DE68925904T2

DE68925904T2 - Makrocyclische chelate und verwendungsverfahren

Info

Publication number: DE68925904T2
Application number: DE68925904T
Authority: DE
Inventors: Martin W. Annandale Va 22003 Brechbiel; Otto A. Washington Dc 20008 Gansow; Michael A. D-6238 Hofheim Magerstadt
Original assignee: United States Department of Commerce
Current assignee: United States Department of Commerce
Priority date: 1988-05-25
Filing date: 1989-05-24
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2009-05-25
Also published as: JPH07258281A; EP0416033A4; AU3210893A; AU630362B2; JP2582341B2; IL90409A; CA1339015C; JPH0720989B2; AU655704B2; ATE134999T1; EP0416033A1; EP0416033B1; IL90409A0; WO1989011475A1; AU3842889A; US5428154A; DE68925904D1; JPH03503531A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft makrocyclische Chelate und Verfahren zur Anwendung hiervon. Mehr spezifisch betrifft diese Erfindung 2-substituierte 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan- N,N',N'',N'''-tetraessigsäure und 2-substituiertes 1,4,7,10- Tetraazacyclododecan und analoge Makorcyclen und deren Verwendungen.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Makrocyclen wurden auf ihre Brauchbarkeit als Chelate für zahlreiche Metallionen untersucht, welche therapeutische, diagnostische oder andere Anwendungen besitzen. Ein Makrocyclus von besonderer Brauchbarkeit als ein Chelat ist 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA) DOTA-Verbindungen wurden an Biomoleküle gebunden, um Anlieferungssysteme für das chelatierte Metallion an spezifischen Plätzen innerhalb eines Organismus zu bilden.
Die US-A-4 678 667 von Meares et al. beschreibt ein makrocyclisches bifunktionelles chelatierendes Mittel. Die chelatierenden Mittel dieser Beschreibung können DOTA-Verbindung, welche ein Cu(II)-chelat ist, einschließen. Die Brauchbarkeit des chelatierenden Mittels ist auf die Effekte des Kupfermetallions beschränkt. Die Synthese dieser Beschreibung ergibt niedrige und nicht immer produzierbare Ergebnisse.
Die US-A-4 622 420 von Meares et al. beschreibt bifunktionelle chelatierende Mittel des acyclischen Liganden Ethylendiamin-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (EDTA), der brauchbar zum Binden von anderen Metallen als Kupfer wie Indium ist. Diese Verbindungen sind brauchbar zur Abbildung von Tumoren.
Die US-A-4 652 519 von Warshawsky et al. beschreibt bifunktionelle chelatierende Mittel und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Die in diesem Patent beschriebenen Verbindungen sind Analoge von EDTA. Diese Verbindungen werden zum Chelatieren von Metallionen verwendet und sie werden an Haptene gebunden, um eine spezifische Ortsauswahl innerhalb eines Organismus bereitzustellen. Die Verbindungen dieses Patentes werden angeboten, um einen verbesserten Substituenten für die EDTA-Verbindungen zu liefern, wie für diejenigen, welche in dem zuvorgenannten Patent von Meares et al. beschrieben sind.
Die US-A-4 454 106 und US-A-4 472 509 von Gansow et al. beschreiben die Verwendung von Metallchelat-konjugierten monoclonalen Antikörpern bzw. die spezifisches Metallchelatkonjugierten monoclonalen Antikörper. Diese Veröffentlichungen liefern Verbindungen und Verfahren zur Behandlung von zellulären Krankheiten. Radiometallchelat-konjugierte monoclonale Antikörper, welche für eine Targetzelle spezifisch sind, werden zur Anlieferung von alpha-, beta- oder Augerelektronen-emittierenden Metallionen eingesetzt. Diese Beschreibungen beziehen sich nicht auf DOTA-Verbindungen.
Der Wert des Vorliegens eines Ligandenkonjugates an Chelatmetallionen für therapeutische, diagnostische und andere Zwecke ist von kommerzieller Wichtigkeit. Diese kommerzielle Wichtigkeit wird durch die Tatsache begründet, daß viele Metallionen erwünschte Charakteristika für diese verschiedenen Zwecke besitzen, daß jedoch den Anlieferungssystemen für die Metallionen Spezifität für Targetzellen mangelt oder daß sie die Metallionen nicht in angemessener Weise binden. Beispiele für die Brauchbarkeit von spezifischen Metallionen sind wie folgt.
