DE3239410C2

DE3239410C2 -

Info

Publication number: DE3239410C2
Application number: DE3239410A
Authority: DE
Inventors: Thomas Henry Leucadia Calif. Us Adams; Gary Samuel La Jolla Calif. Us David; Samuel Elliot San Diego Calif. Us Halpern
Original assignee: Hybritech Inc; University of California Berkeley
Current assignee: University of California
Priority date: 1981-10-27
Filing date: 1982-10-25
Publication date: 1991-12-19
Also published as: DE3239410A1; JPH0564130B2; DK164682C; ATA391682A; FI82379C; CH653040A5; IT1153857B; CA1202892A; FI82379B; FI823633L; NO169947B; GB2109407B; FI823633A0; DK474182A; BE894829A; JPS58135820A; ES516797A0; GB2109407A; LU84441A1; IT8223932A0

Description

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen 1 bis 8 angegebenen monoklonalen Antikörper zu carcinoembryonischen Antigenen sowie die Zusammensetzung nach Anspruch 9.

Seit langem sucht man nach einem zuverlässigen Verfahren zum spezifischen Nachweis von von Krebs befallenen Stel len. Aus den US-PS 36 63 684 und 36 97 638 sind Ver fahren bekannt, mit denen man z. B. carzinoembryonisches Antigen (CEA), das im Blutstrom von Humankarzinoma zir kuliert, vorkommt. Diese Methoden sind jedoch offensicht lich nicht geeignet, um die Lokalisation eines Tumors zu bestimmen. Kürzlich wurde vorgeschlagen, Antikörper, die mit radioaktiven Isotopen von Jod markiert sind, zum Nachweis von mit Tumoren vorkommenden antigenen Substan zen zu verwenden. So wird in US-PS 39 27 193 ein Verfah ren unter Verwendung von Antikörpern zu CEA, das mit ¹²⁵J ¹³¹J markiert ist, beschrieben. Nach dieser Patentschrift wurden Versuche durchgeführt unter Verwendung von männ lichen syrischen Hamstern, denen man humanes Signet-Ring zellenkarzinom eingeführt hatte, worauf man dann markier tes Ziegen-Anti-CEA injizierte und worauf dann die Unter suchung der Tierorgane zeigte, daß Radioisotope im Tumor lokalisiert waren. Es wurde deshalb vorgeschlagen, daß man auch die Lokalisierung eines Tumors beim Menschen da durch bestimmen kann, daß man parenteral Lösungen von Antikörpern in vivo verabreicht und anschließend den Wirt einem Photoscanning-Verfahren unterwirft.

Die praktische Anwendung von radiojodierten Antikörpern hat nicht die ursprünglichen Erwartungen erfüllt. So be richten beispielsweise Goldenberg et. al., N. Eng. J. Med. 298, 1384-1388 (1978) 1978 über einen gewissen Erfolg beim Scanning (Abtasten) von Menschen mit radiojodiertem Anti-CEA. Wegen der restlichen Hintergrundradioaktivität hing der beschränkte Erfolg von der Anwendung der Sub traktionstechnik ab. Mach et al. berichten in N. Eng. J. Med., 303, 5-10 (1980) über noch weniger Erfolg und konnten nur 0,1% der verabreichten Dosis im Tumor lokalisiert finden. In ausgewählten Fällen war jedoch das Auffinden des Tumors dennoch möglich.

Es ist bekannt, daß die Affinitätsreinigung von hetero logen Antiseren zum Erhalten der bei den früheren Tumor nachweisverfahren verwendeten Antikörper im allgemeinen den Verlust von Hochaffinitätsantikörpern ergibt, und daß die erhaltenen Antikörper eine Mischung von spezifischen Antikörpern für unterschiedliche Determinanten von Anti genen sind und hauptsächlich aus Antikörpern mit niedri ger Affinität und Antikörpern, die keine spezifischen Reaktionen ergeben, besteht. Monoklonale Antikörper kann man andererseits so auswählen, daß sie eine hohe Affini tät für ausgewählte Stellen des Antigens und eine niedri ge nichtspezifische Bindung aufweisen. Es wurde jedoch gefunden, daß monoklonale Antikörper zu Tumorantigenen, die mit Radioisotopen von Jod in bekann ter Weise markiert wurden, trotzdem eine schlechte Loka lisierung der Krebsstellen ergeben trotz der Tatsache, daß man eine in vitro-Immunoreaktivität findet. Dies kann wahrscheinlich auf den Verlust von radioaktivem Jod durch den markierten Antikörper zurückzuführen sein. Es besteht infolgedessen weiterhin ein Bedürfnis nach einer zuver lässigen Technik zum in vivo-Nachweis der genauen Lokali sierung eines Tumors.

