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Küvette zur mikroskopischen Beobachtung und/oder optisch-elektrischen
Messung von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen Die Erfindung betrifft eine
Küvette zur mikroskopischen Beobachtung ,und/oder optisch-elektrischen Messung von
in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen mit einer oberen ebenen Begrenzungsfläche
und einem gegen die obere Begrenzungsfläche gewölbtem Boden, sowie mit mindestens
einem Zulauf auf der einen Seite der Wölbung und einem Ablauf auf der gegendberliegenden
Seite der Wölbung.
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Küvetten dieser Art sind in vielfältiger Ausgestaltung für die Durchflußanalyse
vorzugsweise von suspendierten Zellpopulationen bekannt. Diese Durchflußküvetten
dienen überwiegend der Analyse homogener oder heterogener Zellpopulationen für diagnostische
Zwecke (Differentialblutbild, Immuno-Tests u.a.) und für pharmakologische Untersuchungen
auf Zellebene an definierten Zellpopulationen. Als optische Meßgrößen, die als Lichtimpulse
von den Einzelteilchen bzw. -zellen abgegriffen werden, werden ganz überwiegend
die Fluoreszenz- und die Streulichtintensität bestimmt. Während die Fluoreszenzintensität
zur Bestimmung quantitativer zytochemischer Parameter (z.B. DNS-Menge pro Zelle)
und damit des entsprechenden, die Zellpopulation charakterisierenden Histogramms
benutzt wird, dient die Streulichtintensität zur Bestimmung der Zellgröße und der
entsprechenden Häufigkeitsverteilung dieses Parameters.
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Den meisten bekannten Durchflußküvetten ist gemeinsam, daß die Zell-
oder Teilchensuspension vor der Meßstelle in einen zellfreien Flüssigkeitsstrom
eingespeist wird. Durch sogenannte hydrodynamische Fokussierung wird die zentral
in Strömungsrichtung eingespeiste Zellsuspension durch den schneller fließenden
Hüllstrom zu einem schmalen Flüssigkeitsfaden verdünnt (fokussiert) und stabilisiert.
Die Zellen passieren innerhalb dieses Flüssigkeitsfadens senkrecht zur Mikroskopachse
das Meßfeld, auf welches das Mikroskopobjektiv fokussiert ist.
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Bei Führung der Zellsuspension in Richtung der Mikroskopachse werden:die
Zellen nach Einspeisung in den senkrecht hierzu fließenden zellfreien Flüssigkeitsstrom
seitlich weggeführt, nachdem sie die Scharfstellungsebene des Objektivs passiert
haben. Diése liegt etwa in der Austrittsöffnung der in der Mikroskopachse angeordneten
suspensionsführenden Kapillare.
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Der grundiegende Nachteii der beschriebenen Durchflußküetten ist zunächst
einmal die Unmöglichkeit, die erhaltenen Meßergebnisse mikroskopisch und mikroskopphotometrisch
an einer repräsentativen Teilprobe unter identischen optischen Bedingungen sofort,
bequem, sicher und beliebig wiederholbar nachprüfen zu können. Die Information über
die Morphologie und chemische Topologie auf der Grundlage einer strukturkorrelierten
Messung geht beim Durchflußverfahren verloren.
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An diesem Mangel leiden die heute zur Verfügung stehenden Einrichtungen
insbesondere dann, wenn beispielsweise die chemische Topologie der Einzelzelle oder
der verschiedenen Zelltypen zur Vermeidung von Fehlinterpretationen des ermittelten
Histogramms herangezogen werden muß. Dies ist verhältnismäßig häufig der Fall, unterbleibt
jedoch oft aufgrund der nicht gegebenen technischen Voraussetzungen.
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Ein weiterer Nachteil ist in der Tatsache begründet, daß bei Verwendung
des Hüllstromprinzips optisch störende Brechzahldifferenzen zwischen Zelle und Suspensionsmedium
bzw. zwischen Zentral- und Hüllstrom nicht ausgeglichen werden können, es sei denn,
die Brechzahl der Hüllstromflüssigkeit würde ebenfalls durch Zugabe hochmolekularer
Substanzen (u.a. Dextran, Albumin) entsprechend angehoben.
