DE3012242A1

DE3012242A1 - Parabolischer zellenanalysator

Info

Publication number: DE3012242A1
Application number: DE19803012242
Authority: DE
Inventors: Mary Jane Skogen Hagenson; Gary Clyde Salzman
Original assignee: US Department of Energy
Current assignee: US Department of Energy
Priority date: 1979-03-28
Filing date: 1980-03-28
Publication date: 1980-10-09
Also published as: US4200802A; FR2452705A1; JPS55131750A; CA1117310A; GB2044951A

Description

UNITED STATES DEPARTMENT OF ENERGY, Washington, D.C. 20545, USA

Parabolischer Zellenanalysator

Die Erfindung bezieht sich auf zellulare Strömungssysteme und insbesondere auf ein Zellenströmungssystein unter Verwendung parabolischer reflektierender Kammern.

Strömungs-Mikrofluorometer sind auf vielen Gebieten der biologischen Forschung von großem Wert und verwenden typischerweise einen Laser als eine Anregungsquelle und fangen ungefähr 2,5 % der gesamten Zellenfluoreszenz bei Verwendung von Standard-Optikeinrichtungen auf. Es besteht ein Bedürfnis nach einer besseren Instrumentierung derart, daß genauere biologische Untersuchungen ausgeführt werden können. Dazu gehört die Feststellung von Leben aus biolumineszenten Reaktionen, und die quantitative menschliche Chromosomenanalyse (karyotyping), Bestimmung des DNA-Gehalts peripherer Lymphozytaifür die genetische Analyse. Derartige moderne Instrumente sehen eine erhöhte Auflösung vor, einen erhöhten Lichtsammlungswirkungsgrad und eine erhöhte Systemverwendbarkeit und Anwendbarkeit unter Verwendung der Breitbandemission, d.h. unter Verwendung von 250-1000 Nanometer (nm) Lichtquellen.

Ein derartiges modernes Instrument ist in US-PS 3 946 239 beschrieben. Dieses Patent bezieht sich auf ein Zellenströmungsoder Flußsystem unter Verwendung einer Ellipsoid-Strömungs-

TFlEFON: (0S9> 29 8527

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TELEQHAMM: PATLAW MÜNCHEN

TELEX: S-22O30 paCw Ci

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kammer mit licht-reflektierenden Wänden, wobei stark erhöhte Signal-zu-Rauschverhältnisse gegenüber bekannten Systemen erreicht werden. Das Ellipsoid-Zellenströmungssystem liefert eine erhöhte Auflösung, die besonders wertvoll bei der Betrachtung schwach fluoreszenter Teilchen ist, wie beispielsweise von Bakterien und asymmetrischen Teilchen wie beispielsweise Chromosomen und Säugetierzellen.

Gemäß der Erfindung wird eine Zellenanalyse-Vorrichtung vorgesehen, die ein Gehäuse aufweist, welches einen Paraboloid-Hohlraum enthält, der eine Drehachse besitzt, einen Brennpunkt sowie lichtreflektierende Wände. Zellen und ein Bündel aus im wesentlichen parallelen Lichtstrahlen laufen durch den Brennpunkt, um sich senkrecht dort zu treffen. Das durch die durch das Bündel bzw. den Strahl laufenden Zellen gestreute oder zur Fluoreszenz gebrachte Licht wird nach Reflexion durch die Hohl-Raumwände gesammelt. Die Intensitätsverteilung des Lichts wird zur Bestimmung vorgewählter Charakteristiken der Zellen verwendet. Reflektiertes fluoreszierendes oder ursprünglich gestreutes Licht kann zur Erzeugung eines Gesamtstreusignals gesammelt werden. Im Falle reflektierten Lichts kann ein Streuspektrum,im Falle fluoreszenten Lichts kann ein Fluoreszenzspektrum erhalten werden.

Ein Ziel der Erfindung besteht darin, den Strömunysfluß oder Strömungspfad zu minimieren und die Strömungsstabilität zu erhöhen, wobei der Gesamtsammelwirkungsgrad in einem Zellenströmungssystem erhöht wird. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine Zellenmessung mit hoher Auflösung vorzusehen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, asymmetrische Zellenorientierungsinformation zu liefern.

Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß der Sammel- oder Kollektionswirkungsgrad in der Größenordnung von ungefähr

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80 % liegt.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß das Gesamtstreusignal gesammelt werden kann.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich insbesondere aus den Ansprüchen sowie aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 ein System gemäß der Erfindung;

Fig. 2 einen Querschnitt durch das den Hohlraum enthaltende Gehäuses;

Fig. 3 einen weiteren Querschnitt des den Hohlraum enthaltenden Gehäuses.

Fig. 1 zeigt ein Gehäuse 12, welches einen Paraboloid-Hohlraum mit einer kontinuierlichen Wand oder Wänden 14 enthält. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel kann das Drehparaboloid beispielsweise 2,0 mm Brennweite, eine Tiefe von 40 mm und eine öffnung (Apertur) von 35,77 mm aufweisen. Die Wände 14 sind mit einer dünnen aufgedampften Goldlage versehen, um das Reflexionsvermögen innerhalb des gewünschten Spektrums, d.h. zwischen ungefähr 250 and 1000 nm vorzusehen, öffnungen in der Oberfläche sind so klein als möglich gemacht, um den maximalen Sammelwirkungsgrad zu bewahren. Wie man besser in Fig. 3 erkennt, ist ein Probenrohr 16 und ein Mantelrohr 18 vorgesehen, um Pfade oder Bahnen zu schaffen für das die Probe enthaltende Strömungsmittel und das Mantel- oder Umhüllungsströmungsmittel/ die in den Hohlraum eingeführt werden und durch den Brennpunkt 20 des Drehparaboloids verlaufen. Die Strömungsmittel treten über eine Düse 22 ein und werden nach Durch-

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gang durch den Brennpunkt durch ein Sammelrohr 24 aufgenommen. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß die Düse 22 in die Kammer ragt, um einen minimalen Transit oder Durchlaufabstand für die Proben- und Mantel-Strömungsmittel vor deren Durchgang durch den Brennpunkt 20 vorzusehen. Die Kammer ist mit Strömungsmitteln, normalerweise destilliertem Wasser, angefüllt. Ein Laserstrahl 25 wird durch den Brennpunkt 20 geleitet, und er tritt durch einen Strahleninjektor 26 ein und durch ein Strahlenempfangsglied 28 aus. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel wird ein Argonionenlaser verwendet .

Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel mit den zuvor erwähnten Abmessungen erstreckt sich die Einlaßdüse 22 3 mm in das Paraboloid hinein, wodurch die Proben- und Mantel-Strömungsmittel 1 mm oberhalb des Brennpunkts 20 injiziert werden. Die Düse 22 ist mit einem dem Fachmann bekannten Drucksystem gekoppelt, welches eine unabhängige Steuerung der Proben- und Mantel-Strömungsmittel vorsieht, was eine sehr feine Probenstromsteuerung ermöglicht. In der Praxis wird ein laminarer Probenstrom mit einer Breite bis hinab zu 6,0 Mikrometer Durchmesser für eine Zeitspanne von über 1 Stunde erhalten.

Das von dem Paraboloid emittierte Licht ist primär ein kollimierter Strahl aus Fluoreszenzlicht und gestreutem Licht von ungefähr 35 mm Durchmesser, der durch ein Quarzfenster 30 verläuft, welches mit der Kammer durch einen O-Ring 32 und ein Klemmglied 34 abdichtend verbunden ist. Die Kammer ist mit Strömungsmittel durch Düse 22 angefüllt, wohingegen ein Vakuum an einen Blasenablaß 38 angelegt ist.

