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Die Erfindung betrifft die Verwendung eines wasserunlöslichen Proteinpräparates, insbesondere Enzympräparates, wobei das Protein an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Einheiten von
A) 0, 1 bis 50 Gew. -% a, ss-monoole6nisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 C-Atomen und
B) 99, 9 bis 50 Gew.-% Di-und/oder Poly- (Meth) Acrylaten von Di-und/oder Polyolen besteht, wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2 bis 20 ml/g, spezifische Oberflächen von 1 bis
400 m2/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0, 02 bis lOMiIliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, zur Durchführung einer durch Proteine, insbesondere Enzyme, katalysierbaren
Reaktion, wie z.
B. der hydrolytischen Spaltung von Substraten, insbesondere von Penicillinen unter
Bildung von 6-Aminopenicillansäure.
Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z. B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.
Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und
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So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vergl. E. Katchalski, Biochemistry 3, [1964], S. 1905 bis 1919).
Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches
Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mässige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vergl. deutsche Offenlegungsschrift 1908290).
Ausserdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit
Divinyläthern hergestellt. Auf Grund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese
Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen-in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid-, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepasst werden kann (vergl. deutsche
Offenlegungsschrift 2008996).
In der deutschen Offenlegungsschrift 1917057 werden sehr verschiedene Trägermaterialien beschrieben, an welche das Enzym Penicillinacylase gebunden werden kann. Unter anderem werden dort Äthylen-Maleinsäure- anhydrid-Polymerharze, Acrylsäureharze und auch Polysaccharide als mögliche Träger angegeben. Davon sind die Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Polymerharze (EMA) den Harzen gemäss der Erfindung am ehesten vergleichbar. Bei
Nacharbeitung des Beispiels 3 dieser Offenlegungsschrift wurde, wie das Vergleichsbeispiel zeigt, ein gelartiges
Enzympräparat erhalten, welches nach der Spaltung von Penicillinen zu 6-Aminopenicillansäure nur durch
Zentrifugation abgetrennt werden kann. Präparate mit einer derartigen Gel-Struktur sind jedoch für eine wirtschaftliche Verwertung im grosstechnischen Verfahren nicht gut geeignet.
Hingegen können die erfindungsgemäss verwendeten unlöslichen Enzympräparate, welche pulvrige Substanzen darstellen, z. B. durch eine einfache Filtration oder sogar lediglich durch Sedimentation abgetrennt werden. Der Produktionsverlauf wird hiedurch sehr einfach und liegt kostenmässig sehr günstig. Bei der Nacharbeitung konnte nur eine sehr ungünstige Ausbeute an unlöslichem Enzym erreicht werden. In 160 ml Gel wurden nur 9, 6 Einheiten an unlöslichem Enzym gefunden. Eine derartig geringe spezifische Aktivität ermöglicht eine enzymatische Hydrolyse von lediglich etwa 3 g Penicillin-G-Kalium innerhalb einer Reaktionszeit von 9 h. Demgemäss ist eine Verwendung der Harze gemäss der deutschen Offenlegungsschrift 1917057 zu einer grosstechnischen Herstellung von 6-APS mit wesentlichen Nachteilen behaftet.
Im Gegensatz hiezu können in überraschender Weise gemäss der Erfindung Enzympräparate mit hohen spezifischen Aktivitäten hergestellt werden. So sind z. B. zur enzymatischen Spaltung von 129 g Penicillin-G-Kalium nur 79 g feuchtes Enzymharz erforderlich.
Die gemäss der deutschen Offenlegungsschrift 1945680 mit dem Enzym zu kuppelnden Polymere sind Copolymerisate aus z. B. Maleinsäureanhydrid mit Polyacrylaten. Diese Produkte sind jedoch ausnahmslos in Wasser oder organischen Lösungsmitteln löslich. Die unter Verwendung von Anhydriden der Acrylsäure und Methacrylsäure hergestellten Produkte, die in der deutschen Offenlegungsschrift 1695662 beschrieben sind, stellen lineare und nur schwach vernetzte Produkte dar.
Als für die Herstellung der Copolymerisate benötigte a, ss-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen seien namentlich genannt : Maleinsäure-, Itaconsäure-oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.