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Dies ist abgesehen vom Aufwand auch aus hydrodynamischen Gründen meistens
nicht möglich. Hinzu kommt, daß die Durchmischung der Zellsuspension mit einem Vielfachen
des Volumens der Hüllstromflüssigkeit die Rückgewinnung der gemessenen Zellsuspension
außerordentlich erschwert. Eine exakte Wiederholung'der Messung an derselben Zellpopulation,
evtl.
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unter geänderten Meßbedingungen, ist unter diesen Voraussetzungen
kaum möglich.
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Andererseits erfordert eine Durchflußküvette ohne fokussierenden Hüllstrom
eine entsprechende mechanische Einengung des Suspensionsstroms an der Meßstelle,
um diesen in definierter Weise in den Schärfentiefebereich des Mikroskopobjektivs
zu bringen und um geometrisch definierte Meßbedingungen zu schaffen. Dabei muß der
Querschnitt des Durchflußkanals dem größten in der Suspension vorkommenden Teilchen
angepaßt werden, um Verstopfungen zu vermeiden, wenn die größeren Teilchen nicht
verformbar sind. Aber auch wenn durch Verformung der Teilchen Verstopfungen vermieden
werden, so beeinflussen diese Teilchen doch die Durchflußzeit und verfälschen u.U.
die Meßergebnisse für die gesamte Zellpopulation.
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Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine Küvette für die
Analyse von in Flüssigkeit suspendierten Zellen, Mikroorganismen und Partikeln anzugeben,
die neben einer Durchfluß analyse mit und ohne Hüllstrom auch eine mikroskopische
und mikroskopphotometrische Untersuchung mit sta-
tionärer Partikelverteilung
erlaubt. Die Küvette soll eine Reinigung und Beseitigung von Verstopfungen ohne
Demontage und Unterbrechung eines Meßvorqanges ermöglichen und auch für die gleichzeitige
Messung an unterschiedlichen Teilstrombereichen geeignet sein.
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Diese Aufgabe wird bei einer Küvette der eingangs genannten Art erfindungsgemäß
dadurch gelöst, daß der gewölbte Boden gegenüber der oberen Begrenzungsfläche höhenverstellbar
ist.
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Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn eine zylindrische
Wölbung vorgesehen wird, deren Längsachse zumindest angenähert senkrecht zur Verbindungslinie
zwischen dem Zu- und; dem Ablauf liegt. Eine Erweiterung des Anwendungsbereichs
ergibt sich, wenn in die Kuppe der Wölbung mindestens eine parallel zur Verbindungslinie
zwischen Zu- und Ablauf liegende Führungsrinne eingelassen ist. Dabei wird zweckmäßigerweise
der Zulauf als Kapillare ausgebildet, deren Öffnung mit der Richtung der Führungsrinne
fluchtet. Der Querschnitt der Führungsrinne kann gerade oder gekrümmte Begrenzungslinien
aufweisen. Von Vorteil ist es auch, wenn der Boden der Führungsrinne auf der Zulaufseite
stetig in die Wölbung des Küvettenbodens übergeht. Zusätzlich zum Zulauf für die
Teilchensuspension kann ein weiterer Zulauf für einen teilchenfreien Flüssigkeitsstrom
vorgesehen sein. Dabei können die beiden Zuläufe auch übereinander liegen, so daß
unterschiedliche Strömungsschichten entstehen. Zur Anpassung an unterschiedliche
Meßaufgaben und Teilchengrößen können die Kapillare und der höhenverstellbare Küvettenboden
auswechselbar sein. Der Küvettenboden kann für Auflichtuntersuchungen ref-lektierend
sein. Er kann aber auch aus transparentem Material gefertigt sein, so daß er für
Durchlichtuntersuchungen geeignet ist. Dazu. kann im Bereich der Kuppe die Wölbung
opak sein, so daß eine Dunkelfeldbeleuchtung entsteht. Es kann aber auch eine teildurchlässige
oder dichromatische Beschichtung des Küvettenbodens vorteilhaft sein.
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In den Zeichnungen sind Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen
Küvette schematisch dargestellt.
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Im einzelnen zeigen Fig. la, 1b eine Durchfluß anordnung mit Objektiv
und Auflichtbeleuchtung, Fig. 2a den Meßbereich der Küvette als vergrößerten Ausschnitt
im Querschnitt und in Fig. 2b in der Aufsicht, Fig. 3a - c einen ähnlichen Ausschnitt
wie Fig. 2, jedoch mit unterschiedlichen Durchflußkanälen im Küvettenboden, Fig.
