[go: up one dir, main page]

DE19943460A1 - Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel - Google Patents

Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel

Info

Publication number
DE19943460A1
DE19943460A1 DE19943460A DE19943460A DE19943460A1 DE 19943460 A1 DE19943460 A1 DE 19943460A1 DE 19943460 A DE19943460 A DE 19943460A DE 19943460 A DE19943460 A DE 19943460A DE 19943460 A1 DE19943460 A1 DE 19943460A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
roseoferin
aib
val
methyl
culture broth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19943460A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Degenkolb
Brigitte Schlegel
Stephan Heinze
Hans-Martin Dahse
Ute Moellmann
Udo Graefe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Original Assignee
Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi filed Critical Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Priority to DE19943460A priority Critical patent/DE19943460A1/de
Publication of DE19943460A1 publication Critical patent/DE19943460A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist das Lipopeptid-Gemisch Roseoferin, dessen Komponenten der folgenden allgemeinen Struktur zugeordnet werden können: DOLLAR A R 1 -Pro-AHMOD-Ala-X-Y-Z-Aib-Aib-R 2 , DOLLAR A worin R 1 = 2-Methyldecansäure oder 2-Methyloctansäure, X = Aib-Val, Y = Ile, Val, Z = Ile, Val, R 2 = 2- (2'-Aminopropyl)-methylaminoFethanol oder 2-(2'-aminopropyl)-amino-ethanol und AHMOD = 2-Amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxo-decansäure bedeutet, und welches dadurch erhältlich ist, daß man den Pilzstamm Mycogone rosea DSM 12973 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie den üblichen Salzen fermentiert, bis sich Roseoferin in der Kulturbrühe anhäuft, und anschließend Roseoferin aus der Kulturbrühe isoliert. Aufgrund der starken antimikrobiellen und zytotoxischen Wirkungen ist Roseoferin als Heilmittel für bakterielle und fungale Infektionskrankheiten bei Mensch, Tier und Pflanze sowie als Kanzerostatikum geeignet.

Description

Die Erfindung betrifft eine Mischung neuer Lipopeptide mit der Bezeichnung Roseoferin, die von dem Pilz Mycogone rosea DSM 12973 im Verlauf eines Fermentationsprozesses synthetisiert wird und die sich im Myzel und in der Kulturbrühe anhäuft, ein Herstel­ lungsverfahren und die Verwendung von Roseoferin als pharmakologische Wirkstoffe, insbesondere Arznei- und Pflanzenschutzmittel.
Durch Mikroorganismen werden bekanntermassen zahlreiche Antibiotika produziert, von denen eine Anzahl als solche oder in chemisch modifizierter Form praktische Anwendung in der antibakteriellen und antifungalen Chemotherapie, als Krebstherapeutika, als phar­ makologische Wirksubstanzen und Pflanzenschutzmittel gefunden hat. Insbesondere zeichnet sich die Strukturmasse der mikrobiellen Peptidwirkstoffe durch interessante Anwendungen, wie z. B. als Antibiotika (z. B. Bacitracin, Synergimycine, Echinocandin), Antitumormittel, Immunmodulatoren (z. B. Cyclosporin A), Insektizide (z. B. Destruxin), Enzyminhibitoren und Rezeptoragonisten und -antagonisten aus (z. B. Pepstatin; Gräfe, U.: Biochemie der Antibiotika, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1992; W. Steglich et al. Römpp Chemie-Lexikon, Naturstoffe 1998). Die für verschiedene Anwendungen vorge­ sehenen und eingesetzten Wirkstoffe weisen häufig Nachteile auf, wie z. B. die zu geringe Wirksamkeit gegenüber pathogenen Zellen, Enzymen und Rezeptoren sowie unerwünsch­ te Nebenwirkungen und Bildung von Rückständen (z. B. in landwirtschaftlichen Produk­ ten) auf. Ein besonderes im Verlauf der Behandlung mit Antibiotika und Kanzerostatika auftretendes Problem ist die Entwicklung resistenter Bakterien, Pilze und Tumorzellen. Aufgrund der geschilderten Nachteile der bisher in Anwendung befindlichen Naturstoffe und Synthetika besteht weiterhin die Notwendigkeit der Suche nach neuen Strukturen mit verbesserter und potentiell verbesserter Wirksamkeit.
