DE2929018A1

DE2929018A1 - Einrichtung zur messung der aggregation von partikeln mit einer wand oder untereinander

Info

Publication number: DE2929018A1
Application number: DE19792929018
Authority: DE
Inventors: Michael Dr Kratzer; Helmut Prof D Mueller-Mohnssen
Original assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Current assignee: Kratzer Michael Dr 80802 Muenchen De Mueller-
Priority date: 1979-07-18
Filing date: 1979-07-18
Publication date: 1981-02-05
Also published as: DE2929018C2; GB2059051A; GB2059051B

Description

GESELLSCHAFT FÜR STRAHLEN- UND Neuherberg, den 16.JuIi 1979 UMWELTFORSCHUNG MBH, MÜNCHEN PLA 7931 Ga/wk

Einrichtung zur Messung der Aggreaation von Partikeln mit einer Wand oder untereinander

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Beschreibung:

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Messung der Aggregation von dispergierten Partikeln mit der Oberfläche

(Adhäsion)

einer Wand/oder von dispers verteilten Partikeln untereinander in einer Flüssigkeits- oder Gasströmung, wobei dieses flüssige oder gasförmige Mehrphasensystem auf die Wand gerichtet ist.

Die Aggregat!onsneigung dieser Partikel ist ein in der Klinik benötigter diagnostischer Parameter, da Thrombosen in Blutgefäßen und Blutgefäßprothesen durch die Aggregation von Blutzellen und Bestandteilen des plasmatischen Gerinnungssystems aus dem strömenden Blut entstehen. Als Maß der Gerinnungsneigung gilt unter anderem die Aggregationsneigung von Einzelbestandteilen des Gerinnungssystems wie z.B, Thrombozyten. Zu ihrer Messung werden in der Klinik die sog. Aggregometer verwendet. Das Staupunktaggregometer dient zur Bestimmung der Adhasivität u.a. von zellulären Blutelementen unter dem Einfluß vorgegebener hydrodynamischer Kräfte. Rotationssymmetrische Staupunktströmungen von Blutzellensuspensionen erzeugen mechanische Wechselwirkungen der zellulären Elemente untereinander und mit der Oberfläche der angeströmten Wände. Die Wechselwirkungen lassen sich aufgrund von hydrodynamischen Meßwerten als Berührungshäufigkeit (Kollisonsrate) und Berührdrucke quantitativ beschreiben.

Es sind bereits verschiedene Blutzellaggregometer bekannt. Die in Klinik und Forschung am häufigsten verwendeten Verfahren beruhen auf der Messung der Zunahme der Lichttransmission von Blutzellsuspensionen, die mit der Aggregation der Blutzellen einhergeht.

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In dem bereits seit mehereren Jahren im klinischen Labor angewandten Aggregometer von G.V.R.Born (J. of Physiol. (Lond.) 162, 67 (1962))wird plättchenreiches Plasma mit einem magnetischen Rührwerk ständig in konvektiver Bewegung gehalten. Die Strömungsbedingungen (z.B. Geschwindigkeitsfeld) in der Messkammer sind unbekannt. Sie werden je-

u.a.

doch/dadurch standardisiert, daß die Rotationsgeschwindigkeit des teflonbeschichteten Rührmagnetkerns auf einen konstanten Wert eingestellt bleibt. Die Aggregation der Zellen wird durch einen definierten Reiz (z.B. Zugabe von ADP) ausgelöst. Gleichzeitig wird mit Hilfe einer Photozelle die Lichttransmission gemessen. Aggregieren die Blutzellen, so nimmt die Lichtransmission zu. Amplitude und Geschwindigkeit der Zunahme des Photostroms werden in der Klinik als empirisches Maß für die Aggregationsneigung verwendet.

Im Rheoaggregometer von Schmid-Schönbein et al (Thrornb.R_es. 1_, 261 (1975)) , wird die Aggregation einer Blutzellsuspension gemessen, die in einem Kegel-Platte-Rheometer strömt. Der Vorteil dieser Anordnung liegt in der genauen Kenntnis der Strömungsbedingungen in der Meßzelle, da an allen Orten der gleiche einstellbare Geschwindigkeitsgradient herrscht. Die Messung der Aggregation erfolgt wie o.g. Die Anwendung dieses Gerätes beschränkt sich jedoch auf die Forschung.

