JPS5857149B2 - エル − アミノサンサンカコウソノセイセイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカンコクマムシ（Ａｇｋｉ ｓ ｔｒｏｄｏｎ
ｃａｌｉｇｉｎｏｓｕｓ ）毒よりジペプチダーゼ活性
を含！ない純粋なＬ−アミノ酸酸化酵素の精製法にかん
する。

更に詳しくはカンコクマムシの顎下線の毒液もしくはこ
のもの＼凍結乾燥標品（蛇毒）をゲルろ週休であるセフ
ァデックスＧ−１００（ファルマシア社製）、イオン交
換体であるＤＥ ＡＥセファデックスＡ−５０（ファル
マシア社製釦よびイオン交換体であるＳＰ−セファデッ
クスＣ−５０（ファルマシア社製）を用いて処理するこ
とを特徴とするジペプチダーゼ活性を含オない純粋なＬ
−アミノ酸酸化酵素を精製する方法にかんする。

従来より蛇毒中にはプロテアーベホスホリパーゼなどの
酵素が含まれていることが知られてかり、また酵素一般
の精製法の一部として架橋デキストランゲルであるセフ
ァデックスが使用されていることが知られている。

しかしながら、カンコクマムシ毒はＬアミノ酸活性が強
力であるので、種々の精製方法が試みられて来たが、未
だに粗酵素標品しか得られて−１らず、シめ）もとの粗
酵素標品中にはジペプチダーゼが含まれていて、血清中
のジペプチダーゼ活性を測定する臨床診断薬として作用
することが不可能であった。

本発明者らはこのカンコクマムシ毒中の強力なＬ−アミ
ノ酸酸化酵素をジペプチダーゼを含まない純粋な酵素標
品を得る目的で研究を重ねた結果本発明を完成した。

即ち本発明はカンコクマムシ毒をゲルろ週休であるセフ
ァデックスＧ−１００、イオン交換体であるＤＥＡＥ−
セファデックスおよびイオン交換体であるセファデック
スＣ−５０を用いて処理することよりなるジペプチダー
ゼ活性を含オないＬ−アミノ酸酸化酵素を得る方法であ
る。

使用される原料としては新鮮なカンコクマムシ毒そのま
＼かもしくは市販の凍結乾燥標品が用いられる。

一般に凍結乾燥標品を緩衝液に溶解して、セファデック
スＧ −１００カラムによる処理を数回くりかえした後
、活性部分を分ホしてＤＥＡＥセファデックスＡ−５０
カラムクロマトグラフイによりＮａｃ、４水のリニアー
グラディエンド溶出を行って活性部分を分増し、更にＳ
Ｐ−セファデックスＣ−５０カラムにて処理してＮａＣ
１水のリニアーグラディエンド溶出によりジペプチダー
ゼ活性を含オない純粋なＬ−アミノ酸酸化酵素を得るこ
とができる。

原料の蛇毒の純度によってはセファデックスＧ−１００
やＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０の処理を行わずに
直接ＳＰ−セファデックスＣ−５０カラム処理によって
純粋なＬ−アミノ酸酸化酵素を得ることもできる。

このようにして得られたＬ−アミノ酸酸化酵素の性質を
以下に示す。

（１）外 観：白色粉末 （２）分子量（ゲルｐ過法） ： ８．５ｘ １０４（
３）等重点：４．９ （４）均一性：ディスク電気泳動的に均一な糖タンパク
質 （５）至適ＰＨ： ８．０−８．５ （第１図参照）Ｐ
Ｈ５，０−７，５で安定。

（６）熱安定性：５０℃寸で安定 ７０℃、３０分間で失活。

（７）各種金属による影響 Ｈｇ＋＋：強く阻害される。

Ｆｅ千十 、ｃｏ＋＋９Ｍｎ＋十 、Ｃａ＋＋ 、ｚｎ
＋＋Ｃｕ” ” 、 Ｍｇ” ＋：全く阻害されない。

（８）基質特異性（第１表参照） Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、
Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンによく作用する。

第１表二種々のアミノ酸に対するＬ−アミノ酸酸化酵素
の活性 ａ）ロイシンに対する活性を１００％とする。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例 １ １２０ηのカンコクマムシ毒を精製水１０−に溶解し、
０．０５Ｍ、ＮａＣ１を含有する０、０１ＭＴｒｉｓ
ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，６）で緩衝化したセファデック
、’（Ｇ−１００カラム（３，２ｘ ６０Ｃｒｒｌ）に
負荷し、同緩衝液で溶出した。

