DE2215687B2

DE2215687B2 - Neue wasserunlösliche Proteinpräparate

Info

Publication number: DE2215687B2
Application number: DE2215687A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dr. 5074 Odenthal Bartl; Bruno Dr. 5090 Leverkusen Boemer; Fritz Dr. Hueper; Erich Dr. Rauenbusch; Guenter Dr. Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-30
Filing date: 1972-03-30
Publication date: 1980-03-27
Also published as: JPS496114A; GB1413382A; US3871964A; EG11503A; FI52731C; SU576959A3; IT1003076B; CH594010A5; DE2215687A1; IL41886A0; DD108996A5; DK138953B; HU169022B; PL90704B1; BE797505A; DE2215687C3; AR201660A1; IE37477B1; RO74876A; NL7304331A

Description

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Die Erfindung betrifft neue wasserunlösliche Protejnpräparate, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Proteine handelt, welche ar. neue, vernetzte, quellfähige Copolymerisate fixiert sind. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen wasserunlöslichen Proteinpräparate und die Verwendung von neuen wasserunlöslichen Enzympräparaten zur Durchführung von durch Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z.B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.

Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymere des Maleinsäureanbydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wäßrigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so daß vor oder während der Umsetzung zweckmäßig ein zusätzlicher Vernetzer, z. B. ein Diamin, zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vgl. E Katchalski, Biochemistry 3 [1964], Seiten 1905-1919).

Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine ;,ur mäßige mechanische Stabilität, was zu AbrieLsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vgl. deut«. he Offenlegungs- r. schrift 19 08 290).

Außerdem wurden stark vernetzte Tiägerpolynere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt. Aufgrund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen — in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid —, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jewei- 4-. ligen Verwendungszweck angepaßt werden kann (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 20 08 996).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit neuen stark vernetzten, in Wasser quellfähigen Copoly- w merisaten mit stark variierbarem Gehalt an cyclischen Dicarbonsäureanhydridgruppen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden. Die neuen Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit den neuen Copolymerisaten sollten die Nachteile der bisher be- v> kannten Proteinpräparate nicht bzw. nur in geringerem Maße aufweisen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß nach den Methoden der Perl- oder Fällungspolymerisation Anhydride Ä^-monoolefinisch ungesättigter Dicarbonsäu- bo ren, Di- oder Poly-(Meth)Acrylate von Di- oder Polyölen und mindestens ein weiteres hydrophiles Monomere zu statistisch aufgebauten Copolymerisaten polymerisiert und diese erfindungsgemäßen Copolymerisate mit wäßrigen Proteinlösungen zu Proteinpräparaten umgesetzt wurden.

Gegenstand der Erfindung sind somit Protein«:, die an vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymeri- B 35 -90Gew.-<%,

C 5

sierten Einheiten von

A 0,1 — 30 Gew.-%, vorzugsweise 2—20 Gew.-% «,^-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4—9 Kohlenstoffatomen,

B 35 —90Gew.-%, vorzugsweise 50—85 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten von Di- und/oder Polyolen und

C 5 —60Gew.-%, vorzugsweise 10—50 Gew.-% mindestens eines nicht unter B genannten hydrophilen Monomeren,

wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2—20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1 —400 mVg besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0,02—11 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, fixiert sind.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Proteinpräparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere —

A 0,1 —50 Gew.-%, vorzugsweise 2—25 Gew.-°/o «^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 50—85 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

—60Gew.-%, vorzugsweise 10—50 Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren

— die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 —

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20—200°C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und die so erhaltenen Copolymerisate mit Proteinlösungen unter Bildung der erfindungsgemäßen Proteinpräparate umsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von erfindungsgemäß erhaltenen wasserunlöslichen Enzympräparaten zisr Durchführung von durch Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Über die Darstellung der als Ausgangsprodukte für die Synthese der Proteinpräparate benötigten Copolymerisate ist folgendes zu sagen.

Als Λ,/3-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 —5 Kohlenstoffatomen, die für die Herstellung der Copolymerisate benötigt werden, seien namentlich genannt: Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Polymethacrylate bzw. Di- und/oder Polyacrylate von Di- und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxiden mit 2—8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2—4 Kohlenstoffatomen

oder Gemischen dieser Alkylenoxide ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1-1(M₁ bevorzugt 1 — 10 Alkvlenoxidbausteine anpolymerisiert sind. Beispielhaft seien Alkylenoxide, Äthylenoxid, Propylenoxid, Butylenoxjd, Trimethylenoxid, Tetramethylenoxid, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxid, vorzugsweise Äthylenoxid und Propylenoxid genannt Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff-aktiven WasserstuFfatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Alkylenoxiden zur Herstellung der Di- und/oder Poly-(Meth)-Acrylate zu verwenden.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Di- und PoIy-(Meth)Acrylate von Di- und Polyolen werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di- und/oder Polyole mit (Meth)Acryisäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 20⁰C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vgl. deutsche Offenlegungsschrift i9 07 666). Ais Di- bzw. Polyoie mit mindesten¹; 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2—12 Kohlenstoffatomen kommen z. B. in Frage: Äthylenglykol, Propandiol-1,2, Propandiol-1,3, Butandiole, insbesondere Butandiol-1,4, Hexandiole, Dekandioie, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pantaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxiden, wie vorstehend angegeben. Auch Poly-bis-chlormethyl-oxacyclobutan oder Polystyroloxid sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2—4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 — 10 Molen Alkylenoxid mit 2—4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.

Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol. Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgewichten bis 500 oder deren Gemische.

Die uritte Gruppe der Copolymerisationskomponenten besteht aus einfach ungesättigten, hydrophilen Monomeren. Als solche können alle polymerisierbaren, einfach ungesättigten Verbindungen, welche keine gegen Anhydridgruppen reaktiven funktionellen Gruppen besitzen und hydrophile Polymere bilden, verwendet werden.