Bei einem von ί-iarx et al beschriebenen Verfahren (Blut 3., 5.247(1957)) wird plättchenreiches Plasma mit definiertem Voluir.enstrom durch eine Kapillare gepreßt. Die Anzahl der an der Kapillarwand haftenden Thranbozyten wird durch Differenz der Thrombozytenkonzentration vor und nach der Passage der Kapillare durch mikroskopische Auszählungen bestimmt.

Darüberhinaus ist noch ein Verfahren (Baldauf,W. et al. Path.Res.Pract. 163, 9-33(1978)) bekannt, bei dem die Blut-

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partikel durch eine Staupunktsträmung an einer Glaswand abgelagert werden. Die an der Wand haftenden Partikel werden fotographiert und ausgezählt. Dieses Verfahren mißt die Plättchen/ Wand-Aggregat ion oder Adhäsion unter definierten Strörnungshedingungen.

Mit den eingangs genannten ersten beiden Meßverfahren wird nur die Partikel/Partikel Aggregation erfaßt, nicht jedoch die Partikel/Wand Adhäsivität. Die Aggregation läßt sich nicht quantitativ ermitteln, da die Extinktion sowohl von der Anzahl der Teilchen als auch von der Teilchengröße abhängig ist. Die beiden Verfahren liefern nur dann quantitative Werte, wenn entweder die Teilchenzahl oder die Teilchengröße mit anderen Meßverfahren unabhängig gemessen wird -

In der drittgenannten Einrichtung ist die Antransportrate von Thrombozyten an die Kapillarwand nicht eindeutig festgelegt, da die radiale Bewegung der Blutzellen nur durch Diffusion erfolgt. Die .Diffusion von Thrombozyten ist sehr klein und kann um mehrere Zehnerpotenzen schwanken.

Der Nachteil des letztgenannten Verfahrens liegt in dem Bedarf an großen Probemengen (ca. 5oo ml Blut) sowie dem umständlichen und zeitraubenden Auswerteverfahren. Es ist daher nur in der experimentellen Forschung,nicht aber im Routinebetrieb des Klinischen Labors anwendbar.

Die der Erfinduncr zugrundeliegende Aufgabe besteht darin ,eine Einrichtung zu bieten, mit der die Partikel/Wand - und Partikel/Partikel - Aggregabilität und auf diese Weise die Adhäsiyitäten meßbar sind, wobei mit kleinen Probemengen gearbeitet werden kann und die Kollisionsrate Partikel/Partikel bzw. Partikel/Wand genau festgelegt ist. Schließlich soll die Auswertearbeit möglichst einfach und die Wand auswechselbar sein, so daß sie sich als Objektträger für das anhaftende Aggregat verwenden läßt und das Aggregat fixiert.

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Die Lösung dieser Aufgabe ist in den Merkmalen des Anspruches beschrieben. Die Merkmale der Ansprüche 2 bis 6 geben vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung an, während das Merkmal des Anspruches 7 ein besonders vorteilhaftes Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Einrichtung wiedergibt. Insbesondere können mit der Erfindung Wände bzw, natürliche Blutgefäße mit standardisierten Teilchen getestet werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels mittels der Fig. 1 bis 3 näher erläutert, wobei die Fig. 1 die Anordnung schematisch wiedergibt. Die Fig. 2 und 3 zeigen eine zeitliche Aggregationskurve an Wolframsäureteilchen und die Fig. 3 dieselbe von Thrombozyten.

Das erfindungsgemäße Gerät ist in Fig. 1 dargestellt. In der Kammer zwischen den Wänden 4 und 4' herrscht eine rotationssymmetrische Staupunktströmung 11, 12. Für die Antransporte der Partikel 5 gegen die Wand 4 gilt näherungsweise die Gleichung 1:

r 2
P,

t VR AR / 2.

wobei r = Partikelradius, γ = Scherrate am Ort R (R = Ab-

P
stand vom Staupunktzentrum), C = Konzentration der Partikel, t = Zeit ist. Die Gültigkeit der Gleichung 1 wurde experimentell nachgeprüft.

Die Scherrate γ wird als Funktion von R für die Geometrie der betreffenden Staupunktströmung ausgemessen, die von der Form der Kammer sowie dem Volumenstrom abhängig ist.

Die Menge der an der Wand 4 abgelagerten Partikel 5 (z.B. Thrombozyten) wird mit der Streulichttechnik gemessen. Das von der Suspension angeströmte Deckgläschen 4 wird hierbei im Auflichtoder Durchlicht(gestrichelt gezeichneter Kondensor 13 und Strahlung 2)-Dunkelfeld beleuchtet und die Intensität des Streulichts 6 mit einem Photodetektor Io gemessen. Zur Abschätzung der Thrombozytenzahl wird angenommen,

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1) daß die Thrombozytenkonzentration C und die Volumina V der Einzelthrombozyten für alle Plättchen 4 einer Probe annähernd gleich sind,

2) daß der Brechungsindex η und die Konzentration der kolloiddispersen intrazellulären Proteine, die als Streuzentren wirken, bei allen Thrombozyten einer Probe gleich ist und

3) daß der Durchmesser der streuenden Proteine kleiner als die Wellenlänge λ des Beleuchtungslichtes 2 bzw. 3 ist.

Unter diesen Umständen kann in erster Näherung die Beugungstheorie von Rayleigh nach Gleichung 2 angewendet werden:

dabei ist: I = Intensität der Streustrahlung 6 von einem Ha

Plättchen, I = Intensität des einfallenden Lichtes 2 bzw. 3, Λ = Wellenlänge des einfallenden Lichtes 2 bzw. 3, R = Abstand des Objektives vom Streuzentrum 18, V= Thrombozytenvolumen, η,ρ = Brechungsindex der intrazellulären Proteine, η = Brechungsindex der Elektrolytlösung, aWinkel zwischen Dipol-Schwingung und Beobachtungsrichtung. Ist die Verdünnung der Teilchen 5 hinreichend groß, so daß sie sich weder für das Primärlicht 2 bzw. 3 noch für das Streulicht 6 gegenseitig abschatten, so errechnet sich die Anzahl N der abgelagerten Thrombozyten wie folgt nach Gleichung 3:

_{N =}

Ra

wobei I_G = gesamte gemessene Streulichtintensität und Iy .= Streulicht des Untergrundes, bedingt durch Plasmaproteine und Reflexe am Glas 4, ist.

Das aus dem Staurohr 1 mit der Düse 19 ausströmende flüssige oder gasförmige Mehrphasensystem 11, 12 (z.B. Plättchenreiches Plasma) wird senkrecht gegen die Glaswand 4

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der Küvette 4, 4' gerichtet (Staupunktströmuncr) -Sofern die Adhäsivität zwischen Partikel 5 und Glaswand 4 einen Minimalwert überschreitet und geeignete Strömungsgeschwindigkeiten herrschen, führt die Staupunktströmung zu einer Anlagerung der Teilchen an die Glaswand 4 und zwar in einem Flächenbereich 15 der der ebenen Projektion der Öffnung der Düse 19 auf die Glaswand 4 entspricht (Staufläche). Der Durchlichtkondensor 13 (gestrichelt gezeichnet) bzw. der Auflichtkondendor 14 fokussiert das Licht 2 bzw. 3 einer starken Lichtquelle (Xenon-Lampe, nicht näher dargestellt) auf die Höhe der Grenzfläche Wand/Fluid. Das Objektiv 7 fängt das von den abgelagerten Partikeln 5 gestreute Licht 6 auf und erzeugt einτ Bild der Partikel 5 in der Ebene der Zentralblende 8. Das durch die Zentralblende 8 durchtretende Licht 2o wird durch die Feldlinse 9 gebündelt 21 und fällt auf die Photokathode eines Photoelektronen-Vervielfachers 10. Dessen Ausgangssignal wird verstärkt und mit Hilfe eines Direktschreibers als Funktion der Zeit registriert (nicht dargestellt}.

Beleuchtungsapparat 2_r 3, 13, 14, Abbildungssystem 6, 7, 9, und Photokathode 10 sind derart miteinander konjungiert, daß nur das in der Ebene 8 entstehende Streulicht 6 ein photoelektrisches Signal erzeugt (Verminderung der Schärfentiefe auf 1 μτη bis 5o pm). Da die Zentralblende 8 auf den Staupunkt 15 zentriert wird, herrschen wegen der rotationssymmetrischen Strömung 11,12 in der ringförmigen Meßebene 16 überall gleiche Beträge der Geschwindigkeitskomponenten ( gleiche Antransportrate und gleiche Scherrarten).

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Meßbeispiel 1

Fig. 2 zeigt die zeitliche Aggregationskurve einer wäßrigen Suspension con ca. 3 pm großen Wolframsäure-Plättchen (Teilchenkonzentration = 50.000 Teilchen/mm ). Der erste Abschnitt der Kurve (0 - 3.2 min) zeigt die photoelektrischen Signalschwingungen der vorbeiströmenden stabilen Ausgangssuspension. Die Photospannung (Photodiode 10) beträgt im Mittel etwa 21 V. Die Schwankungen gehen auf statistische Konzentrationsschwankungen der Partikel 5 im Meßfeld 16 zurück.

Wird die NaCl-Konzentration der Suspension 5 durch Zugabe (s.Pfeil) einer konzentrierten NaCl-Lösung von ca. Null auf 0,9 M Mol erhöht, so wird die Dispersion instabil: Einige Partikel 5 haften an der Wand und aneinander: Die Partikel/Wand- und die Partikel/Partikel-Adhäsivität ist erhöht. Der Aggregationsvorgang führt während der dargestellten Zeit zu einem annähernd linearen zeitlichen Anstieg der Photospannung V.

Als Mikroskop-Photometer wird das Gerät MPV Leitz (300 V Betriebsspannung) , als Objektiv ein Leitz Ultropak U-O 22 mit Auflichtkondensor 22-100 und als Lichtquelle eine Xenon-Lampe verwendet (25 A Gleichstrombetrieb). Im vorliegenden Experiment betrug der Austrittsdurchmesser der Düse 19 0,5 mm und der Wandabstand der Düse 19 0,5 mm und der Volumenstrom im Staupunktaggregometer 0,06 mm/s.

Meßbeispiel 2

Im folgenden Fall (Fig. 3) strömt plättchenreiches Rinder-Plasma durch das Staupunktaggregometer. Die Thrombozytenaktivität ist durch Zugabe von 3,5 χ 10~ M ADP zum Plasma angeregt. Im ersten Teil der Kurve (0 - 32 min) findet sich ein langsamer Anstieg der Lichtstreuung 6 mit der Zeit, der durch Adhäsion von einzelnen Thrombozyten an der Wand 4 bedingt ist (Befund der Einzelzellablagerungen durch konventionelle Nachuntersuchung

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mikroskopisch überprüft). Die Wandschubspannung beträgt am Meßort O, 7 dyn/cm". Aus diesen Kurvenabschnitt läßt sich die Thrombozyten-Wand Adhäsivität ermitteln. Erhöht man die Wand-

schubspannung auf 3 dyn/cm , so lagern sich Blutplättchen 5, die mit der Strömung in Wandnähe gleiten, an die bereits abgelagerten Blutplättchen an.

Es kommt zu einem steilen Anstieg der Streulichtintensität 6. Dieser zweite Kurvenabschnitt (32 - 40 min) repräsentiert vorzugsweise die Plättchen-Plättchen-Adhäsivität (Befund der polyzellulären Ablagerungen mikroskopisch bestätigt).

Benutzt wurde ein Objektiv UO 52 W Leitz; die Teilchenkonzentration betrug 50.000 Plättchen/mm .

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e e r s e ite

Claims

Patentansprüche:

1.) Einrichtung zur Messung der Aggregation von dispergierten Partikeln mit der Oberfläche einer Wand (Adhäsion) oder von dispers verteilten Partikeln untereinander in einer Flüssigkeits- oder Gasströmung, wobei dieses flüssige oder gasförmige Mehrphasensystem auf die Wand gerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die an der Wand (4) und/oder aneinander haftenden Partikel (5) mittels einer optischen Beleuchtungsvorrichtung (3, 14 bzw. 2, 13) in Auf- oder Durchlichttechnik beleuchtbar sind, und daß das gestreute, reflektierte oder durch Absorption geschwächte Licht (6) mit einem Objektiv "(7) auf einen Detektor (10) richtbar und auswertbar ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung (13 bzw. 14) ein ringförmiger Kondensor ist.

3. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wand (4) eine Glasplatte ist oder aus einem Kunststoff oder einem lebenden oder präparierten organischen Gewebe besteht.

4. Einrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtung mit Infrarotlicht (2 bzw. 3) erfolgt.

5. Einrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß in der Bildebene des Objektives

(7) eine Zentralblende (8) angeordnet ist.

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6. Einrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte (4) mit den Partikeln (5) als Präparat für getrennt durchführbare mikroskopische Untersuchungen geeignet ist.

7. Anwendung der Einrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden für die Messung der Aggregationsneigung von Bestandteilen des zellulären und plasmatischen Gerinnungssystems wie Blutzellen (Thrombozyten) und kolloidal disperse Blutbestandteile (Fibrinogen).

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