4a eine Durchfluß anordnung mit hydrodynamischer Fokussierung und in Fig. 4b den
Durchflußkanal in Aufsicht, Fig. 5 einen Ausschnitt aus dem Meßbereich der Küvette
in Aufsicht mit zentraler Einspeisung der Suspension, sowie Fig. 6 einen Ausschnitt
aus dem Meßbereich der Küvette im Querschnitt mit übereinander liegender Einspeisung
von Suspension und Hüllstrom.
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Die neue Küvette wird mit ihren Vorteilen anhand der vorstehend genannten
Figuren nachfolgend beschrieben.
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Die in Fig. la dargestellte Küvette besteht aus einem Grundkörper
10, der eine Bohrung 11 mit einem Schlauchstutzen 12 für den Zulauf und eine Bohrung
13 mit einem Schlauchstutzen 14 für den Ablauf aufweist. Die beiden Bohrungen 11
und 13 gehen schräg durch den Grundkörper 10 hindurch und haben einander gegenüber-
liegende
Öffnungen 15, 16 in der Oberseite 17 des Grundkörpers 10. Zwischen den beiden Öffnungen
15, 16 befindet sich eine weitere Bohrung 18 senkrecht durch den Grundkörper 10
hindurch. In diese Bohrung ist der Küvettenboden 19 höhenverstellbar eingesetzt.
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In diesem Ausführungsbeispiel besteht der Küvettenboden 19 aus einem
Metallkörper mit zylindrisch gewölbter Oberfläche.
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Die Zylinderachse verläuft senkrecht zur Zeichenfläche. Der Metallkörper
ist in einem Träger 20 befestigt, der in die Bohrung 18 verschiebbar eingesetzt
ist. Als Geradführung für den Träger 20 dient ein in diesen eingesetzter Bolzen
21, der in einem'ton den Grundkörper 10 eingearbeiteten Schlitz 22 geführt wird.
Zur Höhenverstellung des Trägers 20 liegt dieser unter dem Druck einer Feder 23
an einem gerändelten Ring 24 an, der über ein Gewinde 25 mit dem Grundkörper 10
verbunden ist. Ein an dem Grundkörper angebrachter, in radialer oder axialer Richtung
wirkender Anschlag begrenzt dabei den maximalen Hub für den Träger 20 und damit
auch für den Küvettenboden 19. Durch Anbringung geeigneter Markierungen am Rändelring
24 und Grundkörper 10 wird die Höhenverstellung meßbar und die Einstellung reproduzierbar.
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Der über dem Küvettenboden liegende Küvettenraum wird durch eine schlitzförmige
Ausnehmung 26 in einem Deckel 27 und ein den Schlitz abschließendes dünnes Glasplättchen
28 gebildet (Fig. lb). Der Deckel 27 wird mit Schrauben 29 am Grundkörper 10 befestigt.
Zum allseitigen flüssigkeitsdichten Abschluß des Küvettenraumes sind zwischen Deckel
27 und Grundkörper 10 und zwischen Träger 20 und Grundkörper 10 Dichtringe 30, 31
eingelegt.
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Die soweit beschriebene Küvette wird in einem Gehäuse 32 gehaltert,
das auf einem nicht dargestellten Mikroskoptisch befestigt werden kann. Die Beobachtung
des Küvetteninhalts
erfolgt über ein Mikroskopobjektiv 33 im Auflicht.
Dabei wird das Licht einer durch eine Lichtquelle 34 und eine Leuchtfeldblende 35
schematisch dargestellten Beleuchtungseinrichtung, z.
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B. über einen Teilerspiegel 36 in die optische Achse 37 des nicht
weiter dargestellten Mikroskops eingespiegelt.
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In den nachfolgenden Figuren sind gleiche Teile mit denselben Bezugszeichen
versehen.