Die zu verwendenden Di-und/oder Polymethacrylate bzw. Di-und/oder Polyacrylate von Di-und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise
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alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxyden mit 2 bis 8
Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxyde ab, wobei an
1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1 bis 104, bevorzugt 1 bis 20 Alkylenoxydbausteine anpolymerisiert sind. Beispielsweise seien Alkylenoxyde, Äthylenoxyd, Propylenoxyd, Butylenoxyd,
Trimethylenoxyd, Tetramethylenoxyd, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxyd, vorzugsweise Äthylenoxyd und Propylenoxyd genannt.
Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff-aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Alkylenoxyden zur Herstellung der Di-und/oder Poly (Meth) Acrylate zu verwenden.
Die Di-und Poly (Meth) Acrylate von Di-und Polyolen werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di-und/oder Polyole mit (Meth) Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren
Mengen bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 20 C, in
Anwesenheit von Benzol gewonnen (vergl. deutsche Offenlegungsschrift 1907666).
Als Di-bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen kommen z. B. in Frage : Äthylenglykol, Propandiol-1, 2, Propandiol-1, 3, Butandiole insbesondere Butandiol-1, 4,
Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren
Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxyden, wie vorstehend angegeben. Auch Poly- bis-chlormethyl-oxacyclobutan oder Polystyroloxyd sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di-und Polyolen eingesetzt werden.
Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder
Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 bis 20 Molen Alkylenoxyd mit 2 bis 4
Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.
Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol,
Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylenglykolen mit Molgewichten bis 1000 oder deren Gemische.
Falls gewünscht, könnten neben den Di-und/oder Poly (Meth) Acrylaten auch üblicherweise verwendete
Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylen- bisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0, 01 bis 30 Gew.-% der
Monomerenmischung zugesetzt werden.
Auf Grund der möglichen Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der erfindungsgemässen Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck angepasst werden.
Die Polymerisation kann z. B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe sowie halogensubstituierte Kohlenwasser- stoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.
Beispielsweise seien genannt : Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200 C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.
Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 60 C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmischung verwendet man etwa 2 bis
50, bevorzugt 5 bis 20 Gew.-Teile, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinflusst.
In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Ausserdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigneten Initiator als Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmittelmenge eingespeist werden, so dass während der Polymerisation eine gleichmässige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird.
Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepasster Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.
Die Copolymerisate können auch durch Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Die gebrächlichste Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, gegebenenfalls unter Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in Wasser suspendiert werden, lässt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da das Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase übergeht und nur in geringer Menge in das Polymere eingebaut wird. Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmässig in organischem Medium durchgeführt. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z. B.
Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd oder Hexamethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt. Als zusammenhängende Phase eignen sich besonders
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Paraffinkohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Das Volumenverhältnis, zusammenhängende Phase :
Monomerphase beträgt 1 : 1 bis 10 : 1, vorzugsweise 2 : 1 bis 5 : 1.
Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und -dioleate sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- und -trioleate bzw. -stearate, Polyäthylenglykolmonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit ölsäure, Stearinsäure und andern
Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen sowie das Na-Salz des Sulfobernsteinsäuredioctylesters verwendet werden.
Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0, 1 bis 10%, bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgrösse der Suspensionspolymerisate kann ausser durch Vergrösserung der Rührgeschwindigkeit durch Zugabe von 0, 1 bis 2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates verringert werden.
Die Polymerisation wird durch radikalische Initiatoren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z. B.
Azoverbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsaulösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxyde wie Dibenzoylperoxyd oder Percarbonate wie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat in Frage, es können jedoch auch Dialkylperoxyde, Hydroperoxyde und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwendet werden.
Die Initiatoren werden in Mengen von 0, 01 bis 10%, vorzugsweise 0, 1 bis 3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt.
Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 200 C, vorzugsweise 50 bis 100 C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Ausserdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.
Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1, 5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g, und spezifischen Oberflächen von 0, 1 bis 500 m2/g, bevorzugt 1 bis 400 m2fg. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0, 02 bis 10 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0, 4 bis 4 mÄquiv/g. Die Suspensionspolymerisate sind weisse oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmässig geformt sein können und einen Durchmesser von 0, 03 bis 1 mm, vorzugsweise 0, 05 bis 0, 5 mm, und Schüttvolumina von etwa 1, 4 bis 8 ml/g, vorzugsweise 1, 4 bis 5 ml/g, besitzen.
Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0, 02 bis 10 mAquiv/g, vorzugsweise 0, 4 bis 4 mAquiv/g.
Die Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten statistisch verteilt. Auf Grund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.
Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1, 1- bis 2, 5-fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können.
Die Trägerharze werden bei Temperaturen zwischen 0 und 300C direkt in die wässerige Lösung des zu bindenden Stoffes, vorzugsweise in die wässerige Lösung eines Proteins eingetragen, wobei der PH-Wert konstant zu halten ist.
Sollten Proteine an die Copolymerisate gebunden werden, so arbeitet man zweckmässigerweise mit einem
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5in Frage.
Im Gegensatz zu den Erfahrungen der Literatur mit anderen Harzen, nach denen die Umsetzung in gepufferten Lösungen durchgeführt wird, waren die Ausbeuten an gebundenem Enzym mit den oben beschriebenen Harzen umso besser, je niedriger der Salzgehalt der Lösungen war.
Das Gewichtsverhältnis von gebundener Substanz, beispielsweise Protein bzw. Peptid zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepasst werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig. Bei zahlreichen Enzymen ist es zweckmässig, Stabilisatoren der Enzymlösung zuzusetzen.
Als solche kommen Polyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung der Denaturierung an Oberflächen in Frage sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen.
Die notwendige Reaktionszeit ist abhängig von der Art des Polymeren. Im Normalfall ist die Reaktion nach 20 h bei Raumtemperatur abgeschlossen. Bei 40C läuft die Reaktion besser noch etwas länger. Bei
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präparativen Ansätzen wird der Ansatz nicht früher als 2 h nach Beendigung der Alkalizugabe durch den
PH-Staten abgebrochen. Das Polymere mit dem gebundenen Protein wird hierauf abgesaugt oder abzentrifugiert und der Rückstand mit Salzlösungen hoher Ionenstärke, beispielsweise 1 M-Natriumchloridlösung, und anschliessend mit einem Puffer gewaschen, in dem das Enzym stabil ist. Bei der Waschung mit Lösungen hoher
Salzkonzentration wird ionogen gebundenes Protein vom Träger abgelöst.
Zur Beurteilung des Erfolges der Proteinbindung wurde bei Enzymen die enzymatische Aktivität sowohl im
Polymeren als auch in der Restlösung und in den Waschwassern bestimmt. Bei Proteinen ohne spezifische
Wirkung wurde der Stickstoffgehalt im Polymeren nach Kjeldahl bestimmt. Die Ausbeuten bei der
Proteinbildung liegen zwischen 10 und über 90%. Betrachtet man die enzymatische Aktivität, so ist es in einigen
Fällen vorteilhaft, keinen zu grossen Überschuss an Polymermaterial zu verwenden, da sonst zwar das Protein vollständig gebunden wird, die Aktivität jedoch darunter leidet.
Die Trägerharze sind geeignet, alle Substanzen zu binden, die eine funktionelle Gruppe tragen, die befähigt ist, mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden.
An Träger gebundene Peptide und Proteine sind von grosser wissenschaftlicher und technischer Bedeutung.
Die in den meisten Fällen teuren und instabilen Enzyme werden durch die Bindung an das Harz wesentlich stabilisiert. Ausserdem gestattet die leichte und vollständige Rückgewinnung des Enzymharzes eine vielfache
Anwendung über lange Zeitspannen.
Folgende Proteine können beispielsweise an die Copolymerisate fixiert werden :
Enzyme : Hydrolasen wie Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase ; Amidasen, beispielsweise Asparaginase, Glutaminase, Urease ; Acyltransferasen, beispielsweise Penicillinacylase ; Lyasen, beispielsweise Hyaluronidase.
Andere Proteine, wie Plasmabestandteile, Globuline (Antikörper).
Polypeptide, wie Kallikrein-Inhibitor oder Insulin. Aminosäuren wie Lysin oder Alanin.
Die einzusetzenden Proteine werden im allgemeinen aus Bakterien, Pilzen, Aktinomyceten oder aus tierischem Material gewonnen.
Einige Beispiele für technisch wichtige Umsetzungen mit gebundenen Enzymen sind der hydrolytische Abbau der Stärke durch covalent gebundene Amylase, die Klärung von Fruchtsäften u. a. durch gebundene Pektinase, die Herstellung enzymatisch abgebauter Eiweisshydrolysate, die Hydrolyse von Penicillinen zur 6-Aminopenicillansäure. Ausserdem wurden auch gebundene Enzyme, Peptide u. a. zur Isolierung von Inhibitoren durch Affinitätschromatographie und umgekehrt gebundene Inhibitoren zur Isolierung von Enzymen verwendet.
Andere Anwendungen liegen im Gebiet der Medizin. Ein Beispiel ist die Verwendung von gebundener L-Asparaginase oder Urease in einem extrakorporalen Kreislauf zur Erniedrigung des Asparagin- bzw.
Harnstoffspiegels im Blut.
Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z. B. die Zusammenfassungen in Chem. Eng. News v. [15. 2. 1971], S. 86 und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21,83 [1971].
Ein wichtiges Beispiel für die Verwendung der Proteinpräparate stellt die Spaltung von Penicillinen mit Hilfe von PeniciIIinacylase dar, welche an die erfindungsgemäss eingesetzten Copolymerisate gebunden ist.
Zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6APS) können Penicilline mit Hilfe von Acylasen aus Mikroorganismen wie z. B. Bakterien, insbesondere E. coli, Erwinia oder Actinomyceten wie Streptomyces, Micromonospora, Nocardia und Pilzen wie Fusarium und Hefe gespalten werden.
Gemäss dem Verfahren der deutschen Patentschrift Nr. 1111778 zur Herstellung von 6-APS wird eine Penicillin G-Lösung mit einem Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penicillinacylase (E. C. 3. 5. 1. 11) enthält. Durch die Einwirkung des Enzyms wird die seitenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne dass der ss-Lactamring geöffnet wird.
Die Verwendung von Suspensionen von Mikroorganismen hat folgende Nachteile : a) Die Suspension von Mikroorganismen enthält ausser der intracellulären Penicillinacylase weitere
Proteine und Enzyme sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen. b) Die Suspension von Mikroorganismen kann wirtschaftlich zweckmässig nur einmal eingesetzt werden. c) Die Suspension von Mikroorganismen enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin und/oder 6-APS durch Öffnung des ss-Lactamringes inaktivieren. d) Die Suspension enthält nur kleine Mengen an Penicillinacylase. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z.
B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich. e) Die Betriebsausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden Penicillinacylase-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen ab. f) Die vollständige Abtrennung suspendierter Mikroorganismen erfordert bei der Aufarbeitung der
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6-APS-Ansätze einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbussen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere
Reinigungsschritte nötig (brit. Patentschriften Nr. 1, 169, 696 ; Nr. 1, 078, 847 und Nr. 1, 114, 311).
Alle genannten Nachteile werden vermieden, wenn man an Stelle einer Suspension von Mikroorganismen eine Penicillinacylase verwendet, die durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen Träger erhalten wird.
Versuche, 6-APS durch enzymatische Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase herzustellen, sind zwar bekannt, (siehe dazu deutsche Offenlegungsschriften 1917057 und 1907365), konnten jedoch nicht in einen technischen Massstab übergeführt werden. Die Gründe dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials, das zu hohem Abrieb führt, zum andern konnten bei mässigen Verfahrensausbeuten nur geringe spezifische Aktivitäten an trägergebundener Penicillinacylase erreicht werden.
Auch ein gemäss einem unveröffentlichten Vorschlag verwendetes unlösliches Enzym, das durch kovalente
Bindung der Penicillinacylase an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N, N'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid gewonnen wurde, hat für die Spaltung von Penicillin im technischen Massstab Nachteile, da es stark quillt und mechanisch nicht stabil ist. Diese Nachteile beeinträchtigen die mehrmalige Wiederverwendung des so hergestellten Harzes im technischen Massstab.
Es wurde nun gefunden, dass die genannten Nachteile vermieden werden, wenn eine an einen erfindungsgemässen wasserunlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase zur Spaltung von Penicillinen verwendet wird.
Die Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase lässt sich einfach und auch im grosstechnischen Massstab durchführen. Das trägergebundene unlösliche Enzym wird in einer Lösung mit 75000 bis 150000 lU/ml Penicillin, z. B. Penicillin G oder Penicillin V suspendiert. Die enzymatische Spaltung wird bei konstantem pervert im Bereich von 6 bis 9 vornehmlich im Bereich des PH-Optimums der jeweils gebundenen
Penicillinacylase z. B. bei PH 7, 8 durchgeführt. Zur Neutralisation des abgespaltenen Acylrestes z. B. der
Phenylessigsäure oder der Phenoxyessigsäure verwendet man wässerige Alkalilösungen z. B. Kali-oder Natronlauge oder organische Amine, vorzugsweise Triäthylamin.
Aus dem Verbrauch der Base ist die
Reaktionsgeschwindigkeit und die Beendigung der Spaltung zu ersehen. Die Penicillinacylase katalysiert sowohl die Spaltung von Penicillin zur 6-APS als auch die Resynthese der Penicilline aus den Spaltprodukten. Das
Gleichgewicht ist abhängig vom pH-Wert des Mediums.
Bei kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes Penicillin.
Dies kann zur Umacylierung von Penicillinen in Gegenwart anderer Acylreste oder zur Synthese von Penicillinen aus 6-APS ausgenutzt werden.
Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 38 C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z. B. bei 25 C durchgeführt, muss doppelt soviel Enzym wie bei 38 C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.
Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Ausserdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins.
Ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100000 lU/ml (1 mg Penicillin G-Kalium entspricht 1598 IU (internationale Einheiten)) Penicillin G-Kalium ist nach 10 h bei PH 7, 8 und 380e vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 3. lOs Einheiten Penicillin G eingesetzt werden (eine Enzymeinheit (U) ist definiert als die Aktivität, die ljuMol (6-Nitro-3 (Phenylacetyl-) aminobenzoesäure (NIPAB) pro min bei 25 C hydrolysiert). Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0, 5 bis 1% des Reaktionsgemisches. Werden pro 105 IU Penicillin G, 2 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die vollständige Spaltung nur 2 h.
Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Penicillinacylase, bei Verwendung z. B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.
Die erfindungsgemäss verwendete trägergebundene Penicillinacylase kann perlförmig hergestellt werden und zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spezifisches Gewicht aus.
Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachem Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugieren ohne Verlust durch mechanische Beanspruchung z. B. durch Abrieb. Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können. Die erfmdungsgemäss hergestellte trägergebundene Penicillinacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration, da durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen.
Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozess wegen des vergleichsweise hohen spezifischen Gewichts, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so dass nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batch-Prozess im Reaktionsgefäss verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.
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Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen Verfahren z. B. in Reaktionssäulen, wobei die Perlform die erforderliche, hohe Durchflussgeschwindigkeit ermöglicht.
Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach Abtennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen (siehe z. B. deutsche Patentschrift Nr. 1, 111, 778) und bei PH 4, 3 kristallisiert. Bei der Spaltung von Penicillin mit der erfindungsgemäss hergestellten trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten als bei Verwendung von E. coli-Schlamm aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung des Enzymharzes nach der österr. Patentschrift Nr. 319471 erreicht. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Ausbeute von etwa 90% d. Th. isoliert. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung.
Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei andern Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymere zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäss hergestellten 6-APS ausgeschlossen.
Die trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum. Auch hienach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.
Die in den folgenden Beispielen angegebenen Siedepunkte wurden bei Normaldruck bestimmt.
Beispiel l : Die enzymatische Aktivität einer Penicillinacylase, deren Herstellung nachstehend beschrieben ist, wurde colorimetrisch oder titrimetrisch mit 0, 002 M-6-Nitro-3- (N-phenylacetyl) -aminobenzoe- säure (NIPAB) als Substrat bei PH 7, 5 und 25 C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der entstehenden
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pro min.
Herstellung der Penicillinacylase : a) 80 g Tetra thylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 11 Benzol gelöst und unter Rühren 4 h auf 60 C erwärmt. Dann gibt man 1 g
Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100 bis 140 C) zu und polymerisiert weitere 5 h bei
70 C. Das pulvrige Polymere wird abgesaugt, einmal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30 bis 50 C) aufgeschlämmt und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 94 g Schüttvolumen : 3, 5 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 4, 7 ml/g spezifische Oberfläche : 5 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 3, 5 mÄquiv/g b) 1 g des nach a) hergestellten Trägerharzes wird in 30 ml einer wässerigen Lösung von 132 U
Penicillinacylase (spezifische Aktivität 1 U/mg Protein (Biuret)) suspendiert. Unter Konstanthaltung des PH-Wertes auf 6, 3 durch Zugabe von 1 N-Natronlauge mit einem PH-Staten wird die Suspension 20 h bei 25 C gerührt. Anschliessend saugt man über eine Glasfritte G3 ab und wäscht das Harz mit
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ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen wird die Aktivität des Harzes nicht mehr verändert.
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 132 U Überstand + Waschwasser : 12 U
Harz nach der Umsetzung : 86 U das sind 65% der Ausgangsaktivität.
Beispiel 2 : Enzymatische Aktivität einer am Trägerharz gebundenen Asparaginase (Asparagin-Hydrolyse)
Ausgangslösung : 21000 U überstand nach der Umsetzung : 3360 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 3910 U das sind 19% der Ausgangsaktivität.
Herstellung der am Trägerharz gebundenen Asparaginase : a) Eine Lösung von 90 g Äthylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g
Azoisobuttersäurenitril in 11 Benzol wird unter Rühren zunächst bei 60 C polymerisiert. Nach 4 h gibt man 200 ml Benzin (Kp 100 bis 140 ) und 1 g Azoisobuttersäurenitril zu und polymerisiert 2 h bei 70 und 2 h bei 80 C weiter. Anschliessend saugt man das Polymere ab, wäscht gründlich mit
Petroläther (Kp 30 bis 500C) und trocknet im Vakuum.
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Ausbeute : 97 g Schüttvolumen : 6, 4 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 8, 0 ml/g spezifische Oberfläche : 298 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 1, 5 mÄquiv/g b) 6 g des nach a) erhaltenen Trägerharzes wurden mit 590 U Asparaginase in 165 ml Wasser umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 590 U überstand + Waschwasser : 26 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 352 U das sind 60% der Ausgangsaktivität.
Beispiel 3 :
A) 1 g eines Trägerharzes, dessen Herstellung nachstehend beschrieben ist, wurden zu einer Lösung von
50 mg unspezifischer Elastase mit einer enzymatischen Aktivität von 139 U in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei das PH auf 5, 8 konstant gehalten wurde. Nach der Umsetzung wurde das Harz abgesaugt und mit 50 ml 1
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M-Phosphatpuffer PH 7, 5 gewaschen.
Ergebnis :
Ausgangslösung : 139 E überstand und Waschlösungen : 51 E am Trägerharz gebunden : 15 E das sind 11% der Ausgangsaktivität.
Hiebei wurde die enzymatische Aktivität titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration
11, 9 mg/ml) bei pH 8, 0 und 250C bestimmt. 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1,Mol
Kalilauge pro min.
B) 1 g des Trägerharzes wurde zu einer Lösung von 50 mg Urease kristallisiert (Merck) in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur 16 h gerührt, wobei das PH auf 6, 3 konstant gehalten wurde. Die Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel lb angegeben.
Ergebnis :
Ausgangslösung : 5013 U überstand und Waschlösungen : 1397 U am Trägerharz gebunden : 1405 U das sind 28% der Ausgangsaktivität.
Die enzymatische Aktivität der Urease wurde titrimetrisch mit 0, 17 M-Harnstoff als Substrat bei
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min spaltet.
C) 0, 4 g des Trägerharzes wurden mit 40 mg Glutathion in reduzierter Form*) in 32 ml Wasser 16 h bei einem konstanten pH-Wert von 6, 3 bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Harz wurde abgesaugt und mit einer Lösung von 1 N-Natriumchlorid in 0, 05 M-Phosphatpuffer PET 7,5 und anschliessend mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Harzes im Vakuum bei 100 C über Phosphorpentoxyd wurden 0, 47 g erhalten. Die Stickstoffbestimmung nach Dumas ergab einen Wert von 1, 1% N, der einem Gehalt von 8, 04% oder 37, 8 mg Glutathion entspricht. Das sind 94% der eingesetzten Menge an Glutathion.
*) Bemerkung : Glutathion stellt bei biochemischen Reaktionen einen überträger bei Redoxprozessen dar. Hiebei wird das Glutathion in die Disulfidform übergefiihrt. Das hier angeführte Glutathion-Präparat ist also als Reduktionsmittel bei empfindlichen Biochemikalien insbesondere bei Enzymen, in welchen die Disulfidgruppen in SH-Gruppen umgewandelt werden sollen, einsetzbar.
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Herstellung des Trägerharzes : Die Copolymerisation von 90 g Diäthylenglykoldimethacrylat mit 10 g Maleinsäureanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 2a ergibt :
Ausbeute : 96 g Schüttvolumen : 5, 5 ml/g Quellvolumen in Wasser : 6, 7 ml/g spezifische Oberfläche : 9, 2 m2/g
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Beispiel 4 :
A) Die Umsetzung eines Trägerharzes, dessen Herstellung anschliessend beschrieben ist, mit
Penicillin-Acylase analog zu Beispiel lb liefert folgende Ergebnisse :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 123 U Überstand + Waschlösungen : 13 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 79 U das sind 64% der Ausgangsaktivität.
B) 0, 4 g des Trägerharzes wurden zu einer Lösung von 40 mg Trypsin in 32 ml 0, 01
M-Calciumchloridlösung gegeben und 16 h bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des
PH-Wertes auf 6, 3 gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel lb gewaschen.
Enzymatische Aktivität in der Ausgangslösung : 44 U in Überstand und Waschlösungen : 5, 2 U am Harz gebunden : 8, 3 U das sind 19% der Ausgangsaktivität.
Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 [1962] 278, mit Benzoyl-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der
Spaltung von 1, Mol Substrat bei 250C und PH 7, 8.
C) 1 g des Trägerharzes wurde zu einer Lösung von 50 rng unspezifìscher Elastase in 32 ml Wasser gegeben. Die Suspension wurde 16 h bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des PH-Wertes auf
5, 8 gerührt. Die Aufarbeitung und titrimetrische Bestimmung der Enzymaktivitäten mit Casein als
Substrat wurde wie in Beispiel 3A angegeben durchgeführt.
Enzymatische Aktivität in der Ausgangslösung : 139 U in Überstand und Waschlösungen : 32 U am Harz gebunden : 36 U das sind 26% der Ausgangsaktivität.
Herstellung des Trägerharzes : 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und
1 g Porofor N werden in 11 Benzol gelöst und unter langsamem Rühren 16 h bei 800C polymerisiert. Das Polymere wird analog zu Beispiel la aufgearbeitet.
Ausbeute : 95 g Schüttvolumen : 2, 5 ml/g Quellvolumen : 3, 0 ml/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 2, 6 mÄquiv/g Beispiel 5 : 0, 4 g eines Trägerharzes, dessen Herstellung nachstehend beschrieben ist, wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 h unter Konstanthaltung von PH 6, 3 bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel 3C gewaschen und getrocknet. Es wurden 0, 46 g Harz erhalten, das 0, 9% N nach Dumas enthielt. Dem entspricht ein Gehalt von 6, 6% oder 30, 4 mg Glutathion das sind 76% der eingesetzten Menge.
Herstellung des Trägerharzes : In einem Rührgefäss werden 11 Benzin (Kp 100 bis 140 C) und 1 g Azoisobuttersäurenitril 1 h auf 90 C erwärmt. Dann wird bei 800C eine Lösung von 95 g Athylenglykoldimethacrylat, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril innerhalb 3 h zugetropft
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und weitere 2 h bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Polymere wird abgesaugt, mehrmals mit Benzol und
Petroläther (Kp 30 bis 500C) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 96 g Schüttvolumen : 14 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 18, 2 ml/g spezifische Oberfläche : 70 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 0, 5 mÄquiv/g Beispiel 6 : Die Umsetzung eines wie nachstehend beschrieben hergestellten Trägerharzes mit
Penicillin-Acylase lieferte folgende Ergebnisse :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 107 U Überstand und Waschlösungen : 28 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 55 U das sind 51% der Ausgangsaktivität.
Herstellung des Trägerharzes : Eine Lösung von 62, 5 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 37, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 150 ml Butylacetat und 11 Benzin (Kp 100 bis 1400C) wird unter Rühren 2 h bei 70 C, 2 h bei 750C und 1, 5 h bei 900C polymerisiert. Das Polymere wird abgesaugt, 24 h im Soxhlet-Extraktor mit Benzol extrahiert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 77g
Schüttvolumen :7,3ml/g
Quellvolumen in Wasser : 8, 2 ml/g spezifische Oberfläche : 19, 4 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 4, 0 mÄquiv/g.
Beispiel 7 : Die Umsetzung eines wie nachstehend beschrieben hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase lieferte folgende Ergebnisse :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 107 U Überstand und Waschlösungen : 51 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 19 U das sind 18% der Ausgangsaktivität.
Herstellung des Trägerharzes : Eine Lösung von 90 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1, 0 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1000 ml Benzin (Kp 100 bis 1400C), in dem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono-und-dioleat gelöst wurden, suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Bildung fester Perlen (etwa 2h) bei 600C und anschliessend 20h bei 650C polymerisiert. Das Polymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30 bis 50 C) aufgeschlämmt und im Vakuum bei 500C getrocknet.
Ausbeute : 94 g mittlerer Teilchendurchmesser : - 0, 35 mm Schüttvolumen : 2, 8 ml/g
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Beispiele für die Penicillinspaltung Beispiel 8 : 79g feuchte trägergebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 687 U (NIPAB-Test), die durch Bindung von Penicillinacylase an ein Copolymerisat aus Äthylenglykoldimethacrylat und Maleinsäureanhydrid dargestellt worden ist, werden mit 129 g Penicillin G-Kalium (Reinheit 98%) in 2000 ml Wasser 9 h bei 380C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird hiebei durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7, 8 gehalten. Die Aufnahme an Triäthylamin kommt mit Beendigung der Reaktion zum Stillstand.
Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert oder abgesaugt, mit jeweils 200 ml Wasser und 0, 2 M-Phosphatpuffer PH 6, 5 nachgewaschen ; sie ist damit für einen neuen Ansatz bereit. Das Filtrat,
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einschliesslich der Waschlösungen wird im Vakuum auf 300 ml eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischen Punkt bei PH4, 3 in Gegenwart von 200 ml Methylisobutylketon ausgefällt. Nach einer Stunde wird abgesaugt, mit 200 ml Wasser und dann mit 200 ml Aceton nachgewaschen.
Die 6-APS wird im Vakuum bei 400C getrocknet ; Schmelzpunkt 2080C. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 67, 8 g, das sind 90, 5% der Theorie. Die Reiheit beträgt 98%.
Beispiel 9 : 60 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 673 U (NIPAB-Test), die durch Bindung von Penicillinacylase an ein Copolymerisat aus Tetraäthylenglykoldimethacrylat und Maleinsäureanhydrid hergestellt worden ist, werden mit 129 g Penicillin G-Kalium in 2000 ml Wasser 9 h bei 38 C gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin auf 7, 8 konstant gehalten. Die weitere Aufarbeitung wird analog zu Beispiel 8 durchgeführt. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 65, 3 g, das sind 87% der Theorie.
Vergleichsbeispiel : (Beispiel 3 der deutschen Offenlegungsschrift 1917057) : 10 g Äthylen-Maleinsäureanhydrid wurden in 1250 ml 0, 05 m Phosphatpuffer bei einem PH-Wert von 7, 6 gerührt. Dann wurden 100 ml l% ige Hydrazinhydratlösung zugesetzt und 2 min danach 17, 4 ml einer Lösung mit 1150 Einheiten Penicillinacylase (NIPAB-Test, Einheitendefinition wie vorher angegeben). Der Proteingehalt der Enzymlösung betrug 20 mg/ml. Die Mischung wurde 2 h in einem Eisbad gerührt und über Nacht im Kühlraum bei 50C gehalten. Das Präparat war gelartig und konnte nur durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Nach dem
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Substanz erhalten. Die enzymatische Aktivität betrug 0, 06 Einheiten/g, das sind nur 0, 83% der eingesetzten Enzymaktivität.