Die Brauchbarkeit von Radionuclidmaterialien in der Krebstherapie wird in dem Aufsatz, Kozak et al., "Radionuclide-conjugated monoclonal antibodies: A Synthesis of Immunology, in Organic Chemistry and Nuclear Science", Trends in Biotechnology 4(10):259-264 (1985) beschrieben. Dieser Aufsatz diskutiert die Verwendung von Antikörperkonjugaten zur Anlieferung von entweder alpha- oder beta-Strahlung. Der Wert von alpha-Strahlung aus Wismut-212 in der Radionuclidtherapie wird weiter in zwei Aufsätzen, Kozak et al., "Bismuth-212-labeled anti-Tac monoclonal antibody: Alpha-particle-emitting Radionuclides as Modalities for Radioimmunotherapy", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83 : 474- 478 (1986) und Gansow et al., "Generator-produced Bi-212 Chelated to Chemically Modified Monoclonal Antibody for Use in Radiotherapy", Am. Chem. So. Symposium Series, 15 : 215-227 (1984) diskutiert.
Beispiele von anderen Anwendungen für chelatierte Metallionen sind in den folgenden Artikeln veröffentlicht. Magerstadt et al., "Gd (DOTA): An Alternative to Gd (DPTA) as a T1,2 Relaxation Agent for NMR Imaging or Spectroscopy", Magnetic Resonance in Medicine, 3 : 808-812 (1986) beschreibt die Brauchbarkeit von Gadolinium als ein Relaxationsmittel für die NMR-Abbildung. Der Aufsatz, Spirlet et al., "Structural Characterization of a Terbium(III) Complex with 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic Acid. Lanthanide Ions and the Conformation of the 14-Membered Macrocycles", Inorganic Chemistry 23(25):4278-4283 (1984) beschreibt die Brauchbarkeit von Lanthanitchelaten.
In der Industrie fehlt ein DOTA-Chelat, das effizient in hohen Ausbeuten hergestellt werden kann, und das wünschenswerte Chelatierungsqualitäten für zahlreiche Metallionen besitzt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist ein Chelat der Formel I:
worin R&sub1;&submin;&sub4; -CH&sub2;COOH ist;
n = 1 bis 5 ist;
X ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
-NO&sub2;,
-NH&sub2;,
-NCS,
-NHCOCH&sub2;-Z, wobei Z ein Glied ausgewählt aus der aus Br und I bestehenden Gruppe ist,
-COOH, und
-OCH&sub2; COOH;
und M ein Metallion ist, welches ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe von Elementen, bestehend aus Bi, Pb, Y, Cd, Hg, Ac, Th und Sr.
Die Erfindung kann ein Chelat einschließen, worin M ein Kupferion oder ein Lanthanidion ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 bedeutet. Die Erfindung schließt Chelatkonjugate der Formel I und Ligandenkonjugate der Formel II ein:
worin x und R&sub1; bis R&sub4; die in Formel I angegebenen Bedeutungen haben.
Die Erfindung schließt ebenfalls Verfahren zur Anwendung dieser Verbindungen für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Zellstörungen und für diagnostische Tests ein.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 erläutert einen chemischen Weg zur Herstellung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Verbindung dieser Erfindung ist ein substituiertes DOTA, welches durch die Formel I wiedergegeben wird, wie zuvor gezeigt, oder spezifisch durch die Verbindung X von Fig. 1. Die Verbindung X kann nachfolgend in andere substituierte DOTA-Verbindungen umgewandelt werden, jedoch ist die Verbindung X die Mutterverbindung für solche anderen Verbindungen. Die allgemeine Formel ist ein Tetraazamakromolekül mit zwölfgliedrigem Ring, wobei die Stickstoffe in den Stellungen 1, 4, 7 und 10 vorliegen. Jeder der Stickstoffe ist mit einer Ethylengruppe "rippenförmig" versehen.
Der substituierte DOTA-Ligand wird durch die Verbindung X von Fig. 1, welcher Metalle komplexiert, wiedergegeben. Metallkomplexe werden gebildet, indem das DOTA in Lösung mit einem geeigneten Metallsalz, welches das zu chelatierende Metall aufweist, eingebracht wird. Metallsalze müssen so ausgewählt werden, daß sie die Hydrolyse des Metalls vermeiden. Ebenfalls müssen die Reaktionsbedingungen in einem wäßrigen Medium so ausgewählt werden, daß das Metall nicht hydrolysiert wird. Beispielsweise können ein Bleinitratkomplex, Wismutjodidkomplex oder Yttriumacetatsalze verwendet werden, um ein Metallchelat mit Blei, Wismut bzw. Yttrium zu bilden. Allgemeine Beispiele von geeigneten Salzen schließen einen beliebigen löslichen zweiwertigen Metallkomplex oder einen beliebigen dreiwertigen Metallkomplex, welcher nicht bei pH 4 oder darunter hydrolysiert wird, ein. Thorium erfordert spezifische Verwendung von Jodidsalz. Die am meisten erwünschten Metallionen für die Chelatierung mit Formel I sind Glieder aus der Gruppe, welche besteht aus Wismut, Blei, Yttrium, Cadmium, Quecksilber, Actinium, Thorium und Strontium. Wenn n von 2 bis 5 beträgt, schließen die erwünschten Metalle für die Chelatierung mit Formel I Kupfer und die Lanthanidenelemente ein. Die am meisten erwünschten Elemente der Lanthanidenreihe sind Gadolinium bei Anwendung bei der NMR-Abbildung und als Relaxationsmittel bei der NMR-Abbildung, und Terbium und Europium wegen ihrer Anwendung als Chromophore bei zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie. Diese fluoreszierenden Verbindungen können bei einer diagnostischen Untersuchung in vitro brauchbar sein, bei der ein Fluoreszenzassay verwendet wird, eher als bei einem radioaktiven Aminoassay.
