DE3889851T2

DE3889851T2 - Verfahren und Materialien zur Herstellung der Lösungen von metallmarkierten Antikörpern.

Info

Publication number: DE3889851T2
Application number: DE3889851T
Authority: DE
Inventors: David K Johnson; Patrick E Rogers
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-11-06
Filing date: 1988-11-04
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2008-11-05
Also published as: EP0315188B1; ES2056875T3; DE3889851D1; JP3074160B2; AU2466488A; ATE106252T1; AU619218B2; EP0315188A2; EP0315188A3; JPH10330289A; KR890007756A; JP2792871B2; JPH01250327A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung verbesserter wäßriger Lösungen von Metallion/Chelator/Antikörper-Konjugaten und von Kits zur Durchführung dieser Verfahren; diese Konjugate sind für eine Vielzahl diagnostischer und therapeutischer Techniken nützlich.
In den letzten Jahren wurden bedeutende Fortschritte bei den Anstrengungen pharmazeutische Agentien herzustellen erzielt, die Konjugate von radioaktiven Isotopen und anderen Metallionen mit monoklonalen Antikörpern enthalten. Die Fähigkeit von monoklonalen Antikörpern, mit hoher Spezifität an ausgewählte Antigenepitope zu binden, liefert eine Möglichkeit, mit der bestimmte Metallionen selektiv in Richtung Zielgewebe geleitet werden können. Konjugate von radioaktiven Isotopen von Metallionen mit monoklonalen Antikörpern, die zur selektiven Bindung mit tumorösen und anderen Krankheiten zugeordneten Antigenen fähig sind, sind besonders nützlich zur Verwendung in diagnostischen bildgebenden Verfahren und radiotherapeutischen Aufzeichnungen für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten wie Krebs.
Wo Antikörper-Metallion-Konjugate für die therapeutische Bereitstellung von zytotoxischer Strahlung verwendet werden sollen, wird als Metall grundsätzlich ein Betateilchen-Emitter wie Yttrium gewählt. Order, u.a. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 12, 277-81 (1986) beschreiben die Behandlung von Leberzellenkrebs mit antiferritin-polyklonalen Antikörpern, an die &sup9;&sup0;Yttrium chelatisiert ist. Buchsbaum, u.a. Int. J. Nucl. Med. Biol., Jg. 12, Nr. 2, Seiten 79-82, offenbarten 1985 die radioaktive Markierung von monoklonalen Antikörpern gegen CEA mit &sup8;&sup8;Yttrium und schlugen die Möglichkeit der Lokalisierung und Behandlung von colorektalen Krebsarten damit vor. Nicolotti, EPA-Anmeldung 174 853, veröffentlicht am 19. März 1986, offenbart Konjugate aus Metallionen und Antikörperfragmenten. Gemäß dieser Veröffentlichung werden monoklonale Antikörper der Unterklasse IgG enzymatisch behandelt, um das Fc-Fragment zu entfernen und die Disulfidbindung reduktiv aufzubrechen, die die schweren Antikörper-Ketten verbindet. Das Fab'-Fragment wird anschließend mit einem Chelatbildner verbunden, der wiederum an ein radioaktives Metallion gebundenen ist, für diagnostische und therapeutische Zwecke in-vivo.
Wo Antikörper-Konjugate für die Zwecke von diagnostischen durch Radiographie bildgebenden Verfahren (Radioimmunoszintigraphie) verwendet werden sollen, wird am besten ein Gammastrahlen emittierendes Radioisotop gewählt. Goldenberg, u.a., N. Eng. J. Med., 298, 1384-88 (1978) veröffentlichten diagnostische sichtbarmachende Experimente, in denen Antikörper für das bekannte tumorzugeordnete Antigen Carcinoembryonisches Antigen (CEA) mit ¹³¹Iod markiert und Patienten, die an Krebs erkrankten, injiziert wurde. Nach 48 Stunden wurden die Patienten mit einer Gamma- Szintillationskamera abgebildet und die Tumore wurden durch das Gammastrahlungsmuster lokalisiert. Gansow, u.a., U.S. 4 454 106 offenbart die Verwendung von monoklonalen Antikörper/Metallion-Konjugaten für in-vivo radiobildgebende Diagnoseverfahren.
U.S. Patent No. 4 472 509, Gansow, u.a., offenbart die Verwendung von Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) Chelatbildnern für die Bindung von radioaktiven Metallen an monoklonale Antikörper. Das Patent zielt insbesondere auf ein Reinigungsverfahren zur Entfernung von nicht gebundenem und zufällig gebundenem (nicht chelatgebundenen) Metall aus Radiopharmazeutika, ist jedoch beispielhaft für derzeit anerkannte Verfahrenstechniken zur Herstellung von Pharmazeutika mit radioaktiven Isotopen. Entsprechend solcher allgemeiner Verfahren wird ein Antikörper, der spezifisch mit dem, einem Zielgewebe zugeordneten, Antigen reagiert, mit einer Menge eines ausgewählten bifunktionalen Chelatbildners mit Proteinbindungs- und Metallbindungsfunktionen umgesetzt, um ein Chelator/Antikörper-Konjugat herzustellen. Bei der Verbindung von Antikörpern mit den Chelatoren wird ein Überschuß an Chelatbildnern mit den Antikörpern umgesetzt, wobei das spezifische Verhältnis von der Natur des Reagens und der gewünschten Anzahl von Chelatbildnern je Antikörper abhängig ist. Gansow, u.a., berichten von Chelator-Antikörper-Verhältnissen von 100:1 bis 600:1, die besonders nützlich bezüglich eines Systems zum Erhalt von etwa 0,5 bis 1,5 gebundenen Chelatoren je Molekül sind. Die Warnhinweise sind jedoch zu beachten, wonach darauf geachtet werden muß, daß nicht so viele Chelatoren je Antikörpermolekül zugefügt werden, damit die Immunreaktionsfähigkeit des Antikörpers nicht nachteilig beeinflußt wird. Nach der Verbindung des Chelators mit den Antikörpern wird das Reaktionsgemisch gereinigt, um überschüssigen, zersetzten Chelator zu entfernen. Die oben zitierte Gansow-Quelle gibt die Reinigung durch Dialyse des Konjugatgemischs über einen Zeitraum von 48 Stunden gegen eine dreimal ausgetauschte Lösung aus 50 mM Citrat und 200 mM Natriumchlorid mit 1 ml Gelharz bekannt. Die Quellenangabe gibt außerdem eine fakultative erste Stufe der Dialyse bekannt, die gegen eine verdünnte Lösung aus Ascorbinsäure (30 mM) und Ethylendiamintetraessigsäure- (EDTA)-Chelatbildner (5 mM) ausgeführt werden kann "zur Entfernung des gesamten Resteisens, das in dem Chelat oder dem Protein enthalten sein kann".
Das gereinigte Chelator/Antikörper-Konjugat kann dann mit dem aktiven markierten Metall verbunden oder für späteren Gebrauch aufbewahrt werden. Eine Lösung von markiertem Metall wird aus einer Quelle wie einem Radioisotopgenerator oder einem Beschleuniger nach bekannten Verfahren bezogen. Die Metallchelatbildung wird anschließend in einer wäßrigen Lösung mit pH-Werten von etwa 3,2 bis etwa 9 ausgeführt, so daß die biologische Aktivität oder Spezifität der Antikörper nicht beeinträchtigt wird. Schwach chelatbildende Säuren und Basen wie Citronensäure und Glycin werden als Puffer verwendet. Die Metallionen werden im allgemeinen in Form von Metallsalzen wie Metallhalogeniden, -nitraten oder -perchloraten zugefügt, wobei Chloride bevorzugt werden. Die Quellenangabe empfiehlt, daß das Metallsalz in einer so hohen Konzentration wie möglich eingesetzt werden sollte, wenngleich angemerkt wird, daß beim Einsatz von radioaktivem Metall gesundheitliche und Sicherheitsbetrachtungen den Gebrauch einer Metallkonzentration unter einem Metalläquivalent je Chelatbindung empfehlen.
Gansow, u.a., behaupten, daß Metallion/Chelator/Antikörper-Konjugate, die so hergestellt wurden, grundsätzlich eine Reinigung vor ihrer Verabreichung in-vivo benötigen, um freies und zufällig gebundenes Metall zu entfernen. Das Patent offenbart verschiedene technische Verfahren einschließlich einer Kombination von Ionenaustausch und Gelfiltrationschromatographie. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt das Auftragen einer wäßrigen Lösung mit dem Konjugat auf eine chromatographische Säule mit zwei Schichten, wobei die erste Schicht aus einer Gruppe bestehend aus einem anionischen Austauscherharz, einem kationischen Austauscherharz und einem chelatbildenden Ionenaustauscherharz, und die zweite Schicht aus einer Trennmatrix besteht. Ein solches Verfahren soll zu Lösungen führen, die weniger als sechs Prozent (6 %) Verlust von Indium aufzeigen, wenn sie mit einem Puffer aus 20 mM 2-(N- Morpholin)ethansulfonsäure (MES) und 200 mM Natriumchlorid bei pH 6,0 dialysiert werden.
Viele Variationen der allgemeinen, oben angegebenen Verfahren sind bekannt für die kovalente Markierung von Antikörpern und Antikörperfragmenten mit metallchelatbildenden Komponenten. Zu solchen Verfahren gehören jene, bei denen die Markierung über ein gemischtes Anhydrid stattfindet, wie durch Krejcarek, u.a., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77, 581 (1977) offenbart, über ein bizyklisches Anhydrid wie durch Hnatowich, u.a., J. Immunol. Methods, 65, 147 (1983) bekanntgegeben, oder über einen aktiven Ester, wie durch Paxton, u.a., Cancer Res., 45, 5694 (1985) veröffentlicht.
Solche metallchelatmarkierten Antikörper wurden Patienten in mehreren Studien verabreicht, und bestimmte Eigenschaften wurden in der Technik als charakteristisch für das Verhalten dieser Konjugate im menschlichen Körper erkannt. Die am weitesten verbreitete Beobachtung war die, daß sich metallmarkierte Antikörper in der Leber in stärkerem Maße anreichern als Antikörper, die mit einem nicht metallischen Isotop wie Iod-131 markiert wurden (Larson u.a., Nucl. Med. Biol., 15, 231 (1988). Dieses Phänomen bildet die bedeutendste Einschränkung für den klinischen Gebrauch von metallmarkierten Antikörpern, da es oft den Nachweis von Tumoreinlagerungen in der Leber verhindert, die in vielen Fällen von Krebserkrankungen der bedeutendste Ort der Metastasenausbreitung ist (Larson u.a., Nucl. Med.. Biol., 15, 231 (1988) Beatty u.a., Cancer Res., 46, 6494 (1986) Beatty u.a., J. Surg. Onc., 36, 98 (1987) Abdel-Nabi u.a., Radiology, 164, 617 (1987)). Andere Charakteristika beziehen sich auf die pharmakokinetischen Eigenschaften von metallchelatmarkierten Antikörpern. Eine allgemeine Beobachtung war diejenige, daß Antikörper eine zweistufige Serumclearancekinetik aufzeigen mit relativ schnellem Verschwinden einer Fraktion der injizierten Radioaktivitätsdosis (als α-Phase bezeichnet), gefolgt von einer viel langsameren Clearance der restlichen Aktivität (β-Phase genannt) (Hnatowich u.a., J. Nucl. Med., 26, 849 (1985), Murray u.a., Cancer Res., 48, 4417 (1988), Murray u.a., J. Nucl. Med., 28, 25 (1987)). Das Verteilungsvolumen der injizierten Radioaktivität übersteigt oft das Plasmavolumen des Patienten, und sowohl Serumclearance (t1/2 ) als auch das Verteilungsvolumen hängen oft von der verabreichten Dosis an Antikörper ab. (Murray u.a., Cancer Res., 47, 4417 (1988), Carrasquillo u.a., J. Nucl. Med., 29, 39 (1988)). Die Nachweisempfindlichkeit für Tumorstellen hat in ähnlicher Weise eine Dosisabhängigkeit gezeigt (Carrasquillo u.a., J. Nucl. Med., 29, 39 (1988), Abdel-Nabi u.a., Radiology, 164, 617 (1987)). Diese Daten zeigen, daß das injizierte markierte Immunglobulin nicht ausschließlich im Plasma-Kompartiment zurückbleibt, wobei einstufige Serumkinetik und ein Verteilungsvolumen annähernd dem Plasmavolumen erwartet werden würden, sondern sich eher in weiteren Kompartimenten verteilt, was eine nicht-spezifische Akkumulation von Antikörpern in Nicht-Zielorganen wie der Leber darstellt. Diese Kompartimente sind in manchen Fällen absättigbar, und daraus resultiert die beobachtete Dosisabhängigkeit. Multi-Kompartiment-Kinetikmodelle wurden für die Bioverteilung von Antikörpern im menschlichen Körper entwickelt (Egan u.a., Cancer Res., 47, 3328 (1987)).
Die Verfahren von Gansow, u.a., wie auch diejenigen von anderen Wissenschaftlern auf diesem Gebiet, werden durch mehrere Befürchtungen bezüglich der Reinheit bei der Herstellung von Metallion/Chelatbildner/Antikörper- Konjugaten für in-vivo-Verabreichung bestimmt. Grundsätzlich sollte die Menge an radioaktivem Metall (im Unterschied zu anderen Metallverunreinigungen, die in der Konjugatlösung entweder in freier, zufällig gebundener, oder chelatgebundener Form vorliegen), mit dem das Zielgewebe versetzt wird, maximal sein. Ebenso sollte die Menge des Metalls mit radioaktiven Isotop, das Nicht-Zielgeweben zugefügt wird, minimal sein. Bei diagnostischen bildgebenden Aufzeichnungen ist dies der Fall als Folge des Wunschs, Hintergrundsignale zu minimieren. Bei zytotoxischen radiotherapeutischen Aufzeichnungen ist dies eine Konsequenz aus Befürchtungen bezüglich zytotoxischer Effekte auf Nicht- Zielgewebe. Eine weitere Besorgnis bezieht sich auf den Wunsch, daß die Quantität der Antikörper-Konjugate in diesen Aufzeichnungen minimiert werden sollte, damit die antigenischen Effekte der in-vivo-Einführung von Protein minimiert werden.
Das Ziel, maximale Quantität aktiven Metalls zum Zielgewebe zu führen, wird von vielen Faktoren beeinflußt. An vorderster Stelle stehen hierbei die Spezifität und die Aktivität des Antikörpers. Der Antikörper oder das Antikörperfragment, auf dem das Konjugat basiert, muß eine hohe Bindungsaktivität und -selektivität für das Zielantigen besitzen. Zusätzlich muß das Antigen, auf das der Antikörper spezifisch gerichtet ist, so gewählt werden, daß das Antigen eine hohe Spezifität für das Gewebe hat, auf das abgezielt wird, im Gegensatz zu anderen Geweben.
Wenn ein Antigen, das hochspezifisch für das Zielgewebe ist, und ein Antikörper mit hoher Aktivität und Selektivität für dieses Antigen vorliegen, dann besteht ein signifikantes Interesse, daß die Immunreaktionsfähigkeit des Antikörpers, der das Konjugat bildet, nicht auf Grund von irgendeiner chemischen Änderung während des Prozesses zur Bildung des Chelator/Antikörper-Konjugats oder während des metallchelatbildenden Schritts verringert wird. Eine chemische Änderung, die zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der immunologischen Aktivität führt, kann infolge hoher Temperatur, extrem saurem oder basischem pH-Wert oder infolge anderer chemischer Behandlung resultieren. Eine solche Änderung kann im Extremfall zu einer Denaturierung der Antikörpermoleküle führen. Eine weniger extreme Änderung als eine Denaturierung kann dann vorkommen, wenn die Proteinbindungsgruppen von bifunktionalen Chelatbildnern mit Aminosäureresten reagieren und binden oder bei Glykosylierung der Antikörpermoleküle derart, daß die spezifischen Bindungsbereiche des Antikörpers geändert oder räumlich blockiert werden. Je höher der Chelator-zu-Antikörper-Substitutionsgrad in einem beliebigen Chelator/Antikörpersystem ist, um so größer ist die Wahrscheinlichkeit, daß es zu solch einem Verlust an Immunreaktionsfähigkeit kommt.
Folglich sollte die Zuführung von radioaktivem Metall zum Zielgewebe maximal sein, während die Zuführung von radioaktivem Metall zu Nicht-Zielgewebe minimal sein sollte. Grundsätzlich ist radioaktives Metall, das zum Zielgewebe gelangt, fast ausschließlich durch einen Chelatbildner an einen für dieses Gewebe spezifischen Antikörper gebunden. Im Gegensatz dazu ist der Hauptanteil radioaktiven Metalls, das in Nicht-Zielgewebe gelangt, freies Metall, Metall, das kovalent an einen nicht dem Zielgewebe zugeführten Antikörper gebunden war oder zufällig gebundenes Metall, das sich vom Antikörper in-vivo gelöst hat. Radioaktives Metall, das zufällig gebunden oder frei in der Lösung vorliegt, wird oft nach der Verabreichung an den Patienten schnell an Serumtransferrin gebunden und nach und nach hauptsächlich auf Leber und Knochenmark verteilt und führt zu unerwunschter Nicht-Zielakkumulation des radioaktiven Metalls. Die Gegenwart von freien Metall in Verbindungen mit radioaktiven Isotopen für die In-vivo-Verabreichung ist von besonderem Interesse, dort wo die toxischen Effekte der Konzentrierung von solchen Metallen in der Leber oder anderen Nicht-Zielorganen die hauptsächlichen Einschränkungen für die Verwendung von solchen radioisotopischen pharmazeutischen Verbindungen darstellen.
