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CN114591843B - 一种杂色云芝的固体培养基及制备方法和应用 - Google Patents

一种杂色云芝的固体培养基及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种杂色云芝的固体培养基及制备方法和应用，涉及菌用培养料技术领域。本发明所述固体培养基，采用麸皮作为固体培养基中的主要成分，具有经济绿色、杂色云芝生长速度快和抗染菌能力强的优点，不仅解决了现有培养基实验过程容易染菌问题，而且还能缩减成本。利用本发明所述固体培养基，可获得比PDA培养基更高的生物量以及更高的抗染菌性能。

Description

一种杂色云芝的固体培养基及制备方法和应用
技术领域
本发明属于菌用培养料技术领域，具体涉及一种杂色云芝的固体培养基及制备方法和应用。
背景技术
从东北林区分类并鉴定出的杂色云芝(Coriolus versicolor)，多孔菌科云芝属，是一种典型的白腐真菌。漆酶是已知可以降解多环芳烃、石油烃以及卤代烃等多种广泛存于环境中污染物的生物酶，而杂色云芝是文献报道中具有较强分泌漆酶能力的菌种，是未来土壤修复的潜力菌种。
作为土壤生物修复第一步，实验室中需要对修复所用的菌种进行固体培养，但传统所采用的土豆葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)往往存在着成本高和实验过程中易出现染菌的问题，不能满足短时间内获得修复菌种，影响后续进行菌剂制备或粗酶液制备并应用于污染土壤。虽然已有实验证明可以向固体培养基中添加抗生素，以达到抑制细菌生长，但与此同时对抗生素的添加量较为严苛，过多的抗生素会抑制菌种生物量、活性以及产酶能力等，因此不能作为解决染菌问题的最佳解决方案。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杂色云芝的固体培养基及制备方法和应用，解决传统采用的PDA培养基培养杂色云芝培养时间长以及培养过程中容易染菌的问题，降低成本，并提高杂色云芝的生物量和抗染菌能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种杂色云芝的固体培养基，所述固体培养基包括以下原料：麸皮、木糖、微量元素液、琼脂和水；
所述麸皮和木糖的质量比为(8：3)～(1：1)。
优选的，所述微量元素液中的微量元素种类包括：Mg、Mn、Na、Fe、 Co、Ca、Zn、Cu、K、B和Mo。
优选的，所述微量元素液中的微量元素分别由MgSO4、MnSO4、NaCl、 FeSO4、CoSO4、CaCl2、ZnSO4、CuSO4、KAl(SO4)2、H3BO3和NaMoO4提供。
优选的，所述MgSO4包括MgSO4·7H2O，FeSO4包括FeSO4·7H2O， CuSO4包括CuSO4·5H2O。
优选的，所述微量元素液中包括：3.0g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L MnSO4、1.0g/LNaCl、0.1g/L FeSO4·7H2O、0.1g/L CoSO4、0.082g/L CaCl2、0.1g/L ZnSO4、0.01g/LCuSO4·5H2O、0.01g/L KAl(SO4)2、0.01g/L H3BO3和0.01g/L NaMoO4。
优选的，每L所述固体培养基中包括1.36～2mL所述微量元素液。
本发明还提供了上述固体培养基的制备方法，制备每L所述固体培养基时，包括以下步骤：将所述麸皮与500mL煮沸的水混合再煮沸25min，过滤收集麸皮浸出液；
将所述麸皮浸出液与木糖、琼脂、微量元素液和部分水混合，煮沸，利用水定容至1L，灭菌后冷却得所述固体培养基。
优选的，所述过滤包括过9层纱布。
本发明还提供了上述固体培养基在提高杂色云芝生长速度并增强抗染菌能力中的应用。
本发明还提供了一种杂色云芝培养方法，包括以下步骤：将杂色云芝的菌种接种到上述固体培养基上，封口后于28℃进行培养。
有益效果：本发明提供了一种杂色云芝的固体培养基，采用麸皮作为固体培养基中的主要成分，具有经济绿色、杂色云芝生长速度快和抗染菌能力强的优点，不仅解决了现有培养基实验过程容易染菌问题，而且还能缩减成本。在本发明实施例中，向90mm培养皿中加入所述固体培养基，培养7天获得平均0.30135g的生物量，在同样尺寸培养皿上传统PDA培养基仅获得 0.27185g的生物量，相同时间内新型杂色云芝固体培养能获得更多的生物量，有利于后续将菌种进行液体发酵产酶和固体发酵获得菌剂，在空气暴露 2min后，新型杂色云芝固体培养仅出现40％染菌，而PDA培养基出现了 100％染菌。
