich einer Erläuterung der Bestrahlungsdosen wird auf die nm/mird-Schriften Nr. 1 (revidiert) und 10 verwiesen. 10

Claims (21)

Patentansprüche

1. Wässrige Lösung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern, bei der mindestens etwa 94 Prozent des Metalls durch den Chelatanteil des Konjugats komplexiert sind und es sich bei dem Metall um ein oC-emittierendes radioaktives Metall handelt.

2» Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens etwa 97 Prozent des Metalls durch den Chelatanteil des Konjugats komplexiert sind.

3. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in den konjugierten Antikörpern mindestens etwa 80 Prozent ihrer Aktivität und Spezifität erhalten sind.

4. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in den konjugierten Antikörpern mindestens etwa 95 Prozent ihrer Aktivität und Spezifität erhalten sind.

5. Lösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in den konjugierten Antikörpern mindestens etwa 97 Prozent ihrer Aktivität und Spezifität erhalten sind.

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6. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ^-emittierenden radioaktiven Metall um ein Metall aus der Gruppe Bi-211, Bi-212 und Bi-213 handelt.

7· Lösung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem (^-emittierenden radioaktiven Metall um Bi-212 handelt.

8. Verfahren zur Herstellung von Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) Chelat-konjugierte monoklonale Antikörper bereitstellt,

(b) zu einer wässrigen Lösung der gewonnenen Chelat-konjugierten monoklonalen Antikörper ein Metallsalz und

¹^ einen Puffer zur Bildung von Metallchelat-konjugierten Antikörpern zusetzt, wobei es sich bei dem Metall um ein oi-emittierendes radioaktives Metall handelt,

(c) die die Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper enthaltende wässrige Lösung über eine Chromatographiesäule gibt, wobei die Säule eine oder mehrere Schichten aus der Gruppe ionenretardierende Harze, Anionenaustauscherharze, Kationenaustauscherharze und chelatbildende Ionenaustauscherharze und eine Schlussschicht, die eine eine Grössenfraktionierung bewirkende Matrix enthält, aufweist, und

(d) von der Säule eine Lösung von Metallchelat-konjugierten Antikörpern gewinnt, wobei mindestens etwa 80 Prozent des in der Lösung enthaltenen Metalls durch das mit den monoklonalen Antikörpern konjugierte Chelat komplexiert sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Chelat-konjugierten monoklonalen Antikörper durch Kontakt eines Carboxycarbonsaureanhydrids von Piäthylentriaminpentaessigsäure mit einer wässrigen Lösung von monoklonalen Antikörpern hergestellt worden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Carboxycarbonsäureanhydrid von Diäthylentriamihpentaessigsäure um das Reaktionsprodukt handelt, das durch Umsetzung eines Aminsalzes von Diäthylentriaminpentaessigsäure mit einem Ester einer Halogenameisensäure in einem organischen Lösungsmittel bei Temperaturen unter etwa -20 C erhalten worden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Halogenameisensäureester um Isobutylchiorformiat handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem «"-emittierenden radioaktiven Metall- um

!5 ein Metall aus der Gruppe Bi-211, Bi-212 und Bi-213 handelt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ^-emittierenden radioaktiven Metall um Bi-211 handelt.

14. Verwendung einer Lösung von mit radioaktiven Metallchelaten konjugierten monoklonalen Antikörpern, die für eine Zielzelle spezifisch sind, zur Behandlung von

^S zellulären Störungen, wobei es sich bei dem radioaktiven Metall um ein (^-emittierendes Metall handelt.

15. Ausführungsform nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem radioaktiven Metall um ein Metall aus der.Gruppe Bi-211, Bi-212 und Bi-213 handelt.

16. Ausführungsform nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem radioaktiven Metall um Bi-212 handelt.

17. Ausführungsform nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Chelat von Diäthylentriaminpentaessigsäure ableitet.

18. Ausführungsform nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Chelat-konjugierten monoklonalen Antikörper aus einem Carboxycarbonsäureanhydrid von Diäthylentriaminpentaessigsäure und monoklonalen Antikörpern hergestellt worden sind.

19. Ausführungsform nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Carboxycarbonsäureanhydrid durch Umsetzung von Isobutylchlorformiat mit einem Aminsalz von Diäthylentriaminpentaessigsäure hergestellt worden ist.

20. Ausführungsform nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass in der Lösung der mit einem radioaktiven Metallchelat konjugierten monoklonalen Antikörper mindestens

¹^ etwa 94 Prozent des radioaktiven Metalls an das Chelat gebunden sind und im Chelat mindestens etwa 80 Prozent der biologischen Aktivität und Spezifität der Antikörper erhalten sind.

21. Ausführungsform nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem radioaktiven Metall um Bi-212 handelt und in der Lösung der Metallchelat-konjugierten monoklonalen Antikörper mindestens etwa 94 Prozent des radioaktiven Metalls durch das Chelat gebunden sind und im Konjugat mindestens etwa 80 Prozent der biologischen Aktivität und Spezifität der Antikörper erhalten sind.