Hinsichtlich jeglicher Verbindung für die Verabreichung in-vivo ist es besonders erwünscht, die Menge der Antikörper zu minimieren, die für die Bereitstellung einer Menge an radioaktivem Metall verwendet wird. Dies resultiert aus der Sorge um die Antigenität der Antikörper und Antikörperfragmente, die verwendet werden, um radioaktive Metalle zu liefern, und der Möglichkeit von Immunreaktionen gegenüber der pharmazeutischen Verbindung selbst. Anstrengungen um die Menge von eingeführten Antikörpern durch Erhöhung der Menge an Metallionen zu verringern, die an jeden Antikörper gebunden sind, werden gewöhnlich durch die Tendenz der Antikörper, zu denaturieren, oder ihre spezifische Bindungsaktivität bei erheblicher Substitution mit Chelatbildnernzu verlieren, begrenzt.
Ein bedeutender Faktor in Zusammenhang mit den verschiedenen Besorgnissen, die oben genannt wurden, bezieht sich auf die extrem hohen Konzentrationen von Verunreinigungen, die in radioaktiven Metall zusammensetzungen gefunden wurden, die für Konjugationen mit Chelator/Antikörper-Konjugaten erhältlich sind. Von Interesse für die vorliegende Erfindung ist die Veröffentlichung von Hnatowich, u.a., J. Immunol. Methods, 65, 147 (1983), die angibt, daß eine Antikörper/Chelator- Zusammensetzung mit einem Verhältnis von Chelator zu Antikörper von 1:1 und markiert mit einer typischen klinisch genutzten spezifischen Aktivität von 25 mCi/mg, nur 4 % der verfügbaren Chelatstellen durch Indium-111-Atome belegt hat. Die Metallverunreinigungen, die auf hohen Pegeln in verfügbaren radioaktiven Metallzusammensetzungen vorhanden sind, konkurrieren effektiv mit den radioaktiv markierten Metallen um die Bindungsstellen an dem Chelator/Antikörper- Konjugat. Die Gegenwart solcher Verunreinigungen erfordert den Gebrauch von Chelator/Antikörper-Konjugaten in weit größerer Menge als tatsächlich notwendig ist, um eine bestimmte Menge der reinen Metallmarkierung einfach zu chelatisieren. Die Notwendigkeit der Zugabe von größeren Mengen an Metallösung, um sicherzustellen, daß eine spezifische Menge radioaktiven Metalls chelatgebunden wird, ist unerwünscht, da dies zum Vorhandensein von größeren Mengen an freiem und zufällig gebundenem Metall führt, das grundsätzlich in einem Chelat gebunden oder aus der Konjugat-Lösung vor der Verabreichung in-vivo entfernt werden muß. Der Gebrauch von stark erhöhten Mengen von Chelator/Antikörper-Konjugaten, um genügend Markierer in Chelaten zu binden, ist außerdem wegen der erhöhten Antigenität der verabreichten Dosis unerwünscht.
Bemühungen zur Reinigung von radioaktiven Metallösungen vor der Chelatbildung mit der Konjugatlösung wurden offenbart als Bemühungen, das Ausmaß der Chelatbildung von freien Chelatorgruppen im Chelator/Antikörper-Konjugat vor der Markierung zu verringern. Meares, u.a., Anal. Biochem., 142, 68 (1984) legen die Herstellung von bifunktionalem EDTA-Analoga offen, die Isothiocyanat- und Bromacetamidderivate als substratreaktive Gruppen tragen. Die Chelator/Antikörper- Konjugate wurden mit Indium-111 und anderen Metallionen markiert. Die Quellenangabe gibt den Einsatz von ausgefeilten Vorsichtsmaßnahmen bekannt, um die Metallkontaminierung zu minimieren, wenn die Konjugatbildungs- und Kupplungsverfahren ausgeführt werden. Zu solchen Vorsichtsmaßnahmen gehören der Gebrauch von hochreinem Wasser, metallfreien Puffersalzen und säuregewaschenen Glasgegenstände, und diese Maßnahmen sind hilfreich zur Begrenzung der Konzentration von Metallverunreinigungen, die mit dem gewünschten Metall um die Chelatbildungsstellen konkurrieren. Die Quellenangabe gibt außerdem die Reinigung von kommerziell erhältlichen ¹¹¹InCl&sub3;-Lösungen durch Anionenaustauschchromatographie bekannt, um viele der kontaminierenden Metalle zu entfernen, die in der kommerziell erhältlichen Lösung vorhanden sind.
Entsprechend einem Verfahren offenbaren Meares, u.a., die Herstellung des Bromacetamid-Analogon von EDTA und seine Reaktion mit einer Mäuse-monoklonalen Anti-Transferrin- Rezeptor-Antikörper-Lösung bei einem molaren Verhältnis von 10:1. Nach der zweistündigen Inkubation bei 37ºC wurde das Reaktionsgemisch entfernt und auf eine Sephadex G-50-80- Zentrifugensäule aufgebracht, die mit 0,1 M Ammoniumcitrat (pH 6) vorbehandelt wurde. Es wurde eine Gelfiltration ausgeführt um ungebundenen Chelator zu entfernen. Das gereinigte Chelator/Antikörper-Konjugatprodukt hatte eine Konzentration von 9,5 x 10&supmin;&sup5; M, dies ergab mit einem Chelator/Antikörper-Verhältnis von 1,3:1 eine Chelatorkonzentration von 1,24 x 10&supmin;&sup4;.
Trägerfreie ¹¹¹Indium-Stammlösungen wurden präpariert durch Zufügen einer ¹¹¹InCl&sub3;-Lösung, gereinigt durch Behandlung an einer Bio-Rad AG1-X4-Anionenaustauschersäule, eingestellt mit 2 M HCl, zu einer Ammoniumcitratpufferlösung. Zwei aliquote Teile von 10 ul der ¹¹¹Indiumlösung wurden mit 5 ul-aliquoten Teilen der EDTA/Antikörper-Lösung gemischt und über Zeiträume zwischen 5 und 80 Minuten inkubiert. Eine konkurrierende Zugabe von EDTA wurde an Proben von Indium/Chelator/Antikörper- Konjugaten vorgenommen, um die Konjugatlösung von allem freien oder zufällig gebundenen Metall zu reinigen. Ein ul- aliquotes Teil der Konjugatlösung wurde mit 5 ul-Aliquoten einer 10 mM-Lösung von Na&sub2;-EDTA-Konkurrenzlösung zusammengebracht. Die so behandelten Lösungen wurden dann einem Dünnschichtchromatographieverfahren (TLC) ausgesetzt, durch das antikörpergebundenes Metall von freiem und chelatorgebundenem Metall getrennt wurde, um die Quantität des nicht spezifisch gebundenen Indiums zu bestimmen. Die Quellenangabe berichtete, daß die Menge von ungebundenem Indium, die auf der TLC-Platte transportiert wurde, lediglich 3 bis 5 % der Gesamtmenge des Indiums betrug, und dadurch angezeigt wurde, daß die radiochemische Ausbeute des Metallchelatbildungsverfahrens 95 bis 97 % betrug.
Meares, u.a., geben an, daß in Verfahren, bei denen das Metallion zuletzt nach der Darstellung eines Antikörper/Chelator-Konjugats zugefügt werden muß, es vorgezogen wird, daß die Konzentration von proteingebundenen Chelatgruppen größer als 10&supmin;&sup5; M ist, damit die zugefügten Metallionen schnell und quantitativ gebunden werden können. Die Quellenangabe erklärt, daß mit Antikörperkonzentrationen im Überschuß von 15 mg/ml (10&supmin;&sup4; M) die bevorzugten Bedingungen erhalten werden können.
Goodwin, u.a., J. Nuc. Med., 26, 493-502 (1985) geben eine weitere Arbeit der Meares-Gruppe bekannt, worin Bromacetamidobenzyl-EDTA zu Mäuse-monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für das bedeutende Mäuse-Histokompatibilitätskomplex-Alloantigen IAk sind, konjugiert wurde, entsprechend dem Verfahren von Meares, u.a., das bereits früher beschrieben wurde. Die Antikörper sind in einer Konzentration von 1,5 x 10&supmin;&sup4; M vorhanden, womit sich ein Chelator-zu-Antikörper-Verhältnis von 3,3:1 in einer 5 x 10&supmin;&sup4; M Chelatorkonzentration ergibt.
Die Radioaktive Markierung wurde durch Kombination von kleinen Aliquoten (10 bis 50 ul) des Antikörper/Chelator- Konjugats mit 50 ul-Aliquoten von gereinigtem ¹¹¹Indiumcitrat bei pH 5,0 erreicht. Es wurde mitgeteilt, daß die Chelatbildung des Indiums mit dem Chelator/Antikörper-Konjugat in weniger als 5 Minuten vollständig stattgefunden hatte. Die Quellenangabe gab an, daß die Indiummarkierung nicht anschließend aus dem Konjugat entfernt werden konnte, selbst mit einem mehr als tausendfachen Überschuß an konkurrierender EDTA. Die Effizienz der Markierung und die radiochemische Ausbeute wurden nach dem EDTA-Konkurrenz/Dünnschichtchromatographie- Verfahren von Meares, u.a., gemessen, wobei eine radiochemische Ausbeute von 85 bis 95 % angezeigt wurde. In einigen Experimenten wurde ungebundenes Metall mit einer EDTA-Matrize komplexiert. In anderen Experimenten wurde die Indium/Chelator/Antikörper-Lösung mit ungebundenem Metall in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit 0,1 % Humanserumalbumin, 0,1 M Natriumcitrat und 0,01 M EDTA verdünnt, wodurch freies Metall gebunden wurde, jedoch nicht vor der intravenösen Injektion entfernt wurde. Es versteht sich, daß die hinter der Zugabe von nicht konjugiertem Chelator zu einer Lösung stehende Theorie die ist, daß solche Agentien mit freien und zufällig gebundenen Metallen Chelate bilden, und daß die resultierenden Chelate, wenn sie in-vivo verabreicht werden, schnell aus der Zirkulation über die Nierenwege entfernt werden. Die Quellenangabe gibt Biodistributionsstudien für Tiere mit dem Indium/Chelator/Antikörper-Konjugat bekannt. Organdistributionsstudien nach 24 Stunden zeigten Aufnahmen durch die Milz von mehr als 100 % Dosis je Gramm des Organs für antigenpositive Mäuse an, obwohl die Aufnahmen durch die Milz niedriger waren für antigennegative Mäuse und in Systemen, in denen das Konjugat eine normale Mäuse-IgG enthält. Die Quellenangabe wies darauf hin, daß Indiumchelate die Stabilität gegenüber radioaktiven Iodpräparaten vergrößerten und daß solche Stabilitätsverfahren nicht nur die Zielkonzentration vergrößerten, sondern auch zu höherer nicht-spezifischer Blut- und Leberaktivität führten.
Für die vorliegende Erfindung ist die Veröffentlichung von Zoghbi, u.a., Invest. Radiol., 21, 710 (1986) von Interesse, die von Verfahren zur Reinigung von Indium-111 handelt. Die Quellenangabe gibt an, daß es eine große Variabilität in der Reinheit von kommerziell erhältlichem Indium gibt, und daß die Variabilität in der Quantität von durch Chelatoren wie DTPA (weit unter der Kapazität der Liganden) chelatgebundenen Indium erklärt werden kann durch die Gegenwart von kationischen Verunreinigungen wie Zink, Eisen und Aluminium in kommerziellen Indiumpräparaten und durch die Tatsache, daß die Chelatoren nicht spezifisch für Indium sind. Die Quellenangabe berichtet, daß ¹¹¹Indium, das nach einem durch die Quellenangabe veröffentlichten Lösungsmittel-Extraktionsverfahren gereinigt wurde, eine mehr als dreifache Zunahme der spezifischen Aktivität von ¹¹¹In-DTPA-monoklonalen Antikörpern gegenüber ¹¹¹Indium, das nicht gereinigt wurde, aufweist.
Spätere Quellenangaben von der Gansow-Gruppe offenbaren verschiedene Reinigungsverfahren nach dem Chelatbildungsschritt für die Indium/Chelator- Konjugatlösung. Brechbiel, u.a., Inorg. Chem., 25, 2772 (1986) und Esteban, u.a., J. Nucl. Med. , 28, 861 (1987), vergleichen mehrere unterschiedliche Verfahren zur Entfernung von ungebundenem ¹¹¹Indium aus dem monoklonalen Antikörper B72.3. Brechbiel, u.a., vergleicht (1) das EDTA- Chase-Verfahren von Goodwin, u.a., (2) die Gelsäulenchromatographie, (3) die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und (4) die Kombination aus Gelsäulenchromatographie und HPLC-Reinigung. Die Quellenangabe gibt an, daß die einfache Zugabe von freier EDTA zu der Verbindung nicht ausreichte, um das restliche nicht umgesetzte ¹¹¹Indium durch Sammeln in und Ausscheiden über die Nieren zu entfernen, daß stattdessen jedoch das Metall dazu tendierte, sich in der Leber anzureichern. Als bevorzugtes Verfahren zur Reinigung der Konjugatlösungen wurde der Durchgang durch eine Sephadex G-50-Säule mit nachfolgender HPLC-Reinigung über eine TSK-3000-Trennsäule genannt. Die Behandlung mit HPLC wurde als die einzige Methode zum Entfernen von "hochmolekulargewichtigen" Aggregaten wie quervernetzten Chelatkomponenten genannt. Die Quellenangabe empfiehlt den Gebrauch des stärkstmöglichen Chelatbildners in Verbindung mit milden Kupplungstechniken und der besten Reinigungstechnik.
Esteban, u.a. , J. Nucl. Med., 28, 861 (1987) lieferte die Beschreibung von zusätzlichen Reinigungs- und Biodistributionsstudien der Gansow-Gruppe mit dem B72.3- monoklonalen Antikörper. Chelator/Antikörper-Konjugate mit bifunktionaler DTPA und EDTA wurden in unterschiedlichen Substitutionsverhältnissen gebildet. Es wurde festgestellt, daß die Immunreaktionsfähigkeit der Antikörperchelate je nach molarem Verhältnis erheblich variiert, wobei die Konjugate 100% ihrer Immunreaktionsfähigkeit behalten, wenn sie mit unmodifizierter IgG bei einem Verhältnis von 1:1 verglichen werden. Chelator-zu-Antikörper-Verhältnisse von 3:1 oder größer führten zu einem Verlust von mehr als 50 % der Immunreaktionsfähigkeit. Biodistributionsstudien wurden mit indiummarkierten Konjugaten mit Chelator-zu-Antikörper- Verhältnissen von 1:1 durchgeführt. Die Quellenangabe bestätigte die Aussage der Quellenangabe von Brechbiel, u.a., daß der Gebrauch von EDTA im Überschuß zur Chelatbildung von freiem Metall in der Konjugatlösung geringe Reinigung mit Tumor-zu-Leber-Verhältnissen von weniger als 1,6:1 lieferte, während der Einsatz von markierten, durch HPLC gereinigten Konjugaten Tumor-zu- Leber-Verhältnisse von 4,6:1 ergab.
Für die vorliegende Erfindung sind die Quellen von Interesse, die sich mit den Bemühungen um die systematische Feststellung der größtmöglichen Zahl von Chelatgruppen beschäftigen, die in jedes Antikörpermolekül eingebaut werden kann. Paik, u.a. , J. Nucl. Med., 24, 1158 (1983) und J. Nucl. Med., 24, 932 (1983), veröffentlichen die Optimierung der bizyklischen DTPA-Anhydridkopplung an monoklonale Antikörper 17-1A, beziehungsweise die gemischte Anhydridkopplung von DTPA an einen monoklonalen Antikörper zu Humanserumalbumin. Im Allgemeinen haben jedoch Fachleute wenig Bedarf verspürt, die Substitutionsgrade über eine Chelatgruppe je Antikörpermolekül hinaus voranzutreiben, da Indium-111 bereits in trägerfreier Form erhältlich ist.
Diese unterschiedlichen Verfahren, die die Reinigung der Metallionenlösung vor der Markierung oder dem Einfangen oder der Reinigung der Metallion/Chelator/Antikörper- Konjugatlösung nach der Markierung beinhalten, sind zeitintensiv und schwierig unter Bedingungen durchzuführen, die die notwendige Sterilität und Apyrogenität für ein injizierbares Radiopharmazeutikum für den Einsatz beim Menschen gewährleisten. Darüberhinaus ist die Einrichtung, in der solche Radiomarkierungsverfahren für Antikörper routinemäßig geleistet werden sollen, üblicherweise eine klinische Nuklearapotheke, und solchen Einrichtungen fehlt häufig die Ausrüstung und ausgebildetes Personal, um die bevorzugten, dabei äußerst komplexen Nachreinigungstechniken, wie HPLC und Gelchromatographie, auszuführen.
Die Erfindung stellt verbesserte Methoden und Kits für die Herstellung von Metallion/Chelator/Antikörper- Konjugatlösungen bereit. Die Methoden der Erfindung können in Verbindung mit Radioimmunoszintigraphie verwendet werden und sind auch dazu gedacht, für eine Reihe von Anwendungen, einschließlich solcher wie in-vivo zytotoxischer Radiotherapie, hilfreich zu sein.