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Die Fig. 2a und 2b zeigen. eine Betriebsweise, die mit der neuen Küvette
möglich ist. Durch die Höhenverstellung des Küvettenbodens 19 kann der Durchflußbereich
zwischen der Kuppe des Bodens 19 und dem Glasplättchen 28 kontinuierlich soweit
verengt werden, daß sich die in einer Suspension befindlichen, gegen den gewölbten
Boden 19 anschwimmenden Teilchen 39 je nach ihrez ,röße dort verkeilen. Auf diese
Weise können je nach eingestellter maximaler Spalthöhe und Krümmung des Bodens 19
repräsentative Teilproben der Teilchen- bzw. Zellpopulation oder Anreicherungen
großer Teilchen bzw. Zellen für die visuelle mikroskopische Untersuchung z.B. über
ein Immersionsobjektiv 33', 38 oder die mikroskopphotometrische Messung an stationären
Zellen gewonnen werden. Die Zellen können dabei weiterhin von einem beliebigen Medium
umströmt werden. Zu beachten ist, daß sich durch die zylinderförmige Wölbung des
Bodens 19 senkrecht zur Strömungsrichtung, die durch Pfeile 40 angedeutet ist, ein
ausgedehntes Zellpräparat mit ausreichender Zahl stationär zu beobachtender bzw.
zu messender Zellen einstellt. Notwendigenfalls kann durch vorübergehende Erweiterung
und nachfolgende Wiedereinengung des Durchfluß spaltes oder durch mehrfache Umkehrung
der Strömungsrichtung der Vorgang der Gewinnung stationärer Zellpräparate in besonders
schonender Form wiederholt werden.
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Durch den beliebig wählbaren Übergang vom fließenden Teilchenstrom
zur stationären Teilchenansammlung ist die Möglichkeit
geschaffen,
die impulsphotometrisch gewonnenen Ergebnisse durch mikroskopphotometrische Messungen
unter identischen optischen Bedingungen überprüfen zu können. Darüber hinaus ist
jedoch auch die kontrollierte Exposition räumlich fixierter Zellen gegenüber definierten
chemischen und physikalischen Bedingungen und deren Änderungen möglich.
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So können z.B. definierte extrazelluläre Substratkonzentrationen zur
Messung des intrazellulären enzymatischen Umsatzes fluorogener Substrate angewendet
werden und es können die Bestimmung der Brechzahl des Cytoplasmas durch "Index-Matching"
mittels Immersionsrefraktometrie, die Zellreaktion auf Pharmaka, die Farbstoffbindungskinetik
und vieles anderes mehr untersucht werden.
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Weiterhin ist zu beobachten, daß bei Erhaltung einer laminaren Strömung
im Anströmbereich des Durchfluß spaltes die Passage bzw. Verkeilung anisometrischer
Teilchen und Zellen, Wie z.B.
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von Epithelzellen, vorwiegend in bestimmter Orientierung erfolgt,
wodurch die mikroskopische Untersuchung der Morphologie und im angefärbten Zustand
auch der chemischen Topologie begünstigt wird.
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Die Fig. 3a bis 3c zeigen in verschiedenen Ansichten Möglichkeiten,
durch Einfräsen einer Nut in Flußrichtung in dem gewölbten Boden 19 unterschiedlich
geformte Führungsrinnen für den- Teilchenstrom zu schaffen. Der Boden 19 kann dazu
so hoch angehoben werden, daß seine Kuppe das Abdeckglas 28 berührt (Fig. 3a). Der
Querschnitt der parallel zueinander liegenden Führungsrinnen kann z.B. in Form einer
schwach gekrümmten Rinne 41 ausgebildet sein, er kann aber auch rechteckig 42 oder
keilförmig 43 sein. Der Boden der Führungsrinne wird zweckmäßigerweise im Anströmbereich
leicht geneigt, so daß er stetig in' die Krümmung des Küvettenbodens 19 übergeht
(Fig. 3a).
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Die Möglichkeit, das Querschnittsprofil der Führungsrinnen bzw. des
einzelnen durch den gewölbten Boden 19 gebildeten Spaltes in besonders einfacher
Weise unterschiedlich auslegen zu können, schafft auch die Voraussetzung dafür,
unterschiedliche mechanische oder hydrodynamische Verformungskräfte auf die Teilchen
einwirken zu lassen und deren Verformbarkeit zu untersuchen. Außerdem läßt sich
damit auch die Orientierung anisometrischer Zellen während der Passage durch das
Meßfeld beeinflussen. Weiterhin ist es möglich, z.B. mehrere Führungsrinnen gleichen
Profils aber unterschiedlicher Dimensionierung nebeneinander anzuordnen, um so an
voneinander isolierten Teilströmen gleichzeitig oder nacheinanderden Einfluß mechanischer
Strömungsparameter unter im übrigen identischen Versuchsbedingungen messen zu können.