Die hydrophilen Monomeren besitzen vorzugsweise mindestens eine Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfamoylgruppe. wobei die Aminogruppen des Aminocarbonyl- oder Suliumoylrestes ggf. durch Alkylgruppen mit 1 —4 Kohlenstoffatomen oder durch Alkoxymethyl mit i —4 Kohlenstoffatomen im Alkoxyrest substituiert sein können.

Beispielhaft seien Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäurehalbester mit 1—8 Kohlenstoffatomen im Alkoholrest, N-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon, Methacrylamid, N-substituierte (Meth)Acrylamide wie N-Methyl- und N-Methoxymei.hyl-(meth)-acrylamid und N-Acryloyl-dimethyltaurin genannt.

Sie werden je nach der gewünschten Hydrophilie und Quellbarkeit der Copolymeren und der Länge der PoIyalkylenoxidkette(n) des mehrwertigen (Meth)-acrylesters in Mengen von 5 — 60 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt.

Außer der Hydrophilie beeinflußt der Zusatz dieser Monomeren überraschenderweise auch die Struktur der Polymeren, wti bei der Herstellung von Perlpolymerisaten von ganz besonderem Vorteil ist, da hier die Auswahl der zur Monomerenmischung zufügbaren Verdünnungsmittel durch die Bedingungen der Unlöslichkeit in Paraffinkohlenwasserstoffen und der Inertheit gegen Anhydridgruppen stark eingeschränkt wird.

Aufgrund der Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der

ίο erfindungsgemäßen Copolymeriate dem jeweiligen Verwendungszweck optimal angepaßt werden.

Falls gewünscht können neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Poly-(Meth)AcryIaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0,01—30 Gew.-°/o der Monomerenmischung zugesetzt werden.

Die Polymerisation kann z. B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation ausz-ifaiien beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie halogensubstituiert..' Kohlenwasserstoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.

Beispielhaft seien genannt: Heptan, Octan, Isooctan. Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis

.«ι 200°C, Cyclohexan, Benzol, Toluo'., Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole. Äthylacetat. Butylacetat.

Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 60"C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmischung verwendet man etwa 2—50, bevorzugt 5 — 20 Gew.-Teile, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittel: wesentlich

41· beeinflußt.

In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation konti-

4"· nuierlich ein Fäliungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch /u bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Außerdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigneten Initiator als

->n Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmittelmenge eingespeist werden, so daß während der Polymerisation eine gleichmäßige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird. Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschied-

V) licher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen 'assen sich innerhalb e'nes sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßter Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.

Mi Die erfirh'dngsgemäßen Copolymerisate werden vorzugsweise durch Suspensionspolymerisation hergestellt. Die gebräuchlichste Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, ggf. untef Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in Wasser suspendiert werden,

t,5 läßt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da u^s Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase übergeht und nur in geringer Menge in das

Polymere eingebaut wird Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmäßig in organischem Medium durchgeführt. Als zusammenhängende Phase eignen sich besonders Paraffinkohlenwasserstoffe, wie Hexan. Heptan, Octan und höhere Homologe. Cycloaliphaten wie Cyclohexan, sowie Paraffingemische wie Benzin fraktionen oder Paraffinöl. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril. Dimethylformamid. Dimethylsulfo.xid oder Hcxamcthvlphosphorsäuietriamid gelöst und meistens unter /us.it/ von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt. Das Volumenverhältnis. zusammenhängende Phase : Monomerphasc beträgt 1 : 1 bis 10 : !. vorzugsweise 2:1 bis 5 : 1.

Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und -dioleate sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- und -triolcatc bzw. -slearale. Polyäthylenglykolmonoäther mit Ste aryl- bzw. !.allylalkohol oder Nonylphenol. Polyäthylcnglykolmonoester mit Ölsäure. Stearinsäure und anderen Fettsäuren mit mehr als IO C-Atomen, sowie das Na-SaIz des Sulfobernstcinsäiiredioctylesters vor wendet werden. Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0.1 — 10%. bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die PartikelgröUc der Suspensionspols mcrisatc kann außer durch Vergrößerung der Rührgeschsvindigkcit durch Zugabe von 0.01 — 2V«, bezogen auf Monomere, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates verringert werden.

Die Polymerisation wird durch radikalische Initiatoren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z. B. Azoverbindungen oder Perserbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxide wie Dibenzoylperoxid oder Percarbonate svie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat in Frage, es können jedoch auch Diacylperoxide. Hydroperoxide und in organischen Lösungsmitteln wirksame Kedoxsystcne zur Initiierung verwendet werden.

Die Initiatoren werden in Mengen von 0.01 —!0"i>. vorzugsweise 0.1 — 3%. bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomennischung zugesetzt.

Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 — 2(XTC. vorzugsweise 50—100 C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymei tsationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Außerdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.

Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1,5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2—20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0,1 —500 m²/g. bevorzugt 1 —400 m²/g. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0,01 bis 14 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0,02— II mÄquiv/g.

Die Suspensionspolymerisate sind weiße oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmäßig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03—3 mm, vorzugsweise 0,05—05 mm und Schüttvolumina von etwa 1,4—8 ml/g, vorzugsweise 1,4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydrid-

gruppen bestimmter Carboxylgruppengchalt beträgt 0,01 — 14 mÄquiv/g. vorzugsweise 0.02— 11 niAquiv/g.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate enthalten die copolymcrisierten Einheiten im wesentlichen statistisch verteilt. Aufgrund ihrer hohen Vernetziingsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbyr.

Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1,1 ■ bis 3fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können. Außerdem besitzen sie eine ausgezeichnete mechanische Stabilität und damit praktisch keinen Abrieb.

Die oben beschriebenen Trägerharzc binden alle Substanzen, die eine funktionell Gruppe tragen, die befähigt ist mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des l.ysins und die freien Aminogruppen der Peptidkeitenenden. Man geht hierbei so vor. daß man zu einer gerührten wäßrigen Lösung des Proteins bei einer Temperatur zwischen 0 und )ti C die benötigte Polymerenmenge zugibt. Das Gcsviehtsserhältnis von Protein zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepaßt werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gcsv.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Tiiiger. Die optimalen Verhältnisse Mild ledoch sowohl son der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren .ils auch von der Art des Proteins abhängig.