Insbesondere stellt die Erfindung Methoden für die Herstellung einer wäßrigen Lösung eines Metall/Chelator/Antikörper-Konjugats für den Gebrauch in diagnostischen und therapeutischen Verfahren bereit, die weniger als 5 % freie oder zufällig gebundene Metallionen ohne Reinigung nach der Chelatbildung enthalten, wobei das Verfahren den Schritt der Inkubation unter gewählten Bedingungen für die Chelatbildung von Metallionen enthält:
(1) eine erste Lösung von Chelator/Antikörper- Konjugat, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper enthält und eine Chelatorkonzentration größer als 10&supmin;&sup4; M aufweist und hergestellt wurde entsprechend dem Verfahren, umfassend
(a) das Aussetzen einer Lösung von Chelator/Antikörper-Konjugat mit im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper gegenüber einer Lösung von nicht konjugierten Chelatbildnern mit einer Konzentration größer als 0,01 M in einem schwachem Chelatpuffer,
(b) das Trennen des Chelator/Antikörper-Konjugats von der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners, und
(c) das Einstellen der Konzentration der an Antikörper gebundenen Chelatgruppen auf mehr als 10&supmin;&sup4; M und
(2) eine zweite Lösung von Metallsalz.
Es versteht sich, daß die Lösung von nicht konjugiertem Chelatbildner grundsätzlich das Agens sowohl in der Form von Chelatoren (metallfrei) als auch von Chelaten (metallgebunden) enthält. Der nicht konjugierte Chelatbildner, der der Chelator/Antikörper-Konjugatlösung in Schritt 1(a) ausgesetzt wird, ist am besten so frei von Metall wie möglich. Im Gegensatz dazu enthält die Lösung von nicht konjugiertem Chelatbildner, aus der die Konjugatlösung in Teil 1(b) abgetrennt wird, Anteile des Chelatbildners in metallgebundener Chelatform als Folge der Reinigung der Konjugatlösung von Metallverunreinigungen.
Das Verfahren der Erfindung läßt sich auf die Chelatbildung von radioaktiven Metallionen anwenden. Von besonderem Interesse ist ein Verfahren, bei dem das radioaktive Metall ¹¹¹Indium ist. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Lösung eines ¹¹¹Indium/Chelator/Antikörper-Konjugats mit weniger als 5 % freien oder zufällig gebundenen Metallionen bereit, die für die in-vivo-Verabreichung zur Radioimmunoszintigraphie geeignet ist. Das Verfahren ist hilfreich für die Herstellung zur Anwendung von Indiumagentien für die Radioimmunoszintigraphie, wobei Reinigungsschritte nach der Chelatbildung nicht notwendig sind, damit sich das Agens für die Verabreichung in-vivo eignet.
Entsprechend dem Verfahren wird eine erste Lösung von Chelator/Antikörper-Konjugat, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper enthält und eine Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4; M aufweist, und nach dem oben beschriebenen Verfahren behandelt wird, unter ausgewählten Bedingungen für die Chelatbildung von Indiumionen mit einer zweiten Lösung aus kommerziell erhältlichen ¹¹¹Indiumsalz, das durch eine Radioaktivität von mehr als 30 mCi/ml gekennzeichnet ist, zusammengebracht, wobei das Volumenverhältnis der ersten Lösung zur zweiten Lösung größer als 5 zu 1 ist und wobei die Lösungen für einen Zeitraum von weniger als 30 Minuten inkubiert werden. Das Volumenverhältnis der ersten Lösung zur zweiten Lösung sollte bevorzugt 5 zu 1 bis 20 zu 1 und am besten 7 zu 1 bis 15 zu 1 sein.
¹¹¹Indium/Chelator/Antikörper-Konjugatlösungen, die nach den oberen Verfahren hergestellt worden sind, sind durch die Fähigkeit gekennzeichnet, ohne weitere Reinigung 48 Stunden nach einer intravenösen Injektion in eine Nacktmaus nicht mehr als 10 % des Indiums je Gramm des Gewebes von Leber, Milz und Niere der besagten Maus aufzuweisen.
Die Erfindung liefert desweiteren "heiße" und "kalte" Kits für die Darstellung von injizierbaren Lösungen von metallmarkierten Antikörpern.
Kalte Kits entsprechend der Erfindung bestehen aus:
(1) einer sterilen, apyrogenen Lösung eines Chelator/Antikörper-Konjugats, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper enthält und eine Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4; M aufweist, und hergestellt wurde entsprechend dem Verfahren:
(a) Aussetzen einer Lösung von Chelator/Antikörper- Konjugat mit im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper gegenüber einer Lösung von nicht konjugierten Chelatbildnern mit einer Konzentration größer als 0,01 M in einem schwach chelatbildenden Puffer,
(b) Trennen des Chelator/Antikörper-Konjugats von der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners, und
(c) Einstellen der Konzentration der an Antikörper gebundenen Chelatgruppen auf mehr als 10&supmin;&sup4; M und
(2) einen Behälter, der die Sterilität und Apyrogenität der Lösung erhält, und eine Vorrichtung für die aseptische Einführung des Metalls und die aseptische Entnahme des markierten Antikörpers aufweist.
Heiße Kits entsprechend der Erfindung bestehen aus:
(1) einer sterilen, apyrogenen, wäßrigen Lösung eines Metallion/Chelator/Antikörper-Konjugats, die durch die Chelatbildung einer ersten Metallionenlösung mit einer zweiten Lösung eines Chelator/Antikörper-Konjugats hergestellt wurde, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper enthält und eine Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4; M aufweist, und hergestellt wurde entsprechend dem Verfahren:
(a) Aussetzen einer Lösung von Chelator/Antikörper- Konjugat mit im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper gegenüber einer Lösung von nicht konjugierten Chelatbildnern mit einer Konzentration größer als 0,01 M in einem schwach chelatbildenden Puffer,
(b) Trennen des Chelator/Antikörper-Konjugats von der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners, und
(c) Einstellen der Konzentration der an Antikörper gebundenen Chelatgruppen auf mehr als 10&supmin;&sup4; M und
(2) einem Behälter, der die Sterilität und Apyrogenität der Lösung erhält, und eine Vorrichtung für die aseptische Entnahme des markierten Antikörpers aufweist.
Insbesondere können die heißen Kits der Erfindung für den Gebrauch in der Radioimmunoszintigraphie hergestellt werden, wobei diese erste Lösung ¹¹¹Indium enthält und durch eine Radioaktivität von mehr als 30 mCi/ml gekennzeichnet ist, und wobei das Volumenverhältnis von dieser zweiten Lösung zu dieser ersten Lösung größer als 5 zu 1 ist.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Kits für die Herstellung von metallmarkierten Radiopharmazeutika für die Verwendung in der Radioimmunoszintigraphie und in der Radioimmunotherapie bereit. Die Erfindung stellt ein Metallspülverfahren für das Entfernen von freien oder zufällig gebundenen und chelatgebundenen Metallionen aus einer Lösung eines Chelator/Antikörper-Konjugates bereit. Dieses für Chelator/Antikörper-Konjugate mit verbesserter Metallmarkiererbindekapazität gelieferte Verfahren hat als eine Konsequenz reduzierte Pegel von freiem und zufällig gebundenem Metall und erhöhte Pegel von freien Chelatoren. Chelator/Antikörper-Konjugatlösungen mit Chelatorkonzentrationen von mehr als 10&supmin;&sup4; M zeigen unerwartete, verbesserte Eigenschaften, wenn sie dem Verfahren dieser Erfindung unterzogen werden. Die resultierenden Chelator/Antikörper- Konjugatlösungen sind durch eine hohe Metallbindekapazität gekennzeichnet und sind fähig, freie Metallionen schnell in einem Chelat zu binden, um bei der Inkubation unter chelatbildenden Bedingungen mit Lösungen von radioaktivem Metall, die typischerweise signifikante Pegel von Metallverunreinigungen enthalten, hohe radiochemische Ausbeuten zu erhalten.
Als ein Aspekt der Erfindung wurde entdeckt, daß Chelator/Antikörper-Konjugatlösungen mit Chelatorkonzentrationen größer als 10&supmin;&sup4; M, die dem Spülverfahren der Erfindung ausgesetzt worden sind, imstande sind, bei einer Inkubation von 30 Minuten oder weniger unter chelatbildenden Bedingungen mit kommerziell erhältlichen Indiumchloridverbindungen zu Lösungen von Indium/Chelator/Antikörper- Konjugaten mit einer radiochemischen Ausbeute von mehr als 95 % zu führen. Solche Verbindungen benötigen grundsätzlich keine weitere Reinigung, um für in-vivo-Verabreichung an Menschen geeignet zu sein. Die Wahl von Chelator/Antikörper- Konjugaten mit einer Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4; M basiert auf den folgenden Ergebnissen. Erstens gibt es für jedes gegebene Chelator/Antikörper-Konjugat, das unter festen Bedingungen markiert wurde, eine kritische Chelatorkonzentration, unterhalb der es unter diesen Bedingungen unmöglich ist, effektive Radiomarkierung zu erhalten, und oberhalb dieser akzeptable effektive Ausbeuten bei der Radiomarkierung erhalten werden. Dieser Grenzkonzentrationsbereich ist unerwartet eng, eine Verdopplung der Differenz von antikörpergebundenen Chelatgruppen korrespondiert oftmals mit einer Differenz zwischen einer voll akzeptablen radiochemischen Ausbeute (> 90 %) und einer vollständig inakzeptablen Ausbeute (20-30 (%). Zweitens, und noch unerwarteter, variiert diese kritische Grenzkonzentration gebundener Chelatoren von einem Antikörperkonjugat zum nächsten, selbst wenn der gleiche Chelator für die Herstellung von beiden Chelator/Antikörper- Konjugaten verwendet wird. Um eine zufriedenstellende radiochemische Ausbeute von einem allgemein anwendbaren Verfahren für jedes gegebene Antikörpersystem sicherzustellen, muß deshalb eine Konzentration von antikörpergebundenen Chelatoren gewählt werden, die weit außerhalb des für unterschiedliche Antikörper beobachteten kritischen Chelatorkonzentrationsbereichs liegt. Auf der Grundlage von zugehörigen Studien scheint es, daß etwa 10&supmin;&sup4; M solch eine molare Chelatorkonzentration bilden.
Die Fähigkeit zur Reaktion von Chelator/Antikörper- Lösungen mit Indium-Metallsalzlösungen in einem Einschrittverfahren zur Herstellung einer Indium/Chelator/Antikörper-Konjugatlösung, die für die in-vivo-Verabreichung an den Menschen geeignet ist, ist ein signifikanter Vorteil gegenüber dem Stand der Technik, indem es komplexe, teure und zeitintensive Reinigungsschritte nach der Markierung oder das Zufügen eines Reinigungschelators, der hierzu benötigt wird, vermeidet, um geeignete Materialien für die Verabreichung an den Menschen zu erhalten. Die Chelator/Antikörper-Konjugatlösungen der vorliegenden Erfindung haben desweiteren die Eigenschaft, daß wenn man sie mit Lösungen von Indium-Metallchlorid zur Herstellung von Indium/Chelator/Antikörper-Konjugaten umsetzt und diese in- vivo verabreicht, verringerte Indiumpegel in Leber, Milz und Nieren von Versuchstieren, die damit injiziert wurden, zu hinterlassen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Kenntnis von mehreren Einschräkungen von gegenwärtigen Verfahren für die Herstellung von Antikörper/Chelator/Metallion-Verbindungen. Eine Begrenzung bezieht sich auf die Antikörper-Chelator- Verbindungen, die unter Standardvoraussetzungen herge-stellt wurden, um Kontaminierung mit zufälligen Metallionen zu verhindern, und führt zu dem Ergebnis, daß selbst unter den bestmöglichen Voraussetzungen Metallkontaminierungen nicht vollständig bei der Präparationsphase des Konjugats eliminiert werden können. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt daher von Verfahren zur Entfernung von Restmetallkontaminierungen aus Antikörper/Chelator-Zusammensetzungen sofort nach der Herstellung.
Die Erfindung basiert außerdem auf der Beobachtung, daß, selbst wenn die Chelatgruppen in einer Antikörper- Chelator-Zusammensetzung vollständig frei von Metallkontaminierungen gemacht wurden, die während der Darstellung erworben wurden, die Menge an nicht radioaktivem Metall in vielen kommerziellen Radiometallverbindungen wie Indium-III-Chlorid so groß ist, daß sie effektiv um die freien Chelatstellen konkurrieren. Diese Konkurrenz ist bei einem Substitutionsgrad von einem Chelator je Antikörpermolekül ausreichend heftig, sodaß oftmals eine schlechte radiochemische Ausbeute resultiert.
Es wird damit gerechnet, daß die Chelator/Antikörper- Konjugatlösungen, die entsprechend der Erfindung hergestellt werden, verbesserte Eigenschaften aufzeigen, wenn sie mit anderen Metallionenverbindungen als ¹¹¹Indium inkubiert werden. Da die spezifische Chelatorkonzentration und die benötigte Inkubationszeit als Folge spezifischer Chelator- zu-Metall-Bindeaffinität und der Identität und Konzentration von Metallkontaminierungen, die in unterschiedlichen Metallionenverbindungen vorhanden sind, variieren können, wird damit gerechnet, daß die Chelator/Antikörper- Konjugatlösungen der vorliegenden Erfindung verbesserte radiochemische Ausbeuten in Bindungsverfahren mit anderen Metallen aufzeigen.
Chelator-Konjugatlösungen mit hoher Konzentration an metallfreien Chelatoren sind hilfreich nicht nur wegen ihrer Fähigkeit, zu hohen radiochemischen Ausbeuten zu führen, sondern auch wegen ihrer Fähigkeit, die Menge der benötigten Antikörper oder Antikörperfragmente zu minimieren, um eine spezifische Menge von radioaktiven Metall zu liefern. Dies ist dort bedeutend, wo die wiederholte Aussetzung gegenüber fremden Proteinen wahrscheinlich eine nachteilige immunologische Antwort hervorrufen würde.
Die Chelator/Antikörper-Lösungen der Erfindung mit hohen, freien Chelatorkonzentrationen werden hergestellt durch Maximierung der Konzentration der Chelator/Antikörper- Konjugate in Lösung und Maximierung des Substitutionsgrads von Chelator je Antikörper auf das größtmögliche, mit dem Erhalt der Antikörperaktivität und -spezifität zu vereinbarenden Maß. Selbst wenn Konzentration und Chelatorsubstitutionsgrad maximiert werden, ist es zusätzlich notwendig, daß die Chelator/Antikörper- Konjugatlösung dem Spülverfahren ausgesetzt wird, das die Lösung und das Chelator/Antikörper-Konjugat im wesentlichen frei von Metallen macht.
Die Maximierung der Konjugatkonzentration hängt primär von der Löslichkeit des Antikörpers ab, wobei Maximalkonzentrationen im allgemeinen bei etwa 10&supmin;&sup4; M liegen. Die genaue Konzentration wird jedoch von der spezifischen Natur des Antikörpers und des Chelatorsystems abhängen. Bei gegebener Maximierung der Chelator/Antikörper- Konzentration ist es im allgemeinen notwendig, den Durchschnittswert von Chelatkomponenten je Antikörper zu maximieren. Bei der Maximierung des Substitutionsgrads von Antikörpern muß jedoch besonders vorsichtig vorgegangen werden, um die Antikörperaktivität und -spezifität zu erhalten.
Fachleute werden erkennen, daß Antikörper stark differieren in ihrer Anfälligkeit, die Immunreaktionsfähigkeit während der chemischen Modifikation mit Chelatgruppen zu verlieren, und daß daher die maximale Zahl von Metallbindungsgruppen variiert, die ohne Verlust der Antikörperimmunreaktivierungsfähigkeit von Antikörper zu Antikörper eingeführt werden können. Innerhalb der durch das Vorhergehende auferlegten Zwänge werden trotzdem bestimmte Ausführungen für alle Antikörperzusammensetzungen bevorzugt. Zu den bevorzugten Zusammensetzungen gehören die mit einem Mittelwert von 2 bis 15 Chelatgruppen je Antikörpermolekül, wobei Zusammensetzungen mit 3 bis 5 Chelatoren je Antikörper besonders bevorzugt sind. Solche Zusammensetzungen werden bevorzugt erhalten bei einer hohen Antikörperkonzentration in einem schwach chelatbildenden Puffer, um die Markierung zu erleichtern. Bevorzugte Zusammensetzungen enthalten den Antikörper oder sein Fragment in einer Konzentration zwischen 5 mg/ml und 20 mg/ml in 0,01 bis 0,5 M Citratpuffer, pH 6,0.