附图说明
图1为杂色云芝在不同培养基中培养7d后的生物量比较图，从上往下数，其中第1～2行表示本发明所述固体培养基，第3～4行为利用PDA固体培养基；
图2为杂色云芝在不同培养基中培养7d后的漆酶酶活测定；
图3为本发明所述固体培养基的抗染菌实验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种杂色云芝的固体培养基，所述固体培养基包括以下原料：麸皮、木糖、微量元素液、琼脂和水；
所述麸皮和木糖的质量比为(8：3)～(1：1)。
本发明所述固体培养基以麸皮作为主要成分，每L所述固体培养基的原料中优选包括30～40g所述麸皮，更优选为40g，具有经济绿色、杂色云芝生长速度快和抗染菌能力强的优点，并且能缩减成本。本发明对所述麸皮的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述固体培养基中包括木糖，所述木糖为杂色云芝原生长环境中代谢木质素的中间产物，在本发明中作为碳源。本发明每L所述固体培养基的原料中优选包括15～30g所述木糖，更优选为30g。本发明对所述木糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。本发明中，每L所述固体培养基，优选采用40g所述麸皮和30g所述木糖。
本发明所述固体培养基中包括微量元素液，所述微量元素液中的微量元素种类，优选包括：Mg、Mn、Na、Fe、Co、Ca、Zn、Cu、K、B和Mo；且所述微量元素优选分别由MgSO4、MnSO4、NaCl、FeSO4、CoSO4、CaCl2、 ZnSO4、CuSO4、KAl(SO4)2、H3BO3和NaMoO4提供。在本发明中，所述MgSO4优选包括MgSO4·7H2O，FeSO4优选包括FeSO4·7H2O，CuSO4优选包括CuSO4·5H2O。在本发明实施例中，所述微量元素液中优选包括：3.0g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L MnSO4、1.0g/LNaCl、0.1g/L FeSO4·7H2O、0.1g/L CoSO4、0.082g/L CaCl2、0.1g/L ZnSO4、0.01g/LCuSO4·5H2O、0.01g/L KAl(SO4)2、0.01g/L H3BO3和0.01g/L NaMoO4。本发明每L所述固体培养基中优选包括1.36～2mL所述微量元素液，更优选包括1.5mL。本发明对上述各种微量元素的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明对所述微量元素液的制备方法也没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行溶解并定容即可。
本发明所述固体培养基中包括琼脂，所述琼脂的终质量浓度优选为所述固体培养基质量的2％。
本发明还提供了上述固体培养基的制备方法，制备每L所述固体培养基时，包括以下步骤：将所述麸皮与500mL煮沸的水混合再煮沸25min，过滤收集麸皮浸出液；
将所述麸皮浸出液与木糖、琼脂、微量元素液和部分水混合，煮沸，利用水定容至1L，灭菌后冷却得所述固体培养基。
本发明所述过滤优选包括过9层纱布。
本发明所述灭菌优选包括高温高压灭菌，更优选为在121℃高压灭菌 20min。本发明在所述灭菌有优选还包括将灭菌后的培养基平均分配至各平板或培养皿中，实施例中选择90mm培养皿，并向每个培养皿中倒入30mL 经灭菌后的培养基，静置冷却。
本发明还提供了上述固体培养基在提高杂色云芝生长速度并增强抗染菌能力中的应用。
本发明所述固体培养基，利用农业废弃物麸皮作为培养基的主要成分，以杂色云芝原生长环境中代谢木质素的中间产物木糖作为培养基中的添加碳源，并在培养基添加生物生长不可缺少的微量元素，具有经济性与废物再利用性好的优点，并且培养时间短(7天)，还具有一定的抗染菌能力，因此可用于提高杂色云芝生长速度并增强抗染菌能力。
本发明还提供了一种杂色云芝培养方法，包括以下步骤：将杂色云芝的菌种接种到上述固体培养基上，封口后于28℃进行培养。
本发明所述接种优选包括将保存的长满杂色云芝的培养基打成10mm 的菌片，将菌片接种至本发明所述固体培养基上，每个培养皿中可接种2个菌片，并利用封口膜将培养皿下部进行封口；而后置于生物培养箱中，设置温度为28℃进行培养即可。
利用本发明所述培养方法，经培养7d，每皿即可达到生物量0.30135g；同时先将所述固体培养基在空气中放置后再进行所述接种和培养，7d后染菌率为40％，相比于同等条件下的PDA培养基100％染菌率，有显著提高。
下面结合实施例对本发明提供的一种杂色云芝的固体培养基及制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1固体培养基的制备
A、微量元素液的制备，天平称取3.0g MgSO4·7H2O，0.5g MnSO4，1.0g NaCl，0.1gFeSO4·7H2O，0.1g CoSO4，0.082g CaCl2，0.1g ZnSO4，0.01g CuSO4·5H2O，0.01g KAl(SO4)2，0.01g H3BO3，0.01g NaMoO4，溶解至蒸馏水中并定容至1000mL；
B、天平称取40g麸皮，30g木糖备用；
C、将500mL蒸馏水煮沸后添加所称取的麸皮，煮沸25min，9层纱布过滤，获得麸皮浸出液；
D、适当添加蒸馏水后，添加30g木糖，1.5mL微量元素，终浓度为2％ (m/m)的琼脂，并煮沸；
E、蒸馏水定容至1000mL后，121℃高压灭菌20min，将30mL培养基倒至90mm培养皿，冷却，得到杂色云芝固体培养基，备用。
实施例2接种杂色云芝
1、实验例
A、无菌操作台上用无菌打孔器将长满杂色云芝的PDA培养基打成 10mm的菌片；
B、将菌片接种至实施例1制备的固体培养基上，每个培养基接种2个菌片；
C、利用封口膜将培养皿下部进行封口；
D、将已接种的固体培养基放置生物培养箱中，设置温度为28℃。
2、对比例
称取PDA(马铃薯葡萄糖琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)46g制备固体培养基，其余操作均与实验例相同，各设置4组重复。
在生化培养箱7天后测定生物量，结果如图1所示，实验例可获得生物量0.30135g/皿，对比例则仅为0.27185g/皿，即在相同时间内，利用本发明所述固体培养基，生长速度较PDA培养更快，能获得较大的生物量。
3、酶活测定
分别将在各培养基上培养得到的杂色云芝，依照孟瑶的方法(孟瑶.白腐真菌复合菌剂的制备及对石油污染土壤修复的研究[D].东北林业大学, 2012)转接至液体培养基中进行酶活测定实验。
实验如图2所示，本发明所述固体培养基转接后的酶活高于PDA转接至液体培养基的酶活，获得最高平均酶活26445.2818U/L，而同期PDA转接至液体培养基的最高平均酶活仅为19394.3703U/L。
实施例3抗染菌能力对比
1、实验组：将实施例1制备得到的固体培养基，在空气环境中暴露2min 后，放置于28℃生化培养箱7天后观察培养基染菌情况，5个重复。
2、对比组：称取PDA(马铃薯葡萄糖琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)46g制备固体培养基，并在121℃下高压灭菌20min，在空气环境中暴露2min后，放置于28℃生化培养箱7天后观察培养基染菌情况，5个重复。
结果如图3所示，实验组出现40％染菌率，而对照组出现了100％染菌率，由此可以看出本发明所述固体培养基较现有PDA培养基在抗染菌上有着明显优势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种杂色云芝的固体培养基的制备方法，其特征在于，制备每L所述固体培养基时，包括以下步骤：将麸皮与500mL煮沸的水混合再煮沸25min，过滤收集麸皮浸出液；
将所述麸皮浸出液与木糖、琼脂、微量元素液和部分水混合，煮沸，利用水定容至1L，灭菌后冷却得所述固体培养基；
所述麸皮和木糖的质量比为(8：3)～(1：1)；
每L所述固体培养基中包括1.36～2mL所述微量元素液，所述微量元素液中的微量元素种类包括：Mg、Mn、Na、Fe、Co、Ca、Zn、Cu、K、B和Mo。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述过滤包括过9层纱布。
3.利用权利要求1或2所述制备方法制备得到的固体培养基在提高杂色云芝生长速度并增强抗染菌能力中的应用。
4.一种杂色云芝培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将杂色云芝的菌种接种到利用权利要求1或2所述制备方法制备得到的固体培养基上，封口后于28℃进行培养。
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