Bei zahlreichen Lnzymen ist es auch zweckmäßig. Stabilisatoren zuzusetzen. Als solche kommen Polsäthylenglykolc oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung son Denaturierung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen. Das pH wird zweckmäßig mit einem pH-Staten auf dem für die betreffende Bindung optimalen pH-Wert gehalten. Dieser pH-Wert liegt in einem Bereich von 2 bis 9. Vorzugssveise 5 bis 7. Beim Einsatz von Penicillinacyla.se hat es sich als zweckmäßig erwiesen, zwischen pH 5.7 und pH 6.8 zu arbeiten. Dabei müssen zur Konstanthaltung des pH-Wertes anorganische Basen (z. B. Alkalilaugen) oder organische Basen (z. B. tert. organ. Amine) zugesetzt werden. Der Fortschritt der Reaktion ist am Verbrauch der zur pH-Konstanthaltung nötigen Menge an Base ersichtlich. Bei Raumtemperatur werden bis zur Beendigung der Reaktion etwa 16 Stunden, bei 4~C bis zu 40 Stunden benötigt. Das Harz wird hierauf abgesaugt und zur Ablösung eines kleinen Anteils an ionogen gebundenem Protein mit Puffern bzw. Salzen im Konzentrationsbereich von 0,2 bis 1 M gewaschen.

Die gebundene Substanz wird entweder durch Elementaranalyse oder bei Enzymen oder Inhibitoren durch die enzymatische Aktivität bzw. die Hemmung der enzymatischen Aktivität bestimmt. Die Ausbeuten an gebundener Substanz sind von der Art der Substanz und der Zusammensetzung des Polymeren abhängig. So wurden z. B. Aminosäuren und niedermolekulare Peptide praktisch vollständig angekoppelt; aber auch bei den Proteinen liegen die Ausbeuten an gebundener enzymatischer Aktivität bei 20 bis über 90% der eingesetzten Aktivität.

Nach dem Stand der Technik (deutsche Offenlegungsschriften 19 35 711 und 20 08 990) wird die Ankoppelung der Proteine in Pufferlösungen in Konzentrationen von 0,05 M bis 0,2 M vorgenommen. Arbeitet man ohne

Puffer, so steigt der Anteil des ionogen gebundenen Proteins (deutsche Offenlegungsschrift 19 35 711). Überraschenderweise zeigte sich, daß bei den erfindungsgemäßen Harzen die Kopplung in möglichst ionenfreiem Medium maximale Ausbeuten an covalent gebundenem Enzym ergibt. Das pH kann bei dieser Arbeitsweise durch einen pH-Staten sehr genau auf dem optimalen Wert konstant gehalten werden.

Die Anwendung von Enzvmharzen ist technisch von besonderer Bedeutung, da mit ihrer Hilfe technisch wertvolle Produkte hergestellt werden können. Die vorherige Bindung der biologischen Katalysatoren nach dem \orliegenden Verfahren gestattet durch ganz einfache Separaiionsprozesse ihre vollständige Abtrennung aus der Reaktionsmischung und ermöglicht die. aus wirtschaftlichen Gründen entscheidende, vielfache Wiederverwendung. Darüber hinaus wird in den meisten lallen die Stabilität der empfindlichen und teuren Proteine entscheidend verbessert.

im folgenden werden einige Beispiele der Anwendung von trägergebundenen Substanzen angegeben, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können.

Die Gruppe der Proteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase kann z. B. zur Herstellung von Proleinhydrolysaten für mikrobiologische Prozesse verwendet werden. Außerdem können die Enzyme auch zur Entfernung von antigenen Proteinen aus pharmazeutischen Wirkstoffen dienen.

Acyiasen werden technisch zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen oder zur Trennung von Racematen acylierter Aminosäuren verwendet. Trägergebundene Amylase kann zum hydrolytischen Abbau von Stärke verwendet werden.

Spezielle Hydrolasen, wie Asparaginase oder Urease können in gebundener Form im extrakorporalen Kreislauf therapeutisch eingesetzt werden.

Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z. B. die Zusammenfassungen in Chem. Eng. News v. 15. 2. 1971, Seite 86 und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83(1971).

Ein weiteres großes Anwendungsgebiet von an Trägern fixierten Substanzen ist die Affinitätschromatographie. So kann man mit gebundenen Antigenen oder auch Haptenen Antikörper und umgekehrt mit fixierten Antikörpern (y-Globuline) Antigene isolieren. Ebenso lassen sich Enzyme mit Hilfe gebundener Inhibitoren oder Substratanalogen spezifisch anreichern. Bekannt ist z. B. die Gewinnung von Trypsin und Chymotrypsin durch gebundene pflanzliche oder tierische Inhibitoren. Andere Beispiele sind die Gewinnung von Peptidasen an speziellen, gebundenen Peptiden oder die Isolierung von Plasmin mit an einem Träger gebundenem Lysin. Zusammenfassende Arbeiten über dieses Anwendungsgebiet sind von G. Feinstein in Naturwissenschaften 58, 389 (1971), und F. Fried in Chromatographie Reviews 14, 121 (1971), erschienen.

Zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6-A PS) können Penicilline mit Hilfe von Acyiasen aus Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien, insbesondere E. coü, Erwinia oder Actinomyceten wie Streptomyces, Micromonospora, Nocardia und Pilzen wie Fusarium und Hefen gespalten werden.

Gemäß dem Verfahren der deutschen Patentschrift 1111 778 zur Herstellung von 6-APS wird eine Penicil-Iin-G-Lösung mit einem Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penicillinacylase (E. C. 35.1.11) enthält

Durch die Einwirkung des Enzyms wird die seitenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne daß der 0-Laclamring geöffnet wird.