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Ein entfernbarer Strahlenteiler 40 kann zur Beobachtung des Kammerinneren vorgesehen sein. Eine plankonvexe Linse 42 wird zur Fokussierung der Lichtausgangsgröße auf eine 500/um öffnung in einem opaken Schirm 44 verwendet. Durch die öffnung im Schirm 44 verlaufendes Licht wird durch eine bikonvexe Linse 46 gesammelt und auch auf die öffnung oder Apertur in Schirm 44 fokussiert. Diese Kombination aus Linsen und Apertur erzeugt ein räumliches Filter zum Herausfiltern des Fluoreszenzlichts und gestreuten Lichts, welches nicht anfänglich kollimiert wurde. Licht, welches nicht anfänglich kollimiert wurde, ist dasjenige Licht, welches nicht durch die Oberfläche des Paraboloids reflektiert wurde. Das räumliche Filter erzeugt einen kollimierten Strahl, der ungefähr 16 mm Durchmesser beim bevorzuqten Ausführungsbeispiel besitzt. Ein Fluoreszenzstrahl dieser Größe beleuchtet, sobald er durch ein 488 nm Interferenzfilter übertragen wurde, ungefähr 90 % der Stirnfläche einer RCA 4526 Fotovervielfacherröhre.

Durch das räumliche Filter laufendes Licht wird auf einen dichroischen Strahlenteiler 50 geleitet. Licht mit einer 90° Streuung würde im Strahlenpfad 52 liegen und das mit -90° Streuung im Strahlenpfad 54. Auf diese Weise wird gestreutes Licht über den Fotodetektorring 56 hinweg verteilt, der im bevorzugten Ausführungsbeispiel 60 Detektoren besitzt, die jeweils um 5,6° um den Umfang des Rings herum angeordnet sind. Das durch den dichroischen Strahlenspalter 50 laufende Licht wird auf ein eine niedrige Auflösung besitzendes Beugungsgitter 60 geleitet, wie beispielsweise eines welches ungefähr 300 Linien pro mm besitzt. Das Beugungsgitter 60 beugt das Licht in mehrere Beugungsordnungen, wie dies bekannt ist. Eine Linse 62 leitet das fluoreszente

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Licht der ersten Beugungsordnung auf die Enden von fiberoptischen Lichtleitern 64, so daß eine Probe des fluoreszenten Spektrums beispielsweise durch die Fotovervielfacher röhren 66 gesammelt werden kann.Daher kann eine Probe des fluoreszenten Spektrums bei einer Anzahl von Wellenlängenintervallen gesammelt werden, und es kann auch eine Probe des gestreuten Lichtes bei verschiedenen Winkeln von den gefärbten Zellen auf eine Zelle-zu-Zellebasis gesammelt werden. Eine Vielzahl von Fluoreszenzspektren, die für die unterschiedlichste Information, und zwar einschließlich (aber nicht ausschließlich) der verstärkten Signal-zu-Rauschverhältnisse in Spektralbereichen die interessieren, da die unerwünschten Wellenlängen ausgeschlossen sind, und ferner eine erhöhte Spektralauflösung verglichen mit der Zweifarbenfluoreszenz, was tiefere Untersuchungen von Teilchen gestattet, die mit einem oder mehreren Photochromen gefärbt sind.

Der hohe Wirkungsgrad des erfindungsgemäßen Systems ermöglicht die Analyse schwach fluoreszenter Teilchen, die bei üblichen bekannten Zellenanalysesystemen mit ihren typischen Rauschpegeln nicht detektiert werden könnten, weil nämlich durch den paraboloidförmigen Hohlraum die Auflösung in den Fällen verbessert wird, wo die Teilchenfluoreszenz nicht hell ist, und wobei ferner die durch die Systeme mit Schmalwinkelbeleuchtung und Sammeloptik gesehenen Fremdkörper (Artifacten) reduziert werden. Der hohe Wirkungsgrad der Paraboloidstruktur gestattet auch die Verwendung eines Lasers mit geringerer Leistung als sie üblicherweise bei bekannten Systemen benötigt werden.

Die Paraboloidoberfläche kann zur Beleuchtung und auch zum Sammeln verwendet werden. Der Vorteil davon ist die gleichförmige Anregung der Teilchen am Brennpunkt. Da kein biologischer Gegenstand vollkommen symmetrisch ist, können

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Fremdkörper mit den Fluoreszenzsignalen eingeführt werden, wenn nur die fokussierte Strahlbeleuchtung verwendet wird.