Antikörper

Zu den Antikörpern, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, gehören unterschiedliche Typen einschließlich IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Die Antikörper können gegen eine Vielzahl von antigenischen Determinanten gerichtet sein, einschließlich derjenigen, die mit Tumoren, Gewebeverträglichkeits- und anderen Zelloberflächenantigenen, Bakterien, Pilzsporen, Viren, Enzymen, Toxinen, Drogen und anderen biologisch aktiven Molekülen assoziiert sind. Als ein bedeutender Aspekt der vorliegenden Erfindung gilt der Nachweis und die Behandlung von Tumoren; Antikörper, die spezifisch auf mit Tumor assoziierte Antigene reagieren, sind von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung. Zu den mit Tumoren in Verbindung stehenden Antigenen, auf die die Antikörper spezifisch reagieren, gehören Antigene, wie sie von Zalcberg und McKenzie, J. Clin. Oncology, Jg. 3, Seiten 876-82 (1985) beschrieben wurden, und schliessen, ohne auf diese beschränkt zu sein, karzinoembryonale Antigene (CEA), Muczine wie TAG-72, Humanmilchfettkügelchen-Antigene und Rezeptoren wie IL-2 und Transferrin-Rezeptoren ein. Antikörper, die diese Antigene erkennen, können monoklonal oder polyklonal sein oder durch Rekombinationstechniken, wie in Morrison, u.a. , Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851- 55 (1984) beschrieben, hergestellt sein.
Der Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet wird, beinhaltet auch Fragmente von Antikörpermolekülen einschließlich halber Antikörpermoleküle und Fab-, Fab'- oder F(ab')&sub2;-Fragmente.
Nicolotti, EP 174 853, veröffentlicht am 19. März 1986, gibt Verfahren bekannt, durch die ganze Antikörper behandelt werden, um ein seitenspezifisches Abspalten der zwei schweren Ketten durch Entfernen des FC-Teils der Carboxylenden der schweren Ketten zu bewirken.
Die Antikörper sollten in der Lage sein, im Mittel 2 bis maximal 15 Chelatgruppen je Molekül zu enthalten, obwohl Antikörper mit der Fähigkeit zur Anpassung von im Mittel 2 bis 5 Chelatgruppen je Molekül sich für die Verwendung mit der Erfindung eignen. Zu den bevorzugten Antikörpern gehören solche, die zur Aufnahme von im Mittel 3 bis 5 Chelatgruppen je Antikörper ohne nachteilige Beeinflussung der Immunreaktionsfähigkeit des Antikörpers fähig sind.

Chelatbildner

Eine breite Palette von Chelatbildnern kann entsprechend der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Da die spezifische Wahl des Chelatbildners abhängig ist von einer Zahl von Faktoren einschließlich der Identität des zu bindenden Metallions, sind eine Menge von Chelatbildnern grundsätzlich geeignet für die Verwendung mit der Erfindung. Solche Chelatbildner sollten hohe Bindungseffizienz haben und bifunktionale Derivate von Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthalten. Bifunktionale Derivate von DTPA, worin Para-Aminophenyl-Substituenten an die Methylenkohlenstoffe der Polyamin-Hauptkette angelagert werden, sind durch Brechbiel, u.a., Inorg. Chem., 25, 2772- 81 (1986) beschrieben. Bifunktionale Derivate von EDTA, die einen Para-Aminophenylprotein-reaktiven Substituenten tragen, sind durch Sundberg, u.a. , J. Med. Chem., 17, 1304 (1974) beschrieben. Besonders bevorzugte bifunktionale Derivate von DTPA und EDTA sind in EP-A-0 279 307 beschrieben.
Weitere Chelatbildner, die entsprechend der vorliegenden Erfindung hilfreich zu sein scheinen, umfassen die zyklischen Chelatbildner Cyclohexan-1,2-transdiamintetraessigsäure, Kroll, u.a. , Nature, 180, 919-20 (1957) makrozyklische Chelatbildner wie 6-(p-Nitrobenzyl)- 1,4,8,11-tetraazacyclotetradekan-N, N', N", N"'- tetraessigsäure (p-Nitrobenzyl-TETA), Moi, u.a. , Anal. Biochem., 148, 249-253 (1985) ein sechszähniger Ligand N,N'- Dipyridoxyl-ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (PLED), Green, u.a. , Int. J. Nucl. Med. Biol., 12, 381-86 (1985) und N,N'- Ethylen-bis[2-(o-hydroxyphenyl)glyzin] (EHPG) und N,N'- bis(2-Hydroxybenzyl)ethylendiamin-N,N'-Diessigsäure (HBED), Taliaferro, u.a. , Inorg. Chem., 23, 1188-92 (1984).
Zu den bevorzugten Chelatbildnern zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gehören vielzähnige Chelatoren auf der Basis der 8-Hydroxychinolin-Chelateinheit sowie mehrzähnige Chelatoren mit Hauptkettenstrukturen auf der Basis von Tris(2-Aminoethyl)amin (TREN).

Substratreaktive Funktionalitäten

Zu den bifunktionalen Chelatbildnern, die entsprechend der vorliegenden Erfindung nützlich sind, gehört eine substratreaktive Komponente, die fähig ist, an einer spezifischen Bindungsreaktion mit mindestens einer Funktionalität teilzunehmen, die in dem zu markierenden Antikörpermolekül vorhanden ist. Die substratreaktive Komponente kann mit Seitenkettengruppen aus Aminosäuren reagieren und die Polypeptid-Hauptkette bilden. Zu solchen Seitenkettengruppen gehören die Carboxylgruppen von Asparaginsäure und Glutaminsäureresten, die Aminogruppen von Lysinresten, die aromatischen Gruppen von Tyrosin und Histidin und die Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten.
Carboxylseitengruppen, die durch den Antikörper dargestellt werden, können mit aminsubstratreaktiven Komponenten von bifunktionalen Chelatbildnern durch eine lösliche Carbodiimidreaktion umgesetzt werden. Aminoseitengruppen, die durch einen Antikörper dargestellt werden, können mit Isothiocyanat, Isocyanat oder Halotriazin-substratreaktiven Komponenten umgesetzt werden, um eine Vernetzung vom Chelator zum Polypeptid zu erreichen. Alternativ können Aminoseitengruppen des Antikörpers mit bifunktionalen Chelatbildnern, die aminsubstratreaktive Komponenten tragen, durch bifunktionale Agentien wie Dialdehyde und Imidoester vernetzt werden. Aromatische Gruppen in einem Antikörper können mit den Chelatbildnern über ein Diazoniumderivat gekuppelt werden. Sulfhydrylgruppen an den Antikörpermolekülen können mit Maleinimiden oder mit Haloalkyl-substratreaktiven Gruppen wie Iodacetamid umgesetzt werden. Freie Sulfhydrylgruppen, die für solche Reaktionen geeignet sind, können aus den Disulfidbindungen der Immunoglobulinproteine erzeugt werden oder können durch chemische Derivatisierung eingeführt werden. Vernetzung mit freien Sulfhydrylgruppen, die im intraschweren Kettenbereich von Immunoglobulinen erzeugt werden, interferieren nicht mit den Antigen-Bindungsstellen des Immunoglobulins, können jedoch den Antikörper für aktivierende Bindung unfähig machen.
Ein alternatives Verfahren zur Bildung einer Antikörper/Chelator-Vernetzung über die Polypeptid- Hauptkette besteht darin, eine kovalente Bindung mit den Carbohydratseitenketten des Glykoproteins zu bilden entsprechend solcher Verfahren wie die nach Rodwell, u.a. , U.S. No. 4 671 958. Dadurch können die Carbohydratseitenketten der Antikörper selektiv oxidiert werden, um Aldehyde zu bilden, die dann entweder mit aminsubstratreaktiven Gruppen umgesetzt werden können zur Bildung einer Schiffschen Base, oder mit Hydrazin, Semicarbazid oder Thiosemicarbazidsubstrat-reaktiven Gruppen umgesetzt werden können, um die entsprechende Hydrazon-, Semicarbazon- oder Thiosemicarbazon-Bindung zu liefern.
Eine alternative substratreaktive Komponente, die für die Bindung an Carbohydrate und Polysaccharide ohne die Notwendigkeit einer vorherigen Oxidation nützlich ist, ist die Dihydroxyborylkomponente. Diese Komponente reagiert mit Substraten, die ein 1,2-cis-Diol enthalten, zu einem 5- gliedrigen zyklischen Boratester, und das ist nützlich für solche Carbohydrate, Polysaccharide und Glycoproteine, die diese Gruppe enthalten.
Zu den substratreaktiven Komponenten, die nützlich sind zusammen mit Chelatbildnern gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung, gehören Amino (-NH&sub2;), Diazonium (-NN&spplus;), Isothiocyanat (-NCS), Isocyanat (-NCO), Hydrazin (-NHNH&sub2;), Semicarbazid (-NHCONHNH&sub2;), Thiosemicarbazid (-NHCSNHNH&sub2;), Haloacetamid (-NHCOCH&sub2;X) einschließlich Chlor-, Brom- und Iodacetamid, Azide (-N&sub3;), Carboxylat (-CO&sub2;H), Aminoalkylharnstoff (-NHCONH(CH&sub2;)nNH&sub2;), Aminoalkylthioharnstoff (-NHCSNH(CH&sub2;)nNH&sub2;), Carboxyalkylharnstoff (-NHCONH(CH&sub2;)nCO&sub2;H) und Carboxyalkylthioharnstoff (-NHCSNH(CH&sub2;)nCO&sub2;H), Maleinimid, Halotriazin einschließlich Chlor-, Brom- und Iodtriazin und Meta-(Dihydroxyboryl)phenylthioharnstoff (-NHCSNHC&sub6;H&sub4;B(OH)&sub2;). Weitere reaktive Komponenten, die für die Bindung der Chelatbildner an Antikörper geeignet sind, umfassen Disulfide, Nitrene, Sulfonamide, Carbodiimide, Sulfonylchloride, Benzimidate, OCH&sub3; und -SO&sub3;H. Die bevorzugte substratreaktive Komponente für jede einzelne Anwendung dieser Erfindung wird durch die Natur des Antikörpers und seine Anfälligkeit für den Verlust der biologischen Aktivität wegen der Bildung eines bestimmten Bindungstyps diktiert.
Die substratreaktiven Komponenten, die für die Erfindung nützlich sind, können entsprechend einer Vielzahl von Möglichkeiten dargestellt werden, es wurde jedoch herausgefunden, daß sie besonders effektiv sind, wenn sie in der meta- oder para-Position an einer Phenylgruppe ausgerichtet sind, die durch eine aliphatische Spacergruppe an das chelatbildende Gerüst der Erfindung angehängt wird. Die Spacergruppe kann aus von einem bis zehn Kohlenstoffatomen bestehen und kann ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder substituiertes Alkyl sein, vorausgesetzt, daß die Verzweigungen oder Substituenten nicht die Metallbindungsstellen oder substratreaktiven Gruppen beeinflussen. Lineare Alkylbindungen werden nichtdestotrotz bevorzugt, mit C&sub1;-Alkylbindungen sogar besonders bevorzugt.
Antikörper werden mit den substratreaktiven Komponenten der Chelatbildner entsprechend der oben diskutierten Verfahren umgesetzt. Jeder Antikörper ist am besten durch mehr als einen Chelatbildner gebunden, wobei ein Chelator-zu-Antikörper-Verhältnis zwischen 2:1 und 5:1 bevorzugt wird und insbesondere ein Chelator-zu-Antikörper- Verhältnis zwischen 3:1 und 5:1. Der maximale Substitutionsgrad an einem Antikörper ist jedoch durch die Natur der Glykosylierung oder Zahl und Stellung von reaktiven Aminosäuren-Seitenketten am Molekül begrenzt. Da es erwünscht ist, daß die konjugierten Proteine ihre biologische Aktivität behalten, wird der Substitutionsgrad entsprechend der Natur und Stellung der Zielglykosylierung oder der Aminosäurereste, sowohl in der ersten als auch in der dritten Sequenz des Antikörpers, und ihrem Beteiligungsgrad an der Antigenbindungsstelle begrenzt sein.