この操作で低分子の不純物を除去することができ、酵素
活性の存在する部分（はじめ７５．ら２１６〜２４０−
の流出液）を集めた。

この操作を４回行ない（４８０７ｎＩ！のカンコクマム
シ毒を処理）活性部分を、０．１ ＭＮａＣＡ ｋを
含有する０、０１ Ｍ Ｔｒｉｓ Ｈｃ、ｌ緩衝液（
ｐＨ７，６）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファデックスＣ
−５０カラム（１，６５ｘ １５ｃＷＩ）に吸着させ、
同緩衝液でＮａＣｔが０，１Ｍから０．３ Ｍのリニア
ーグラディエンドによシ溶離した。

ここで得られた活性部分を濃縮し、０．０４Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，０） ２０−に溶解した。

この酵素液を０．０４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で緩
衝化したｓｐ−セファデックスＣ−５０カラム（１，６
５ｘ１５ｃｒｒｌ）に吸着させ、同緩衝液でＮａＣｔが
ＯＭから０．２のりニア−グラディエンドによう溶離し
た。

活性部分を濃縮し、１ＭＴｒｉｓ を加えてｐＨ７，
０に調整し ４℃で保存した。

以上の精製過程を第■表に示す。

活性収率は３８％、カンコクマムン毒から６１倍精製さ
れディスク電気泳動で本酵素は純粋であることが証明さ
れた。

精製酵素の比活性は３９Ｖ■であう、ジペプチターゼ活
性を示さなかった。

第■表：カンコクマムシ毒よりＬアミノ酸酸化酵素の精
製 精製段階 活性 タンパク 比活性（ｕ）
（７’Ｗ） （ｕＡ’）粗酵素 ３０５４８０ ０
．６３５（１）セファデックス Ｇ−１ｏｏ１．、．２０３３８．０５．３４（８，４）
１７７デ′り” １４４ ８．３８ １７．２（２
７，１）−５０ ゞ７７デ′り” １１７ ３．００ ３９．０（６
１，４）−５０ 実施例 ２ カンコクマムシ毒８６０■を０．０４ Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ５，０） ２００ｍｌに溶解し、同緩衝液で緩衝化
したＳＰ−セファデックスＣ−５０カラム（１，８Ｘ
２０ＣｒＩＮ）に吸着させ、同緩衝液１ｔでカラムを洗
滌したのち、同緩衝液で、ＮａＣＡがＯＭから０−２
Ｍ ’１でのリニアーグラディエンドで溶離した。

第■表に示すように活性収率は５２多であり、比活性１
４．６Ｖ■であり、ジペプチダーゼ活性は認められなか
った。

（Ｌ−アミノ酸酸化酵素活性測定法） １憎／−濃度のＬ−ロイシンｌ−に〔４ア□ノアンチピ
リン４７ｑ、Ｎ 、 Ｎ’ ジメチルアニリン１０μを
鮫よび西洋ワサビパーオキシダーゼ４■を５０ＴＩｌの
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した〕発色液
２ｍｌを加え、酵素０．５−を加え３７℃、１０分反応
後３饅酢酸０．５７ｎｌを加え反応を停止させ５５０
ｎｍにむける吸光度を測定した。

酵素活性は上記反応条件下に１分間に１μｍｏ、／、の
Ｌ−ロイシンを酸化する酵素活性を１単位とした。

（ジペプチダーゼ活性測定法） １ｍｔｌｌｒｎｌｌｅｋ度のＬ−ロインルロイシン１−
に、Ｌ−ア□ノ酸酸化酵素（１５ｕ／ｍｇ） ２０ ｐ
Ｌ、〔４−アミノアンチピリン４弘西洋ワサビパーオ
キシダーゼ４ηを５０−の０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ −
ＨＣ，ｇ緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解した〕発色液２．
０−に酵素０．１−を加え、３７℃、２０分反応させ、
０．Ｉ Ｎ酢酸１．０−を加え反応を停止させ、５５０
ｎｍの吸光度を測定した。

酵素活性は上記反応条件下に２０分間に１μｇのＬ−ロ
イシンを遊離する酵素活性をｌ単位（ｕｎｉｔ）とした
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素のＰＨ安定性を示すグラフ図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ カンコクマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃａｌ
   ｉｇ−ｉｎｏｓｕｓ ）毒をゲルろ週休であるセファデ
   ックＧ−１００、イオン交換体であるＤＥＡＥ−セファ
   デックスＡ−５０およびイオン交換体であるＳＰ−セフ
   ァデックスＣ−５０により処理することを特徴とするジ
   ペプチダーゼ活性を含まないＬ−アミノ酸酸化酵素の精
   製法。