Die verschiedenen Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der obigen Beschreibung, wobei durch weitere Merkmale und Vorteile für den Fachmann auch aus der Zeichnung zu entnehmen sind.

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L e e r s e it e

Claims

Patentansprüche

θ Zellenanalysevorrichtung gekennzeichnet durch ein Gehäuse (12), welches einen Paraboloidhohlraum mit einer Drehachse, einen Brennpunkt (20) und lichtreflektierende Wände (14) enthält,

Mittel (22) zum Hindurchleiten von zu analysierenden Zellen durch den Brennpunkt (20) des Paraboloidhohlraums,

Mittel (26), um einen Strahl (25) aus im wesentlichen parallelen Lichtstrahlen derart durch den Brennpunkt zu leiten, daß dieser auf jedwede dort hindurchverlaufende Zellen auftrifft, und

Mittel (56,66) zum selektiven Sammeln des durch öie durch den Strahl am Brennpunkt laufenden Zellen reflektierten Lichts zur Bestimmung vorgewählter Eigenschaften der Zellen.
2. Vorrichtung nach Anspi oh 1, dadurch gekennzeichnet, daß im wesentlichen das ganze reflektierte Licht zur Zeugung eines Gesamtstreusignals gesammelt wird.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch g ekennzeichnet, daß die selektiven Lichtsammelmittel Mittel aufweisen, um nur von den Zellenwänden reflektiertes Licht zu sammeln, welches aus dem Hohlraum parallel zu dessen Drehachse austritt.

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4. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammelmittel ein räumliches Filter aufweisen.
5. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammelmittel eine Fotodetektorringanordnung aufweisen.
6. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere Anspruch 5, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Anordnung ungefähr 60 Detektoren aufweist, die mit jeweils ungefähr 5,6° verteilt angeordnet sind.
7. Zellenanalysevorrichtung gekennzeichnet durch

ein Gehäuse, welches einen Paraboloidhohlraum mit einer Drehachse, einem Brennpunkt und lichtreflektierenden Wänden umfaßt,

Mittel zum Hindurchleiten von zu analysierenden Zellen im wesentlichen durch den Brennpunkt des Paraboloidhohlraums,

Mittel, um einen Strahl aus im wesentlichen parallelen Licht einer ausgewählten Wellenlänge durch den Brennpunkt zu leiten, um auf irgendeine Zelle aufzutreffen, die durch den Brennpunkt läuft, um die Zelle zur Fluoreszenz zu veranlassen, und

Mittel zum selektiven Sammeln von Licht, welches durch die Zellen zur Fluoreszenz gebracht ist, die durch den Strahl am Brennpunkt laufen, um daraus die Zelleneigenschaften zu bestimmen.

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8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet/ daß die Sammelmittel ein räumliches Filter aufweisen, um nur fluoreszierendes Licht hindurchzulassen, welches parallel zur Drehachse läuft, und mit einem Beugungsgitter zur Aufnahme des parallelen fluoreszierenden Lichts und zum Beugen des Lichts in mindestens ein Beugungsspektrum erster Ordnung, wobei Mittel vorgesehen sind, um das Beugungsspektrum erster Ordnung auf eine Brennebene zu fokussieren, wobei schließlich Mittel zur quantitativen Detektierung des auf die Brennebene aufprallenden Beugungsspektrums dienen.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitativen Detektormittel eine Vielzahl von Fotovervielfacherrohren aufweisen.
10. Kammergebilde zur Verwendung in einem Zellenanalysesystem gekennzeichnet durch

ein einen Paraboloidhohlraum mit einem Brennpunkt und einer Drehachse enthaltendes Gehäuse,

Mittel zum Hindurchleiten eines Laserstrahls" durch den Brennpunkt im wesentlichen senkrecht zur Drehachse, und

Mittel, welche eine Düse aufweisen, die in das Kammergebilde im wesentlichen senkrecht zur Drehachse und dem

Laserstrahl hineinragt, um einen Strom aus zu analysierenden Zellen durch den Strahl im wesentlichen am Brennpunkt zu leiten.

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