Metallspülverfahren

Entsprechend einem Aspekt der Erfindung werden Verfahren bereitgestellt für die Entfernung von freien, zufällig gebundenen oder chelatgebundenen Metallionen aus den Lösungen von Antikörper/Chelator-Konjugaten vor der radioaktiven Markierung der Konjugatlösung. Diese Verfahren enthalten den Schritt Aussetzung der Antikörper/Chelator- Konjugatlösung gegenüber hohen Konzentrationen eines unkonjugierten Chelatbildners in einem schwach chelatbildenden Puffersystem, um kontaminierende Metallionen zu entfernen und die chelatbildenden Komponenten für die Bindung mit den Metallen der Metallmarkiererlösung verfügbar zu machen. Nach dem Aussetzen gegenüber dem unkonjugierten Chelatbildner wird das Chelator/Antikörper-Konjugat von der Lösung des unkonjugierten Chelatbildners abgetrennt.
Die Bedingungen sind während des Schrittes des Aussetzens der Lösung des Chelator/Antikörper-Konjugates gegenüber einem unkonjugierten Chelatbildner so gewählt, daß Metallionen, die in der Konjugatlösung vorhanden sind oder zufällig an den Antikörper gebunden wurden, entweder an den spezifischen Chelatstellen, die absichtlich eingeführt worden sind, oder an Stellen innerhalb des Immunoglobulinmoleküls, welches innere Metallbindungseigenschaften besitzt, durch den Chelatbildner ausgespült werden, um Chelate mit niederen Molekulargewichten zu bilden. Diese können dann vom Antikörper/Chelator-Konjugat durch geeignete Verfahren wie solche, die auf unterschiedlichen Molekülgrößen basieren, abgetrennt werden.
Eine bevorzugte Ausführung verwendet eine Dialyse gegen eine gepufferte Lösung von freiem Chelatbildner als günstige Möglichkeit, sowohl eine Spülung als auch eine Abtrennung zu bewirken, aber auch andere Verfahren wie Diafiltration oder Siebchromatographie können für diese Zwecke eingesetzt werden.
Der Chelatbildner muß, als Spülmittel verwendet, Metallkomplexe von ausreichender thermodynamischer und kinetischer Stabilität bilden, damit er effektiv mit den antikörpergebundenen Chelatgruppen konkurrieren kann. Wenn die Natur der kontaminierenden Metalle generell unbekannt ist, ist am besten ein Verfahren anzuwenden, bei dem als Spülmittel der gleiche Chelatbildner verwendet wird, der an den Antikörper angelagert ist. Im Fall eines EDTA- Antikörper-Konjugats ist daher freies EDTA als Spülmittel zu verwenden, während für ein DTPA-Antikörper-Konjugat freies DTPA verwendet wird, usw..
Um die Verlagerung von kontaminiertem Metall von antikörpergebundenen Chelatstellen zum nicht konjugierten Chelatbildner zu maximieren, wird letzterer bevorzugt in hohem Überschuß verwendet. Nützliche Konzentrationen von Spülchelatoren liegen im Bereich von etwa 0,01 M bis etwa 5 M oder höher. Die Lösung von nicht konjugierten Chelatbildnern hat bevorzugterweise eine Konzentration mindestens um eine Größenordnung höher und am besten um zwei Größenordnungen höher als die Chelatorkonzentration des Konjugates, um ein ausreichendes thermodynamisches Potential zur Entfernung der Metallionen zu erzeugen. Je höher die Konzentration an nicht konjugiertem Chelatbildner, umso zügiger das Entfernen von freiem und zufällig gebundenem Metall aus der Konjugatlösung. Die maximale Konzentration von nicht konjugiertem Chelatbildner ist nur begrenzt durch die Löslichkeit des Chelatbildners. Gleichzeitig gilt jedoch, daß, je höher die Konzentration von nicht konjugiertem Chelatbildner, umso extensiver und zeitaufwendiger ist der Schritt zur Trennung der Konjugatlösung von der des nicht gebundenen Chelatbildners. Aus praktischen Überlegungen heraus wird daher die maximale Konzentration von nicht konjugiertem Chelatbildner begrenzt. Bevorzugte Konzentrationen für die Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners liegen im Bereich von 0,05 M bis 1 M, wobei Konzentrationen von 0,1 M am besten sind.
Die Dauer des Extraktionsschrittes, während dessen das Chelator/Antikörper-Konjugat gegenüber dem nicht konjugierten Chelatbildner ausgesetzt ist, hängt von der Konzentration der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners ab. Lösungen mit geringerer Konzentration an nicht konjugiertem Chelatbildner brauchen längere Aussetzungs zeiträume gegenüber Chelator/Antikörper- Konjugatlösungen, brauchen jedoch weniger Zeit für die Extraktion. Lösungen mit höherer Konzentration an nicht konjugiertem Chelatbildner brauchen weniger Zeit für die Reinigung der Chelator/Antikörper-Konjugatlösung von freien und zufällig gebundenen Metallionen, brauchen dafür jedoch einen längeren Extraktionsschritt. Wo die Lösung von nicht konjugiertem Chelatbildner Konzentrationen von 1 M und mehr aufweist, kann der Reinigungsschritt, in dem die Lösung des Chelator/Antikörper-Konjugats der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners ausgesetzt wird, in weniger als 12 Stunden ausgeführt werden. Wo die Lösung von nicht konjugiertem Chelatbildner eine Konzentration am unteren Bereichsende aufweist, kann der Reinigungsschritt 72 Stunden und länger dauern. Wo ein bevorzugtes Verfahren nach dieser Erfindung eine Lösung von nicht konjugiertem Chelatbildner mit einer Konzentration von 0,1 M aufweist, wird diese Lösung am besten der Lösung des Chelator/Antikörper- Konjugats für einen Zeitraum von 48 Stunden ausgesetzt.
Das Metallspülverfahren wird in einem schwach chelatbildenden Puffersystem ausgeführt. Ein solches Puffersystem sollte eine ausreichende Chelatstärke haben, um Metallionen in Lösung zu halten und sie daran zu hindern, auszufallen, aber sie sollte nicht so stark sein, daß die Metallionen mit den nicht konjugierten Chelatbildnern konkurrieren. Bevorzugte Puffer für die Verwendung in EDTA- und DTPA-Chelatsystemen sind typischerweise durch Metallbindungsbildungskonstanten von 10&sup6; bis 10¹² gekennzeichnet, wobei Bildungskonstanten von 10&sup9; bis 10¹² am besten geeignet sind. Wo der verwendete Chelatbildner für die Bildung des Chelator/Antikörper-Konjugats oder die Reinigungslösung des nicht konjugierten Chelatbildners ein Chelator mit einer extrem hohen Bildungskonstanten ist, sollte die schwach chelatbildende Lösung eine höhere Bildungskonstante haben. Zu den schwach chelatbildenden Puffern, die besonders für die Verwendung mit EDTA- und DTPA-chelatbildenden Materialien bevorzugt werden, gehören Citrat, Acetat, Nitrilotriacetat und Glycin. Geeignete Konzentrationen für solche Puffer reichen von 0,01 M bis 0,5 M, wobei Konzentrationen von 0,01 bis 0,1 M besonders bevorzugt werden. Der pH-Wert der Lösungen kann von 4 bis 10 reichen, wobei die richtigen pH-Werte von der Identität der während des Reaktionsverfahrens anwesenden Komponenten abhängen und durch Fachleute festgelegt werden können.
Das Metallspülverfahren kann bei Temperaturen von 2ºC bis maximal 45ºC ausgeführt werden, wird jedoch bevorzugt bei geringen Temperaturen ausgeführt, um Denaturierung und Verlust der biologischen Aktivität des Antikörpers zu verhindern. Eine Behandlung im Temperaturbereich von 2ºC bis 8ºC wird besonders bevorzugt.
Nach der Reinigung der Lösung des Chelator/Antikörper- Konjugats durch Aussetzen gegenüber der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners ist es notwendig, das Chelator/Antikörper-Konjugat von der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners abzutrennen. Die Trennung kann auf vielfache Weise ausgeführt werden, was für Fachleute offensichtlich ist, sie wird jedoch bevorzugterweise durch Dialyse ausgeführt. Zu den alternativen Möglichkeiten gehören Chromatographietechniken oder andere Verfahren, bei denen für die Trennung von der unterschiedlichen Teilchengröße Gebrauch gemacht wird. Der benötigte Trennungsgrad hängt teilweise von der Konzentration des nicht konjugierten Chelatbildners ab, dem das Chelator/Antikörper-Konjugat ausgesetzt wurde. Wo Dialyse für die Trennung angewandt wird, wird im allgemeinen eine Dauer von mindestens 24 Stunden benötigt, um den nicht konjugierten Chelatbildner ausreichend zu entfernen. Wo die Chelator/Antikörper-Konjugatlösung durch Aussetzen gegen eine 0,1 M Lösung von nicht konjugiertem Chelatbildner gereinigt wird, wird eine Dauer von 24 bis 144 Stunden zur Trennung der Konjugatlösung vom nicht konjugiertem Chelatbildner benötigt.
Entsprechend einer Ausführung der Erfindung, in der eine Lösung von Chelator/Antikörper-Konjugat, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper besitzt und eine Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4; M aufweist, gebildet wird nach dem Verfahren von (a) Aussetzen einer Lösung von Chelator/Antikörper-Konjugat mit im Mittel 2 und mehr Chelatorgruppen je Antikörper gegenüber einer Lösung von nicht konjugiertem Chelatbildner mit einer Konzentration größer als 0,01 M in einem schwach chelatbildenden Puffer für einen Zeitraum größer als 12 Stunden, (b) Trennen des Chelator/Antikörper-Konjugats von der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners und (c) Einstellen der Konzentration der antikörpergebundenen Chelatbildnergruppe auf mehr als 10&supmin;&sup4; M, wird der Spülschritt bevorzugt durch Dialyse ausgeführt. Wo dies der Fall ist, wird die in Schritt (a) behandelte Lösung von Chelator/Antikörper- Konjugat bevorzugt gekennzeichnet durch eine Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4;. In solch einem Fall ist es im allgemeinen nicht notwendig, die Konzentration der Antikörper-Chelat-Gruppe auf einen Wert höher als 10&supmin;&sup4; M einzustellen. Wo in den Schritten Aussetzen und Trennen andere Verfahren verwendet wurden, kann es jedoch wünschenswert sein, den Aussetzungs- oder Trennungsschritt bei Verdünnungen auszuführen, so daß die Konzentration der Antikörper-Chelatgruppe kleiner als 10&supmin;&sup4; M ist. In diesen Fällen wird es notwendig sein, die Konzentration der Konjugatlösung so einzustellen, daß die Konzentration höher als 10&supmin;&sup4; M ist, damit die Lösung die unerwartet verbesserten Eigenschaften entsprechend der Erfindung aufweist.