Aufgabe der Erfindung ist es, neue mikrobielle Wirkstoffe mit Peptidstruktur und verbes­ serten Anwendungseigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass der Pilzstamm Mycogone rosea DSM 12973 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff und Stickstoffquelle sowie den übli­ chen Salzen fermentiert wird, bis sich die Mischung bestehend aus neuen Lipopeptiden, nachfolgend Roseoferin genannt, in der Kulturbrühe anhäuft, anschliessend Roseoferin als Komplex von 16 eng verwandten homologen und chemisch ähnlichen Verbindungen aus der Kulturbrühe isoliert, in reiner Form bereitgestellt und gegebenenfalls in chemi­ sche Derivate überführt wird.
Roseoferin besitzt starke antibakterielle, antifungale und zytotoxische Wirksamkeit und kann daher als Heilmittel für bakterielle und pilzliche Infektionskrankheiten von Mensch, Nutztier und Pflanze sowie als Antitumormittel eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft somit:
  • 1. Roseoferin, enthaltend Lipopeptide, die der folgenden Struktur zugeordnet werden können:
    R1-Pro-AHMOD-Ala-X-Y-Z-Aib-Aib-R2,
    worin R1 = 2-Methyldecansäure oder 2-Methyloctansäure, X = Aib-Val, Y = Ile, Val, Z = Ile, Val, R2 = 2-[(2'-Aminopropyl)-methylamino]ethanol oder 2-(2'-amino­ propyl)-aminoethanol und AHMOD = 2-Amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxo­ decansäure bedeutet.
  • 2. Die Verwendung von Roseoferin als Antibiotika für Human- und Tiertherapie sowie als Pflanzenschutzmittel und Kanzerostatika.
  • 3. Verfahren zu dessen Herstellung unter Verwendung des Mikroorganismus Mycogone rosea DSM 12973.
  • 4. Arzneimittel enthaltend Roseoferin nebst üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.
Die Erfindung wird nachfolgend in ihren Einzelheiten beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird sie durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.
Definitionen:
  • - Die erfindungsgemässen Lipopeptide werden Roseoferine, die Mischung Roseoferin genannt.
  • - Das erfindungsgemässe Antibiotikum Roseoferin besteht aus den homologen Kompo­ nenten (in Klammern deren Molmassen) Roseoferin A1 (1149), A2 (1149) A3 (1149); Roseoferin B1 (1135), B2 (1135), B3 (1135), Roseoferin C1 (1163), C2 (1163), Rose­ oferin D1 (1121), D2 (1121), D3 (1121); Roseoferin E1 (1107), E2 (1107), E3 (1107), F (1093) und Roseoferin G (1177).
Das erfindungsgemässe, aus 16 homologen Strukturen mit Roseoferin A1 als Hauptkom­ ponente bestehende Antibiotikum wird durch Mycogone rosea DSM 12973 produziert. Mycogone rosea LINK ex. LINK (J. A. von Arx, The genera of fungi sporulating in pure culture, Ganthner Verlag KG, Vaduz, 1981) ist als Mykoparasit auf Basidiomyceten- Fruchtkörpern im europäischen Raum weit verbreitet. Der Stamm Mycogone rosea DSM 12973 ist durch folgende morphologische Merkmale charakterisiert:
  • - Myzel reich septiert, an den Septen mitunter schwach angeschwollen, Hyphen 5-7 µm im Durchmesser, hyalin.
  • - Aleuriokonidien (Chlamydosporen) 24-29 µm im Durchmesser, rund, Wände bis 5 µm dick, Oberfläche warzig, Warzen bis zu 1 µm lang.