Science 209 (1989) 295-297 beschreibt die Verwendung von Chelat- gebundenem Indium-111 (Indium-111-Diethylentriaminpentaessigsäure) als Marker für F(ab′)₂ Fragmente eines Antikörpers gegen Herzmyosin beim Hund zum Nachweis eines Myocardinfarktes.

Proc. Society Exper. Biol. Med. 151 (1976) 297-302 beschreibt das Markieren polyklonaler Antikörper mit Chelat-gebundenen Schwermetallen (Indium-111) als Alternative zur Radioiodierung; es wird berichtet, daß bei Radiomarkierung unter Verwendung von Chelat-bildenden Agentien der Antikörper in seinen Bindungscharakteristiken nicht nachteilig beeinflußt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, monoklonale Antikörper zu carcinoembryonischem Antigen (CEA) zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe Krebs bei einem infizierten Wirt effizienter lokalisiert werden kann, als es mit herkömmlichen Methoden der Fall ist. Diese Aufgabe wird mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper zu carcinoembryonischem Antigen (CEA), der dadurch gekennzeichnet ist, daß an den Antikörper ¹¹¹In mittels eines Chelatbildners, der mit dem Antikörper konjugiert ist, gebunden ist.

Zweckmäßige Ausgestaltungen davon sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 8.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie in einer Lösung für die parenterale Verabreichung einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zu CEA umfaßt.

Gemäß der Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment mit dem chelatgebundenen Radionuklid, z. B. DTPA-gebundenem ¹¹¹In markiert, indem man ein chelatbildendes Mittel mit dem Antikörper konjugiert und anschließend einen Komplex aus dem Chelatbildner und dem Radionuklid bildet. Der gebil dete markierte Antikörper, oder ein Fragment davon, kann dann, wenn er einem Tumor-tragenden Wirt injiziert wird, schnell und mit hoher Spezifität den Tumor selbst lokali sieren. In einigen Fällen kann auch die Lokalisierung von entfernteren Metastasen auftreten und dadurch das Ausbrei ten des Tumors angezeigt werden. Die Lokalisierung des Tumors kann durch Photoscanning-Technik nachgewiesen wer den. Ebenso kann man auch Mischungen von markierten mono klonalen Antikörpern verwenden.

Die Erfindung und deren Vorteile gegenüber dem Stand der Technik wird durch die nachfolgende ausführliche Beschreibung der Erfindung und der Figuren veranschaulicht.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Verteilung von ¹¹¹In, ¹²⁵J, und ⁶⁷Ga im Gewebe als Funktion der Zeit nach dem Injizieren von Anti-CEA, das mit ¹¹¹In und ¹²⁵J und ⁶⁷Ga-Citrat markiert war, in nackte, mit humanem Coloncancer infizierte Mäuse.

Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung und gibt die Menge an ¹¹¹In und ¹²⁵J und ⁶⁷Ga an, die von nack ten Mäusen in zunehmender Zeit nach dem Injizieren von ¹¹¹In und ¹²⁵J markiertem Anti-CEA und ⁶⁷Ga-Ci trat ausgeschieden wird.

Fig. 3 ist eine graphische Darstellung und zeigt die Ver teilung im Gewebe von ¹¹¹In und ¹²⁵J in nackten Mäu sen 48 h nach dem Injizieren von ¹¹¹In und ¹²⁵J mar kiertem Anti-CEA, und von ¹¹¹In-Citrat und ¹²⁵J markiertem Humanalbumin.

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung und zeigt das Tumor/ Gewebe-Verhältnis von ¹¹¹In, ¹²⁵J und ⁶⁷Ga nach dem Injizieren von ¹¹¹In- und ¹²⁵J-mar kiertem Anti-CEA und ⁶⁷Ga-Citrat in nackte Mäuse als Funktion der Zeit.

Wie dargelegt, werden erfindungsgemäß monoklonale Anti körper oder Fragmente davon mit dem chelatgebundenen Radionuklid markiert. Die erfindungs gemäß verwendeten monoklonalen Antikörper sind Produkte der bekannten Hybridoma-Technologie. Hierzu wird bei spielsweise auf die Originalarbeiten von Milstein und Kohler, die in Nature, 256, 495-497 (1957) beschrie ben werden, verwiesen. Kurz gesagt, wird bei diesem Ver fahren eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier mit Immunogen injiziert, im vorliegenden Fall mit dem tumorassoziierten Antigen CEA. Anschließend wird die immu nisierte Maus dann getötet, und aus der Milz werden Zel len genommen, die mit Myelomazellen unter Ausbildung von Hybridzellen, die man als "Hybridomas" bezeichnet, vereinigt werden und die in vitro reproduziert werden können. Die Population der zellbildenden Antikörper wird selektiv kultiviert und untersucht, um Individualklone zu iso lieren, von denen jeder eine einzelne Antikörperspezies, die spezifisch für eine spezielle Region ist ("Determinant") an der Oberfläche des Antigenmoleküls abscheidet.