Die Verwendung von Suspensionen von Mikroorganismen hat folgende Nachteile:

a. Die Suspension von Mikroorganismen enthält außer der intracellulären Penicillinacylase weitere Proteine und Enzyme sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b. Die Suspension von Mikroorganismen kann wirtschaftlich zweckmäßig nur einmal eingesetzt werden.

c. Die Suspension von Mikroorganismen enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin iind/oHpr fi-AP.S Hnrrh ("iffnnntj Hpq ft.I aotamrin.

ges iraktivieren.

d. Die Suspension enthält nur kleine Mengen an Penicillinacylase. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial. z. B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich.

c. Die Betriebsausbeuten an 6APS hängen von der schwankenden Penicillinacylase-Bildung in den jeweiligen lermentationsansätzen ab.

f. Die vollständige Abtrennung suspendierter Mikroorganismen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-A PS-Ansätze einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinhaltigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (britische Patente 11 69 696; 10 78 847; Il 14 311).

Alle genannten Nachteile werden vermieden, wenn man anstelle einer Suspension von Mikroorganismen eine Penicillinacylar.e verwendet, die durch koval°nte Bindung an einen wasserunlöslichen Träger erhalten wird.

Versuche, 6-APS durch enzymatische Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase herzustellen, sind zwar bekannt (siehe dazu DE-OS 19 17 057, DE-OS 19 07 365), konnten jedoch nicht in einen technischen Maßstab übergeführt werden. Die Gründe dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials, das zu hohem Abrieb führt, zum anderen konnten bei mäßigen Verfahrensausbeuten nur geringe spezifische Aktivitäten an trägergebundener Penicillinacylase erreicht werden.

Auch das in der deutschen Patentanmeldung P 21 57 970.4 verwendete unlösliche Enzym, das durch kovalente Bindung der Penicillinacylase an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid gewonnen wurde, hat für die Spaltung von Penicillin im technischen Maßstab Nachteile, da es stark quillt und mechanisch nicht stabil ist Diese Nachteile beeinträchtigen die mehrmalige Wiederverwendung des so hergestellten Harzes im technischen Maßstab. Es wurde nun gefunden, daß die genannten Nachteile vermieden werden, wenn eine an einen erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase zur Spaltung von Penicillinen verwendet wird.

Die Spaltung von Penicillinen mit erfindungsgemäßer trägergebundener Penicillinacylase läßt sich einfach und auch im großtechnischen Maßstab durchführen. Das trägergebundene unlösliche Enzym wird in einer Lösung mit 75 000- 150 000 IU/ml Penicillin, z. B. Penicillin G oder Penicillin V suspendiert. Die enzymatische Spaltung wird bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6—9 vornehm^|;ch im Bereich des pH-Optimums der jeweils gebundenen Penicillinacylase, z. B. bei pH 7,8, durchgeführt. Zur Neutralisation des abgespaltenen Acylrestes z. B. der Phenylessigsäure oder der Phenoxyessigsäure verwendet man wäßrige Alkalilösiingcn. z. B. Kali- oder Natronlauge oder organische Amine, vorzugsweise Triethylamin. Aus dem Verbrauch der Base ist die Reaktionsgeschwindigkeit und die Beendigung der Spaltung zu ersehen. Die Penicillinacylase katalysiert sowohl die Spaltung von Penicillin zur 6-APS als auch die Resynthese der Penicilline aus den Spaltprodukten. Das Gleichgewicht ist abhängig vom pH-Wert des Mediums.

Bei kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes Penicillin. Dies kann zur Umacylierung von Penicillinen in Gegenwart anderer Acylreste oder zur Synthese von Penicillinen aus 6-APS ausgenutzt werden.

Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 38'¹C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z. B. bei 25°C durchgeführt, muß doppelt soviel Enzym wie bei 38°C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.

Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Außerdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins. Ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100 000 IU/ml Penicillin-G-Kalium ist nach 10 Std. bei pH 7.8 und 38°C vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase I0⁵ Einheiten Penicillin G eingesetzt werden (eine Enzymeinheit (E) ist definiert als die Aktivität, die 1 μΜοΙ Penicillin G pro Minute bei 37°C zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert). Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0,5—1% des Reaktionsgemisches. Werden pro 10' IU Penicillin G 5 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die vollständige Spaltung nur zwei Stunden. Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Penicillinacylase, bei Verwendung z. B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase ist perlförmig, zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spezifisches Gewicht aus. Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachem Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugieren ohne Verlust durch mechanische Beanspruchung, z. B. durch Abrieb. Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können. Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene PenicilFnacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration, da

durch die mechanisch? Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden F.'instanteile entstehen. Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozeß wegen des vergleichsweise hohen spezifischen Gewichts, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so daß nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batch-Prozeß im Reaktionsgefäß verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.

Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen Verfahren z. B. in Reaktionssäulen. wobei die Perlform die erforderliche, hohe Durchflußgeschwindigkeit erlaubt.

Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach Abtrennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen (siehe z. B. deutsche Patentschrift 11 11 778) und bei pH 4,3 kristallisiert.

Bei der erfindiingsgemäßen Spaltung von Penicillin mit der erfindungsgemäß hergestellten trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten, als bei Verwendung von E.-coli-Schlamm, aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung des Enzymharzes nach der deutschen Patentanmeldung P 21 57 970.4. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Ausbeute von ca. 90% d. Th. isoliert. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung. Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei anderen Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymere zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäß hergestellten 6-APS ausgeschlossen.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum. Auch hiernach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.

Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck bestimmt.

Beispiel la)

70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 I Benzol gelöst und zunächst 4 Stunden bei 60⁰C polymerisiert. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100—140°C) zu und polymerisiert 2 Stunden bei 70⁰C und 2 Stunden bei 80⁰C.

Das pulvrige Polymere wird gründlich mit Petroläther (Kp 30—50⁰C) gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 96 g
Schüttvolumen: 8,8 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 12,4 ml/g Spez. Oberfläche: 8,6 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3,85 mÄquiv/g

Beispiel Ib)

6 g des nach Beispiel la) hergestellten Trägerliarzes »erden in einer Lösung von 610U Penicillinacylase in 150 ml Wasser suspendiert. Durch Zugabe von 1 N-NaOH mit einem pH-Staten wird der pH-Wert

auf 6,3 gehalten und die Suspension 20 h bei 25"C gerührt.