Da der Küvettenboden 19 jederzeit abgesenkt und bei Verwendung geeigneter Markierungen
schnell wieder in die alte Position gemacht werden kann, lassen sich momentan auftretende
Verstopfungen einer oder mehrerer Führungsrinnen ohne Störung des Versuchsaufbaus
und der optischen Justierung beseitigen.
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Die in Fig. 4a dargestellte Küvette unterscheidet sich von der bisher
beschriebenen dadurch, daß in den Deckel 27 zusätzlich eine Kapillare 44 eingebaut
ist, deren Austrittsöffnung 45 bis nahe an den höhenverstellbaren Küvettenboden
19 herangeführt werden kann. In dieser Ausstattungkann über den Zulauf 11 ein partikelfreier
Flüssigkeitsstrom eingespeist werden, während durch die Kapillare 44 die Zellsuspension
eingeleitet wird. Durch hydrodynamische Fokussierung kann jetzt der Suspensionsstrom
so eingestellt werden, daß die Teilchen bzw. Zellen einzeln nacheinander das Meßfeld
passieren.
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Der Küvettenboden 19 ist hier ein Glaskörper, der in den Träger 20
auswechselbar eingesetzt ist. Auf diese Weise ist
auch eine Durchlichtbeleuchtung
möglich. In die Kuppe des Bodens 19 können wiederum unterschiedliche Führungsrinnen
als Durchflußkanäle eingefräst sein. Besonders vorteilhaft ist es, wenn nur ein
Kanal vorhanden ist, der der Austrittsöffnung 45 der Kapillare 44 gegenüberliegt
(Fig. 4b). Durch Variation der Höhe des Durchfluß spaltes und des-Abstandes der
Kapillare von dem Durchflußkanal können optimale Arbeitsbedingungen eingestellt
werden.
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Fig. 5-zeigt die Strömungsverhältnisse im Beobachtungs- und Meßbereich
in vergrößerter Aufsicht. Das Meßfeld ist durch eine gestrichelt eingezeichnete
Blende 46 angedeutet. Bei der Anordnung'tach Fig. 6 liegen die Einspeisung für die
Zellsuspension und den Mantelstrom übereinander. Ein Plättchen 47 unterteilt den
Küvettenråum 26 auf der Zuflußseite in zwei übereinanderliegende" Räume. Der teilchenfreie
Flüssigkeitsstrom hat die Aufgabe, den Teilchenstrom möglichst einlagig an der Unterseite
des Abdeckglases 28 entlangzuführen, um die Teilchen in der Schärfenebene des Mikroskopobjektivs
33', 38 zu halten. Dabei unterstützt die mögliche Variation der Höhe des Durchfluß
spaltes die Einstellung der günstigsten Arbeitsbedingungen. Die Teilchen verteilen
sich hier über die gesamte Breite des Küvettenbodens 19 quer zur Flußrichtung. Die
Meßsignalgewinnung kann z.B. durch periodisches Verschieben eines Meßfeldes 46 (Fig.
5) in Richtung des Scheitels des Küvettenbodens 19 erfolgen. Die Abtastgeschwindigkeit
ist dabei entsprechend größer als die Fließgeschwindigkeit der Teilchen zu wählen.
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Die Ausgestaltung des Küvettenbodens 19 als bylinderlinse schafft
die Möglichkeit, diese als optisch wirksames Teil der nicht weiter dargestellten
Durchlichtbeleuchtungseinrichtung auszulegen. Durch opake Beschichtung im Bereich
des Linsenscheitels kann eine Dunkelfeldbeleuchtung erzeugt werden, die in bekannter
Weise die Gewinnung eines von der
Teilchengröße abhängigen Meßsignals
ermöglicht. Bei teildurchlässiger, insbesondere dichromatischer Beschichtung, können
z.B. Durchlicht-Streulicht- und Auflicht-Fluoreszenzlicht-Messungen miteinander
kombiniert werden.
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