Die Individualklone können weiterhin auf solche unter sucht werden, die Antikörper der höchsten Affinität für das Antigen bilden und die eine niedrige nichtspezifische Bindung aufweisen. Der für die Radiomarkierung verwendete Antikörper (der normalerweise aus Ascites isoliert wird), wird mit einem geeigneten Chelatbildner, der anschließend zum Binden des Radionuklids verwendet wird, konjugiert. Der Chelatbildner kann unter Verwendung einer großen An zahl von Verfahren an den Antikörper gebunden werden. Da der Antikörper ein Polypeptid ist, wendet man im allge meinen einen Chelatbildner an, der eine reaktive Gruppe enthält, von der man weiß, daß sie zum Einführen einer Gruppe eines proteinhaltigen Substrats geeignet ist. Als geeignete reaktive Gruppen können die folgenden er wähnt werden:

worin Ch der Rest des Chelatbildners ist.

Geeignete Chelatbildner schließen eine große Anzahl von vielzähnigen Chelatbildnern, deren Liganden mit metalli schem Radionukliden Komplexe bilden, ein. Zu solchen Mit teln gehören beispielsweise Polyaminocarbonsäuren der Formel

worin bedeuten:
x 0 oder eine ganze Zahl (x=0 oder x=1 bevorzugt),
y 1 oder 2, (y=1 bevorzugt) und
z eine ganze Zahl von 1 bis 7 (z=1 oder 7 bevorzugt), und
R Wasserstoff oder eine Gruppe, durch welche der Chelat bildner mit dem Antikörper konjugiert ist oder eine Gruppe, welche die Bindungskonstante des Chelatbildners für das Radionuklid beeinflußt.

Geeignete R-Gruppen sind insbesondere die Gruppe

worin A die Gruppe ist, durch welche die Konjugation er zielt wird. Beispielsweise kann A -N₂⁺ sein und wird er halten, indem man die Gruppe -NH₂ diazotiert und die -NH₂- Gruppe selbst kann man durch Reduktion einer Nitro (-NO₂)- Gruppe erhalten, die man wiederum erhält, indem man den Phenylkern nitriert. Die Gruppe A kann auch

bedeuten, die man erhält, indem man die Gruppe -NH₂ in bekannter Weise acetyliert und worin L eine austretende Gruppe ist, die während der Konjugation ersetzt wird, z. B. ein Halogen, wie Chlor, Brom oder Jod (wobei Brom bevorzugt wird).

In anderen Fällen kann R -CH₃ oder -CH₂C₆H₄OCH₂CO₂H sein.

Im Falle der Polyaminocarbonsäuren kann man die Konju gation selbst durch die Carboxylsäuregruppe bewirken, z. B. indem man ein Säureanhydridzwischenprodukt bil det gemäß der Lehre von Krejcarek und Tucker, Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 (1977).

Als Polyaminocarbonsäuren werden Polyaminoessigsäuren bevorzugt. Spezifische Polyaminocarbonsäuren, die hier verwendet werden können, schließen Ethylendiaminotetra essigsäure (EDTA) und Derivate davon wie Diethylentri aminpentaessigsäure (DTPA), p-Bromoacetamidophenyl(ethylen dinitrilotetraessigsäure)säure und 1-(p-Aminophenyl)- ethylendiaminotetraessigsäure ein, wobei man die letztere zur Ermöglichung einer Konjugation in ein Diazoniumsalz überführt. Von den Chelatbildnern wird DTPA zur Zeit besonders bevorzugt.

Weitere geeignete Chelatbildner sind Polyamino(alkylen phosphor)säuren, insbesondere solche der Formel:

worin x, y, z und R die vorher angegebene Bedeutung haben. Vorzugsweise ist x 0 oder 1, y=1 und z=1. Spezifische Polyamino(methylenphosphor)säuren (y=1) schließen Ethylen diaminotetra(methylenphosphor)säure, Hexamethylendiamin tetra(methylenphosphor)säure und Diethylentriaminpenta- (methylenphosphor)säure für die erfindungsgemäße Verwend dung ein.

Weitere Chelatbildner sind Polyamine der Formel

worin X, Z und R die vorher angegebene Bedeutung haben.

Eine andere Klasse der Chelatbildner hat die Formel

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat mit der Aus nahme, daß dann, wenn R keine Gruppe ist, die eine Kon jugation ermöglicht, wenigstens eine der Phenolgruppen eine Gruppe der Formel

ist, worin A die zuvor angegebene Bedeutung hat.

