DE2061371C3 - Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzymkomplexes und dessen Verwendung - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzymkomplexes und dessen VerwendungInfo
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Description
30
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzyms
sowie auf ein Verfahren zur Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose unter J5
Verwendung dieses Enzyms.
Glucoseisomerase ist ein Enzym oder Enzympräparat, das die Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose
katalysiert. Dieses Enzym wird, wie berichtet, von zahlreichen Mikroorganismen produziert. Einige dieser
Mikroorganismen sind z. B. Aerobacter aerogenes, A. cloacae, Bacillus coagulans, B. megaterium, Brevibacterium
pento-aminoacidicum, Escherichia intermedia, Lactobacillus brevis, L fermenti, L. gayonii, L.
lycopersici, L. mannitopoeus, L. pentoaceticus, Leuconostoc mesenteroides, Paracalabacterium aerogenoides,
Pseudomonas hydrophilia, Streptomyces albus, S. bobiliae, S. favovirers und S. phaechromogenes.
Die in der obigen Umwandlungsreaktion teilnehmenden Glucose- und Fructoseverbindungen sind nahe
verwandte Monosaccharide, wobei Glucose die Aldosestruktur hat und Fructose in der Ketoseform vorliegt.
Diese einfachen Zucker treten natürlich und im freien Zustand in Früchten und anderen Pflanzenteilen auf. Sie
finden weite Verwendung als Süßungsmittel in Süßigkeiten, wohlschmeckenden Mischungen und anderen
Lebensmittelprodukten.
Der größte Teil an Glucose wird großtechnisch durch Hydrolyse von Maisstärke hergestellt. Obgleich Fructose
aus Sucrose durch enzymatische Umwandlung W) hergestellt werden kann, ist die Herstellung von
Fructose aus Glucose wirtschaftlicher; und bei der Herstellung bestimmter Maissirupprodukte wird ein
Teil der Glucose normalerweise in Fructose umgewandelt. Die Bedeutung dieser Umwandlung von Glucose in f>'>
Fructose bei der Maissirupherstellung liegt in der Tatsache, daß Fructose nicht nur wesentlich süßer ist als
Glucose, sondern daß sie auch sehr hygroskopisch und schwer zu kristallisieren ist Daher würde eine geeignete
Maßnahme zur erhöhten Umwandlung von Glucose in Fructose bei der großtechnischen Durchführung der
MaiEEirupherstellung weite Verwendung finden.
Ein weiteres Ziel ist die Schaffung einer immobilisierten Glucoseisomerase mit verbesserter Wärmebeständigkeit,
die eine erhöhte Umwandlung von Glucose in Fructose ergeben kann.
Die Umwandlung von Enzymen in immobilisierte oder unlöslich gemachte Produkte mit spezifischer
katalytischer Wirksamkeit hat in den letzten Jahren an Interesse gewonnen. Gewöhnlich wurden diese Enzymprodukte
nach verschiedenen Verfahren hergestellt einschließlich einer Polymerisation auf organische
Polymerisatgitter und Bindung an Polymerisate von Aminosäuren, Kupplung an Cellulose, Dextran und
andere Kohlehydrat- oder Polystyrolderivaten, Immobilisierung in Stärke- und Acrylamidgelen und Kupplung
an anorganische Träger, wie Bentonit, Kaolinit und poröses Glas. Diese immobilisierten oder unlöslich
gemachten Enzymprodukte werden gewöhnlich mit Hilfe von drei allgemeinen Arten von Reaktionen
gebildet: nämlich kovalente Bindung, ionische Bindung und physikalische Adsorption. Bisher ist jedoch noch
nicht berichtet worden, daß man eine für praktische Zwecke geeignete immobilisierte oder unlöslich gemachte
Glucoseisomerase nach irgendeinem der genannten Verfahren herstellen kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf einen Glucoseisomeraseenzymkomplex, in welchem das Enzym
an eine Matrix aus wasser-unlöslicher basischer Anionenaustauschercellulose gebunden ist. Ohne an
irgendeine Theorie gebunden werden zu wollen wird vermutet, daß der erfindungsgemäße Enzymkomplex
sowohl durch ionische Bindung als auch durch Adsorption des Enzyms an die wasser-unlösliche Matrix
gebildet wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Glukoseisomeraseenzyms,
wobei Dextranase enthaltende Glukoseisomerase vom Streptomyces phaechromogenes mit einem basischen Austauscher-Harz durch
gründliches Mischen in wäßrigem Puffer bei einem pH-Wert zwischen 7 — 10 umgesetzt wird und das
immobilisierte Enzym daraus gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Austauscher-Harz DEAE-/
TEAE- oder ECTEOLA-Cellulose verwendet wird.
Unter DEAE- und TEAE-Cellulose sind di- oder
triäthylaminoäthylierte Cellulosen und unter ECTEOLA-Cellulose sind Cellulosederivate von Epichlorhydrin
undTriäthanolamin zu verstehen.
Es wurde gefunden, daß der erfindungsgemäß hergestellte Glucoseisomeraseenzymkomplex eine ausgezeichnete
Wärmebeständigkeit zeigt und wiederholt (z.B. etwa 5 bis lOmal) bei 70°C verwendet werden
kann, bevor 50% seiner Enzymwirksamkeit verloren geht. Im üblichen Verfahren verliert das ungebundene,
lösliche Enzym dagegen praktisch seine gesamte Wirksamkeit in nur einer Umwandlung. Weiterhin
wurde gefunden, daß sich in der von der Matrix adsorbierten Form das pH-Optimum der Glucoseisomerase
auf eine Einheit niedriger verändert und die prozentuale Umwandlung von Glucose in Fructose
wesentlich erhöht wird. Im allgemeinen können etwa ,2—15% mehr als die verfügbare Glucose in Sirups in
Fructose umgewandelt werden, wenn man bei der Umwandlung den erfindungsgemäßen Enzymkomplex
anstelle des ungebundenen, löslichen Enzyms verwen-
deL Diese verbesserte Warmebeständigkeit und erhöhte
Ausbeute der Glucoseumwandlung stellen die außergewöhnlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung
dar.
Die vorliegende Erfindung wird dutch die Zeichnungen
weiter veranschaulicht In diesen Zeichnungen zeigen F i g. 1 und 2 die Wärme- oder Temperaturbeständigkeit
der ungebundenen, löslichen Glucoseisoinerase bzw. des immobilisierten Glucoseisomeraseenzymkomplexes
bei 700C. Fig. 3 zeigt die allmählichen ι ο
Verluste der Enzymwirksamkeit nach wiederholten Glucoseumwandlungen mit dem immobilisierten Glucoseisomeraseenzymkoinplex.
Die Herstellung von immobilisierten oder unlöslich gemachten Enzymen durch Reaktion mit Kohlehydratderivaten,
wie Ionenaustauschercellulosen und vernetztes Dextran, ist bereits beschrieben worden. So ist die
Bindung verschiedener Pflanzen- und Tier enzyme, wie Papain, Ficin, Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidase,
Catalase und Ribonuclease, an Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), Diazobenzylcellulose und ähnliche
Cellulosederivate von Michael and Evers, Makromol. Chem. 3, 200 (1949), Mitz und Summaria, Nature 189,
576—7 (1961), Weliky und Weetall, Immunochemistry 2, 293-322 (1965), Hornby und Lilly, Biochem. J. 107,
699—70 (1968), Manecke, Proceedings of the Biochemical Society 2P—3P (1968) und in der US-Patentschrift
31 26 324 beschrieben; die Bindung mikrobialer Enzyme, wie Aspergillus und Bacillus-Enzympräparate an
diäthylaminoäthyl- und andere aminoäthylierte Cellulosen ist von Tosa et al, Enzymologia 31, 214—22 (1966),
Boyer und Bruce, Arch. Biochem. Biophys. 128,442-55
(1968) und in der britischen Patentschrift 1108 533 beschrieben; die Bindung von Pflanzen-, Tier- und
mikrobialen Enzymen, wie Papain, Ficin. Ribonuclease, Lysozym, Trypsin, Chymotrypsin, Rinderserumalbumin
und /?-Amylase an vernetzte Dextran-(»Sephadex«)-gelfilter ist von Glazer und Wellner, Nature 194, 862-3
(1962) und Axen und Porath, Nature 210,367-69 (1969) beschrieben.
Im »Journal of Food Science and Technology«, Vol. 14, No. 12 (1967), Seiten 539—540, ist eine Immobilisierung
von Glucoseisomerase an einem DEAE-Sephadex-Harz und die Isolierung des erhaltenen unlöslichen
Komplexes beschrieben. Dieses Verfahren ist jedoch nur für hoch gereinigte Glucoseisomerase geeignet.
Rohe Enzympräparate von Streptomyces phaechromogenes enthalten nämlich immer Dextranasen, und diese
Dextranaseenzyme führen zur Auflösung des Sephadexharzes.
Die Reinigung der Glucoseisomerasepräparate stellt einen zusätzlichen Arbeitsschritt dar, der sich gemäß
vorliegender Erfindung vermeiden läßt, indem man nur die bestimmten obengenannten basischen Austauscherharze
verwendet.
Bei der versuchten Herstellung von immobilisierten oder unlöslich gemachten Glucoseisomerasekomplexen
wurde gefunden, daß andere Kohlehydrat- oder Cellulosederivate, wie CM-CeHülose, Phospho-cellulose,
Dextran, Sephadex und DEAii-üephadex, und verschie- t>o
dene andere Ionenaustauscher, wie »Dowex 1-X8« und »Dowex 2-X8«, die ebenfalls stark basische Anionenaustauscher
(vom quaternären Ammoniumtyp) sind, keine aktiven immobilisierten oder unlöslich gemachten
Glucoseisomeraseenzympräparate liefern. b5
Die erfindungsgemäß verwendbaren basischen Anionenaustauschercellulosen
sind bekannte Materialien, die im Handel erhältlich sind oder nach üblichen Verfahren
hergestellt werden können, vgl. z. B. J. Am. Chem. Soc. 78, 751-55 (1956) und die US-Patentschrift 31 02 1 !3.
DEAE-Cellulose und ECTEOLA-Cellulose sind in
grober und feiner Faser mit einem Schüttgewicht (g/ccm) von 0,14 (Type 20) und 0,20 (Type 40) im Handel
erhältlich. Geeignete mikrogranulare und faserige DEAE-Cellulosen sind auch als »Whatman« verbesserte
Ionenaustauschercellulosen bekannt Bei der Herstellung der letzgenannten Cellulosederivate wird das reine
Rohmaterial aus Baumwollcellulose zur Erhöhung der molekularen Orientierung vor Einführung der lonenaustauschergruppen
modifiziert; oder man kann die reine Baumwollcellulose chemisch während der Einverleibung
der funktionellen lonenaustauschergruppen in die Cellulosestruktur modifizieren. Solche Materialien sind
die mikrogranularen »Whatman« (vorgequollenen) Aminoäthylcellulosen DE 32 und DE 52.
Das Glucoseisomeraseenzym oder -enzympräparat wird aus Streptomyces phaechromogenes, erhalten.
Dieser Mikroorganismus ist bekannt, er gehört zu den Actinomycetalen. Streptomyces phaechromogenes wird
aus dem Boden isoliert und ist von Conn [Actinomyces phaechromogenus (sie)] »N. Y. State Agr. Exp. Sta.
Techn. Bull. Nr. 60«, 1917, und von Waksman und Henrici [Streptomyces phaechromogenus] in Bergey's
Manual 6. Aufl. 1948, Seite 943, beschrieben.
Die Herstellung von Glucoseisomerase aus Strepiomyces-Arten
ist ebenfalls bekannt und beschrieben (vgl. Takasaki,Agr.Biol.Chem..Bd.30,Nr. 12, Seite 1247-53
[1966], Bd.31,Nr.3, Seite 309-12 [1967]).
Obgleich die meisten Streptomyces-Arten D-Xylose
verwendende Organismen sind, bilden bestimmte Stämme bekanntlich Glucoseisomeraseenzyme durch
Assimilierung von Xylan, das wesentlich billiger ist als D-Xylose. Es ist sogar nicht notwendig, reines Xylan zur
Bildung der Glucoseisomerase zu verwenden. So können Rohmaterialien, wie Weizenkleie, Maiskolben
oder Maisschoten, direkt verwendet werden.
Andere Beispiele von Streptomyces phaechromogenes, die Xylose aus Kohlenstoffquelle verwenden, sind
von Sato und Tsumura, Agr. Biol. Chem., Bd. 29, Nr. 12,
Seite 1129—34 (ί 965) und in der japanischen Patentschrift
17 640 (1966) beschrieben. Die enzymische Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose wurde in
zellfreien, in Anwesenheit von D-Xylose gezüchteten Extrakten von Streptomyces phaechromogenes gezeigt.
Der Organismus benötigte bestimmte Metalle; Mg wurde als wesentlich gefunden, und Co regte die
Reaktion an.
Weitere besondere Beispiele von Streptomyces phaechromogenes, die bei der Herstellung der erfindungsgemäß
verwendeten Glucoseisomerase verwendet werden können, sind drei bei den Northern Regional
Research Laboratories deponierte Stämme, die der Öffentlichkeit unter den NRRL Kode-Bezeichnungen
B-1131, B-1517 und B-3559 zugänglich sind. Geeignete
Beispiele der Herstellung von Glucoseisomerase aus diesen Stämmen ist von Strandberg, Bacteriology
Proceeding, Seite 18, Al 17 (1969) beschrieben. Bei dieser Herstellung wird das Enzym durch Schallbehandlung
aufgebrochen und durch Amrr.oniumsulfatfraktionierung und anschließende Dialyse und Lyophilisierung
teilweise gereinigt.
Das erfindungsgemäß verwendete Glucoseisomeraseenzym umfaßt rohe Enzympräparate, die andere,
normalerweise in Stoffwechselprodukten der Ausgangsmikroorganismen auftretende Substanzen, wie
Enzyme von Dextranase-Typ, enthalten. Es können
auch in üblicher Weise gereinigte Enzympräparate verwendet werden.
Im Hinblick auf den weiten Reinheitsbereich des im erfindungsgemäßen Enzymkomplex verwendbaren
Glucoseisomeraseenzyms oder -enzympräparates können auch die \ crhältnisse von Enzym und basischer
Anionenaustauschercellulose in weiten Grenzen variieren. Im allgemeinen werden jedoch ausgezeichnete
Ergebnisse erzielt mit einem Verhältnis von etwa 1 — 100, vorzugsweise etwa 10 g nasser DEAE-Cellulose
(was 4 g Trockengewicht entspricht) pro 1000 G. I. (Glucoseisomerase)-Einheiten oder von etwa
227—454 g feuchtem Celluloseaustauscher pro 100 000 G. i.-Enzymeinheiten. Die im folgenden angegebenen
Beispiele veranschaulichen die geeigneten Enzymanteile in der Matrix, und der Fachmann erkennt
weitere geeignete Werte nach dem Studium der vorliegenden Anmeldung.
Die hier verwendete Bezeichnung »Glucoseisomeraseeinheit«
bezieht sich auf die Menge an Glucoseisomeraseenzym, die zur Bildung von 1 mg D-Fructose
während der Bebrütung von 0,2 ecm 1 M D-Glucose für 1 Stunde bei 7O0C in 0,5 ecm einer 0,2 M Phosphatpufferlösung
(pH-Wert 7,2) und 0,1 ecm einer 1 M MgSC>4 · 7 H2O Lösung gemäß dem Bestimmungsverfahren
von Takasaki, Agr. Biol. Chem., Bd. 30, Nr. 12, Seite 1248(1966) erforderlich ist.
Zur Erzielung einer wirksameren Produktion des immobilisierten Enzymkomplexes wird das Enzymausgangsmaterial
aus der Fermentationsbrühe von unerwünschten Materialien abgetrennt. So kann Kleie oder
anderes Wachstumsmaterial entfernt werden, indem man das Ferment durch ein Sieb führt; man kann Toluol
zur Verhinderung eines bakteriellen Wachstums und zur Einleitung der Glucoseisomerasefreigabe in das Medium
zufügen, und das lysierte Medium kann nach Zugabe einer Filterhilfe zur Entfernung von Zellrückstand und
unlöslichen Materialien filtriert werden.
Man erreicht die Herstellung des immobilisierten Glucoseisomeraseenzymkomplexes durch Mischen des
Enzyms oder Enzympräparates mit der basischen Anionenaustauschercellulose in wäßrigem Puffer bei
einem pH-Wert von etwa 7 — 10, vorzugsweise etwa 8.
Nach gründlichem Mischen dieser Komponenten bei normaler Temperatur (etwa 25° C) oder anderen
geeigneten Temperaturbedingungen wird der erhaltene Enzymkomplex z. B. durch Filtrieren, Zentrifugieren
und ähnliche Abtrennungsverfahren gewonnen und dann vorzugsweise mit weiterem Puffer gewaschen
oder besprüht Der filtrierte und gewaschene Enzymkompiex kann per se in nasser Form verwendet werden;
oder man kann den Kuchen durch übliche Protein- oder Enzymtrocknungsverfahren, wie z. B. auf Böden, in
Rotationstrommeln oder durch Sprühtrocknung, jedoch vorzugsweise durch Gefriertrocknung, trocknen.
Der immobilisierte Enzymkomplex kann auch nach irgendeinem der oben für das Glucoseisomeraseenzymausgangsmaterial
beschriebenen Reinigungsverfahren weiter gereinigt werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren
des Enzymkomplexes besteht in der selektiven Gradienteneluierung. Da auf dem Celluloseaustauscher
auch unerwünschte Bestandteile der fermentierten Flüssigkeit adsorbiert werden können, kann man
eine selektive Eluierung mit einem 0,2 M NaCl enthaltenden Puffer zur Entfernung dieser Verunreinigungen
ohne Eluierung des Enzyjns anwenden. Die selektive Eluierung des Enzyms aus dem Celluloseaustauscher
erreicht man durch erneutes Suspendieren des Kuchens in einem etwa 0,6 M NaCI enthaltenden Puffer
worauf man das eluierte Enzym nach geeignete: Verdünnung wie vorher mit neuer Austauschercellulost
zur erneuten Bildung des Enzymkomplexes mischt.
Geeignete Puffer zur Verwendung bei der Herstel lung des immobilisierten Enzymkomplexes sind Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
Borsäure-Borat, GIycinamid und Cholaminchlorid. Bevorzugt wird eir
0,02 M Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8—8,5-Phos
to phatpuffer, die zu einer Phosphorylierung der Stärkefragmente, Glucose oder Fructose führen könnten
werden erfindungsgemäß zweckmäßig vermieden.
Für die oben beschriebene selektive Eluierung können anstelle von NaCl andere Metallsalze, Vorzugsweise
einwertige Metallchloride, wie LiCI oder KCI verwendet werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Man stellte eine wachsende 445 kg Kultur vor Streptomyces phaechromogenes her, indem man eir
Medium aus 1% D-Xylose, 03% K2HPO4, 0,1 °/c
MgSO4 · 7 H2O, 0,02% CoCl2 · 6 H2O, 1% Pepton, 3%
Weizenkleie und 2% Maisweichflüssigkeit mit Streptomyces phaechromogenes aus einer Agaraufschlämmung
beimpfte und 48 Stunden bei 30°C fermentierte. Das rohe Wachstumsprodukt enthielt 125 000 G. I. Einheiter
und wurde zur Erzielung einer klaren überstehenden 50 000 G. I. Einheiten enthaltenden Flüssigkeit aufgearbeitet,
indem man das Ferment zur Entfernung vor restlicher Kleie durch ein 20 mesh Sieb führte, 4%
Toluol zufügte, dann 4% Kieselgur als Filterhilfe zugab und filtrierte. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde
mit 0,02 M Tris-Puffer (pH-Wert 8,5) gepuffert, wurden 500 g voräquilibrierte nasse DEAE-Cellulose zugefügt
Der pH-Wert des Mediums wurde durch die Zugabe des Celluloseaustauschers auf etwa 8,0 verringert. Nach
gründlichem Mischen durch 1 stündiges Rühren wurde die Mischung filtriert, der Filterkuchen mit 0,02 M
Tris-Puffer (pH 8,0) besprüht, und der gewaschene Kuchen wurde als aktiver Glucoseisomeraseenzymkomplex
zurückgehalten. Dieser Komplex hatte eine ausgezeichnete Wärmebeständigkeit und konnte zur
Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose bei wesentlich erhöhter Umwandlung im Vergleich zu
derjenigen mit der ungebundenen, löslichen Glucoseisomerase verwendet werden.
Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei anstelle des DEAE-Celluloseaustauschers eine äquivalente Menge
an ECTEOLA-Celluloseaustauscher zur Herstellung des immobilisierten Enzymkomplexes verwendet wurde.
Man erhielt ein immobilisiertes Glucoseisomeraseenzymprodukt mit praktisch derselben ausgezeichneten
Wärmebeständigkeit und Fähigkeit zur Umwandlung von Glucose in Fructose.
In einer Versuchsanlage wurde die Fermentation des Glucoseisomerasepräparates gemäß Beispiel 1 wiederholt
Nach 48stündiger Fermentation wurden 59 kg Mycelium und Kleie mit geringer Festigkeit (aus 4
Fermentationstanks) erneut in 227 kg Leitungswasser
suspendiert. Der Myceliumaufschlämniung wurde zugefügt:
2 1 Tris-Puffer(182g).pH8,0
121 g MgCI2 und 21,3 g EDTA (pH-Wert vor der
Zugabe auf 7,0 eingestellt)
1 kg Eiweiß (Lysozym)
1 I Toluol zur Inhibierung von bakteriellem
1 kg Eiweiß (Lysozym)
1 I Toluol zur Inhibierung von bakteriellem
Wachstum.
Der endgültige pH-Wert betrug 7,4. Die Myceliumaufschlämmung
wurde kontinuierlich bei 40—45"C gerührt, und zu den angegebenen Zeiten wurden Proben
zur Enzymbestimmung entnommen:
| Stunden | Aktivität |
| G.I./ccm | |
| 0 | 0,725 |
| 21 | 1,08 |
| 45 | 2,42 |
| 69 | 2,57 |
Der lysierten Aufschlämmung wurden 500 g nigCb
zugefügt, und zur Koagulierung des Lysozyms wurde
die Temperatur auf 60°C erhöht.
Der Aufschlämmung wurden 2,5% Kieselgur zugefügt, die Aufschlämmung wurde filtriert und die
Enzymlösung durch Eindampfen konzentriert. Das eingedampfte Material wurde durch Filtrieren geklärt
und das Enzym mit kaltem Aceton ausgefällt. Die Gesamtausbeute an eingedampften Material aus der
Versuchsanlage betrug etwa 30%.
Das eingedampfte Material aus der Versuchsanlage
ίο und die geklärte Glucoseisomerase wurden mit dest.
Wasser im Verhältnis von 1 :50 verdünnt. Zur verdünnten Glucoseisomeraselösung wurden 0,05 M
Tris-Puffer (pH 8,5) sowie vor-äquilibrierter DEAE-CeI-lulosekuchen
(4 g DEAE/1000 G. I. Einheiten) zugefügt, dann wurde 1 Stunde bei 4°C gerührt. Die Aufschlämmung
wurde filtriert und mit 0,15 M NaCl in 0,05 M Tris-Puffer (pH 8,0) gewaschen, bis keine weitere Farbe
eluiert wurde. Der erhaltene feuchte DEAE-G. I.-Kuchen
wurde in einem Kühlschrank gelagert und zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Die folgende Tabelle gibt einen Vergleich der physikalischen und chemischen Eigenschaften des
filtrierten Glucoseisomerasepräparates (G. I.) aus der obigen Fermentation und dem mit DEAE-Cellulose
gebildeten immobilisierten Glucoseisomeraseenzymkomplex (DEAE-G. I.)
Physikalische und chemische Eigenschaften von G.l. und DEAE-G.I.
DEAE-G. I.
pH-Optimum
pH-Stabilität
Temperaturoptimum
Temperaturbeständigkeit bei 700C
Benötigte Metallionen
pH-Stabilität
Temperaturoptimum
Temperaturbeständigkeit bei 700C
Benötigte Metallionen
Umwandlungsverhältnis von Glucose in Fructose
Verlust der Enzymwirksamkeit nach jeder Umwandlung Notwendige Enzymmenge zur Umwandlung von 100 g Glucose in Fructose (40 %) unter optimalen Bedingungen
(700C, pH 7,0 und 24 Std.)
Verlust der Enzymwirksamkeit nach jeder Umwandlung Notwendige Enzymmenge zur Umwandlung von 100 g Glucose in Fructose (40 %) unter optimalen Bedingungen
(700C, pH 7,0 und 24 Std.)
Eine Untersuchung von Tabelle 1 und den F i g. 1 bis 3 zeigt die folgenden entscheidenden Faktoren bezüglich
des immobilisierten Glucoseisomeraseenzymkomple-8,5-10
5,0-8,0
80-850C
20 Std. (Halbwertszeit)
(vgl. Fig. 1)
Mg++ (10"'n M)
Co++ (IO'3 M)
35-40 %
100 %
1800 Einheiten
7,5-8,5
4,5-9,0
75-85°C
stabil
(vgl. Fig. 2)
Mg++(10"2M)
Co++ (10~3 M)
45-50 %
vgl. Fig. 3
1200 Einheiten
ungebundene, lösliche Glucoseisomerase schon nach einer Umwandlung ihre gesamte Aktivität
verliert.
1) das pH-Optimum des Enzymkomplexes verlagerte sich um etwa 1 Einheit auf einen niedrigeren Wert;
2) die pH-Stabilität dehnte sich in beiden Richtungen aus;
3) die Temperaturbeständigkeit wurde wesentlich verbessert;
4) das Umwandlungsverhältnis von Glucose in Fructose wurde stark erhöht;
5) der Enzymkomplex verlor nach jeder Umwandlung nur etwa 10—15% seiner Aktivität, während'die
Das ungebundene, lösliche Glucoseisomeraseenzympräparat
und der immobilisierte Glucoseisomeraseenzymkomplex von Beispiel 3 wurden jeweils zur
Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose durch 20st0ndige Bebrütung mit einem 50%igen Maisstärkehydrolysat
mit einem Dextroseäquivalent von 97 bei 8O0C verwendet Die mit dem Enzymkomplex erzielte
Glucoseumwandlung war etwa 15% größer als die mit der freien Glucoseisomerase erzielte Umwandlung.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Glukoseisomeraseenzyms, wobei Dextranase enthaltende
Glukoseisomerase vom Streptomyces phaeochromogenes mit einem basischen Austauscher-Harz
durch gründliches Mischen in wäßrigem Puffer bei einem pH-Wert zwischen 7—10 umgesetzt
wird und das immobilisierte Enzym daraus gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Austauscher-Harz DEAE-/TEAE- oder
ECTEOLA-Cellulose verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer ein 0,02 M Tris-Puffer
verwendet wird und der pH-Wert 8 beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Streptomyces
phaechromogenes, als Austauschercellulose DEAE-Cellulose
und als Puffer ein etwa 0,02 M Tris-Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8 verwendet wird.
4. Verbessertes Verfahren zur Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose durch ein Glucoseisomeraseenzym,
dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym ein immobilisierter Glucoseisomeraseenzymkomplex
verwendet wird, der nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt worden ist.
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