Dann saugt man über eine Glasfritte G 3 ab und wäscht mit je 300 ml 0,05 M-Phosphalpuf?er pH 7,5, der I M-Natriumchlorid enthält, und mit demselben Puffer ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen kann keine Aktivität mehr eluiert werden. Überstand und Waschlösungen werden vereinigt und ihre enz.ymatische Aktivität bestimmt. In einer aliquoten Menge wird die enzymatische Aktivität des feuchten Harzes gemessen.

Ergebnis:

F.n/.ymaiischc Aktivitäten (NIPAH-Test)

Ausgangslösung MOI;

Überstand + Waschlösungen I 12 U

Tragerharz nach der Umsetzung ")M U

el. s. 92% der Ausgarigsaktivität

Die enzyma;^:schc Aktivität der Peniciliinacylase wird colorii.-ietrisch oder titrimetrisch mit 0.002 M-6-Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäurc (NIPAB) als Substrat bei pH 7,5 und 25" C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der entstehenden 6-Nitio-J-aminobenzoesäurc betrügt E₄₀-,,,,,, = 9090. 1 Einheit (LJ) entspricht dem Umsatz \>n 1 μΜοΙ Substrat pro Minute.

Beispiel Ic)

In einer Lösung von 40 ml Urease in 32 ml Wasser werden 400 mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Bei ständigem Rühren bei Raumtemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge auf. pH b,0 konstant gehalten. Nach 16 Stunden ist die Reaktion beendet, das Harz wird abgesaugt und wie in Beispiel Ib) mit Puffer gewaschen.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität
Ausgangslösung
Überstand + Waschlösungen Trägerharz nach der Umsetzung d. s. 52% der Ausgangsaktivität

168 U 64.5 1 87 U

Die enzymatische Aktivität der Urease wird titrimetrisch mit 0,17 M-Harnstoff als Substrat bei 25⁼C und pH 6,1 bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht der Enzymmenge, die 1 μΜοΙ Harnstoff, d. h. 2 μΜοΙ Salzsäure pro Minute verbraucht.

Beispiel Id)

In einer Lösung von 100 mg Trypsin in 32 ml 0,02 M-Calciumchlorid werden 500 mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Unter ständigem Rühren bei 4°C wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge auf pH 63 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und wie in Beispiel Ib) mit Puffer gewaschen.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität

Ausgangslösung 110 U

Überstand + Waschlösungen 15,6 U

Trägerharz nach der Umsetzung 64 U

d. s. 58% der Ausgangsaktivität

Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 (1962), 278, mit Benzol-arginin-p-niiroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 μΜοΙ Substrat pro Minute bei 25"C und pH 7,8.

Beispiel 2a)

Eine Lösung von 80 g Te'.raäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in I I Benzol wird unter langsamem Rühren 4 Stunden bei 60°C, 2 Stunden bei 70⁰C und 1 Stunde bei 80"C polymerisiert. Das Polymere wird abfiltricTi. dreimal in Benzol ausgerühri. mit Petroläthcr gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 70 c
Si hiiHvolumeii: 7,0 nil g
Quellvol'.inicn in Wasser: H,2 ml'g
Spez. Oberfläche: i.i tn-^vg

Säuregehalt nach Verseifung der Anhvdrulirruppen = 2.55 mAciuiv/a

Beispiel 2b)

1 g des nach Beispiel 2a) hergestellten Polymeren wird analog /u Beispiel Ib) mit Peniciliinacylase ir 3 3 ml Wasser bei pi I 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivitäten (ΝΙΡΛΒ-Tcst)

Ausgangslösung 118 11

Überstand + Waschlösungen 2! U

Trägerharz nach der Umsetzung 82 U

d. s. 69¹Hi der Ausgangsaktivität

B e i s ρ ι e I 3a)

60 g Tetraäthylenglykoldimcthacrylat. 30 g Methacrylsäure, lüg Malcinsüureanh)drid und Ig Azoisobuttersäurenitril werden in 300 ml \cetonitril gelöst. Diese Lösung wird in 1 I Benzin (Kp 100- 140"C). welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat enthält, susperHicrt und 22 Stunden bei 60^r C polymerisiert.

Die Po!;. riK'rperlen werden a'nfiltriert. li-eimal in Benzol und ,." sch-ieiiend zweimal in Petrol.·.■ her (Kp 30 —50 C) suspendiert ur.J im Vakuum g Mroi--.net.

Ausbeute: 94 g weiße Kugeln
Schuttvolumen: 4.4 ml/g
Queilvolumen in Wasser: 5,5 ml/g
Spez. Oberfläche: 6,6 m-'/g
Mittlerer Pan keldurchmesser: -200 μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgnipp
= 4.3 mAqiiiv/g

Beispiel 3b)

1 g des nach Beispiel 3a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Peniciliinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6.3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand + Waschlösungen 43 U

Trägerharz nach der Umsetzung 96 U

d.s. 81% der Ausgangsaktivität

Beispiel 4a)

Eine Lösung von 2i00g Tetraäthyiengiykoidimeihacrylat, 600 g Methacrylsäure, 300 g Maleinsäureanhydrid und 30 g Azoisobuttersäurenitril in 7.5 I Acetonitril

wird in 21 I Benzin (Kp 100—140⁰C),indem !50geines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat gelöst wurden, suspendiert und 1 Stunde bei 50° C und 20 Stunden bei 60⁰C polymerisiert.

Das Perlpolymerii£t wird abgesaugt, zweimal mit Toluol und einmal mit Petroläther (Kp 30—50⁰C) ausgerührt und bei 60⁰C getrocknet.