Reinkulturen lassen sich von befallenen Fruchtkörpern direkt isolieren, ggf. durch Ab­ schwemmen, evtl. zum Beispiel Anlagen von Verdünnungsreihen, Ausplatten und Bebrü­ ten auf ausgewählten Nährmedien.
Aufgrund von aufeinanderfolgenden Isolierungsschritten wurde von Mycogone rosea eine Pilzkolonie isoliert, die das aus 16 Homologen bestehende Peptidantibiotikum Roseoferin besonders effizient in der Kulturbrühe anhäuft. Ein Isolat von Mycogone rosea DSM 12973 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, Deutschland, am 10. 8. 1999 gemäss den Bedingungen des Budapester Vertrages hinter­ legt.
Der Stamm bildet Luftmyzel und Chlamydosporen auf Malz-Agar. Die Koloniefarbe ist rot bis braunrot. Das Myzel ist reich septiert, an den Septen mitunter schwach ange­ schwollen. Der Hyphendurchmesser beträgt 5-7 µm. Die Basalzellen sind 7-12 µm lang und 10-12 µm breit; die Terminalzellen 16-20 µm lang und 10-13 µm breit; reife Makrokonidien weisen 24-29 µm Gesamtlänge auf. Die Hyphenwände sind bis 5 µm dick, die Oberfläche ist mit bis zu 1 µm langen Warzen versehen. Die Bildung einzelliger Phialokonidien an verticillat verzweigten Konidienträgern wurde nicht beobachtet. (Arx, J. A. von 1981. The Genera of Fungi, Sporulating in Pure Culture, S. 337-339, A. L. Ganthner-Verlag, FL-9490 Vaduz/Liechtenstein).
In einem Medium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und den üblichen Mineralsalzen produziert Mycogone rosea, bevorzugt Mycogone rosea DSM 12973, das erfindungsgemässe Roseoferin. Anstelle des Stammes Mycogone rosea DSM 12973 kön­ nen auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden. Als Mutanten und Varianten gelten alle jene Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemä­ ssen Verbindungen zu synthetisieren.
Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, bei­ spielsweise Bestrahlung mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutage­ ne erzeugt werden. Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemä­ sse Verbindung synthetisieren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der in der Kulturbrühe angehäuften Wirkstoffe, beispielsweise durch Austesten der antibioti­ schen Wirkung auf bekannte Testkeime anhand der dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie z. B. Maltose, Cellobiose, Glucose, Lactose, Glycerol, Mannitol oder deren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt.
Als Stickstoffquellen eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Ab­ bauprodukte, wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, bei­ spielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillations­ produkte der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoni­ umsalze und Nitrate.
Die Bildung der Roseoferine erfolgt gut in Nährmedien, die 0,2-6% Malzextrakt, be­ vorzugt 2-4% Malzextrakt und 0,01-1% Hefeextrakt, bevorzugt 0,1-0,4% Hefeex­ trakt enthalten. Alternativ können auch Nährmedien mit anorganischer Stickstoffquelle gewählt werden, die 0,5-6% Maltose oder Glucose, bevorzugt 2-4%, und 0,1-0,6% (NH4)2SO4, bevorzugt 0,2-0,4% (NH4)2SO4, und Spurenelemente (Mg, Zn) enthalten.
Die Kultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder unter Verwendung von Standkulturen in Glasflaschen. Die Fermen­ tation kann beispielsweise in Steilbrustflaschen, Erlenmeyer- oder Rundkolben verschie­ dener Volumina durchgeführt werden. Sie wird in einem Temperaturbereich zwischen 10-37°C, besonders bevorzugt 20-25°C, durchgeführt. Der pH-Wert liegt zwischen 4 und 7, bevorzugt zwischen 5,5 und 6,5. Der Mikroorganismus wird unter diesen Bedingungen 5-21 Tage, bevorzugt 7-18 Tage, kultiviert.
Die Fermentation kann im Labormaßstab (Kulturvolumina zwischen 100 ml und 250 ml), aber auch im Produktionsmaßstab (Volumina bis mehrere m3), durchgeführt werden.
Vorteilhafterweise kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. zunächst werden eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium hergestellt, die dann in das eigent­ liche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1 : 15 - 1 : 20, überimpft werden.
Die Vorkultur erhält man, indem man ein versportes Myzel von z. B. Malzagar- Nährböden in eine Nährlösung überführt, beispielsweise durch Einimpfen von Myzel­ bewachsenen Agarstücken, und diese 11-21 Tage, vorzugsweise 15-18 Tage, inkubiert. Das versporte Myzel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 11-21 Tage, bevorzugt 15-18 Tage, auf einem Nährboden, wie z. B. Malz-Agar, Kartof­ fel-Glucose-Agar oder Sojamehl-Glucose-Agar, wachsen lässt.
Das Peptidantibiotikum Roseoferin ist in Form des Gemisches der Homologen Roseofe­ rin A1, A2, A3; Roseoferin B1, B2, B3; Roseoferin C1, C2; Roseoferin D1, D2, D3; Rose­ oferin E1, E2, E3; Roseoferin F und Roseoferin G in der Kulturbrühe, vorzugsweise im Myzel, enthalten. Roseoferin A1 wird als Hauptprodukt gebildet.
Zum Testen der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolie­ rungsstufen ist die Fähigkeit der Roseoferine zur Ionenpaarbildung mit wasserlöslichen Anionen (z. B. Helianthat) gut geeignet (Stengel, C. et al., J. Basic Microbiol. 32, 339-­ 345, 1992); ferner können die üblichen dem Fachmann vertrauten Methoden der biologi­ schen Aktivitätsbestimmung, z. B. der Agarplatten-Diffusionstest unter Verwendung von Sporobolomyces salmonicolor und Candida spec. oder die Dünnschichtchromatographie, beispielsweise an Kieselgel RP18 mit Methanol/Tetrahydrofuran-Mischungen in gesättig­ ter Ammoniak-Atmosphäre als Laufmittel, verwendet werden.
Die Detektion nach dünnschichtchromatographischer Aufreinigung (rf 0,6 des Roseofe­ rin-Komplexes bei Verwendung eines Laufmittelgemisches Methanol/Tetrahydrofuran 99 : 1 in gesättigter Ammoniak-Atmosphäre) kann durch Iod-Dampf oder durch Färbe­ agentien, z. B. Vanillin/H2SO4 (konz.), erfolgen.
Die Isolierung der Roseoferine aus der Kulturbrühe erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte.
Zur Isolierung von Roseoferin werden am Ende der emersen Fermentation im Labor­ maßstab wasserunlösliche organische Lösemittel, wie z. B. Ethylacetat, zur Kulturlösung zugesetzt und somit die Kulturbrühe vollständig extrahiert. Zur Isolierung von Roseoferin aus submersen Kulturansätzen werden am Ende der Fermentation Kulturmedium und Myzel getrennt und das Myzel mit organischen Lösemitteln, wie Methanol oder Ethylace­ tat, vorzugsweise Ethylacetat, extrahiert. Weitere Mengen an Roseoferin werden durch Extraktion der vom Myzel abgetrennten Kulturlösung mit wasserunlöslichen organischen Lösemitteln, wie z. B. Ethylacetat, gewonnen.
Nach Einengen der Extrakte und gegebenenfalls Reextraktion des Methanolextraktes des Myzels mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Essigsäureethyle­ ster, Dichlormethan oder Chloroform erfolgt die Isolierung des Peptidantibiotikums Ro­ seoferin unter Einsatz üblicher chromatographischer Adsorbentien bzw. Trägermateriali­ en, wie z. B. Kieselgel oder organophile Dextrangele.
Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatographie an Kieselgel, der Gelper­ meations-Chromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, der Mitteldruckchromatographie an Kie­ selgel RP18 unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Triethylamin-Gemischen sowie der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Anwendung von Metha­ nol/Tetrahydrofuran-Gemischen, ferner Ausfällung aus Chloroform oder Dichlormethan mittels n-Hexan bzw. Petrolether werden schliesslich die reinen Roseoferine erhalten.
Es wird schliesslich reines Roseoferin als Homologengemisch der allgemeinen Formel 1 und der in Tabelle 1 aufgeführten strukturellen Zusammensetzung mit Roseoferin A1 als Hauptkomponente erhalten.
Die chemische Identität der Homologen des Lipopeptidantibiotikums Roseoferin entspre­ chend der in Formel 1 aufgeführten allgemeinen und in Tabelle 1 spezifizierten Struktu­ ren wird durch die Ergebnisse der hochauflösenden Elektrospray-Ionisations-Sektorfeld­ analysator-Massenspektrometrie, Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (ESI-CID- MS/MS) und Elektrospray-Ionisations-Ionenfallenanalysator-Massenspektrometrie (MSn) bewiesen.
Die antibakteriellen und antifungalen Wirkungen der Roseoferine können durch die dem Fachmann bekannten Methoden, wie beispielsweise die Bestimmung der minimalen Hemmzonenkonzentration (MHK) im Agarplattendiffusionstest aufgezeigt werden.
Die Fähigkeit zur Ionenpaarbildung mit Anionen (z. B. Helianthat) wird durch Anwen­ dung bereits bekannter Testverfahren (Stengel, C. et al., J. Basic Microbiol. 32, 339-345, 1992) nachgewiesen.
Roseoferin ist gegen Bakterien, vorzugsweise gegen grampositive Organismen, wie z. B. Micrococcus luteus ATCC 10240, Mycobacterium smegmatis SG 987, Mycobacterium aurum SB 66, Mycobacterium vaccae IMET 10670 und andere, wirksam. Die antibakte­ riellen, minimalen Hemmkonzentrationen liegen in einem Bereich < 3.1 µg/ml. Starke Wirksamkeit besteht ferner gegen Pilze, wie z. B. Penicillium notatum JP 36, Sporobo­ lomyces salmonicolor SBUG 549 und andere (Tab. 2). Eine fungizide Wirkung kann ebenfalls durch in vitro Test, in denen die Hemmung des Wachstums verschiedener Pilze und Hefen bestimmt wird, gezeigt werden. Beispielsweise inhibieren die Roseoferine in einer minimalen Konzentration von 1,56 µg/ml das Wachstum von Candida albicans- Stämmen.
Das erfindungsgemässe Lipopeptid Roseoferin eignet sich aufgrund seiner wertvollen an­ tibakteriellen und antifungalen Eigenschaften sehr gut zur Anwendung als antimikrobiell wirksames Therapeutikum.
Das erfindungsgemässe Roseoferin kann als solches in Substanz oder in Verbindung mit geeigneten Hilfsmitteln oder Trägermaterial verabreicht werden.
Die erfindungsgemässen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral appli­ ziert, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees.
Die Erfindung wird durch nachfolgende Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Ausführungsbeispiele Beispiel 1
  • 1. Zur Gewinnung eines versporten Mycels wird Mycogone rosea DSM 12973 15 Tage bei 25°C auf Nährböden folgender Zusammensetzung (g/) kultiviert:
    Malzextrakt 40, Hefeextrakt 4, Agar 15, destilliertes Wasser pH 6,0 (Sterilisation 25 min. bei 110°C).
  • 2. Herstellung von emersen Standkulturen:
    1-2 cm2 Areale von Oberflächenkulturen von Mycogone rosea DSM 12973, die auf Ag­ armedien entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden, dienen zur Beimpfung von 1-l- Erlenmeyerkolben mit 250 ml Malznährmedium folgender Zusammensetzung (g/l): Malz­ extrakt 20; Glucose 10; Hefeextrakt 2; (NH4)2HP04 0,5; Agar 4. Die Kultivierung er­ folgt 18-21 Tage bei 25°C als Oberflächenkultur.
Beispiel 2
  • 1. Das Impfmaterial wird wie unter 1a) beschrieben hergestellt.
  • 2. Herstellung von Submerskulturen:
    1-2 cm2 Areale von Oberflächenkulturen von Mycogone rosea DSM 12973, die auf Ag­ armedien entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden, dienen zur Beimpfung von 1-l- Erlenmeyerkolben mit Schikanen und 250 ml Nährmedium Wb6-1/14 folgender Zusam­ mensetzung (g/l): Maltose30; Glucose 10; (NH4)2SO4 3,5; K2HPO4 2; MgSO4 × 7H2O 0,5; CaCO3 5,1; ZnSO4 × 7H2O 0,008; Agar 4.
    Die Kultivierung erfolgt bei 25°C und 110 U/min für 7-12 Tage.
Beispiel 3 Gewinnung von Roseoferin aus der Kulturbrühe
Das nach 18 Tagen bei 25°C in Standkultur auf Malz-Medium (120 l) bzw. nach 7 Tagen bei 25°C in Submerskultur auf Wb 6-1/14 (Frequenz des Schüttlers 110 U/min) gebilde­ te Myzel wird durch Filtration von dem Nährmedium abgetrennt und mit einer der Hälfte des Ausgangsvolumens des Ansatzes entsprechenden Menge Ethylacetat unter Rühren bei Raumtemperatur für 16 Stunden extrahiert. Eine Steigerung der Ausbeute wird durch er­ neute Extraktion des Myzels mit Ethylacetat erreicht. Durch Extraktion der Kulturbrühe mit dem Aliquot an Ethylacetat kann eine weitere Erhöhung der Ausbeute erzielt werden. Nach Abtrennung des Myzels wird der Ethylacetat-Extrakt am Vakuumrotationsverdamp­ fer bis zur Trockene eingeengt, der Rückstand wird in Methanol aufgenommen und die Verunreinigungen aus der methanolischen Lösung bei einer Temperatur von -15°C für 48 Stunden ausgefällt. Nach Abtrennung des Überstandes wird das Filtrat am Vakuumro­ tationsverdampfer zur Trockenheit eingeengt. Eine weitere Aufreinigung wird durch er­ neutes Lösen des Rückstandes und Wiederholung der Fällung erreicht. Nach Konzentrati­ on des Methanolextraktes im Vakuum wird der trockene Rückstand zunächst mit n-Hexan bzw. Petrolether gewaschen und nach Abtrennung des Lösemittels mit destilliertem Was­ ser. Nach vollständiger Entfernung des destillierten Wassers im Vakuum wird der trockene Rückstand in Dichlormethan bzw. Chloroform gelöst und das Roseoferin mit dem 20fachen Überschuß an n-Hexan bzw. Petrolether, vorzugsweise n-Hexan, bei einer Tem­ peratur von 4°C ausgefällt. Der Rückstand der Fällung wird nach Abtrennung des Über­ standes in Methanol aufgenommen. Ausbeute: 860 mg
Beispiel 4 Chromatographische Aufreinigung des Roseoferinkomplexes
Roseoferin wird als Gemisch von 16 Homologen, bestehend in der Hauptsache aus Rose­ oferin A1 sowie wechselnden Anteilen der anderen in Tabelle 1 aufgeführten Roseoferi­ ne, aus dem eingeengten Ethylacetatextrakt von 120 l Fermentationsbrühe durch die nachfolgenden chromatographischen Aufarbeitungsschritte erhalten:
Zunächst wird der Rückstand der Fällung in Methanol gelöst und auf eine Chromatogra­ phiesäule, gefüllt mit Dextrangelen, wie z. B. Sephadex LH-20, in Methanol, gegeben. Mit dem gleichen Lösungsmittel werden zunächst ölige Begleitkomponenten eluiert, da­ nach eluiert man die Hauptmenge an Roseoferin sowie nachfolgend niedermolekulare Verunreinigungen. Ausbeute: 425 mg. In einer zweiten säulenchromatographischen Rei­ nigungsstufe erfolgt die Chromatographie an Kieselgel G 60 unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Triethylamin (70 : 27 : 3 bzw. 60 : 37 : 3) als Eluent. Ausbeute: 60 mg. Nach Konzentration des Eluentengemischs am Vakuumrotationsverdampfer wird der Rückstand mit Wasser versetzt und bis zur vollständigen Entfernung des Triethylamins gefriergetrocknet. Der lyophilisierte Rückstand wird in Chloroform oder Dichlormethan aufgenommen und der Roseoferin-Komplex durch präparative Dünnschichtchromatogra­ phie unter Verwendung geeigneter Laufmittel-Systeme, beispielweise eines Gemisches aus Methanol/Tetrahydrofuran = 99 : 1 in gesättigter Ammoniak-Atmosphäre (rf-Wert 0,6), aufgereinigt. Beispielsweise beträgt die Ausbeute der Aufarbeitung eines 120-1- Fermentationsansatzes für Roseoferin ca. 40 mg.
Physikalisch-chemische und mikrobiologische Eigenschaften des Roseoferinkomplexes (siehe auch Tabelle 1):
Aussehen: farblose semikristalline Substanz
Massenspektrum ([M+H]+): m/z 1094; m/z 1108; m/z 1122; m/z 1136; m/z 1150; m/z 1164; m/z 1178
Tabelle 1
Sequenz der Fett- und Aminosäuren in den Einzelkomponenten des Roseofe­ rinkomplexes
Beispiel 5 Antimikrobielle Aktivität des Roseoferins (siehe Tabelle 2) Tabelle 2 Antimikrobielle Aktivität des Roseoferins
Testorganismus
MHK-Werte (µg/µl)
Micrococcus luteus ATCC 10240 3,11
Enterococcus faecalis 1528 12,51
Mycobacterium smegmatis SG 987 6,21
Mycobacterium aurum SB 66 6,21
Mycobacterium vaccae IMET 10670 3,11
Mycobacterium fortuitum B 25,01
Mycobacterium cheloni B 50,01
Candida albicans BMSY 212 1,52
Sporobolomyces salmonicolor SBUG 549 0,43
Penicillium notatuum JP 36 0,43
1) Anonymous: European Pharmacopoia 3rd Ed., Deutscher Apothekerverlag Stuttgart, pp. 113~118, 1997@ 2) National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Approved Standard M7-A. NCCLS, Villanova, Pa., 1991@ 3) National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of yeasts. M27-P. NCCLS. Volume 12, 25 NCCLS, Villanova, Pa., 1991@@
6. Zytotoxische und antiproliferative Wirksamkeit von Roseoferin
Die zytotoxische und antiproliferative Wirksamkeit des Roseoferins wurde nach WINKELMEIER, GLANNER und LINDL (Quantification of cytotoxicity by cell volu­ me and cell proliferation. ATLA 21: 269~280, 1993) ermittelt.
L-929 Maus-Fibroblastenzellinie: IC50 : 0.4 µg/ml,
K 562 humane Leukämie: IC50: 0.08 µg/ml,
HeLa humanes Zervikal-Karzinom: IC50: 3.3 µg/ml.
Sequenz der Fett- und Aminosäuren in den Einzelkomponenten des Roseoferinkomplexes

Claims (3)

1. Lipopeptid-Gemisch Roseoferin, dessen Komponenten der folgenden allgemeinen Struktur zugeordnet werden können:
R1-Pro-AHMOD-Ala-X-Y-Z-Aib-Aib-R2,
worin R1 = 2-Methyldecansäure oder 2-Methyloctansäure, X = Aib-Val, Y = Ile, Val, Z = Ile, Val, R2 = 2-[(2'-Aminopropyl)-methylamino]ethanol oder 2-(2'-aminopropyl)- amino-ethanol und AHMOD = 2-Amino-4-methyl-6-hydroxy-8-oxo-decansäure bedeutet, und welches dadurch erhältlich ist, daß man den Pilzstamm Mycogone rosea DSM 12973 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff und Stickstoffquelle sowie den üblichen Salzen fermentiert, bis sich Roseoferin in der Kulturbrühe anhäuft, und anschliessend Roseoferin aus der Kulturbrühe isoliert.
2. Verwendung von Roseoferin gemäß Anspruch 1 zur die Behandlung von Infektionskrankheiten.
3. Arzneimittel enthaltend Roseoferin gemäß Anspruch 1 nebst üblichen pharmazeu­ tischen Hilfs- und Trägerstoffen.
DE19943460A 1999-09-11 1999-09-11 Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel Withdrawn DE19943460A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19943460A DE19943460A1 (de) 1999-09-11 1999-09-11 Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19943460A DE19943460A1 (de) 1999-09-11 1999-09-11 Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19943460A1 true DE19943460A1 (de) 2001-03-15

Family

ID=7921590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19943460A Withdrawn DE19943460A1 (de) 1999-09-11 1999-09-11 Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE19943460A1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499277A (zh) * 2019-08-30 2019-11-26 福建省农业科学院植物保护研究所 一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法
CN111500760A (zh) * 2020-05-09 2020-08-07 福建省农业科学院植物保护研究所 一种快速鉴定红丝疣孢霉的分子检测引物及应用
CN111549166B (zh) * 2020-05-09 2022-05-20 福建省农业科学院植物保护研究所 一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499277A (zh) * 2019-08-30 2019-11-26 福建省农业科学院植物保护研究所 一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法
CN110499277B (zh) * 2019-08-30 2021-04-20 福建省农业科学院植物保护研究所 一种红丝疣孢霉厚垣孢子萌发培养基及萌发方法
CN111500760A (zh) * 2020-05-09 2020-08-07 福建省农业科学院植物保护研究所 一种快速鉴定红丝疣孢霉的分子检测引物及应用
CN111500760B (zh) * 2020-05-09 2022-05-20 福建省农业科学院植物保护研究所 一种快速鉴定红丝疣孢霉的分子检测引物及应用
CN111549166B (zh) * 2020-05-09 2022-05-20 福建省农业科学院植物保护研究所 一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68910213T2 (de) Antibiotikum R106.
EP0864584B1 (de) Lipopeptide aus Actinoplanes sp. mit pharmakologischer Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung derselben
DE2463138C2 (de) Das Antibiotikum Cyclosporin B (S 7481/F-2), seine Herstellung und Verwendung
DE69011006T2 (de) Antibiotische Mittel.
EP0916680B1 (de) Lantibiotikum verwandt mit Actagardine, Verfahren zur Herstellung und Verwendung desselben
DE19943460A1 (de) Neue Lipopeptide und deren Verwendung als Arzneimittel
DE69104022T2 (de) Antibiotisches zyklisches Hexapeptid.
EP0829487B1 (de) Neue Polyenantibiotika 3874 H1 bis H6, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
DD252116A5 (de) Verfahren zur bekaempfung von pflanzennematoden
DE69913369T2 (de) Mikrobielle transformationsprodukte
DE19740030A1 (de) Ampullosporin, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
DE69718141T2 (de) Fungizid
EP0848064B1 (de) Neues Antibiotikum, Feglymycin, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung
DE19948644A1 (de) Neue Peptaibole mit neuroleptischer Wirkung
EP0472186B1 (de) Antibiotika AB-023 und deren Herstellung
DE69206858T2 (de) Verbindung UCA1064-B
EP0272668B1 (de) Amycin und dessen Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
DE69107083T2 (de) Antibiotikum ge1655-komplex und seine faktoren a,b und c.
DE4305249A1 (de) Galaktosylbrefeldin A, ein neuer Metabolit mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
EP0026485B1 (de) Herbicolin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende Mittel
DE10238697A1 (de) Neue Peptaibole mit neuroleptischer Wirkung
DE4415345A1 (de) Helioferine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
EP1740566B1 (de) Hki10311129, neues antibiotikum, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung
DE10065606A1 (de) Altamiramycin, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
CH589716A5 (en) Antibiotics S 7481-F-1 and 2 - prepd. from new strains of Cylindrocarbon or Trichoderma esp. useful as immunosuppressant

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee