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Die Erfindung betrifft die Verwendung eines wasserunlöslichen Proteinpräparates, insbesondere Enzym- präparates, wobei das Protein an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Ein- heiten von
A 0, l-50 Gew.-% o ;, ss-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen
B 35 - 90 Gew. -% Estern von Diolen und/oder Polyolen mit Acrylsäure oder Methacrylsäure und
C 5 - 60 Gew.
-% mindestens eines hydrophilen Monomeren mit mindestens einer Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfonylgruppe besteht-wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt-und die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2 bis 20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1 bis 400 m ?/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0, 02bis 11 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, zur Durchführung einer durch Proteine katalysierbaren Reaktion wie z. B. der hydrolytischen Spaltung von Substraten, insbesondere zur Spaltung von Penicillinen unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure.
Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z. B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.
Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymeren des Maleinsäureanhydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wässerigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so dass vor oder während der Umsetzung zweckmässig ein zusätzlicher Vernetzer z. B. ein Diamin zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vgl. E. Katchalski, Biochemistry 3 [1964], S. 1905 bis 1919).
Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mässige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 1 908 290).
Ausserdem wurden stark vernetzte Trägerpolymeren durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt. Auf Grund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen - in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid-, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepasst werden kann (vgl. deut- sehe Offenlegungsschrift 2 008 990).
In der deutschen Offenlegungsschrift 1 917 057 werden sehr verschiedene Trägermaterialien beschrieben, an welche das Enzym Penicillinacylase gebunden werden kann. Unter anderem werden dort ÄthylenMaleinsäureanhydrid-Polymerharze, Acrylsäureharze und auch Polysaccharide als mögliche Träger angegeben. Davon sind die Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Polymerharze (EMA) den Harzen gemäss der Erfindung am ehesten vergleichbar. Bei Nacharbeitung des Beispiels 3 dieser Offenlegungsschrift wurde, wie das Vergleichsbeispiel zeigt, ein gelartiges Enzympräparat enthalten, welches nach der Spaltung von Penicillinen zu 6-Aminopenicillansäure nur durch Zentrifugation abgetrennt werden kann.
Präparate mit einer derartigen Gel-Struktur sind jedoch für eine wirtschaftliche Verwertung im grosstechnischen Verfahren nicht gut geeignet. Hingegen können die erfindungsgemäss verwendeten unlöslichen Enzympräparate, welche pulverige Substanzen darstellen, z. B. durch eine einfache Filtration oder sogar lediglich durch Sedimentation abgetrennt werden. Der Produktionsverlauf wird hiedurch sehr einfach und liegt kostenmässig sehr günstig.
Bei der Nacharbeitung konnte nur eine sehr ungünstige Ausbeute an unlöslichem Enzym erreicht werden.
In 160 ml Gel wurden nur 9, 6 Einheiten an unlöslichem Enzym gefunden. Eine derartig geringe spezifische Aktivität ermöglicht eine enzymatische Hydrolyse von lediglich etwa 3g Penicillin-G-Kalium innerhalb einer Reaktionszeit von 9 h. Demgemäss ist eine Verwendung der Harze gemäss der deutschen Offenlegungschrift 1917 057 zu einer grosstechnischen Herstellung von 6-APS mit wesentlichen Nachteilen behaftet.
Im Gegensatz hiezu können in überraschender Weise gemäss der Erfindung Enzympräparate mit hohen spezifischen Aktivitäten hergestellt werden. So sind z. B. zur enzymatischen Spaltung von 129 g PenicillinG-Kalium nur 79 g feuchtes Enzymharz erforderlich. Als ,-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 4 bis 5 Kohlenstoffatomen die für die Herstellung der Copolymerisate benötigt werden, seien namentlich genannt : Maleinsäure-, Itaconsäure-oder Ci- traconaäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen
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dieser Anhydride eingesetzt werden.
Die zu verwendenden Ester von Diolen und/oder Polyolen mit Acrylsäure oder Methacrylsäure leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oderphenolischen, vorzugsweise alkoholischen OH-
Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxyden mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise
2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxyde ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tra- genden Verbindung 1 bis 104,bevorzugt 1 bis 10 Alkylenoxydbausteine anpolymorisiert sind.
Beispielhaft seien Alkylenoxyde, Äthylenoxyd, Propylenoxyd, Butylenoxyd, Trimethylenoxyd, Tetra- methylenoxyd, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxyd, vorzugsweise Äthylenoxyd und Propylenoxyd ge- nannt.
Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff- aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Al- kylenoxyden zur Herstellung der Di-und/oder Poly- (Meth) Acrylate zu verwenden.
Die einzusetzenden Ester von Diolen und/oder Polyolen mit Acrylsäure oder Methacrylsäure werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di-und/oder Polyole mit (Meth) Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Tri- äthylamin, bei Temperaturen unter 200C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vgl. deutsche Offenlegungs- schrift 1907666)..
Als Di-bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen kommen z. B. in Frage : Äthylenglykol, Propandiol-1, 2, Propandiol-1, 3, Butandiole insbesondere Butan- diol-1, 4, Hexandiole, Dekandiole, Glycerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxyden, wie vorstehend angegeben. Auch Poly-bis-chlormethyl-oxacyclo- butan oder Polystyroloxyd sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.
Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 bis 10 Molen Alkylenoxyd mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.
Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgewichten bis 500 oder deren Gemische.
Die dritte Gruppe der Copolymerisationskomponenten besteht aus einfach ungesättigten, hydrophilen Mo- nomeren. Als solche können alle polymerisierbaren, einfach ungesättigten Verbindungen, welche keine gegen Anhydridgruppen reaktiven funktionellen Gruppen besitzen und hydrophile Polymeren bilden, verwendet werden.
Die hydrophilen Monomeren besitzen vorzugsweise mindestens eine Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfooder Sulfamoyigruppe, wobei die Aminogruppen des Aminoearbonyl- oder Sulfamoylrestes gegebenenfalls durch Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder durch Alkoxymethyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkoxyrest substituiert sein können.
Beispielsweise seien Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäurehalbester mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen im Alkoholrest, N-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon, Methacrylamid, N-substituierte (Meth) Acrylamide wie N-Methyl-und N-Methoxymethyl- (meth)-acrylamid und N-Acryloyl-dimethyltaurin genannt.
Sie werden je nach der gewünschten Hydrophilie und Quellbarkeit der Copolymeren und der Länge der Polyalkylenoxydkette (n) des mehrwertigen (Meth)-acrylesters in Mengen von 5 bis 60 Gew.-% der Mono- merenmischung zugesetzt. Ausser der Hydrophilie beeinflusst der Zusatz dieser Monomeren überraschenderweise auch die Struktur der Polymeren, was bei der Herstellung von Perlpolymerisaten von ganz besonderem Vorteil ist, da hier die Auswahl der zur Monomerenmischung zufügbarenVerdünnungsmittel durch die Bedingungen der Unlöslichkeit in Paraffinkohlenwasserstoffen und der Inertheit gegenAnhydridgruppen stark einge- schränkt wird.
Auf Grund der Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck optimal angepasst werden.
Falls gewünscht, können neben den zu verwendenden Di-und/oder Poly- (Meth) Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladi- pat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0, 01 bis 30 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt werden.
Die Polymerisation kann z. B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie halogensubsti- tuierte Kohlenwasserstoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.
Beispielsweise seien genannt : Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200 C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.
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Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 2000C, vorzugsweise 50 bis 1000C in Ab- hängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Ausserdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.
Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulverige Substanzen mit Schüttvolumina von 1, 5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0, 1 bis 500 m2/g, bevorzugt 1 bis 400 m2/g. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0, 01 bis 14 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0, 02 bis 11 mÄquiv/g.
Die Suspensionspolymerisate sind weisse oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmässig geformt sein können und einen Durchmesser von 0, 03 bis 3 mm, vorzugsweise 0, 05 bis 0, 5 mm und
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Schüttvolumina von etwa 1, 4 bis 8 ml/g, vorzugsweise 1, 4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0, 01 bis 14 mAquiv/g, vorzugsweise 0, 02 bis
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Grund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekular- gewichte sind daher nicht bestimmbar.
Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1, l-bis Sfache ihres Schüttvolumen quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymeri- sate reagieren können. Ausserdem besitzen sie eine ausgezeichnete mechanische Stabilität und damit prak- tisch keinen Abrieb.
Die oben beschriebenen Trägerharze binden alle Substanzen, die eine funktionelle Gruppe tragen, die be- fähigt ist, mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden. Man geht hiebei so vor, dass man zu einer gerührten wässerigen Lösung des Proteins bei einer Temperatur zwi- schen 0 und 300C die benötigte Polymerenmenge zugibt.
Das Gewichtsverhältnis von Protein zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepasst werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig.
Bei zahlreichen Enzymen ist es auch zweckmässig, Stabilisatoren zuzusetzen. Als solche kommen Poly- äthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung von Denaturierung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen. Das pH wird zweckmässig mit einem PH-Staten auf dem für die betreffende Bindung optimalen pH-Wert gehalten. Dieser pH-Wert liegt in einem Bereich von 2 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7.
Beim Einsatz von Penicillinacylase hat es sich als zweckmässig erwiesen, zwischen PH 5, 7 und 6, 8 zu arbeiten. Dabei müssen zur Konstanthaltung des pH-Wertes anorganische Basen (z. B. Alkalilaugen) oder organische Basen (z. B. tert. organ. Amine) zugesetzt werden. Der Fortschritt der Reaktion Ist am Verbrauch der zur pH-Konstanthaltung nötigen Menge an Base ersichtlich.
Bei Raumtemperatur werden bis zur Beendigung der Reaktion etwa 16 h, bei 40C bis zu 40 h benötigt. Das Harz wird hierauf abgesaugt und zur Ablösung eines kleinen Anteiles an ionogen gebundenem Protein mit Puffern bzw. Salzen im Konzentrationsbereich von 0, 2 bis 1 M gewaschen.
Die gebundene Substanz wird entweder durch Elementaranalyse oder bei Enzymen oder Inhibitoren durch die enzymatische Aktivität bzw. die Hemmung der enzymatischen Aktivität bestimmt. Die Ausbeuten an gebundener Substanz sind von der Art der Substanz und der Zusammensetzung des Polymeren abhängig. So wurden z. B. Aminosäuren und niedermolekulare Peptide praktisch vollständig angekoppelt ; aber auch bei den Proteinen liegen die Ausbeuten an gebundener enzymatischer Aktivität bei 20 bis Uber 90% der eingesetzten Aktivität.
Nach dem Stand der Technik (deutsche Offenlegungsschrift 1935 711 und 2 008 990) wird die Ankoppelung der Proteine in Pufferlösungen in Konzentrationen von 0, 05 bis 0, 2 M vorgenommen. Arbeitet man ohne Puffer, so steigt der Anteil des ionogen gebundenen Proteins (deutsche Offenlegungsschrift 1935711). Überra- schenderweise zeigte sich, dass bei den erfindungsgemäss verwendeten Harzen die Koppelung in möglichst ionenfreiemMedium maximale Ausbeuten an covalent gebundenem Enzym ergibt. Das PH kann bei dieser Arbeitsweise durch einen pH-Staten sehr genau auf dem optimalen Wert konstant gehalten werden.
Die Anwendung von Enzymharzenist technisch von besonderer Bedeutung, da mit ihrer Hilfe technisch wertvolle Produkte hergestellt werden können. Die vorherige Bindung der biologischen Katalysatoren nach dem vorliegenden Verfahren gestattet durch ganz einfache Separationsprozesse ihre vollständige Abtrennung aus der Reaktionsmischung und ermöglicht die, aus wirtschaftlichen Gründen entscheidende, vielfache Wiederverwendung. Darüber hinaus wird in den meisten Fällen die Stabilität der empfindlichen und teuren Proteine entscheidend verbessert.
Im folgenden werden einige Beispiele der Anwendung von trägergebundenen Substanzen angegeben.
Die Gruppe der Proteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase kann z. B. zur Herstellung von Proteinhydrolysaten für mikrobiologische Prozesse verwendet werden. Ausserdem können die Enzyme auch zur Entfernung von antigenen Proteinen aus pharmazeutischen Wirkstoffen dienen.
Acylasen werden technisch zur Herstellung von 6-Aminopenicillansä. ure aus Penicillinen oder zur Trennung von Racematen acylierte Aminosäuren verwendet. Trägergebunden Amylase kann zum hydrolytischen Abbau von Starke verwendet werden.
Spezielle Hydrolasen, wie Asparaginase oder Urease können in gebundener Form im extrakorporalen Kreislauf therapeutisch eingesetzt werden.
Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden, Sie-
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linen aus 6-APS ausgenutzt werden.
Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 380C. Bei niedrigeren Tem- peraturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z. B. bei 250C durchgeführt, muss doppelt soviel Enzym wie bei 380C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.
Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der
Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Ausserdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins. Ein
Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100000 IU Im ! Penicillin G-Kalium ist nach 10 h bei PH 7, 8 und
380C vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 3. 105
Einheiten Penicillin G eingesetzt werden [eine Enzymeinheit (U) ist definiert als die Aktivität, die 1 p. Mol 6-Nitro-3 (phenylacetyl) -amino-benzoesäure (NIPAB) pro Minute bei 250C hydrolysiert].
Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0, 5 bis 1% des Reaktionsgemisches. Werden pro 105 IU
Penicillin G 2 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die vollständige Spaltung nur 2 h. Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Pencillinacylase, bei Verwendung z. B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.
Die trägergebundene Penicillinacylase kann perlförmig hergestellt werden und zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spez. Gewicht aus. Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachen Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugierenohne Verlust durch mechanische Beanspruchung z. B. durch Abrieb. Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können.
Die trägergebundene Penicillinacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration, da durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen. Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozess wegen des vergleichsweise hohen spez. Gewichtes, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so dass nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batch-Prozess im Reaktionsgefäss verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.
Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen Verfahren z. B. in Reaktionssäulen, wobei die Perlform die erforderliche, hohe Durchflussgeschwindigkeit erlaubt.
Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nachAbtrennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen (s. z. B. deutsche Patentschrift Nr. 1111778) und bei pH 4, 3 kristallisiert. Bei der Spaltung von Penicillin mit der trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten, als bei Verwendung von E. coli-Schlamm aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung eines Enzymharzes aus Penicillinacylase gebunden an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N, N'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Ausbeute von etwa 90% d. Th. isoliert.
Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung. Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei andern Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymeren zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäss hergestellten 6-APS ausgeschlossen.
Die trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum.
Auch hienach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.
Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck bestimmt.
Bei s pie 1 1 a) : 70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 1 Benzol gelöst und zunächst 4 h bei 600C polymerisiert. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp. 100 bis 1400C) zu und polymerisiert 2 h bei 70 C und 2 h bei 800C.
Das pulverige Polymere wird gründlich mit Petroläther (Kp. 30 bis 500C) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 96 g Schüttvolumen : 8, 8 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 12, 4 ml/g spez. Oberfläche : 8, 6 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3, 85 m Äquiv/g Bei s pie 1 1 b) : 6 g des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes werden in einer Lösung von 610 UPenicillinacylase in 150 ml Wasser suspendiert. Durch Zugabe von 1 N-NaOH mit einem pli-Staten wird
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der pH-Wert auf 6, 3 gehalten und die Suspension 20 h bei 250C gerührt.
Dann saugt man über eine Glasfritte G 3 ab und wäscht mit je 300 ml 0, 05 M-Phosphatpuffer pH 7, 5, der 1 M-Natriumchlorid enthält, und mit demselben Puffer ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen kann keine Aktivität mehr eluiert werden. Überstand und Waschlösungen werden vereinigt und ihre enzymatische Aktivität bestimmt, m einer aliquoten Menge wird die enzymatisohe Aktivität des feuchten Harzes gemes- sen.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung 610 U Überstand + Waschlösungen 112 U
Trägerharz nach der Umsetzung 561 U d. s. 92% der Ausgangsaktivität
Die enzymatische Aktivität derPenicillinacylase wird colorimetrisch oder titrimetrisch mit 0, 002 M-6Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäure (NIPAB) als Substrat bei PH 7, 5 und 250C gemessen. Der mo-
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heit (U) entspricht dem Umsatz von 1 Mol Substrat pro Minute.
Beispiel lc) : In einer Lösung von 40ml Urease in 32 ml Wasser werden 400 mg nach Bei- spiel 1a) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Bei ständigem Rühren bei Raumtemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von lN-Natronlauge auf PH 6,0 konstant gehalten. Nach 16 h ist die Reaktion been- det, das Harz wird abgesaugt und wie in Beispiel lb) mit Puffer gewaschen.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität
Ausgangslösung 168 U Überstand + Waschlösungen 64,5 U
Trägerharz nach der Umsetzung 87 U d. s. 52% der Ausgangsaktivität
Die enzymatische Aktivität der Urease wird titrimetrisch mit 0, 17 M-Harnstoff als Substrat, bei 250C und pH 6, 1 bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht der Enzymmenge, die 1 Mol Harnstoff d. h. 2 juMol Salzsäure pro Minute verbraucht.
Beispiel Id) : In einer Lösung von 100 mg Trypsin in 32 ml 0,02M-Calciumchlorid werden 500mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Unter ständigem Rühren bei 40C wird der pH-Wert durch Zugabe von IN-Natronlauge auf PH 6,3 konstant gehalten. Nach 16 h wird das Harz abgesaugt und wie in Beispiel lb) mit Puffer gewaschen.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität
Ausgangslösung 110 U Überstand + Waschlösungen 15,6 U
Trägerharz nach der Umsetzung 64 U d. s. 58% der Ausgangsaktivität
Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 [1962], S. 278, mit Benzol-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 J. L Mol SUbstrat pro Minute bei 250C und pH 7, 8.
Beispiel 2a): Eine Lösung von 80g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10g Methaorylsäure, 10g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 11 Benzol wird unter langsamem Rühren 4 h bei 600C, 2 h bei 70 C und 1 h bei 800C polymerisiert. Das Polymere wird abfiltriert, dreimal in Benzol ausgerührt, mit Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 70 g
Schüttvolumen : 7,0 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 8, 2 ml/g spez. Oberfläche : 5, 3m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 2,55 mÄquiv/g
Beispiel 2b) : 1 g des nach Beispiel 2a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel lb) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei PH 6,3 umgesetzt.
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Ergebnis :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung 118 U Überstand + Waschlösungen 21 U
Trägerharz nach der Umsetzung 82 U d. s. 69% der Ausgangsaktivität
Beispiel 3a):60g Tetraäthylenglykoldimethacrylat,30g Methacrylaäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1g Azoisobuttersäurenitril werden in 200 ml Acetonitril gelöst, Diese Lösung wird in 11 Benzin (Kp. 100 bis 1400C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono-und-dioleat enthält, suspendiert und 22 h bei 600C polymerisiert.
Die Polymerperlen werden abfiltriert, dreimal in Benzol und anschliessend zweimal in Petroläther (Kp. 30 bis 500C) suspendiert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 94 g weisse Kugeln Schüttvolumen : 4, 4 ml/g Quellvolumen in Wasser : 5, 5 ml/g spez. Oberfläche : 6, 6 m2/g mittlerer Partikeldurchmesser :#200
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 4, 3 mXquiv/g Beispiel 3b): 1 g des nach Beispiel 3a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel1b) mit
Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei PH 6, 3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
Ausgangslösung 118 U Überstand + Waschlösungen 43 U
Trägerharz nach der Umsetzung 96 U d. s. 81% der Ausgangsaktivität
Beispiel4a):EineLösungvon2100gTetraäthylenglykoldimethacrylat,600gMethacrylaäure,300g Maleinsäureanhydrid und 30 g Azoisobuttersäurenitril in 7,5 1 Acetonitril wird in 211 Benzin (Kp. 100 bis 1400C), in dem 150 g eines Gemisches von Glycerinmomo-und-dioleat gelöst wurden, suspendiert und 1 h bei 50 C und 20 h bei 600C polymerisiert.
Das Perlpolymerisat wird abgesaugt, zweimal mit Toluolund einmal mit Petroläther (Kp. 30 bis 500C) ausgerührt und bei 600C getrocknet.
Ausbeute : 2, 95 kg Schüttvolumen : 4,7 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 5, 4 ml/g mittlerer Partikeldurchmesser : zirka 0, 3 mm
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 4, 0 mÄquiv/g Beispiel 4b) : Ig des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel lb) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6, 3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test) in der Ausgangslösung 107 U Überstand und Waschlösungen 27 U
Trägerharz nach der Umsetzung 67 U d. s. 63% der Ausgangsaktivität Bei s pie 1 4 c) : 20 g des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren werden bei Raumtemperatur in 600ml einer Lösung von 1, 0 gunspezifischer Elastase aus Schweinepankreas unter Rühren eingetragen. Das PH wird hiebei auf 5, 8 konstant gehalten. Nach einer Reaktionszeit von 16 h wird das Harz abgesaugt und in der in Beispiel lb) beschriebenen Weise aufgearbeitet.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (Casein-Test)
Ausgangslösung 2180 E Überstand + Waschlösungen 992 E
Trägerharz nach der Umsetzung 1225 E d. s. 56% der Ausgangsaktivität
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Die enzymatische Aktivität der unspezifischen Elastase wird titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11,9 mg/ml) bei pH 8,0 und 250C bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht einem Verbrauch von 1 J. lMol Kalilauge pro Minute.
Beispiel 5a): Eine Lösung von 80g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 3a) polymerisiert.
Ausbeute : 92 g weisse, eiförmige Partikel Schüttvolumen : 2, 5 ml/g
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spez. Oberfläche : 1, 7 m2/g mittlerer Partikeldurchmesser : 125 J. l
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3, 5 mÄquiv/g
Beispiel 5b): 1 g des nach Beispiel 5a) bergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
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Überstand + Waschlösungen 34 U Trägerharz nach der Umsetzung 61 U d. s. 52% der Ausgangsaktivität
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6a) : Eine Lösung von 50 g Athylenglykoldimethacrylat, 40gMethacrylaäure, lOgMalein-Beispiel 7c : Ig des nach Beispiel 7b) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel lb) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei PH 6, 3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
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Überstand + Waschlösung 26 U
Trägerharz nach der Umsetzung 38 U d. s. 36% der Ausgangsaktivität
Beispiel8a):EineLösungvon50gTetraäthylenglykoldimethaorylat,40gN-Vinylpyrrolidon10g Maleinsäureanhydrid und 1 g Dicyclohexylpercarbonat in 200 ml Acetonitril wird in 11 Benzin (Kp. 100 bis 1400C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono-und-dioleaten enthält, suspendiertund unter Rühren zunächst 18 h auf 500C erwärmt. Dann gibt man 1 g des Initiators nach und rührt weitere 8 h bei 600C. Die Polymerlmgeln werden mit Benzol und Petroläther gründlich gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 54 g klare Perlen Schüttvolumen : l, 6 ml/g
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Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3, 3 m.. quiv/g
Gehalt an Stickstoff-3, 4% A 27% N-Vinylpyrrolidon.
Beispiel8b):1gdesnachBeispiel8a)hergestelltenPolymerenweidanalogzuBeispiel1b)mitPenicillinacylase in 33 ml Wasser bei PH 6, 3 umgesetzt.
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:Ergebnis : Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test) Ausgangslösung 107 U Überstand + Waschlösungen 49 U Trägerharz nach der Umsetzung 25 U d. s. 23% der Ausgangsaktivität
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lla) : Setzt man imAnsatz von 10a) statt N-Methoxymethyl-acrylamid 30 g N-Methoxyme-thylmethacrylamid ein, so erhält man folgendes Ergebnis :
Ausbeute : 94 g Schüttvolumen : 2, 4 ml/g
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in Wasser : 3, 9 ml/gErgebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
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Überstand + Waschlösungen 60 U
Trägerharz nach der Umsetzung 24 U d. s. 22% der Ausgangsaktivität Beispiel 12 : 76, 1 kg (Feuchtgewicht) trägergebundener Penioillinaoylase dargestollt gemässBeispiel 4b) mit einer Aktivität von 737000 U (NIPAB-Test) und 125 kg Penicillin G-Kalium (Reinheit 98%) werden nacheinander zu 2000l Wasser gegeben und bei 380C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7, 8 gehalten. Nach 8 h wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert, mit jeweils 60 1 Wasser und 801 0, 2 M Phosphatpuffer, PH 6, 5, nachgewaschen und für weitere Spaltungsansätze erneut eingesetzt.
Das Filtrat einschliesslich Waschwasser wird im Vakuum auf 300 l eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischen Punkt bei pH 4, 3 in Gegenwart von 200 l Methylisobutylketon ausgefällt. Nach 1 h wird abfiltriert, mit 200 1 Wasser und dann mit 200 1 Aceton nachgewa-
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Reinheit 98%.
Die trägergebundene Penicillinacylase wurde nacheinander zu insgesamt 30 Ansätzen eingesetzt. Auch nach 30 Spaltungen ist die trägergebundene Penicillinacylase nicht verbraucht. Die Reaktionszeit verändert sich nicht. Aufgearbeitet wurde wie vorstehend beschrieben. Die erzielten 6-APS-Ausbeuten sind nachstehend zusammengestellt :
1. Spaltung 91, 9% d. Th.
2. Spaltung 91, 4% d. Th.
3. Spaltung 91, 6% d. Th.
4. Spaltung 91, 0% d. Th.
5. Spaltung 91, 2% d. Th.
6. Spaltung 90, 3% d. Th.
7. Spaltung 91, 5% d. Th.
8. Spaltung 90, 9% d. Th.
9. Spaltung 91, 9% d. Th.
10. Spaltung 90, 7% d. Th.
11. Spaltung 91, 2% d. Th.
12. Spaltung 90, 1% d. Th.
13. Spaltung 90, 9% d. Th.
14. Spaltung 90, 7% d. Th.
15. Spaltung 91, 0% d. Th.
16. Spaltung 90, 2% d. Th.
17. Spaltung 90, 3% d. Th.
18. Spaltung 89, 9% d. Th.
19. Spaltung 89, 8% d. Th.
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1%Vergleichsbeispiel : (Beispiel 3 der deutschen Offenlegungsschrift 1917057):
10 g Äthylen-Maleinsäureanhydrid wurden in 1250 ml 0,05 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7, 6 gerührt. Dann wurden 100 ml 1%ige Hydrazinhydratlösung zugesetzt und 2 min danach 17,4 ml einer Lösung mit 1150 EinheitenPenicillinacylase (NIPAB-Test, Einheitendefinition wie vorher angegeben). Der Proteingehalt der Enzymlösung betrug 20 mg/ml. Die Mischung wurde 2 h in einem Eisbad gerührt und über Nacht im Kühlraum bei 50C gehalten. Das Präparat war gelartig und konnte nur durch Zentrifugieren abgetrennt werden.
Nach dem Auswaschen mit jeweils 250 ml 1M NaCl, 0, 5M NaH CO, 1M NaCl und Wasser wurden 160 g einer gelartigen Substanz erhalten. Die enzymatische Aktivität betrug 0,06 Einheiten/g, das sind nur 0, 83% der eingesetzten Enzymaktivität.