Metallionen

Chelator/Antikörper-Konjugatlösungen mit hoher Metallbindungskapazität, die nach den Verfahren und den Lehren der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, können verwendet werden, um eine Vielzahl von Metallionen für unterschiedliche diagnostische, therapeutische oder andere Anwendungen zu binden. Da die Metallbindungsaktivitäten und -spezifitäten der Konjugatlösungen der Erfindung abhängig sind von der jeweiligen Identität des konjugierten Chelatbildners, ist es im allgemeinen so, daß Metallionen, die anfällig sind für Bindungen durch die Konjugate der Erfindung, eine Valenz von drei oder höher haben. Dies ist deshalb der Fall, da mono- und bivalente Metalle im allgemeinen keine genügend stabile Chelate für die Zwecke dieser Erfindung bilden.
Während in Betracht gezogene Anwendungen der vorliegenden Erfindung sich im allgemeinen auf die Chelatbildung von radioaktiven Metallionen beziehen, ist es natürlich auch möglich, daß die Materialien der Erfindung verwendet werden können, um eine Vielzahl von nichtradioaktiven Metallen zu binden. Zu den radioaktiven Ionen, die entsprechend der Erfindung chelatgebunden werden können, gehören Gammastrahlen emittierende Isotope, die nützlich sind für diagnostische Szintigraphie. ¹¹¹Indium mit einer Halbwertszeit von 2,8 Tagen ist besonders nützlich, während andere geeignete Gammaemitter &sup6;&sup7;Gallium, &sup6;&sup8;Gallium, und 99mTechnetium sind. Betastrahlenemitter, die als cytotoxische Agentien für die Radiotherapie nützlich sind, sind auch für diese Erfindung nützlich. Zu solchen Emittern gehören Isotope wie &sup4;&sup6;Scandium, &sup4;&sup7;Scandium, &sup4;&sup8;Scandium, &sup6;&sup7;Kupfer, &sup7;²Gallium, &sup7;³Gallium, &sup9;&sup0;Yttrium, &sup9;&sup7;Ruthenium, ¹&sup0;&sup0;Palladium, ¹&sup0;¹mRhodium, ¹&sup0;&sup9;Palladium, ¹&sup5;³Samarium, ¹&sup8;&sup6;Rhenium, ¹&sup8;&sup8;Rhenium, ¹&sup8;&sup9;Rhenium, ¹&sup9;&sup8;Gold, ²¹²Radium und ²¹²Blei. Weitere nützliche Metallionen für die Erfindung sind Alphastahlenemittermaterialien wie ²¹²Wismut, Positronemitter wie &sup6;&sup8;Gallium und &sup8;&sup9;Zirkonium, fluoreszierende Elemente der Lanthanoidenreihe wie Terbium und Europium und aus der Übergangsreihe wie Ruthenium und paramagnetische Materialien wie Gadolinium und Eisen.
Ein besonderer Vorteil der hohen Konzentration an freiem Chelator in Konjugatlösungen der vorliegenden Erfindung ist deren Fähigkeit, schnell komplexe Metallösungen mit einer hohen Bindungsausbeute zu bilden, so daß niedrige Pegel von freiem Metall in Lösung zurückbleiben. Die Konjugatlösungen sind derart, daß sie in der Lage sind, routinemäßig Ausbeuten von radioaktiven Bindungen von mehr als 95 % zu erreichen, wenn sie 30 Minuten oder weniger mit den relativ verunreinigten kommerziell erhältlichen radiochemischen Lösungen von ¹¹¹Indium inkubiert werden. Die spezifischen Bindungscharakteristika von anderen Metallen als Indium unterscheiden sich natürlich von denen für dieses Metall. Außerdem, und vielleicht noch wichtiger, enthalten Lösungen von anderen Metallen Metallkontaminierungen unterschiedlicherer Identitäten und in unterschiedlicherem Ausmaß als die Lösungen von kommerziell erhältlichem ¹¹¹Indium. Als Folge werden Konjugatlösungen mit höheren Konzentrationen an freien Chelatorgruppen benötigt um das Verfahren zur Herstellung von radioaktiv markierten Chelator/Antikörper-Konjugaten mit einer höheren radiochemischen Ausbeute als 95 % auszuführen, wobei die Lösung von radioaktivem Metall einen höheren Grad an Metallverunreinigungen aufweist.

Komplexbildung von Metallionen

Verfahren zur Bildung von Chelatbildner/Metallion- Konjugaten sind Fachleuten gut bekannt. Komplexe des Chelatbildners und von Metallionen können generell durch Inkubation des Chelatbildner/Substrat-Konjugats mit dem Metallion in einer gepufferten Lösung gebildet werden, in der das Konjugat physiologisch stabil ist. Zu den geeigneten Puffern gehören jene mit schwachen Metallbindungseigenschaften wie Citrat, Acetat oder Glycin. Geeignete Konzentrationen, Temperaturen und pH-Werte können durch Fachleute gewählt werden, um eher Metallionenbindung zu der chelatbildenden Funktionalität sicherzustellen als an schwache Bindungsstellen an den Substraten. Es ist besonders erwünscht, daß alle Lösungen frei von Metallverunreinigungen gehalten werden.
Unter einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zur Darstellung einer injizierbaren Lösung von metallmarkiertem Antikörper oder Antikörperfragment bereitgestellt. Dieses Kit enthält eine sterile, apyrogene Lösung eines Antikörper-Chelator-Konjugats, worin die maximale Zahl von Chelatgruppen je Antikörper in Übereinstimmung mit dem Erhalt von Immunreaktionsfähigkeit und Spezifität des Antikörpers steht, und die frei von kontaminierenden Metallen ist; das Konjugat ist bei hoher Konzentration in einem schwach chelatbildenden, leicht angesäuertem Puffer gelöst, und diese Lösung wird in einem sterilen, apyrogenen Behälter bereitgestellt, der geeignet ist für die aseptische Einführung von ¹¹¹Indiumchlorid und nachfolgender aseptischer Entnahme des ¹¹¹Indiummarkierten Antikörpers oder Antikörperfragmentes.
Die vorliegende Erfindung kann zusammen mit jedem Antikörper, polyklonal oder monoklonal, und mit Antikörper- Chelator-Konjugaten eingesetzt werden, die durch ein beliebiges bekanntes Verfahren hergestellt worden sind, vorausgesetzt, daß das Verfahren der Immunreaktionsfähigkeit des Antikörpers nicht schadet. Deshalb sind Zusammensetzungen nützlich, in denen die Chelatgruppe ein Amidderivat von DTPA ist, das an einen Antikörper entweder durch eine gemischte Anhydridreaktion, eine aktive Esterreaktion oder ein zyklisches Anhydridverfahren gekoppelt ist, wie es Konjugate sind, in denen die Chelatgruppe ein Benzylthioharnstoffderivat von EDTA oder DTPA ist, hergestellt durch Reaktion des Antikörpers mit dem entsprechenden Isothiocyanatderivat. Für Fachleute ist es offensichtlich, daß die hier beschriebenen Konzepte, Verfahren und Techniken auch anwendbar sind auf die Markierung einer großen Palette von weiteren Proteinen und biologisch aktiven Substraten mit ¹¹¹Indium und anderen Metallen und radioaktiven Metallen mit hoher radiochemischer Ausbeute.

BEISPIEL 1

In diesem Beispiel wurde ein monoklonaler Antikörper gegen ein karzinoembryonales Antigen (CEA) mit einem Benzylisothiocyanatderivat des Chelators DTPA zu einem hohen Chelatorsubstitutionsgrad derivatisiert. Das resultierende Antikörper/Chelator-Konjugat wurde gereinigt, um kontaminierende Metalle zu entfernen, und in eine Zusammensetzung für Indium-111-Markierung formuliert. Die radiochemische Ausbeute von Indium-111-markiertem Antikörper, der mit dieser Zusammensetzung erhalten wurde, wurde dann durch wiederholte Markierung mit Indium-111- Chlorid aus drei verschiedenen kommerziellen Quellen beurteilt.
Der IgG1-murine monoklonale Antikörper gegen CEA wurde mit N-(Carboxymethyl)-N-(2-aminoethyl)-N'-(carboxymethyl)- N'-(2'-bis(carboxymethyl)amino)-ethyl)(4-isothiocyanatophenyl)alanintrihydrochlorid, einem Benzylisothiocyanatderivat von DTPA, umgesetzt, wie ausführlich in EP-A-0 279 307 beschrieben. Das resultierende Konjugat wurde 24 Stunden lang bei 2ºC bis 8ºC gegen eine 0,1 M Lösung von DTPA in 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0, dann weitere 24 Stunden gegen 0,05 M Citrat, pH 6,0, dialysiert. Die Konzentration der Konjugatlösung wurde dann auf 5 mg/ml eingestellt und die Lösung in aliquoten Teilen in säuregewaschene Glasgefäße gebracht, die jeweils mit einem Gummiseptum abgedichtet wurden. Die Analyse eines Aliquots des Konjugats durch die Verfahren, wie sie in der obengenannten Anwendung beschrieben wurden, ergab, daß das Konjugat im Mittel 13 DTPA-Gruppen je Antikörpermolekül enthielt und die gesamte Immunreaktionsfähigkeit des nicht derivatisierten Antikörpers erhalten blieb.
Die Gefäße mit dem Antikörper/Chelator-Konjugat wurden bei 2-8ºC aufbewahrt, und im nachfolgenden Zeitraum von 146 Tagen wurde periodisch ein Gefäß aus dem Vorrat entnommen und durch Einführung von 5 mCi Indium-111-Chlorid (mit einem Konzentrationsbereich zwischen etwa 30 und 100 mCi/ml, wie es in allen hierin dargestellten Beispielen der Fall war) über eine Spritze markiert. Das Indium-111-Chlorid entstammte einer der drei Quellen: New England Nuclear, Billerica, Massachusetts (abgekürzt NEN) Medi+ Physics, Richmond, California (abgekürzt MP) und Atomic Energy of Canada, Ltd., Kanata, Ontario (abgekürzt AEC). Nach 30 Minuten Inkubation in dem Gefäß bei Raumtemperatur wurde die Ausbeute an Indium-111-markiertem Antikörper durch Dünnschichtchromatographie (TLC) nach einer DTPA-Matrize bestimmt, wie in Meares, u.a., Anal. Biochem., 142, 68 (1984) beschrieben. Insgesamt wurden 14 von diesen Markierungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Tage nach der Konjugatpräparation Quelle des Indium-111 Chlorids % Indium-Inkorporation im Antikörper
Die mittlere radiochemische Ausbeute von Indium-111- markiertem Antikörper über 14 Markierungen betrug 97,3 % (SE = 1,6 %), und der in EP-A-0 279 307 beschriebene ELISA- Test zeigte keinen Verlust an Immunreaktionsfähigkeit in allen markierten Präparaten.

BEISPIEL 2

In diesem Beispiel wurde monoklonaler Antikörper B 72.3, dessen Spezifität und Eigenschaften ausführlich von Schlom, u.a. , Int. J. Cancer, 29, 539 (1982) beschrieben wurde, mit einem Benzylisothiocyanatderivat von DTPA derivatisiert, gereinigt, um kontaminierende Metalle zu entfernen und in eine für Indium-111-Markierung geeignete Zusammensetzung formuliert. Wie in Beispiel 1 wurden anschließend wiederholt Indium-111-Markierungen durchgeführt, um die mittlere radiochemische Ausbeute zu bestimmen.
Der IgG1-murine monoklonale Antikörper B72.3 wurde mit dem Benzylisothiocyanatderivat von DTPA aus Beispiel 1 umgesetzt entsprechend der in EP-A-0 279 307 ausführlich beschriebenen Verfahren.
Das Molverhältnis von Chelatbildner zu Antikörper in der Kupplungsreaktion betrug 7,5:1. Das resultierende Konjugat wurde 24 Stunden lang bei 2ºC bis 8ºC gegen eine 0,1 M Lösung von DTPA in 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0, dann weitere 24 Stunden gegen 0,05 M Citrat, pH 6,0, dialysiert. Die Konzentration der Konjugatlösung wurde dann auf 5 mg/ml eingestellt und in aliquoten Teilen in säuregewaschene Glasgefäße mit einem Volumen von 1,0 ml je Gefäß gebracht. Die Gefäße wurden jeweils mit einem Gummiseptum abgedichtet und bei 2-8ºC aufbewahrt. Die Analyse eines Gefäßes der resultierenden B72.3-Zusammensetzung zeigte, daß diese im Mittel 5 DTPA-Gruppen je Antikörpermolekül enthielt und etwa 60 % der Immunreaktionsfähigkeit des nicht derivatisierten B72.3 erhalten blieb, gemessen durch das in der obengenannten Anwendung beschriebene ELISA-Verfahren.
Über einen Zeitraum von 58 Tagen nach der Präparation wurde die Zusammensetzung durch periodische Entnahme eines Gefäßes aus dem Vorrat und durch Einführung von 5 mCi Indium-111-Chlorid (AEC) geprüft. Nach 30 Minuten Inkubation in dem Gefäß bei Raumtemperatur wurde das Ausmaß der Indium- 111-Inkorporation in den Antikörper nach dem Verfahren von Meares, u.a. , bestimmt. Insgesamt wurden 9 von diesen Markierungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Tage nach der Konjugatpräparation % Indium-Inkorporation in Antikörper
Die mittlere radiochemische Ausbeute von Indium-111- markiertem B72.3 betrug 95,5 % (SD 1,5 %), und der ELISA- Test zeigte keinen Verlust an Immunreaktionsfähigkeit in den markierten Verbindungen bezogen auf den Wert vor der Markierung.

BEISPIEL 3

In diesem Beispiel wurde die Zusammensetzung aus Beispiel 2 weiter optimiert, um den geringen Verlust an Immunreaktionsfähigkeit bei einem Substitutionsgrad von 5 Chelatoren je Antikörper zu verhindern.
Eine Konjugation des Benzylisothiocyanats von DTPA zu monoklonalem Antikörper B72.3 wurde genau wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, außer daß das Molverhältnis von Chelator zu Antikörper 5:1 betrug. Das resultierende Konjugat wurde gereinigt und in aliquoten Teilen in Gefäße entsprechend der Verfahren aus Beispiel 2 gebracht. Eine nachfolgende Analyse ergab, daß diese Zusammensetzung im Mittel 3 DTPA-Gruppen je Antikörpermolekül enthielt und 100 % der Immunreaktionsfähigkeit des nicht derivatisierten B72.3 erhielt. Bei der Markierung mit Indium-111-Chlorid, wie in Beispiel 2 beschrieben, ergab diese Zusammensetzung eine radiochemische Ausbeute von 94 bis 97 %, wenn man sie nach dem Verfahren von Meares, u.a. , prüfte.

BEISPIEL 4

In diesem Beispiel wurde die Zusammensetzung aus Beispiel 3 mit Indium-111 markiert und ohne weitere Reinigung in Nacktmäuse, die ein Heterotransplantat der humankolorektalen Karzinomlinie LS174T trugen, injiziert. Die Biodistribution der Indium-111-Aktivität wurde dann 48 Stunden nach der Injektion bestimmt und diese Daten mit Literaturwerten verglichen, die durch Verwendung von Indium- 111-markierten B72.3-Zusammensetzungen erhalten worden waren, die einer Reinigung nach der Markierung unterzogen wurden, um nicht antikörpergebundenes Indium-111 zu entfernen.
Das in diesem Beispiel verwendete Mausmodell wurde ausführlich von Colcher, u.a. , Cancer Res., 44, 5744 (1984) und in der oben genannten Anmeldung beschrieben. Ein Indium- 111-markiertes Aliquot von der B72.3-Zusammensetzung aus Beispiel 3 mit einer spezifischen Aktivität von 1 uCi/ug wurde in die Schwanzvene von Nacktmäusen, die subkutane LS174T-Tumoren trugen, injiziert, in einer Dosis von 1 ug Antikörper je Maus. Nach 48 Stunden wurden die Mäuse getötet und die Radioaktivität in mehreren Geweben durch Zählen mit einem Gammazähler bestimmt. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Gewebe ¹¹¹In-B72.3(1) vorliegende Erfindung ¹¹¹In-B72.3(2) nach Sephadex-G-50 & TSK-3000 HPLC ¹¹¹In-B72.3 (3) nach TSK-250 HPLC Blut Tumor Leber Milz Niere Lunge (1) Angegebene Werte sind Mittelwerte (±SD) für n = 10. (2) Daten aus Esteban, u.a. , J. Nucl. Med., 28, 861 (1987). Angegebene Werte sind Mittelwerte (±SEM) für n =3 oder 4. ¹¹¹In-Markierung wurde über ein Benzylisothiocyanatderivat von DTPA erreicht. (3) Daten aus Brown, u.a. , Cancer Res., 47, 1149 (1987). Angegebene Werte sind Mittelwerte (±SD) für n = 5. ¹¹¹In-Markierung wurde über ein bizyklisches Anhydrid von DTPA erreicht.
Aus den Daten in Tabelle 3 geht offensichtlich hervor, daß die Indium-111-markierte B72.3-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein Biodistributionsmuster liefert, das vergleichbar ist, und manchmal sogar besser ist, als diejenigen Biodistributionsmuster, die mit anerkannten Indium-111-markierten B72.3-Zusammensetzungen, die einer extensiven Reinigung nach der Markierung unterzogen wurden, erhalten wurden. Die Blutpegel sind generell für alle drei Zusammensetzungen vergleichbar, ebenso wie die Tumoraufnahmewerte, die den hohen Variabilitätsgrad in Tumoren angeben, der sich in den Standardabweichungen wiederspiegelt. Signifikant ist, daß die Aufnahme in Organe des retikuloendothelialen Systems (primär Leber und Milz) in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung am geringsten ist, was vorteilhaft ist, da hohe Aufnahmen in diesen Organen ernsthafte Hintergrundprobleme in Szintigraphie-Untersuchungen verursachen. Die Ursache der relativ hohen Nierenaktivität bei beiden Zusammensetzungen nach bisherigem Stand ist unklar, obwohl dies die Indiumaktivität wiederspiegeln könnte, die vom Antikörper abgetrennt wurde und in der Niere durch den normalerweise bei der Resorption von endogenen Metallionen involvierten Mechanismus zurückblieb.

BEISPIEL 5

In diesem Beispiel wurde ein monoklonaler Antikörper A6H, der ein im Nierenzellenkarzinom vorhandenes Antigen erkennt und ausführlich in Vessella, u.a. , Cancer Res., 45, 6131 (1985) beschrieben wurde, bei unterschiedlichen Molverhältnissen mit einem Benzylisothiocyanatderivat von DTPA umgesetzt, um die optimale Zahl von Chelatgruppen zu ermitteln, die in dieses bestimmte IgG-Molekül ohne Verlust der Immunreaktionsfähigkeit inkorporiert werden konnte. Die resultierenden Konjugate wurden von kontaminierenden Metallen gereinigt, dann in Zusammensetzungen für Indium- 111-Markierung formuliert. Testmarkierungen wurden dann ausgeführt, um zu beurteilen, welches Konjugat akzeptable radiochemische Ausbeuten an Indium-111-markiertem A6H liefert.
Der IgG&sub1;-murine monoklonale Antikörper in einem 0,1 M KH&sub2;PO&sub4;/0,1 M NaHCO&sub3;-Puffer, pH 8,5, wurde 3 Stunden lang bei 37ºC mit unterschiedlichen Mengen des Benzylisothiocyanatderivates von DTPA umgesetzt. Die resultierenden Antikörper-DTPA-Konjugate wurden anschließend 48 Stunden lang bei 2ºC bis 8ºC gegen eine 0,1 M Lösung von DTPA in 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0, dann weitere 6 Tage bei 2 bis 8ºC gegen 0,05 M Citrat, pH 6,0, dialysiert. Die Konzentration jeden Konjugats wurde dann auf 5 mg/ml eingestellt und jedes Präparat wurde dann durch den Kobalt- 57-Bindeversuch von Meares, u.a. , Anal. Biochem., 142, 68 (1984) bewertet, um die mittlere Zahl der Chelatoren je IgG- Molekül zu erhalten, und durch den ELISA-Versuch auf Mikrotiter-Platten mit immobilisierten Nierenzellenkarzinomzellen bewertet, um die Immunreaktionsfähigkeit zu erhalten. Zuletzt wurden Testmarkierungen mit Indium-111- Chlorid (AEC) vorgenommen nach dem Verfahren aus Beispiel 1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Molverhältnis DTPA-SCN;IgG verwendet in der Konjugation Mittlere Zahl der DTPA-Gruppen je IgG-Molekül in der Konjugation % Immunreaktionsfähigkeit Radiochemische Ausbeute (%)
Es ist offensichtlich, daß die beiden Konjugate, die bei Molverhältnissen von Chelator zu Antikörper von 25:1 und 50:1 gewonnen wurden, akzeptable Zusammensetzungen für den Gebrauch ohne weitere Reinigung liefern.

BEISPIEL 6

In diesem Beispiel wurde ein IgG&sub1;-muriner monoklonaler Antikörper gegen die humane Lungen-Adenokarzinomzellinie, CALU-3, durch das Optimierungsverfahren aus Beispiel 5 aufgenommen. Der Antikörper in einem 0,1 M KH&sub2;PO&sub4;/0,1 M NaHCO&sub3;-Puffer, pH 8,5, wurde 3 Stunden lang bei 37ºC mit unterschiedlichen Mengen des Benzylisothiocyanatderivates von DTPA umgesetzt. Die resultierenden Antikörper-DTPA- Konjugate wurden anschließend 48 Stunden bei 2ºC bis 8ºC gegen eine 0,1 M Lösung von DTPA in 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0, dialysiert. Die Konzentration jedes Konjugats wurde dann auf 5 mg/ml eingestellt und jedes Präparat wurde dann durch den Kobalt-57-Bindeversuch, durch den ELISA-Versuch auf Mikrotiter-Platten mit immobilisierten CALU-3-Zellen und durch Testmarkierungen mit Indium-111-Chlorid entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1 bewertet. Die radiochemische Ausbeute des Chelator-zu-Antikörper-Konjugats von 6,0:1 wurde nach dem Verfahren von Meares, u.a. , bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5 Molverhältnis DTPA-SCN;IgG verwendet in der Konjugation Mittlere Zahl der DTPA-Gruppen je IgG-Molekül in der Konjugation % Immunreaktionsfähigkeit Radiochemische Ausbeute (%)

BEISPIEL 7

In diesem Beispiel wurde das F(ab')&sub2;-Fragment eines IgG&sub1;-murinen monoklonalen Antikörpers von CEA mit dem Benzylisothiocyanatderivat von DTPA derivatisiert, das für die Markierung der gesamten Antikörper entsprechend Beispiel 1 eingesetzt wurde. Das resultierende Fragmentkonjugat wurde gereinigt, um kontaminierende Metalle zu entfernen und auf eine geeignete Verbindung für die Markierung mit Indium-111 mit hoher radiochemischer Ausbeute eingestellt.
Das Fragment mit einer Konzentration von 5 mg/ml in einem 0,1 M KH&sub2;PO&sub4;/NaHCO&sub3;-Puffer, pH 8,5, wurde 3 Stunden lang bei 37ºC mit dem Benzylisothiocyanatderivat bei einem Molverhältnis von 40:1 umgesetzt. Das resultierende Fragment-DTPA-Konjugat wurde anschließend 48 Stunden lang bei 2ºC bis 8ºC gegen eine 0,1 M Lösung von DTPA in 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0, dialysiert. Die Konzentration des Chelator-Fragment-Konjugats wurde dann auf 5 mg/ml eingestellt. Eine nachfolgende Analyse zeigte, daß im Konjugat die gesamte Immunreaktionsfähigkeit des ursprünglichen (d.h. nicht derivatisierten) Fragments erhalten geblieben ist, und daß das Konjugat einen Mittelwert von 8 Chelatgruppen je F(ab')&sub2;-Molekül enthält. Eine Testmarkierung mit Indium-111-Chlorid unter den Bedingungen nach Beispiel 1 ergab eine radiochemische Ausbeute des Indium-111-markierten Fragments von 95 % bei der Nachprüfung mit dem TLC-Verfahren von Meares, u.a.

BEISPIEL 8

In diesem Beispiel wurde eine B72.3-DTPAZusammensetzung, wie in Beispiel 3 dargestellt, in ein "kaltes" Kit für die Darstellung einer injizierbaren Lösung von Indium-111-markiertem B72.3 umgesetzt. In diesem Zusammenhang bezeichnet kaltes Kit eine Zusammensetzung, die selbst nicht radioaktiv ist, bei der jedoch beabsichtigt ist, sie mit einem geeigneten Radioisotop unmittelbar vor der Injektion bei einem Patienten zu verbinden.
Eine Konjugat-Zusammensetzung entsprechend Beispiel 3 wurde unter sterilen Bedingungen mit Hilfe von depyrogenierten Puffern und Glasgerät hergestellt. Die resultierende Lösung wurde unter sterilen Bedingungen in 5 ml-Glasgefäße abgefüllt, die mit Säure gewaschen und in einem Autoklaven thermisch getrocknet und sterilisiert wurden. Die Füllmenge betrug 0,6 ml je Gefäß und die Konjugatkonzentration betrug 10 mg/ml. Jedes Gefäß wurde dann mit einem Gummiseptum abgedichtet, das durch Waschen mit Natriumhydroxidlösung depyrogeniert und in einem Autoklav sterilisiert wurde. Der Gummiverschluß wurde dann mit einer Metallzwinge am Gefäß abgedichtet. Jedes so präparierte Gefäß bildete dann ein geeignetes kaltes Kit für die Präparation einer Einzeldosis von Indium-111-markiertem B72.3, wenn es zusammen mit Indium-111-Chlorid, geliefert von einem Händler für Radioisotope, verwendet wurde.
Testmarkierungen wurden mit 5 mCi-Aliquoten einer Indium-111-Lösung an 11 dieser Kits über einen Zeitraum von 3 Monaten durchgeführt und radiochemische Ausbeuten wurden nach dem Verfahren von Meares, u.a. , bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Tabelle 6 Kit-Nr. In-111-Chlorid-Quelle Radiochemische Ausbeute (%)
Die Radioisotopen-Lieferanten wurden wie in Beispiel 1 abgekürzt. Die mittlere radiochemische Ausbeute an Indium- 111-B72.3 über alle 11 Markierungen betrug 96,5 % (SD = 2 %). Jede Indium-111-markierte Dosis wurde auf Pyrogenität gemessen durch den USP-Hasenpyrogentest und auf Sterilität durch Auskultivieren eines Aliquots des Materials. Alle 11 Präparationen wurden für steril und apyrogen befunden.

BEISPIEL 9

In diesem Beispiel wurde ein anti-CEA-monoklonales Antikörperkonjugat mit dem DTPA-Isothiocyanatderivat, präpariert wie in Beispiel 1 beschrieben, in ein heißes Kit für die Bereitstellung einer injizierbaren Lösung von Indium-111-markiertem Anti-CEA formuliert. In diesem Zusammenhang bezeichnet heißes Kit ein Radiopharmazeutikum, das dem Anwender in radioaktiver Form bereitgestellt wird. Daher benötigt ein heißes Kit im Gegensatz zu einem kalten Kit, das vor Ort durch den Anwender mit einem Radionuklid markiert werden muß, nur minimale Handhabung der Patientendosis durch die nukleare Pharmazie vor Ort. Heiße Kits werden typischerweise in großem Umfang an einer zentralen Stelle präpariert und auf Anfrage an den Endverbraucher verteilt. Dies erfordert wiederum, daß das radioaktiv markierte Material genügend Stabilität aufweist, damit es über einen vernünftigen Zeitraum auf Vorrat aufbewahrt werden kann. Für ein heißes Indium-111-Kit würde ein vernünftiger Produktionszeitplan die Präparation eines Satzes je Woche verlangen, so daß am Ende der 7-Tage- Lagerdauer das Produkt einen radioaktiven Zerfall von etwa 3 Halbwertszeiten durchlaufen hat. Deshalb bestand die Aufgabe darin, eine heiße Kitformulierung für Indium-111-markierten Anti-CEA zu entwickeln, der seine Immunreaktionsfähigkeit und stabile Bindungen der Indiummarkierung über einen Zeitraum von 7 Tagen nach der Markierung behält.
Das in dieser Untersuchung verwendete Anti-CEA-DTPA- Konjugat enthielt im Mittel 4 DTPA-Gruppen je Antikörper. Das Konjugat wurde gegen einen 0,05 M Citronensäure/0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer, pH 6,0, dialysiert und die Konzentration wurde auf 5 mg/ml eingestellt. Das Konjugat wurde anschließend mit Indium-111 durch Zufügen von Indium- 111-Chlorid und 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur markiert. Das resultierende Indium-111-markierte Anti-CEA- Präparat wurde in aliquoten Teilen in Gefäße mit einer Füllmenge von 1,0 ml/Gefäß abgefüllt. Die spezifische Anfangsaktivität betrug 22,32 mCi je 5 mg Antikörper. Da ein heißes Kit höhere spezifische Anfangsaktivität benötigt und die Zugabe von größeren Mengen ¹¹¹InCl&sub3; einen gehobenen Säuregrad in die Konjugatlösung einbringt, war es notwendig, einen Natriumbicarbonatpuffer in die Konjugatlösung aufzunehmen, um so den Verlust der immunologischen Aktivität als Folge des gesenkten pH-Wertes zu verhindern. Der Anteil von Indium-111, der spezifisch am Antikörper gebunden wurde, und die Immunreaktionsfähigkeit wurden mit dem Chelatorreizung/TLC-Versuch von Meares, u.a. , bzw. dem ELISA-Versuch, unmittelbar nach der Markierung und 1, 2, 3, 5 und 7 Tage danach gemessen. Die gewonnen Daten sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7 Tage nach der Markierung am Antikörper gebundenes Indium-111 in % Antikörper-Immunreaktionsfähigkeit (%)
Da die Markierungseffektivität und die Immunreaktionsfähigkeit der Verbindung über einen Aufbewahrungszeitraum von 7 Tagen in Lösung bei 2-8ºC unverändert erhalten blieb, und da sich die spezifische Aktivität nach 7 Tagen (4,01 mCi/5 mg) in akzeptablen Grenzen hielt, ermöglicht die Formulierung aus diesem Beispiel ein lebensfähiges heißes Kit für die Bereitstellung einer injizierbaren Dosis von Indium-111-Anti-CEA-Antikörper.

BEISPIEL 10

In diesem Beispiel wurde ein Anti-CEA-Konjugat mit dem Benzylisothiocyanatderivat von DTPA dargestellt, von kontaminierenden Metallionen gereinigt, und in eine Zusammensetzung für radioaktive Metallmarkierung umgesetzt. Die resultierende Verbindung wurde dann mit dem Gammastrahlen emitterenden Radionuklid Gallium-67 markiert. Ein Anti-CEA-DTPA-Konjugat wurde dargestellt und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende Material enthielt im Mittel 5 DTPA-Gruppen je IgG-Molekül und erhielt die gesamte Immunreaktionsfähigkeit des ursprünglichen Anti- CEA-Antikörpers. Dieses Konjugat wurde bei einer Konzentration von 5 mg/ml in einem 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0, mit Gallium-67-Chlord (New England Nuclear) durch Mischen von 0,1 ml der Konjugatlösung mit 0,5 mCi von Gallium-67 und Inkubation der resultierenden Lösung bei Raumtemperatur markiert. Aliquote der Lösung wurden 1 Stunde und 24 Stunden nach der Markierung entnommen und die radiochemische Ausbeute an Gallium-67-markiertem Antikörper wurde mit dem gleichen Chelatorreizung/TLC-Verfahren wie bei der Prüfung der Indium-111-markierten Konjugate bestimmt. Die Daten sind in Tabelle 8 aufgeführt. Tabelle 8 Stunden nach der Markierung %67Ga inkorporiert in Antikörper
Die radiochemische Ausbeute von 95 % 24 Stunden nach der Markierung wurde durch HPLC auf einer Bio-Rad-TSK-250- Trennsäule bestätigt. Es wird gefolgert, daß eine akzeptable Gallium-67-markierte Anti-CEA-Zusammensetzung erhalten wurde, die für die Verwendung ohne zusätzliche Reinigung nach der Markierung geeignet sein könnte.

BEISPIEL 11

In diesem Beispiel wurde der Einfluß der Konzentration von antikörpergebundenen Chelatgruppen auf die radiochemische Ausbeute an Indium-111-markiertem Antikörper für Konjugate bestimmt, die durch das Benzylisothiocyanatderivat von DTPA mit einem Anti-CEA- Antikörper und mit B72.3 gebildet wurden. Die Anti-CEA- und B72.3-Konjugate wurden präpariert und gereinigt wie in Beispiel 1 bzw. 2 beschrieben. Das Anti-CEA-DTPA-Konjugat enthielt im Mittel 5 DTPA-Gruppen je IgG-Molekül und hatte eine Anfangskonzentration von 5 mg/ml in 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0 (molare Konzentration von DTPA = 1,56 x 10&supmin;&sup4; M). Das B72.3-DTPA-Konjugat enthielt im Mittel 3 DTPA- Gruppen je IgG-Molekül und hatte eine Anfangskonzentration von 10 mg/ml in 0,05 M Citratpuffer, pH 6,0 (molare Konzentration von DTPA = 1,88 x 10&supmin;&sup4; M). Aufeinanderfolgende 2-fache Verdünnung jedes Konjugats wurde in 0,05 M Citrat, pH 6,0, als Lösungsmittel durchgeführt. Ein 0,1 ml Aliquot für jede der resultierenden Lösungen wurde mit Indium-111 durch Zugabe von Indium-111-Chlorid (NEN) und 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur markiert. Für B72.3 betrug die zugefügte Menge an Indium-111-Chlorid 9 ul (1,2 mCi), für Anti-CEA-Antikörper wurden 4,5 ul (0,6 mCi) der Indium-111- Aktivität verwendet. Die bei jeder Konzentration erhaltene radiochemische Ausbeute wurde anschließend durch das Chelatorreizung/TLC-Verfahren bestimmt. Die entsprechenden Daten sind in den Tabellen 9 und 10 aufgeführt. Tabelle 9 Molare Konzentration an anti-CEA-gebundenen DTPA-Gruppen Radiochemische Ausbeute an Indium-111-Anti-CEA (%) Tabelle 10 Molare Konzentration an B72.3-gebundenen DTPA-Gruppen Radiochemische Ausbeute an Indium-111-B72.3
Es ist bemerkenswert, daß es für jedes Konjugat einen engen kritischen Chelatorkonzentrationsbereich gab, in dem die Ausbeute an markiertem Antikörper dramatisch abfällt. Es ist außerdem bemerkenswert, daß sich diese kritische Konzentration signifikant für B72.3 (etwa 2 x 10&supmin;&sup5; M) und Anti-CEA-Antikörper (etwa 4 x 10&supmin;&sup6; M) unterscheidet. Es ist höchst unwahrscheinlich, daß diese Diskrepanz von der geringen Differenz der Indium-111-Quantität herrührt, die jedem Konjugat zugesetzt wurde (1,2 mCi gegenüber 0,6 mCi).
Die bildliche Darstellung von kleinen, malignen Veränderungen im Menschen zur Behandlung oder Heilung der Malignität ist die wichtigste Aufgabe der aktuellen Krebsbehandlung. Wenn eine maligne Veränderung oder ein Tumor in einem sehr frühen Stadium nachgewiesen werden kann, kann eine Behandlung durch Chirurgie, Chemotherapie, Bestrahlung oder andere Verfahren vorgenommen werden. Ein Verfahren zur Verwendung der vorliegenden Erfindung durch die Substitution eines zytotoxischen oder therapeutischen Agens durch die radioaktive, bildgebende Komponente des Konjugats ist eine weitere Behandlung, die bei der Heilung von Krebs nützlich sein kann. Die vorliegende Erfindung bildet kleine, maligne Veränderungen mit Tumormassen von etwa 0,5 cm Durchmesser ab.
Die bildliche Darstellung von malignen Veränderungen in der Leber mit radioaktiv markierten Metall-Chelat- Antikörpern ist besonders schwierig, da die Radioaktivität dazu neigt, sich im normalen Lebergewebe anzureichern und dadurch den Nachweis zu verhindern. Es wurde jedoch gezeigt, daß die Konjugate der vorliegenden Erfindung dieses Problem beseitigen, und wenn sie einem Patienten mit einer oder mehreren malignen Veränderungen verabreicht werden, zeichnen sie sich durch eine beständige Fähigkeit aus, diese krankhaften Veränderungen als positive Anreicherungen von Radioaktivität abzubilden. Desweiteren zeigen diese Konjugate eine Serumradioaktivitäts-Clearancekurve, die im wesentlichen einstufig über einen Zeitraum von 3 Tagen nach der Verabreichung verläuft.
Diese Konjugate oder bildgebenden Agentien sind außerdem durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet: ein Anfangsverteilungsvolumen und eine Serumclearancekurve, die von der Antikörperdosis unabhängig sind, eine Serum- Halbwertszeit von 20 Stunden bis zu 60 Stunden im Patienten und ein Anfangsverteilungsvolumen, das dem zirkulierenden Plasmavolumen des Patienten nahekommt.
Bei malignen Veränderungen in der Leber oder an anderen Stellen des Körpers, die CEA produzieren, kann als bildgebendes Agens der Wahl eine ¹¹¹Indium/DTPA- Isothiocyanat/Anti-CEA-Antikörper-Konjugatlösung, dargestellt entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1, angewendet werden. Es ist vorzuziehen, Patienten abzubilden, die einen Serum-CEA-Pegel von weniger als etwa 1000 ng/cc haben und noch günstiger, wenn der Serum-CEA-Pegel kleiner als 500 ng/cc beträgt. Ein Verfahren zur bildlichen Darstellung dieser krankhaften Veränderungen besteht aus den Schritten Verabreichung eines bildgebenden Agens an den Patienten, Abtasten des Patienten mit gängigen, konventionellen Abtastverfahren und anschließender Identifizierung dieser krankhaften Veränderungen oder Tumore.
CEA-Konjugatlösungen verlieren ihre Aktivität im Menschen, wenn sie nicht korrekt gehandhabt werden, besonders wenn sie eingefroren und wieder aufgetaut werden. Man vermutet, daß eine richtige Handhabung aller bildgebenden und therapeutischen Agentien der vorliegenden Erfindung notwendig ist, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erhalten.
Metallchelatmarkierte Antikörper wurden Patienten als Hilfsmittel in klinischen radioimmunologischen Nachweisuntersuchungen verabreicht, wie in den folgenden Beispielen gezeigt.

BEISPIEL 12

Patient 1 in Tabelle 11 wurde einem chirurgischen Eingriff zur Entfernung eines Adenokarzinoms des Sigmoidkolons unterzogen. Zum Zeitpunkt des ersten chirurgischen Eingriffs war das Bild einer Computertomographie (CT) des Bauchs negativ für Metastasenbildung.
Nach der Operation hatte der Patient einen CEA-Pegel im Serum von 7,6 ng/cc. Etwa drei Monate nach dem ersten chirurgischen Eingriff erreichte der CEA-Pegel im Serum des Patienten einen Wert von 23,5 ng/cc, während CT-Bilder weiterhin negative Befunde für Tumorstellen ergaben.
Dem Patienten wurde über einen Zeitraum von 20 Minuten 5 mg einer ¹¹¹Indium/DTPA-Isothiocyanat/Anti-CEA-Antikörper Konjugatlösung durch Infusion verabreicht, wie nach dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt. Ein Nuklearscan des Patienten zeigte eine Tumorstelle im linken Leberlappen. Diese wurde durch ein MRI-Scan verifiziert und subsequent chirurgisch entfernt. Postoperative CEA-Pegel sanken auf 1,3 ng/cc.

BEISPIELE 13 - 20

Tabelle 11 beschreibt die Krankheitsgeschichte der Patienten 1 bis 9. Das Fortschreiten der Krankheit für jeden Patienten entspricht grob gesehen der von Patient 1, wie in Beispiel 12 beschrieben.
Nachdem bei jedem Patienten in einem ersten chirurgischen Eingriff Karzinome entfernt wurden, kehrten die CEA-Pegel im Serum jedes Patienten postoperativ auf normale Werte zurück. Einige Zeit nach dem ersten chirurgischen Eingriff begannen die CEA-Pegel im Serum auf abnormale Werte zu steigen. Obwohl neue Tumore wegen des Anstiegs der CEA-Pegel im Serum vermutet wurden, waren konventionelle Abtasttechniken nicht in der Lage, die neuen Tumorstellen zu identifizieren.
¹¹¹Indium/DTPA-Isothiocyanat/Anti-CEA-Antikörper Konjugatlösungen der vorliegenden Erfindung wurden diesen Patienten verabreicht und neue Tumorstellen wurden identifiziert. Die neu identifizierten Tumore wurden chirurgisch oder durch Biopsie bestätigt. Tabelle 11 Anti-CEA-Konjugatlösungstest für nicht nachweisbaren Tumor primär Krebs erhöhter CEA-Pegel vor Scan (ng/cc) Konjugatdosis (5 mCi) Konjugat Scanergebnisse AC* des Sigmoidkolons AC* des Reaktosigmoids Rektalkarzinom 1 Herd-Leber 5 Herde im Brustbereich; Leberinfiltration 2 Herde, Präsakrum, Sakroiliakalgelenk AC* des Sigmoidkolons AC* des Rektums Rektumkarzinom Immunkomplex-Ablagerung; negatives Bild; multiple 3-4 cm Leber-Mts** 1 Beckenlymphknoten 1 Herd mutiple Mts**, Leber 1 Herd, Sakroiliakalgelenk 1 Herd, Leber *AC = Adenokarzinom **MTS = Metastasen

BEISPIEL 21

Obwohl vorzugsweise nur Patienten mit CEA-Pegeln von weniger als 1000 ng/cc mit diesem Verfahren abgebildet werden sollten, wurde auch an Patient 4 mit einem CEA-Pegel von 2546 ng/cc eine Untersuchung vorgenommen. Bei diesem Patienten war bekannt, daß er an einer schnell voranschreitenden Erkrankung litt, die von einem Adenokarzinom des Sigmoidkolons herrührte. Die prinzipiellen Ergebnisse waren eine stark verkürzte Serumhalbwertszeit (Tabelle 12) aufgrund der Bildung von Immunkomplexen und hoher Anreicherung von Radioaktivität in Leber und Milz. Trotzalledem waren mehrere krankhafte Veränderungen an der Leber als Füllungsdefekte im Abtastbild zu sehen, die später durch Biopsie bestätigt wurden.

BEISPIEL 22

Serumclearancezeiten und Verteilungsvolumen wurden für jeden der Patienten 1 - 9 berechnet und charakterisieren das kinetische Verhalten des Konjugats.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt. Tabelle 12 CEA-Pegel (ng/cc) Serumclearancezeit (T1/2) in Stunden Verteilungsvolumen (Liter)
Das Verschwinden der radioaktiv markierten Antikörper- Konjugatlösung aus dem Serum zeigt eine Eliminationskinetik erster Ordnung mit einer Halbwertszeit von 38 Stunden auf. Die Eliminationshalbwertszeit wurde bei CEA-Pegeln im Serum kleiner als 500 ng/cc nicht durch die verabreichte Dosis beeinflußt.

Claims

1. Ein Verfahren zur Darstellung einer wäßrigen Lösung eines Metall/Chelator/Antikörper-Konjugats für die Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Methoden, die weniger als 5 % freie oder zufällig gebundene Metallionen ohne Reinigung nach der Chelatbildung enthält, wobei das Verfahren den Schritt der Inkubation unter ausgewählten Bedingungen für die Chelatbildung von Metallionen umfaßt:

(1) eine erste Lösung von Chelator/Antikörper- Konjugat, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper enthält und eine Chelatorkonzentration größer als 10&supmin;&sup4; M aufweist, und hergestellt ist gemäß einem Verfahren umfassend:

(a) Aussetzen einer Lösung von Chelator/Antikörper- Konjugat mit im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper gegenüber einer Lösung von nicht konjugierten Chelatbildnern mit einer Konzentration größer als 0,01 M in einem schwachem Chelatpuffer,

(b) Trennen des Chelator/Antikörper-Konjugats von der Lösung des nicht konjugierten Chelatbildners, und

(c) Einstellen der Konzentration der an Antikörper gebundenen Chelatgruppen auf mehr als 10&supmin;&sup4; M; und

(2) eine zweite Lösung von Metallsalz.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Metall ein radioaktives Metall ist.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Metall ¹¹¹Indium ist.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite Lösung eine Lösung von kommerziell erhältlichem ¹¹¹Indiumsalz ist, gekennzeichnet durch eine Radioaktivität größer als 30 mCi/ml, und worin das Volumenverhältnis von der ersten Lösung zur zweiten Lösung größer als 5 zu 1 ist, und worin die Lösungen für einen Zeitraum weniger als 30 Minuten inkubiert werden.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 1, worin der Chelator aus der Gruppe, bestehend aus den Derivaten von Dietyhlentriaminpentaessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure, gewählt wird.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 1, worin der Antikörper aus der Gruppe, bestehend aus B72.3 und aus für das karzinoembryonale Antigen spezifischen monoklonalen Antikörpern, gewählt wird.

7. Ein Kit für die Darstellung einer injizierbaren Lösung von metallmarkierten Antikörpern bestehend aus:

(1) einer sterilen apyrogenen Lösung eines Chelator/Antikörper-Konjugats, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper enthält und eine Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4; M aufweist, und hergestellt ist gemäß einem Verfahren, umfassend:

(a) Aussetzen einer Lösung von Chelator/Antikörper- Konjugat mit im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper gegenüber einer Lösung von nicht konjugierten Chelatbildnern mit einer Konzentration größer als 0,01 M in einem schwach chelatbildenden Puffer,

(c) Einstellen der Konzentration der an Antikörper gebundenen Chelatgruppen auf mehr als 10&supmin;&sup4; M und

(2) einem Behälter, der die Sterilität und Apyrogenität der Lösung erhält, und Mittel für das aseptische Einführen des Metalls und aseptische Entnahme des markierten Antikörpers aufweist.

8. Ein Kit für die Darstellung einer injizierbaren Lösung von metallmarkierten Antikörpern bestehend aus:

(1) einer sterilen, apyrogenen, wäßrigen Lösung eines Metallion/Chelator/Antikörper-Konjugats, die durch die Chelatbildung einer ersten Metallionenlösung mit einer zweiten Lösung eines Chelator/Antikörper-Konjugats hergestellt wurde, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie im Mittel zwei oder mehr Chelatorgruppen je Antikörper enthält und eine Chelatorkonzentration von mehr als 10&supmin;&sup4; M aufweist, und hergestellt wurde gemäß einem Verfahren, umfassend:

(2) einem Behälter, der die Sterilität und Apyrogenität der Lösung erhält, und Mittel für die aseptische Entnahme des markierten Antikörpers aufweist.

9. Ein Kit nach Anspruch 8, worin die erste Lösung ¹¹¹Indium enthält und durch eine Radioaktivität größer als mCi/ml gekennzeichnet ist, und worin das Volumenverhältnis von der zweiten Lösung zur ersten Lösung größer als 5 zu 1 ist.