Porphyrine stellen eine weitere nützliche Klasse von Che latbildnern dar. Für die vorliegende Erfindung sind synthetische und natürlich vorkommende Porphyrine, ein schließlich Porphyrine der Formel

geeignet, worin R die vorher angegebene Bedeutung hat und R₁ Wasserstoff oder einen Substituenten darstellt, der als Teil eines natürlich vorkommenden Porphyrin moleküls auftritt oder eine Gruppe, die während der Syn these eingeführt ist, bedeutet, z. B. um die Konjugation zu ermöglichen oder um die Bindungskonstante des Porphy rins zu beeinflussen. Bevorzugte Porphyrine sind Tetraphe nylporphyrin (R=Phenyl, R₁=H) oder Tetrapyridylpor phyrin (R=4-Pyridyl, R₁=H). Ein oder mehrere der Phenyl- oder Pyridylgruppen sind mit -NH₂ oder

substituiert, worin L die zuvor angegebene Bedeutung hat oder durch andere Gruppen, die eine Konjugation mit dem Antikörper ermöglichen. Die Substitution erfolgt norma lerweise in para-Stellung der Phenylgruppe oder in der 2- oder 4-Stellung der Pyridylgruppe.

Weitere Chelatbildner, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Kronenether und deren Cryptandanaloge der allgemeinen Formeln

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat. Alternativ wird die Gruppe, die die Konjugation ermöglicht, direkt in den Kronenether oder die Cryptandstruktur eingeführt, wie dies in der folgenden Formel gezeigt wird,

worin A die vorher angegebene Bedeutung hat.

Derivate von Desferrioxamin B können auch als Chelatbildner verwendet werden. Diese haben die Formel

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat.

Auch Derivate von Enterobaktin sind als Chelatbildner geeignet. Bevorzugt sind solche der Formel

worin A die vorher angegebene Bedeutung hat.

Weiterhin sind auch carbocyclische Analoge von Entero baktin geeignet. Von diesen können Verbindungen der Formel

worin A die vorher angegebene Bedeutung hat, erwähnt wer den.

Weitere als Chelatbildner geeignete carbocyclische Systeme sind solche der Formel

und die entsprechenden Anilide, bei denen A die vorher angegebene Bedeutung hat.

Für den Fachmann ist es klar, daß er für die Enterobak tin- und carbocyclischen Analogen gezeigte Ring weiterhin durch Substituenten, die die Fähigkeit metallische Radio nuklide zu bilden, nicht erheblich beschränken, substi tuiert sein kann und daß man solche Substituenten ein führen kann, um Stellen für die Konjugation des Antikörpers einzuführen.

Eine noch weitere Gruppe der Chelatbildner umfaßt Siloxane der Formel

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat mit der Aus nahme, daß dann, wenn R keine Gruppe ist, die die Konju gation ermöglicht, wenigstens eine Katecholgruppe eine Gruppe der Formel

worin A die vorher angegebene Bedeutung hat, ist.

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorhergehen de Aufzählung von Chelatbildnern nicht erschöpfend ist, son dern nur die geeigneten Chelatbildner beschreiben soll.

Das Radionuklid (¹¹¹In) wird an den Antikörper gebunden, indem man zuerst einen Chelatbildner zu dem Antikörper kon jugiert und dann einen Komplex mit dem Radionuklid bildet. Hierbei bevorzugt man besonders die Verwendung von ¹¹¹In (t 1/2=2,8 Tage) zusammen mit DTPA als Chelatbildner.

Bei der praktischen Anwendung wird der markierte Antikörper in einer geeigneten parenteralen Lösung dem Patienten injiziert. Nachdem eine genügende Zeit abgelaufen ist, wird der Patient einer Photoscannierung zum Nachweis der Stellen einer lokalisierten Strahlung unterworfen, die einen Tumor und/oder dessen Metastasen anzeigen.

Die nachfolgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele wurden mit monoklonalen Antikörpern zu CEA, markiert mit ¹¹¹In und ¹²⁵J durchge führt und zeigen den Vorteil der Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zum Nachweis von Tumoren gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu Verfahren, bei denen man Jod-markierte Antikörper verwendet.

1. Herstellung von radiomarkiertem Anti-CEA

Monoklonales Anti-CEA, erhältlich von Hybritech, Inc., La Jolla, CA, wurde mit ¹²⁵J unter Anwendung der Methode von Bolton und Hunter, Biochem. J., 133, 529-39 (1973) markiert. Das Produkt wurde durch eine Sephadex G-25- Säule fließen gelassen, und das fertige Material enthielt weniger als 0,5% an freiem Jodid. Die Markierung des radiomarkierten monoklonalen Antikörpers betrug mehr als 80% mit Pferde-Antimaus-Antikörper, gebunden an Sepharose und mehr als 75% mit CEA, gebunden an Sepharose.

Das gleiche monoklonale Anti-CEA wurde mit ¹¹¹In unter Ver wendung von konjugiertem DTPA als Chelatbildner nach dem Verfahren von Krejcarek und Tucker, Biochemical and Bio physical Research Communications, 77. 581 (1977) markiert.

Das Reaktionsprodukt wurde gereinigt, indem man es durch eine Sephadex G-75-Säule hindurchlaufen ließ. Die Antigen bindung war vergleichbar zu der, die von dem ¹²⁵J-markier ten Antikörper gezeigt wurde. Das Markierungsverfahren beeinflußte nicht die Affinitätskonstante Ka für den An tikörper in bezug auf den nichtchelierten Antikörper, wie dies durch Titrieren mit CEA festgestellt wurde.

Die in vitro-Stabilitäten der markierten Anti-CEA-Anti körper wurde bestimmt, indem man einen Teil des Materials in einer parenteralen Lösung, enthaltend sterile normale Kochsalzlösung, U.S.P., bei 37°C während 72 h inkubierte und dann auf die Gegenwart von freiem Radiomnuklid chro matographisch untersuchte. Die Antikörperlösungen wurden auf Baker-Aluminiumoxid 1B-Streifen punktförmig aufge bracht und in einer 50%igen wäßrigen Acetonlösung ent wickelt. Das proteingebundene Radionuklid verbleibt am Ursprungsort, während freies Radionuklid wandert. Nach der Inkubationsperiode zeigte das radiojodierte Material weniger als 3% Aktivität, die als freies Jodid vorlag. Durch Lagerung bei 4°C wurde diese um 50% vermindert. Unter den gleichen Bedingungen zeigte ¹¹¹In-Anti-CEA eine vergleichbare Stabilität.

2. Verteilungsstudien bei nackten Mäusen

Gewebeverteilungsstudien bei radiomarkierten monoklonalen Mäuse-Anti-CEA wurden an mit 0,5 bis 1,0 g Humancolontu moren versehenen nackten Mäusen durchgeführt. Die Mäuse hatten ein Gewicht zwischen 17 und 28 g (Mittel etwa 23 g). Die Tumoren waren durch subkutane Injektion von Minze ent halten CEA-bildenden Humancolonadenocarzinomazellen einge leitet worden. Die Verteilungsstudien wurden 3 Wochen später durchgeführt. Es wurden zwei Versuche durchgeführt. Beim ersten Versuch wurden 19 Tiere in vier Gruppen von 4 bis 6 eingeteilt und intravenös (IV) mit 0,1 ml einer sterilen normalen Kochsalzlösung U.S.P., enthaltend 0,5 Mikrokurie an ¹²⁵J Anti-CEA-Antikörper (etwa 0,3 Mikro gramm Antikörper) injiziert, und als Kontrolle wurde trä gerfreies ⁶⁷Ga-Citrat verwendet, einem bekannten nicht spezifischen Humancolontumornachweismittels. Die Injek tionen wurden ohne Anästhesie unter Verwendung einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze aus Genauigkeitsgründen durchgeführt. Tiere, bei denen die Dosis teilweise in den Schwanz infiltrierte, wurden von den Untersuchungen ausgeschlossen. Im Anschluß an die Injektion wurden die Mäuse in sterile metabolische Käfige mit erhöhtem Draht boden, so daß sich Urin und Feces darunter ansammeln konn te, gehalten. Unterhalb des Bodens wurde sterile 4×4 Gaze derart gepackt, daß diese nicht von den Tieren angeknabbert werden konnte. Die Mäuse wurden in einem reinen Raum bei 4,4°C (40°F) gehalten und erhielten sterile Nahrung und Wasser ad libitum und wurden dann in Gruppen 4, 24, 48 bzw. 72 h nach der Injektion des Tracers getötet.

Die Mäuse wurden mit Ether anästhesiert, und Blutproben wurden durch direkte Herzpunktur entnommen. Dann wurden die Mäuse durch Zervikaldislokation getötet. Während der nachfolgenden Sezierung wurden der Tumor, die Leber, die Nieren, Muskel, Herz, Lungen, Femur und Milz herausge nommen, zweimal mit Wasser, einmal mit 10%igem Formalin gespült, trocken getupft und dann auf einer analytischen Waage feucht gewogen. Der Mageneingang und die Eingeweide wurden gleichfalls entfernt und gewogen. Blut, Muskel und Knochen wurden bei der Berechnung der Gesamtmenge mit 7%, 40% bzw. 10% des Gesamtkörpergewichts angenommen. Die Messung der Radioaktivität wurde mit einem Auto-Gamma- Quellen-Counter durchgeführt, dessen Fenster über dem 27-35 keV-Photopeak von ¹²⁵J und dem ⁹³keV-Photopeak von ⁶⁷Ga eingestellt waren. Der Zähler war so programmiert, daß er bei 10 min oder bei einer Million Zählungen nicht ansprach, um dadurch die statistische Signifikanz für solche Proben mit niedrigstem Aktivitätsniveau zu er zielen. Korrektionen für Hintergrundsaktivität und den reziproken Beitrag der isotopischen Aktivität zwischen den Fenstereinstellungen wurden durchgeführt unter Ver wendung von Quellen, wobei man ähnliche Gleichungen zu lösen hatte. Die Aktivität in den Proben wurde dann mit Standards des injizierten Materials verglichen, und die Ergebnisse werden ausgedrückt als Prozent der injizier ten Dosis pro Gramm und als Prozent der injizierten Do sis pro Organ. Die Tumor zu Gewebe-Verhältnisse wurden aus den Prozentangaben von Dosis/g berechnet. Die Aktivi tät im Darm, im Urin und in der Feces wurde als Prozent satz der gesamtinjizierten Dosis berechnet.

Bei der zweiten Untersuchung wurden 27 nackte Mäuse mit den gleichen Tumoren aus dem gleichen Humancoloncancer in fünf Gruppen von 7 bis 8 Tieren eingeteilt. Eine Grup pe diente zur Kontrolle und erhielt gleichzeitig IV 1 Mikro kurie ¹²⁵J Humanserumalbumin (0,01 mg HSA) und 3 Mikrokurie trägerfreies ¹¹¹In-Citrat (0,01 mg Citrat) injiziert und wurde 48 h nach der Injektion getötet. Bei den verblei benden vier Gruppen erhielten die Tiere gleichzeitig In jektionen von 3 Mikrokuries ¹¹¹In-markiertem Anti-CEA (1,5 Mikrogramm Antikörper) und 5 Mikrokuries trägerfreiem ⁶⁷Ga-Citrat. Die Gruppen wurden 4, 24, 48 bzw. 72 h danach getötet.

Die Sezierung des Gewebes, die Probezubereitung für die Radioassays, die Zähltechnik und die Berechnung wurde wie oben durchgeführt. Im Falle von ¹¹¹In wurde das Spek trometer so eingestellt, daß es das 247 keV Photopeak un ter Verwendung eines 40-keV-Fensters (210-250 keV) zählte, während ⁶⁷Ga mit einem 30-keV-Fenster, das das 93-keV-Photopeak überlappte, gezählt wurde. Diese Ein stellungen ergaben in weniger als 10% reziproke Beiträge der Radioaktivität.

Wie in Fig. 1 gezeigt wird, stiegen die Konzentrationen an ¹¹¹In-Anti-CEA unter Lokalisierung des Tumors während der Zeitdauer des Experiments ständig an. 23% der inji zierten Dosis war nach 72 h angesammelt, und aus den Er gebnissen kann man entnehmen, daß dieses Niveau sogar noch höher wäre, wenn noch spätere Proben genommen worden wä ren. Das Niveau im Blut nahm dagegen während dieses Zeit raumes ab. Die Leber zeigte eine schnelle Aufnahme nach 4 h, worauf sich dann eine Zeit mit wenig Veränderung an schloß und dann eine Erhöhung bis 72 h. Die anderen Gewebe zeigten wenig Veränderung während der Versuchsdauer.

Das Niveau an ⁶⁷Ga im Tumor blieb im Laufe des Versuches ziemlich konstant und lag bei etwa 1/4 des ¹¹¹In-Anti-CEA bei 72 h. Das Niveau von ⁶⁷Ga im Blut fiel ständig ab, während die Leberkonzentrationen ein Muster zeigten, das ziemlich ähnlich dem des ¹¹¹In-markierten Antikörpers war. Die Muskelkonzentration an ⁶⁷Ga fiel bis 48 h ab und ver lief dann gleichmäßig, während die Knochenkonzentrationen während der Zeit im wesentlichen gleich blieb.

Die Menge an Jodid in dem Tumor zeigte einen Peak nach 4 h und war anfangs etwas größer als die Menge an ¹¹¹Indium und nahm dann unregelmäßig während des weiteren Versuchs ab und betrug nur 1/10 der von ¹¹¹In bei 72 h. Zu dieser Zeit trat zweimal soviel ⁶⁷Ga in dem Tumor auf als ¹²⁵J. Die Zählrate für ¹²⁵J im gesamten Gewebe nahm sehr schnell vom Maximum bei 4 h ab und erreichte in einigen Fällen Hintergrundniveaus bei 48 h.

Die Exkretionsdaten (Fig. 2) zeigten einen ständigen An stieg in ¹¹¹In des Urins zwischen 24 und 72 h und er reichten ein Maximum von 14% der injizierten Dosis. Die Feceskonzentration an ¹¹¹In blieb bei 24 und 48 h ziem lich konstant und erhöhte sich nach 72 h auf 17%, während die Menge in den Eingeweiden verhältnismäßig konstant wäh rend der gesamten Periode blieb und niemals 5% der Dosis überstieg.

Das ⁶⁷Ga-Exkretionsmuster war ähnlich dem des ¹¹¹In, zeigte aber mehr Tracer in den Eingeweiden und in den Feces, als man bei ¹¹¹In feststellte und weniger im Urin.

Nahezu 60% der ¹²⁵J Radioaktivität wurde während der er sten 24 h im Urin eliminiert und 75% nach 48 h. Weitere 5% an ¹²⁵J gingen in der Feces verloren. Somit sind nach 72 h etwa 80% des ursprünglichen initiierten ¹²⁵J von dem Tier ausgeschieden worden. Die Chromatographie von ¹²⁵J im Urin zeigte, daß das meiste davon in Form freien Jodids vorlag, wobei eine zweite Spezies wahrschein lich freies ¹²⁵J, das mit irgendeiner anderen Verbindung als einem Protein in komplexer Form gebunden war, darstellte.

Fig. 3 zeigt die Daten für ¹¹¹In-markiertes Anti-CEA nach 48 h und vergleicht diese mit ¹¹¹Indiumcitrat und ¹²⁵IHSA.

Das ¹¹¹In-Citrat wurde zur Kontrolle für alles Indium verwendet, das aus dem Antikörper abgetrennt worden sein könnte, während das ¹²⁵IHSA als nichtspezifische Protein kontrolle verwendet wurde. Das ¹¹¹In-Anti-CEA zeigte ein viel differenzierteres Verteilungsmuster gegenüber dem ¹¹¹In-Citrat und konzentrierte sich im Tumor wirksamer um den Faktor 10. Die Aufnahme der beiden anderen Tracer durch die anderen Gewebe waren ebenfalls unterschiedlich. Die Tumorkonzentration an ¹²⁵IHSA betrug 20% der von ¹¹¹In- Anti-CEA, war aber immer noch um 50% größer als die von ¹²⁵J-Anti-CEA. Die ¹²⁵IHSA-Verteilung in dem Nichttumorge webe ist ebenfalls sehr unterschiedlich von der des ¹¹¹In- Anti-CEA-Produktes. Es ist besonders bedeutsam, daß ¹²⁵IHSA, das lange als ein stabiles jodiertes Protein angesehen wurde, eine nahezu 60%ige Ausscheidung (43% davon im Urin) nach 48 h zeigte, was bemerkenswert mit der obigen Feststellung übereinstimmt, daß ¹²⁵J-Anti-CEA gleichfalls im Urin gefunden wurde. Die Urinfraktion stellt wahrschein lich freies Jodid dar.

Die Tumor/Gewebe-Verhältnisse (Fig. 4) zeigen ¹¹¹In-Anti- CEA als überlegen gegenüber ⁶⁷Ga hinsichtlich aller Ge webe mit Ausnahme von Blut und liegen in diesem Falle etwa gleich mit ⁶⁷Ga. Die ¹²⁵J-Anti-CEA-Verhältnisse sind zwar offensichtlich gegenüber solchen, die von ¹¹¹In und ⁶⁷Ga bei einigen Geweben gezeigt werden, vorzuziehen, führen aber dennoch auf eine falsche Fährte, weil sie von niedri gen ¹²⁵J-Niveaus im normalen Gewebe anstelle von einer Lo kalisation im Tumor stammen.

Aufgrund der vorhergehenden Versuche ist ¹²⁵J-Anti-CEA eindeutig als Tumorlokalisierungsmittel ungeeignet. Die schnelle und extensive Dehalogenierung erniedrigt die Tumortracerkonzentration und erhöht den Bluthintergrund und verbietet daher dessen Verwendung zum Krebsnachweis ohne komplizierte Subtraktionstechniken. Tatsächlich enthielt der Krebs nach 72 h die zweifache Menge des nichtspezifischen ⁶⁷Ga auf einer Pro-Gramm-Basis im Vergleich zu ¹²⁵J. Weiterhin sind die Tumor/Blut-Verhält nisse bei ⁶⁷Ga besser als bei dem jodierten Antikörper. Berücksichtigt man, daß ⁶⁷Ga als ungeeignet angesehen wird, Adenokarzinoma des Colon aufzuzeigen, so werden die Schwierigkeiten, die von Mach et al. in In. Eng. J. Med., 303, 5-10 (1980) berichtet werden, leicht verständ lich. Diese Daten, bei denen ¹²⁵J verwendet wurde, demon strieren eindeutig, daß ohne eine Subtraktionstechnik bei der Verwendung von ¹³¹J große Dosen von ¹³¹J-markier tem Material verabreicht werden müssen, um die erforder lichen Tumorkonzentrationen für einen wirksamen Nachweis zu liefern. Dies würde bedeuten, daß ein Patient eine hohe Strahlungsdosis erhält wegen der physikalischen Halb wertszeit von 8 Tagen und der 608 keV Beta-Komponente von ¹³¹J.

Im Gegensatz dazu ermöglicht der große Prozentsatz der injizierten Dosis an ¹¹¹In-Anti-CEA, die vom Tumor aufge nommen wird, und die günstigeren physikalischen Eigenschaf ten von ¹¹¹In die Injektion von niedrigeren Mengen an Radio pharmazeutika, während die Nachweisbarkeit verbessert und die Strahlungsdosis, welcher der Patient ausgesetzt ist, minimalisiert wird.

Die Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse, die von ¹¹¹In-Anti- CEA gebildet werden, liegen in einem Bereich, der ausreicht, um den Nachweis zu ermöglichen, und zwar wegen der großen Menge der Radionuklidlokalisation im Tumor. Weiterhin kann man den Daten entnehmen, daß der Tumor Radiomarkierungen aufgenommen hat, die einstmals in anderen Geweben inkorpo riert waren oder daran hafteten.

Einzelne Mäuse wurden 4, 24, 48 und 72 h nach der Injek tion von ¹¹¹In-markiertem Anti-CEA unter Verwendung einer Phogam H P Anger-gamma-Kamera photoradiologisch abgeta stet. Nach 48 h war der Tumor gut definiert, ohne daß man eine Subtraktionstechnik anwenden mußte. Nach 72 h war die Tumordefinition sogar noch verstärkt.

Es ist bekannt, daß CEA und einige andere tumorassoziierte Antigene durch den Tumor abgeschieden oder ausgebreitet wer den. In solchen Fällen kann das Auftreten von Hintergrunds strahlung, die dadurch verursacht wird, daß das im Blut oder in anderen Geweben zirkulierende Antigen sich mit mar kiertem Antikörper verbindet, reduziert werden, indem man zu Anfang unmarkierten Antikörper verabreicht, der sich mit dem zirkulierenden Antigen vereinigt. Dadurch könnte auch die hohe Leberaufnahme an markiertem Antikörper vermindert werden. Nach einer ausreichenden Zeit gibt man dann markier ten Antikörper zu, und das Subjekt wird radiophoto-untersucht, um die Stelle der lokalisierten Strahlung zu bestimmen.

Die vorhergehende Beschreibung hat die Verwendung eines ein zigen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers, der mit einem Radionuklid markiert ist, betont, aber es liegt im Bereich der Erfin dung, auch zusätzlich einen oder sogar mehr markierte monoklonale An tikörper zu verwenden, um unterschiedliche Antigenbestim mungen durchzuführen. Die verschiedenen Antikörper werden so ausgesucht, daß sie die Bindung des Antigens an einen anderen Antikörper nicht stören. Durch die Verwendung von mehreren nichtstörenden markierten Antikörpern kann die Nachweisbarkeit des Tumors noch vergrößert werden, weil das Antigen eine höhere Kapazität für den markierten An tikörper hat. Die Verwendung von mehreren Antikörpern ist besonders geeignet, um solche Tumore zu zeigen, deren assoziertes Antigen in einer niedrigen Konzentration vorliegt.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper zu carcinoembryonischem Antigen (CEA), dadurch gekennzeichnet, daß an den Antikörper ¹¹¹In mittels eines Chelatbildners, der mit dem Antikörper kon jugiert ist, gebunden ist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß der Chelatbildner ausgewählt ist aus Polyaminocarbonsäuren, Polyamino(alkylenphos phor)säuren, Polyaminen, Porphyrinen, Kronenethern, Cryptanden, Desferrioxamin B und Derivaten davon und Enterobaktinen und carbocyclischen Analogen davon.

3. Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß der Chelatbildner eine Poly aminocarbonsäure der folgenden Formel darstellt worin x 0 oder eine ganze Zahl, y 1 oder 2, z eine ganze Zahl von 1 bis 7 und R Wasserstoff oder eine Gruppe, durch welche der Chelatbildner mit dem Anti körper konjugiert ist, oder eine Gruppe, welche die Bindungskonstante des Chelatbildners für das Radio nuklid beeinflußt, bedeutet.

4. Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Polyamino(alkylen-phos phor)säure die Formel hat, worin x 0 oder eine ganze Zahl, y 1 oder 2, z eine ganze Zahl von 1 bis 7 und R Wasserstoff oder eine Gruppe, welche die Bindungskonstante des Chelat bildners für das Radionuklid beeinflußt, bedeutet.

5. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch ge kennzeichnet, daß R ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl, -CH₂C₆H₄OCH₂CO₂H und -C₆H₄-A, worin A ein Diazoniumsalz oder ein Vorläufer davon oder worin L eine während der Konjugation ausgestoßene Gruppe ist, bedeutet.

6. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekenn zeichnet, daß X=0 und R ist.

7. Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß X=1 und R ist.

8. Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß der Chelatbildner ausgewählt ist aus Ethylendiaminotetraessigsäure, p-Bromoacetyl amidodiphenyl(ethylendinitrilotetraessigsäure), 1-(p-Aminophenyl)-ethylendiaminotetraessigsäure und Diethylentriaminopentaessigsäure.

9. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer Lösung für die parenterale Verabreichung einen monoklonalen Antikörper zu CEA gemäß einem oder mehre ren der Ansprüche 1 bis 8 umfaßt.