Der Substituent X der Formel I ist wünschenswerterweise ein Substituent, welcher die Verbindung mit Haptenen konjugiert. Dieser Substituent ist wünschenswerterweise eine Nitrogruppe am freien Ende, die zu einem Amin reduziert werden kann. Das Amin kann dann mit einer Verbindung wie Thionylchlorid aktiviert werden, um eine reaktionsfähige chemische Gruppe wie ein Isothiocyanat zu bilden. Ein Isothiocyanat ist bevorzugt, da es direkt an Aminoreste eines Haptens wie eines monoclonalen Antikörpers bindet. Die Aminogruppe kann an ein oxidiertes Carbohydrat auf dem Protein gebunden werden, und nachfolgend die Bindung durch Reduktion mit Cyanoborhydrid fixiert werden. Die Aminogruppe kann dann ebenfalls mit Bromacetylchlorid oder Jodacetylchlorid umgesetzt werden, um -NHCOCH&sub2;Z, wobei Z Bromid oder Jodid ist, zu bilden. Diese Gruppe reagiert mit einer beliebigen verfügbaren Amin- oder Sulfhydrylgruppe auf einem Hapten unter Bildung einer stabilen kovalenten Bindung. Falls Tyrosin bei der Formulierung des Makromoleküls benutzt wird, kann eine carbocyclische Säuregruppe oder Methoxycarboxylatgruppe in dieser Stellung der Verbindung vorliegen. Die am meisten erwünschten Substituenten für diese Stellung sind Glieder ausgewählt aus der Gruppe, welche besteht aus: -NO&sub2;, -NH&sub2;, -NCS, -COOH, -OCH&sub2;COOH, -OCH&sub2;COOH und -NHCOCH&sub2;-Z, wobei Z ein Glied ausgewählt aus der aus Bromid und Jodid bestehenden Gruppe ist. Der bevorzugte Substituent für diese Stellung ist -NCS.
Die zum Binden mit dem Substituenten in der X-Stellung der Formel I geeigneten Haptene können im breiten Maße variieren. Die am meisten erwünschten Haptene sind Glieder ausgewählt aus der Gruppe, welche besteht aus Hormonen, Steroiden, Enzymen und Proteinen. Diese Haptene sind als Folge ihrer Platzspezifität für Tumore und/oder verschiedene Organe des Körpers erwünscht. Das bevorzugte Hapten zur Anwendung bei der Behandlung von Zellstörungen oder verschiedenen Krankheitszuständen ist ein monoclonaler Antikörper.
Die Verbindung dieser Erfindung kann Werte von n gleich einer ganzen Zahl von 1 bis 5 besitzen. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist n = 2. Es ist erwünscht, daß n = 2 statt 1 ist, weil der chelatierende Ligand weiter von dem Antikörper getrennt ist und größere Rotation aufweist. Die erhöhte freie Rotation erlaubt einem Metall, mit dem Makromolekül leichter ein Chelat zu bilden. Wenn n = 3 oder größer ist, wird die Synthese der Verbindung langwierig.
Fig. 1 zeigt den bevorzugten Reaktionsweg oder das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Verbindung dieser Erfindung. Diese Reaktion ergibt eine Verbindung der Formel I, worin n = 1 ist. Falls n = 2 sein soll, wäre eine weitere Methylengruppe zwischen dem alpha-Aminokohlenstoff und der aromatischen Gruppe vorhanden. Diese Verbindung ist 2-Amino- 4-nitrophenylbuttersäure.
Das Verfahren zur Synthese einer Verbindung gemäß dieser Erfindung ergibt zuerst ein Triamin mit einem Substituenten in der 2-Stellung. Die Ausführungsform von Fig. 1 besitzt ein Methylen [n = 1] als anfänglichen Substituenten für die Bindung. Die bevorzugte Ausführungsform besitzt eine Phenylethylengruppe. Das Verfahren liefert dann ein Tetraazamakromolekül, welches den Substituenten in der 2-Stellung besitzt. Alkylierung mit Bromessigsäure bildet die vier Kohlenstoffe an Stickstoffbindungen der Carboxymethylensubstituenten R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; in der Formel I.
Das Verfahren von Fig. 1 reagiert p-Nitrophenylalanin mit Methanol und Chlorwasserstoffsäure zur Bildung der Esterverbindung II. Dieser Ester wird mit Ethylendiamin in Anwesenheit von Triethylamin umgesetzt, um das Hydrochloridsalz des in Verbindung II gebildeten Esters zu entfernen. Das Kondensat des Amids des Ethylendiaminadduktes oder die Verbindung III wird anschließend mit einem di-aktiven Ester oder der Verbindung VI zur Bildung eines cyclischen Produktes oder der Verbindung VII umgesetzt.
Der gewünschte di-aktive Ester VI wird schrittweise aus Aminodiessigsäure IV von Fig. 1 gebildet. Das Amin wird zuerst unter Verwendung des Reagens BOC-ON oder eines beliebigen anderen Blockierungsmittels wie FMOC in Anwesenheit von Triethylamin, welches zum Deprotonieren des Ausgangsmaterials dient, blockiert. Die nachfolgende Stickstoffblockierte Diessigsäure V oder eine andere solche Stickstoff-blockierte Verbindung wird dann mit N-Hydroxysuccinimid oder einer beliebigen anderen geeigneten Verbindung wie Phenolen oder N-Hydroxydicarboximiden gekuppelt, welche einen reaktionsfähigen Ester bildet. Die Auswahl von Verbindungen, welche aktive Ester oder Blockierungsgruppen bilden, liegt innerhalb des Wissens auf dem Fachgebiet. Das Kuppeln wird durch Dicyclohexylcarbodiimid oder "DCC" durchgeführt. Diese Stufe ergibt den Stickstoff-blockierten aktiven Ester oder die Verbindung VI.
Ringbildung unter Bedingungen hoher Verdünnung zwischen Aminoacidamid oder Verbindung III mit dem Stickstoffblockierten aktiven Ester von Verbindung VI erfolgt dann. Diese Kondensationsstufe bildet den Triamidmakrozyklus oder die Verbindung VII. Die Verbindung VII wird in sehr hoher Ausbeute erzeugt. Die Ausbeute beträgt typischerweise wenigstens etwa 80%. Die Ausbeute liegt mehr erwünscht zwischen etwa 80% bis etwa 95%.
Die Synthese des Makrozyklus der Verbindung IX kann auf zwei Wegen herbeigeführt werden. Der Aminstickstoff der Verbindung VII wird mit Trifluoressigsäure oder "TFA" deblockiert. Dies bildet das TFA-Salz des Triamidmakrozyklus oder der Verbindung VIII. Diese Verbindung wird mit Boran/Tetrahydrofuran oder THF reduziert. Das erhaltene Boranaddukt wird durch Chlorwasserstoffsäure gespalten, um den substituierten Tetraazamakrozyklus von Verbindung IX zu bilden. Dieser Tetraazamakrozyklus kann dann mit Halogenessigsäure in Anwesenheit einer Base zur Bildung einer Nitrobenzyl-DOTA oder Verbindung x alkyliert werden. Alternativ kann die Verbindung VII mit Boran/THF reduziert und mit Chlorwasserstoffsäure unter direkter Bildung der Verbindung IX umgesetzt werden. Dieser alternative Weg ergibt etwas geringere Ausbeuten.
Die Nitrogruppe der Verbindung X kann mit Wasserstoff über Platin auf einem Kohlekatalysator zur Erzeugung der Aminogruppe oder des Aminobenzyl-DOTA, das als Verbindung XI wiedergegeben ist, reduziert werden. Die Verbindung XI kann dann mit Thiophosgen zur Bildung des Isothiocyanates oder der Verbindung XII umgesetzt werden.
Die Methode in Spalte 3 der US-A-4 652 519 von Warshawsky et al. ergibt die Methode zur Bildung des Substituenten -COOH. Diese Arbeitsweise ergibt das Ethylendiaminzwischenprodukt. Der gewünschte Zwischenproduktmakrozyklus wird durch Bildung des analogen di-aktiven Esters der Verbindung VI unter Verwendung von N,N'-Ethylendiamindiessigsäure erzeugt. Kondensation des Diamins mit dem Dinitrogen, diBOC-di-aktiven Ester ergibt ein Diamidzwischenprodukt, welches dann mit Diboran unter Bildung des geeigneten Tetraazamakrozyklus reduziert wird. Der DOTA-ligand kann aus diesem Makrozyklus hergestellt werden. Die Synthese der Gruppen X und Z wird ebenfalls in dem Patent von Warshawsky et al. beschrieben.
Die zuvor beschriebenen Reaktionsstufen zur Herstellung der Verbindungen X, XI und XII sind bekannt. Das neue Merkmal des in Fig. 1 gezeigten Verfahrens ist die Arbeitsweise zur Cyclisierung. Die Umwandlungsreaktion der Verbindung IV mit Verbindung VI zur Bildung des Makorzyklus und die vollständige Reduktion des Makrozyklus zur Bildung der Verbindung X ergibt die unerwarteten Ergebnisse der sehr hohen Ausbeuten an Verbindung x.
In ihrer bevorzugten Ausführungsform wird das Kuppeln eines Isothiocyanatchelates der Verbindung XII von Fig. 1 durch direkte Konjugation des Isocyanates mit einer freien Aminogruppe, welche in zahlreichen Resten von Proteinen, Enzymen oder anderen Verbindungen wie bestimmten Hormonen gefunden wird, durchgeführt. Ein Beispiel dieser Situation mit einem Hormon findet sich in der freien Aminogruppe, welche durch die epsilon-Aminogruppe des Lysins oder der endständigen Aminogruppe als Hormonpeptidkette bereitgestellt ist. Eine beliebige freie Aminogruppe kann mit dem Isocyanat unter Bildung einer Thioharnstoffbindung, welche kovalent gekuppelt und irreversibel ist, umgesetzt werden. Die Verwendung eines Steroids als Hapten erfordert, daß eine Aminofunktion in dem Steroid vorhanden ist.
Ein Vorteil des Aminderivatchelates der Verbindung XI von Fig. 1 liegt darin, daß beim Kuppeln an Proteine und insbesondere beim Kuppeln an Antikörper das Carbohydrat des Antikörpers vor der Kupplungsreaktion oxidiert werden kann. Das Amin reagiert mit dem Aldehyd, welcher auf dem Protein gebildet wird. Dieses gebildete Aldimin kann durch Cyanoborhydrid zur Bildung einer kovalenten sekundären Aminbindung an den Antikörper in einer Stellung, welche ortsspezifisch ist, reduziert werden. Diese Stellung führt von dem Bindungsort des FAB'2-Teiles des monoclonalen Antikörpers weg.
Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist eine solche mit der Formel (IB)
worin M ein Kupfermetallion oder ein Lanthanidmetallion ist, und worin n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, und X und R&sub1;bis R&sub4; dieselben Bedeutungen wie in Formel I besitzen. Diese Ausführungsform der Erfindung kann verwendet werden, um einen monoclonalen Antikörper mit Cu&sup6;&sup7; oder mit einem radioaktiven Lanthanid zu markieren. Wenn n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, liegt weniger Hinderung der Kette des Liganden mit dem Protein vor, als dies im Fall n = 1 gegeben ist. Wenn n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, wird ausreichend Platz zwischen dem Liganden und dem Protein bereitgestellt, um eine freiere Rotation des Liganden zu erlauben. Dies ergibt eine effizientere Chelatierung des Kupfer- oder Lanthanidions durch das resultierende Konjugat. Besonders bevorzugte Glieder der Lanthanidreihe schließen Gadolinium, Terbium und Europium ein.
Eine Ausführungsform der Erfindung schließt ein Ligand-Hapten-Konjugat der Formel II ein:
worin X und R&sub1; bis R&sub4; wie zuvor in Formel I definiert sind.
Dieses Konjugat chelatiert Metallionen. Es ist erwünscht, viele Metalle dem Proteinkonjugat in einer konzentrierten Metallösung für eine möglichst kurze Zeitdauer zu exponieren. Bestimmte Metalle wie zweiwertige Metallionen reagieren rasch und direkt mit dem Konjugat. Die Kinetik der Bildungsreaktion dieser Verbindungen ist so rasch, daß es erwünscht ist, daß das Ligand-Hapten-Konjugat in der Pharmazie unmittelbar vor der Anwendung verfügbar zu haben. Das Konjugat kann dann mit dem Radionuclid zur Bildung eines Komplexes gemischt werden, und anschließend kann das gebildete Metallchelat-Konjugat gereinigt werden, beispielsweise durch Größenausschluß-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie. Ein wünschenswertes Hapten für das Ligand-Konjugat kann dann aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus Hormonen, Steroiden, Enzymen und Proteinen besteht.
Die brauchbarsten kommerziellen Ausführungsformen der Erfindung sind Chelat-Konjugate mit der Formel IA:
worin (1) n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, (2) X' ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -NHQ, -NHCS-Q, -NHCOCH&sub2;-Q, -OCH&sub2;COOQ und -COO-Q, wobei Q ein Hapten ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hormonen, Steroiden, Enzymen und Proteinen, und (3) M ein Metallion ist, welches ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe von Elementen, bestehend aus Bi, Pb, Y, Cd, Hg, Ac, Th und Sr. Bevorzugte Verbindungen schließen solche ein, in denen ein Radioisotop von Wismut, insbesondere ein alphaemittierendes Radioisotop hiervon, gemäß der Formel I chelatiert ist. Diese Chelat-Konjugate können radioaktive Metallionen wie Pb²&sup0;², Pb²¹², Bi²¹², Y&sup9;&sup0;, Th²²&sup4; und Sr&sup9;&sup0; an spezifische Zellstörungen anliefern. Besonders bevorzugte Konjugate schließen solche ein, in denen n = 2 ist und X' = -NHCS-Q ist.
Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung benutzt ein Chelat-Konjugat, welches Pb²¹² bindet. Pb²¹² ist eine sehr vorteilhafte pharmazeutische Verbindung zur Anlieferung sowohl von beta- als auch alpha-Strahlung an einen ausgewählten Ort zur Behandlung der Zellstörungen. Die Anlieferung erfolgt durch das Ion Pb²¹², welches sich mit einer Halbwertszeit von 10,5 h in Bi²¹² umwandelt. Bi²¹² und Tochterprodukte liefern ein alpha-Teilchen pro Pb²¹²-Kern. Das erwünschte Ergebnis dieses Chelat-Konjugates, ist, daß die Halbwertszeit von Pb²¹² ausreichend ist, um die Platzauswahl aus der Körperflüssigkeit durch das Hapten zu erlauben, bevor das alpha-Teilchen emittiert wird.
Die Erfindung schließt ebenfalls Chelat-Konjugate mit der Formel IA ein, worin (1) n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, (2) X' ein Glied ist, ausgewählt aus -NHQ, -NHCS-Q, NHCOCH&sub2;-Q, -OCH&sub2;COO-Q und -COO-Q, wobei Q ein Hapten ist, ausgewählt aus der aus Hormonen, Steroiden, Enzymen und Proteinen bestehenden Gruppe, und (3) M ein Metallion ist, ausgewählt aus Cu und den Lanthanidenelementen. Bevorzugte Lanthanidenelemente schließen Gd, Eu und Tb ein. Bevorzugte Konjugate schließen solche ein, in denen n = 2 ist und X' = -NHCS-Q ist.
Die Erfindung schließt ein Verfahren zur Behandlung von Zellstörungen ein. Dieses Verfahren benutzt das Chelat-Konjugat mit einem Hapten, das einen selektiven Bindungsplatz bei der Zellstörung besitzt. Beispielsweise kann Q ein monoclonaler Antikörper sein, bei welchem der Antikörper gegen ein Epitop, das spezifisch auf den Tumorzellen gefunden wird, gerichtet und ausgeprägt ist. Wenn auf diese Weise Pb²¹² zu dem Antigenplatz transportiert wird und anschließend im Zeitgleichgewicht in Bi²¹² und seine Tochterprodukte zerfällt, wird eine beta-Strahlung aus dem Bleizerfall erzeugt. Eine beta-Strahlung wird durch die Wismut-Töchter erzeugt. Diese beta-Strahlung ist der beta-Strahlung aus Y&sup9;&sup0; vergleichbar, jedoch erzeugt jeder Zerfall von Wismut zusätzlich weiterhin ein alpha-Teilchen. Auf diese Weise wird eine Radiotherapie mit einer Bestrahlungsdosis von sowohl einem alpha- als auch einem beta-Teilchen geliefert. Gewünschtenfalls kann nur Bi²¹² in solchen Fällen eingeführt werden, wo die zu behandelnde Störung wie bei leukämischen Zellen leicht innerhalb der Halbwertszeit von 1 h von Bi²¹² erreicht werden kann. Ebenfalls ist es möglich, dieses Verfahren zur Behandlung von Krebsarten zu verwenden, bei denen die Zellen weit differenziert sind. Dies könnte bevorzugt sein, falls nur ein weitreichender beta-Emitter, wie Y&sup9;&sup0;, erwünscht ist. In unterschiedlichen Umgebungen, in vivo, wird das Bi²¹² innerhalb des Chelates nach der beta-Emission in unterschiedlichen Mengen zurückgehalten. Es ist am meisten erwünscht, daß wenigstens 95% von Bi²¹² in dem Chelat verbleiben. In einem sauren Medium, wie dem Magen, werden wenigstens 70% des Bi²¹² zurückgehalten. Die Rückhaltung von wenigstens etwa 80 oder 90% Bi²¹² ist ebenfalls in Abhängigkeit von dem Medium erwünscht.
Die Erfindung schließt ein Verfahren zum diagnostischen Testen ein. Dieses Verfahren benutzt ein Chelat-Konjugat mit der Formel I, worin M ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Pb²&sup0;³, Tc99m, In¹¹¹, Ga&sup6;&sup7;, Ga&sup6;&sup8;, Sc&sup4;³, Sc&sup4;&sup4;, Fe&sup5;², Fe&sup5;&sup4;, Fe&sup5;&sup6;, Fe&sup5;&sup7;, Fe&sup5;&sup8; und Co&sup5;&sup5; besteht, vorausgesetzt, daß n größer als 1 ist, falls M = In¹¹¹, Fe&sup5;², Fe&sup5;&sup4;, Fe&sup5;&sup6;, Fe&sup5;&sup7;, Fe&sup5;&sup8; oder Co&sup5;&sup5; ist. Die Brauchbarkeit von Metallionen bei diagnostischen Arbeitsweisen sowohl in vitro als auch in vivo ist in der US-A-4 454 106 beschrieben.
Die am meisten erwünschte Ausführungsform dieses diagnostischen Verfahrens benutzt Pb²&sup0;³. Pb²&sup0;³ hat eine Halbwertszeit von 52,1 h als gamma-Emitter. Pb²&sup0;² hat eine einzigartige Eigenschaft, da es zu einem hohen Prozentsatz nur durch eine einzige Photonenemission zerfällt. Diese gamma-Emission ist gegenüber allen anderen Emissionen bevorzugt und dominant. Diese einzige Photonenemission macht Pb²&sup0;³ für die computerisierte Einzelphotonenemissionsspektroskopie [SPECT = single photon emission cmputed spectroscopy] brauchbar, die ein diagnostisches Werkzeug ist. Wenn daher Pb²&sup0;³ durch Verwendung des Chelats an ein Hapten, das spezifisch in einem Tumor sich lokalisiert, gebunden ist, kann diese besondere Lokalisierung dreidimensional für diagnostische Zwecke in vivo durch Einzelphotonenemissionstomographie aufgezeichnet werden. Alternativ kann die Emission in vitro bei Radioimmunoassays eingesetzt werden.

BEISPIEL 1

Die zuvor beschriebenen Arbeitsweisen und Reagentien für die bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung der Verbindungen werden in diesem Beispiel eingesetzt.
Der spezifische Antikörper für das IL-2-Antigen ist der monoclonale Antikörper alpha-Tac. Dieser Antikörper wird mit dem Chelat der Verbindung XII von Fig. 1 wie folgt markiert. Der Antikörper wird in einer gepufferten normalen Salzlösung mit einem pH von etwa 8,5 suspendiert. Fester Ligand oder Verbindung XII wird zu der Proteinsuspension zugesetzt. Das Protein-Konjugat bildet sich während der Reaktion über Nacht und wird durch Dialyse gegen metallfreien 0,05 molaren Citrat/0,15 molaren Natriumchlorid-Puffer bei pH 5,5 gereinigt. Vor der Markierung mit Metall wird das Protein gegen eine Lösung dialysiert, welche 0,02 molare N-Morpholinoethansulfonsäure und 0,02 molares Acetat bei pH 5,9 umfaßt.
Das Protein in Lösung wird mit Y&sup9;&sup0; durch Umsetzung mit einer Acetatlösung des Isotops mit anschließender Passage durch eine TSK 3000 Größenausschlußsäule markiert. Hierbei handelt es sich um eine Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Arbeitsweise. Die Verbindung wird mit einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel vermischt und bei Säugetieren in einer therapeutischen Menge zur Behandlung von T-Zellenleukämie von Erwachsenen bei Säugetieren eingesetzt. T-Zellenleukämie zeichnet sich durch außergewöhnliche große Mengen von IL-2-Rezeptoren auf den Tumorzellen aus. Der Antikörper lokalisiert sich spezifisch an diesen Tumorzellen, um seine Strahlung abzuliefern.

BEISPIELE 2 UND 3

Die für die bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung der Verbindungen zuvor beschriebenen Arbeitsweisen und Reagentien werden für diese Beispiele benutzt. Der einzige Unterschied zwischen Beispiel 1 und den Beispielen 2 und 3 ist die Verwendung des Antikörpers B72.3, welcher spezifisch an ein Glycoprotein auf LS-174T Zellen bindet. Dieses Glycoprotein findet sich ebenfalls in Menschen, welche Colonkrebs haben. Das Modellsystems dieses Beispiels ist eine athymische Maus, in welche LS-174T Zellen implantiert wurden, um einen Tumor auf der Flanke des Tieres, wo die Zellen implantiert wurden, zu entwickeln. Die angewandte diagnostische Methode zur Visualisierung des wachsenden Tumors schließt die folgenden Komponenten ein. Das Chelat der Verbindung 12 wird zuerst an Gadolinium oder Pb²&sup0;³ durch Mischen der Chelatlösung bei pH 4 bis 5 mit Gadolinium- oder Pb²&sup0;³nitrat gekuppelt. Dieses Material kann dann direkt an den Antikörper durch Mischung zur Reaktion mit dem Protein gebunden und entsprechend der Methode des vorangegangenen Beispiels gereinigt werden.
In Beispiel 2 wird das Konjugat aus Gadoliniumchelat- Ligandenprotein in Körperflüssigkeiten eines Säugetieres injiziert oder eingeführt. Das Gadolinium lokalisiert sich dann mit dem Antikörper an dem Tumor und es werden konventionelle Arbeitsweisen der resonanzmagnetischen Abbildung zur Visualisierung des Tumors benutzt.
In Beispiel 3 wird Pb²&sup0;³ verwendet, und das mit Metall markierte Protein-Konjugat wird in vergleichbarer Weise in das Säugetier eingeführt, jedoch wird eine Gammakamera oder Abbildung mittels SPECT zur Visualisierung des Tumors benutzt.

Claims

1. Chelat der Formel I:

worin R&sub1; bis R&sub4; jeweils -CH&sub2;COOH sind;

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist;

X ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

-NO&sub2;

-NH&sub2;,

-NCS,

-NHCOCH&sub2;-Z, wobei Z ein Glied ausgewählt aus der aus Br und I bestehenden Gruppe ist,

-OCH&sub2;COOH, und

-COOH;

und M ein Metallion ist, welches ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe von Elementen, bestehend aus Bi, Pb, Y, Cd, Hg, Ac, Th und Sr.

2. Chelat nach Anspruch 1, worin n = 1 oder 2 ist und X ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -NO&sub2;, -NCS und -NHCOCH&sub2;-Z, wobei Z ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Br und I.

3. Chelat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2' worin X = -NCS ist.

4. Chelat der Formel IA:

worin R&sub1; bis R&sub4;, n und M wie in Anspruch 1 definiert sind und X' ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

-NH-Q

-NHCS-Q

-NHCOCH&sub2; -Q

-OCH&sub2;COOQ und

wobei Q ein Hapten ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hormonen, Steroiden, Enzymen und Proteinen.

5. Chelat nach Anspruch 4, worin n = 1 bis 2 ist und X'

ist.

S

6. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin M ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bi, Pb, Y, Th und Sr.

7. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin M ein Radioisotop von Wismut ist.

8. Chelat nach Anspruch 7, worin M ein α-emittierendes Isotop von Wismut ist.

9. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin n = 2 ist und M ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pb²¹², Pb²&sup0;³, Bi²¹², Y&sup9;&sup0;, Th²²&sup4; und Sr&sup9;&sup0;.

10. Chelat der Formel IB:

wobei R&sub1;&submin;&sub4; und X wie in Anspruch 1 definiert sind, worin n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist und M = Cu oder ein Lanthanidenelement ist.

11. Chelat nach Anspruch 10, worin n = 2 ist und X ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -NO&sub2;, -NCS und -NHCOCH&sub2;-Z, wobei Z ein Glied ist, ausgewählt aus der aus Br und I bestehenden Gruppe.

12. Chelat nach Anspruch 11, worin X = -NCS ist.

13. Ligand-Hapten-Konjugat der Formel II:

worin R&sub1; bis R&sub4; und n wie in Anspruch 1 definiert sind und X' wie in Anspruch 4 definiert ist.

14. Ligand-Hapten-Konjugat nach Anspruch 13, worin n = 2 ist und X'

ist.

15. Ligand-Hapten-Konjugat nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, worin Q ein Protein ist, wobei dieses Protein ein monoklonaler Antikörper ist.

16. Verwendung eines Metall-Chelates der Formel IC zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zellstörungen:

worin R&sub1; bis R&sub4; und n wie in Anspruch 1 definiert sind, X' wie in Anspruch 4 definiert ist und M ein Metallion ist, das ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Bi, Pb und Y.

17. Verfahren für diagnostisches Testen, umfassend: Einführen einer Lösung eines Metall-Chelates der Formel IE in ein Testmedium:

worin R&sub1; bis R&sub4; wie in Anspruch 1 definiert sind, X' wie in Anspruch 4 definiert ist, n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist und M ein Metallion ist, das ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus In¹¹¹, Fe&sup5;², Fe&sup5;&sup4;, Fe&sup5;&sup6;, Fe&sup5;&sup7;, Fe&sup5;&sup8; und Co&sup5;&sup5;.

18. Verfahren für diagnostisches Testen, umfassend: Einführen einer Lösung eines Metall-Chelates der Formel ID in ein Testmedium:

worin R&sub1; bis R&sub4; und n wie in Anspruch 1 definiert sind, X' wie in Anspruch 4 definiert ist und M ein Metallion ist, das ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pb²&sup0;³, Tc99m, Ga&sup6;&sup7;, Ga&sup6;&sup8;, Sc&sup4;³ und Sc&sup4;&sup4;.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, worin n = 2 ist, X' = -NCHS-Q ist und Q ein monoklonaler Antikörper ist.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin M = Pb²&sup0;³ ist.

21. Verwendung eine Metall-Chelates der Formel IE:

worin R&sub1; bis R&sub4; jeweils -CH&sub2;COOH sind,

n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist,

X' ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

-NH-Q

-NHCOCH&sub2;-Q

-OCH&sub2;COOQ

wobei Q ein Hapten ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hormonen, Steroiden, Enzymen und Proteinen,

M ein Metallion ist, das ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe von Elementen, bestehend aus Gd, Cu und anderen Lanthanidenelementen,

zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Zellstörungen, umfassend das Einführen einer Lösung des Metall-Chelates in Körperflüssigkeit.