Ausbeute: 2^5 kg
Schüttvolumen: 4,7 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 5,4 ml/g
Mittlerer Partikeldurchmesser: ca. 0,3 mm
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 4,0 mÄquiv/g

Beispiel 4b)

1 g des nach Beispiel 4a) hergestelltem Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

In der Ausgangslösung 107 U

Überstand und Waschlösungen 27 U

Trägerharz nach der Umsetzung 67 U

d. s. 63% der Ausgangsaktivität

Beispiel 4c)

20 g des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren werden bei Raumtemperatur in 600 ml einer Lösung von 1,0 g unspezifischer Elastase aus Schweinepankreas unter Rühren eingetragen. Das pH wird hierbei auf 5.8 konstant gehalten. Nach einer Reaktionszeit von 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und in der in Beispiel Ib) beschriebenen Weise aufgearbeitet.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (Casein-Test)
Ausgangslösung
Überstand + Waschlösungen
Trägerharz nach der Umsetzung
d. s. 56% der Ausgangsaktivität

2180 E
993 E

!225 F

Die enzymatische Aktivität der unspezifischen Elastase wird titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11,9 mg/m!) bei pH 8.0 und 25°C bestimmt. 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1 μΜοΙ Kalilauge pro Minute.

Beispiel 5a)

Eine Lösung von 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat. 10 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und I g Azoisobuttci saurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 3a) polymerisiert.

Ausbeute: 92 g weiße, eiförmige Partikel
Schüttvolumen: 2,5 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 3,2 ml/g
Spez. Oberfläche: 1.7 m'/g
Mittlerer Pariikeldurchmesser; 125 μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3,5 mÄquiv/g

Beispiel 5b)

I g des nach Beispiel 5a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
Ausgangsicsung
Überstand + Waschlösungen
Trägerhtrz nach der Umsetzung
d. s. 52% der Ausgangsaktivität

118 U
34 U
61 U

Beispiel 6a)

Eine Lösung von 50 g Äthylenglykoldimethacrylat 40 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird in 1 I Benzin (Kp 100-14O⁰C)₁ in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerinmonooleat und -dioleat gelöst sind, suspendiert und 20 Stunden bei 60⁰C polymerisiert. Das Perlpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und zweimal in Petroläther (Kp 30—50° C) suspendiert und im Vakuum bei 50⁰C getrocknet.

Ausbeute: 87 g
Schüttvolürncn: 4.8 rn!/g
Quellvolumen in Wasser: 5,6 ml/g
Spez. Oberfläche: 1 i.2 m²/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgrupperi = 4,2 mÄquiv/g

Beispiel 6b)

1 g des nach BeispH ba) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml in Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

!"> Überstand und Waschlösungen 29 U

Trägerharz, nach der Umsetzung 55 U

d.s. 47% der Ausgangsaktivität

_4fl Beispiel 7a)

Eine Lösung von 50 g Trimethylolpropan-trimcthacrylat, 30 g Methacrylsäure. 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 6a) polymerisiert.

Ausbeute: 86 g
Schüttvolumen: 2.0 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 2.2 ml/g
Mittlerer Partikeldurchmesscr: -30 μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 4.1 mÄquiv/g

Beispiel 7b)

1 g des nach Beispiel 7a) hergestellten Polymeren wird bei Raumtemperatur und ständigem Rühren zu einer Lösung von 100 mg Lysin in 32 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird auf 6,3 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt, in 50 ml I M-Natriumchloridlösung suspendiert, abgesaugt und mit 100 ml Wasser nachgewaschen. Der Rückstand wird im Vakuum bei 100° C getrocknet und der Stickstoffgehalt nach Kjeldahl bestimmt.

Ergebnis:

Trockengewicht: 860 mg

Stickstoffgehalt: 1.5% entsprechend einem Gehalt des Harzes von 65 mg Lysin. Das sind 65% der eingesetzten Menge an Lysin.

030)13/109

Beispiel 8 Analog zu Beispiel 6a) wurden polymerisiert (Variation der Maleinsäureanhydrid-Menge):

Versuch Nr.
a

TGDM (g)
MAS (g)
MSA (g)
AIBN (g)
Acetonitril (ml)
Benzin (ml)
Emulgator (g)
Ausbeute (g)
Vs (ml/g)
Vq (ml/g)
Säure {m'AqJg)

TGDM = TetraäthylenglykoldimethacrylaL MAS = Methacrylsäure. MSA = Maleinsäureanhydrid. AIBN = Azoisobuttersäurenitril. Emulgator = Gemisch aus Glycerin-mono- und -dioleaten. Vs = Schottvolumen. Vq = Quellvolumen in Wasser. Säure = Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen.

75	70	65	60	55	50
20	20	20	20	20	20
5	10	15	20	25	30
1	1	1	1	1	1
250	250	250	250	250	250
1000	1000	1000	1000	1000	1000
5	2,5	5	5	5	5
95	93	86	88	80	79
3,4	3,4	3,6	2,6	3,0	3.2
4,4	6,0	4.5	33	4,0	43
3,1	4.2	3,6	3,8	33	4,7

45

20

35

250

1000

70

3,4

Beispiel 9a)

Eine Lösung von 70 g Tetraäthylenglykotdimeth- jo acrylat, 20 g Acrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und I g Azoisobuttersäurenitril in 1 I Benzol wird unter Luftausschluß und langsamem Rühren 4 Stunden auf 6O°C, 2 Stunden auf 70° C und 2 Stunden auf 80° C erwärmt. Das feinteilige Fällungspolymerisat wird i; dreimal in Benzol und zweimal in Acetonitril suspendiert, abgesaugt und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 94 g
Schüttvolumen: 6,8 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 7,6 ml/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 1,64 mÄquiv/g

Beispiel 9b)

I g des nach Beispiel 9a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel I b) mit Pcnicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand + Waschlösung 26 U

Trägerharz nach der Umsetzung 38 U

d. s. 36% der Ausgangsaktivität

Beispiel 10a)

Eine Lesung von 50 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat. 40 g N-Vinylpyrrolidon, 10 g Maleinsäureanhydrid und ! g Dicyclohexylpercarbonal in 200 ml Acetonitril wird in I I Benzin (Kp 100-140⁰C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleaten enthält, suspendiert und unter Rühren zunächst 18 Stunden auf 50°C erwärmt. Dann gibt man I g des Initiators nach und rührt weitere 8 Stunden bei 60⁰C. Die Polymerkugeln werden mit Benzol und Petroläther gründlich gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 54 g klare Perlen
Schüttvolumen: 1,6 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 2,4 ml/g Mittlerer Partikeldurchmesser: ~03mm Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen

= 33 mÄquiv/g
Gehalt an Stickstoff: 3,4% = 27% N-Vinylpyrrolidon

Beispiel 10b)

g des nach Beispiel 10a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand+ Waschlösungen 26 U

Trägerharz nach der Umsetzung 82 U

d.s. 77% der Ausgangsaktivität

Beispiel Ha)

line Lösung von 70 g Fetraathylenglykoldimethacrylat, 20 g Methacrylamid, 10 g Maleinsäureanhydrid. Ig Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Acetonitril werden analog /u Beispiel 5a) in Benzin suspendiert und polymerisiert.

Ausbeute: 93 g
Schüttvolumen: 2.0 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 3,3 ml/g Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,7 mÄquiv/g

Beispiel 11b)

g des nach Beispiel Ha) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 6.3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 LJ

Oberstand und Waschlösungen 42 U

Trägerharz nach der Umsetzung 33 U

d.s. 31% der Ausgangsaktivität

Beispiel 12a)

Eine Lösung von 60 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 30 g N-Methoxymethyl-acrylamid, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1 I Benzin, in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und -dioleat gelöst werden, suspendiert und 20 Stunden bei 60⁰C polymerisiert

Das Perlpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Essigester suspendiert und im Vakuum bei 50° C getrocknet.

Ausbeute: 97 g ,„

Schüttvolumen: 1,6 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 3,1 ml/g Mittlerer Teilchendurchmesser: ~03 mm

Beispiel 12b) ,₅

1 g des nach Beispiel 12a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt.

Ergebnis: „,

Enzymatische Aktivität (N!PAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand +Waschlösjngen 49 U

Trägerharz nach der Umsetzung 25 U

d. s. 23% der Ausgangsaktivilä! Ji

Beispiel 13a)

Setzt man im Ansatz von 12a) statt N-Methoxymethyl-acrylamid 30 g N-Methoxymethylmethacryl- w amid ein, so erhält man folgendes Ergebnis:

Ausbeute: 94 g

Schüttvolumen: 2,4 ml/g

Quellvolumen in Wnsser: 3,9 ml/g ₄_

Mittlerer Pariikeldurchmcsser: ~0,6mm

Beispiel 13b)

1 g des nach Beispiel 13a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml ν ι Wasser bei pH 6.3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U >>

Überstand und Waschlösungen 60 U

Tragerharz nach der Umsetzung 24 U

d.s. 22% der Ausgangsaktivität 20

Beispiel 14

76,1 kg (Feuchtgewicht) trägergebundener Penicillinacylase dargestellt gemäß Beispiel 4 (NIPAB-Test) mit einer Aktivität von 737 000 U und 125 kg Penicillin-G-Kalium (Reinheit 98%) werden nacheinander zu 20001 Wasser gegeben und bei 38°C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7,8 gehalten.

h0 Nach 8 Stunden wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert, mit jeweils 601 Wasser und 0,2 M-Phosphatpuffer, pH 6,5, nachgewaschen und für weitere Spaltungsansätze erneut eingesetzt Das Filtrat einschließlich Waschwasser wird im Vakuum auf 3001 eingeengt Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischec Punkt bei pH 43 in Gegenwart von 2001 Methylisobutylketon ausgefällt Nach einer Stunde wird abfiltriert, mit 2001 Wasser und dann mit 2001 Aceton nachgewaschen. Getrocknet wird im Vakuum bei 40° C; Schmelzpunkt 208⁰C; Ausbeute 66,7 kg, das sind 91,9% d. Th.; Reinheit 98%.

Die trägergebundene Penicillinacylase wurde nacheinander zu insgesamt 30 Ansätzen eingesetzt Auch nach 30 Spaltungen ist die trägergebundene Penicillinacylase nicht verbraucht Die Reaktionszeit verändert sich nicht. Aufgearbeitet wurde wie vorstehend beschrieben. Die erzielten 6-APS-Ausbeuten sind nachstehend zusammengestellt:

1. Spaltung

2. Spaltung

3. Spaltung

4. Spaltung

5. Spaltung

6. Spaltung

7. Spaltung

8. Spaltung

9. Spaltung

10. Spaltung

11. Spaltung

12. Spaltung

13. Spaltung

14. Spaltung

15. Spaltung

16. Spaltung

17. Spaltung

18. Spaltung

19. Spaltung

20. Spaltung

21. Spaltung

22. Spaltung

23. Spaltung

24. Spaltung

25. Spaltung

26. Spaltung

27. Spaltung

28. Spaltung

29. Spaltung

30. Spaltung

913% d. Th. 91,4% d. Th. 91,6% d.Th. 91,0% d.Th. 91,2% d.Th. 903% d. Th. 91,5% d.Th. 90,9% d. Th. 91.9% d.Th. 90,7% d.Th. 91,2% d.Th. 90,1% d. Th. 90,9% d. Th. 90,7% d. Th. 91,0% d.Th. 90,2% d.Th. 90,3% d. Th. 89,9% d. Th. 89,8% d. Th. 89,1% d.Th. 91,7% d.Th. 91.9% d.Th. 91,6% d.Th. 91,1% d.Th. 91,8% d.Th. 90.70/0 d.Th. 91.;% d.Th. 91,4% d.Th. 90,8% d. Th. 903% d. Th.

0=90.95% d.Th.

Beispiel

g trägergebundene Penicillinacylase dargestellt gemäß Beispiel 1 mit einer enzymatischen Aktivität von 3410U (NIPAB-Test) und 129 g Penicillin-G-Kalium werden nacheinander zu 2000 ml Wasser gegeben und wie im Beispiel 14 beschrieben bei JI8⁹C und pH 7,8 gerührt. Das Penicillin G wird in 2 Stunden vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure gespalten. Die 6-APS wird, wie im Betspiel 14 beschrieben, isoliert. Die trägergebundene Penicillinacylase wird zwanzigmal nacheinander eingesetzt. Auch nach der zwanzigsten Spaltung muß zur vollständigen Spaltung die Reaktionszeit nicht verlängert werden.

21

6-APS-Ausbeuten:

1. Spaltung

2. Spaltung

3. Spaltung

4. Spaltung

5. Spaltung

6. Spaltung

7. Spaltung

8. Spaltung

9. Spaltung

10. Spaltung

11. Spaltung

12. Spaltung

13. Spaltung

14. Spaltung

15. Spaltung

16. Spaltung

17. Spaltung

18. Spaltung

19. Spaltung

67.5 g (90,1%
68,4 g (91,1%

68.7 g (91,9%

68.6 g (91,5%
68,4 g (91,0%
68,1 g (90,8%

68.7 g (31,6%

68.4 g (91,2%

68.5 g (91,5%
68,1 g (90,9%

68.5 g (913%

68.6 g (91,7%
68,5 g (913%
68,1 g (90,8%
g (91,1%

67.8 g (90,5%
68,0 g (90,6%

67.4 g (89,9%

67.5 g (90,0%

66.8 g (89,1%

d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d.Th.) d. Th.) d.Th.) cLTh.) cLTh.) d.Th.) d.Th.) d.Th.)

=90,89% d. Th.

(NIPAB-Test) werden mit 120 g Penicillin-G-Kalium in 1300 ml Wasser gegeben und 9 Stunden bei 38⁰C und pH 7,8 wie im Beispiel 14 beschrieben gerührt. Aufgearbeitet wird wie im Beispiel 14 beschrieben. Die trägergebundene Penicillinacylase wird fünfmal nacheinander zur enzymatischen Spaltung eingesetzt. Die erzielten Ausbeuten an 6-APS sind nachstehend zusammengestellt:

ίο

Beispiel 16

g trägergebundene Penicillinacylase (Feuchtgewicht) gemäß Beispiel 4 mit einer Aktivität von 1160 U

1. Spaltung 6Ug (87,6% d.Th.)

2. Spaltung 62,0 g (88,9% d. Th.)

3. Spaltung 63,3 g (90,6% d.Th.)

4. Spaltung 62,7 g (89,9% d. Th.)

5. Spaltung 63,1 g (90,4% d.Th.)

Beispiel 17

290 g trägergebundene PenHIünacylase gemäß Beispiel 4 mit einer enzymatischem Aktivität von 2803 IJ (NIPAB-Test) werden mit 138 g Penicillin-V-Kalium zu 2000 ml Wasser gegeben und 9 Stunden bei 38°C gerührt. Der pH-Wert wird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7.8 gehalten. Aufgearbeitet wirii wie im Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute an 6-APS 64,3g (86.1% d.Th.); Reinheit 97,4%.

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches Proteinpräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt, welches an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Einheiten von

A 0,1 —30 Gew.-% «,^-monoolefinisch ungesät- ,_Q tigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4—9 Kohlenstoffatomen,

B 35 — 90Gew.-% Di- und/oder Poly-{Meth)-

Acrylaten von Di- und/oder ₎₅ Polyolen und

C 5 —60 Gew.-% mindestens eines nicht unter A und B genannten hydrophilen Monomeren,

wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2—20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1 —400 mVg besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0,02—11 MiIIiäquivalente Säure pro Gramm enthalten, besteht.

2. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisates aus Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, die copolymerisierten Ein- jo heiten der Komponente B des Copolymerisates aus Di(Meth)Acrylaten von Diolen mit 2—4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 — 10 Molen Alkylenoxid mit 2—4 Kohlenstoffatomen bzw. aus Trimethylolpropantrimethacrylat und die copolymerisierten Einheiten der Komponente C des Copolymerisates aus mindestens einem hydrophilen Monomeren mit mindestens einer Carboxyl-, Aminocarbonyi-, Sulfo- oder Sulfamoylgruppe bestehen.

3. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisates aus Maleinsäureanhydrid, die der Komponente B aus Äthylenglykol-, Diäthylenglykol-, Triäthylenglykol- oder Tetraäthylenglykoldimethacrylat bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat oder deren Mischungen und die der Komponente C aus Methacrylsäure, Acrylsäure, Methacrylamid, N-Methoxymethylacrylamid, N-Methoxymethyl- w methacrylamid oder N-Vinylpyrrolidon oder deren Mischungen bestehen.

4. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um ein Enzym r. handelt.

5. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um einen Enzyminhibitor handelt. μ

6. Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um Penicillinacylase handelt.

7. Verfahren zur Herstellung von wasserunlösli- « chen Proteinpräparaten gemäß Atispruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere des Copolymerisates -

A 0,1 —50 Gew.-% ot^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—9 Kohlenstoffatomen,

B 35 -90Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)-Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

C 5 — 60Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren

— die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 -

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Peripolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20—200°C in Gegenwart Radikaie bildender Verbindungen polymerisiert und anschließend das Copolymerisat in einer wäßrigen Suspension mit einer Proteinlösung zu wasserunlöslichen Proteinpräparaten umsetzt.

8. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Pinicillinacylasepräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere des Copolymerisates —

A 0,1 —5OGew.-°/o «^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4—9 Kohlenstoff atomen,

B 35 -90Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)-Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

C 5 —60Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren

— die Sumi : der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 -

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Peripolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20—200⁰C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und anschließend mit wäßriger salzarmer Penicillinacylaselösung in einem pH-Bereich von 5,7 bis 6,8 zu einem unlöslichen Penicillinacylasepräparat umsetzt.

9. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparatcs gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration des Reaktionsmediums zu Beginn der Umsetzungsreakiion des Copolymerisates mit der Penicillinacylaselösung weniger als 0,02 Mol/l beträgt.

10. Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparates gemäß Anspruch 4 zur Durchführung einer durch Enzyme katalysierbaren Reaktion.

11. Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparates gemäß Anspruch 4 zur hydrolytischen Spaltung von Substraten.

12. Verwendung von wasserunlöslicher Penicillinacylase gemäß Anspruch 6 zur Spaltung von Penicillinen unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure.