DE2463138C2

DE2463138C2 - Das Antibiotikum Cyclosporin B (S 7481/F-2), seine Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE2463138C2
Application number: DE2463138A
Authority: DE
Inventors: Eugen Dr. 4106 Therwil Härri; Artur Dr. 4103 Bottmingen Rüegger
Original assignee: Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1973-12-06
Filing date: 1974-11-26
Publication date: 1984-07-05
Also published as: IL46180A0; IE40549B1; JPS5615235B2; NL179220C; SE423720B; PH13773A; HK53880A; CA1030469A; NO744292L; FR2253531B1; FI52851B; JPS5089598A; AU500889B2; AU7608174A; FI54606B; DK617074A; FR2253531A1; DE2455859C2; ES432559A1; GB1491509A

Description

a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform + 4% Methanol als Fließmittcl: Rf = 0,46.

b) Kieselgel auf Folien »Polygram«; Hexan/ Aceton (1 :1) als Fließmittel: Rf = 0.28; Chloroform/Aceton (2:1) als Fließmittcl: Rf = 0,26.

Elementaranalyse:
Gefundene 61,7 H 9,1
Bruttoformcl CbiHuwN

N 13,1 O 16,5%

2. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Cyclosporin B(S 7481/F-2) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm NRRL 5760 der Pilzspecies Cyclindrocarpon lucidum Booth bzw. den Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Garns auf oder in einem üblichen Nährmedium mit einer assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze und Spurenelemente züchtet, hierauf das erhaltene Mycel des Pilzstammes NRRL 5760 (falls erforderlich, unter mechanischer Zerkleinerung) mit 90% Methanol extrahiert, anschließend abdampft, das resultierende wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, wobei diesem Extrakt ein weilerer Extrakt gewonnen durch Extraktion des Kulturfiltrates mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel beifügt, hierauf die organische Lösung zur Trockene eindampft, den so erhaltenen Rückstand entweder durch Chromatographie an Kieselgcl mit Chloroform mit wenig Methanol, oder durch Verteilung zwischen Petroläther und Methanol, dem eine zur Phasentrennung genügende Menge Wasser beigemischt ist, entfettet, im ersten Fall die gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksamen Fraktionen vereinigt und zur Trockene eindampft, im zweiten Fall das Methanol abdestilliert und das wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, hierauf zur Trockene eindampft, den in beiden Fällen erhaltene Rückstand in methanolischer Lösung an Sephadex LH 20 Chromatographien, die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt, hierauf entweder an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/F-1). dann Cyclosporin B (S7481/F-2) eluiert wird, oder an Ahiminiumoxyd mit Toluol und F.ssigester Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/!-'-1), dann ein Gemisch von Cyclosphorin Λ (S 7481/1·"-1) und Cyclosporin B (S748I/F-2) eluiert wird, wobei letzteres durch Chromatographie an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol /ugesei/.t sind, aufgetrennt wird, oder die bei der Züchtung des Pilzstammes NRRL 8044 erhaltene Kulturbrühe durch Homogenisieren (unter mechanischer Zerkleinerung des Mycels) aufschließt, mit 1,2-Dichloräthan extrahiert, hierauf zur Trockene eindampft, den erhaltenen Rückstand an methanolischer Lösung an Sephadex LH 20 Chromatographien, die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt, hierauf an Aluminiumoxyd mit Toluol und Essigester Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S7481/F-1), dann Cyclosporin B(S 7481/F-2) eluiert wird.

3. Arzneimittel mit einem Gehalt an Antibiotikum Cyclosporin B (S 7481/F-2) gemäß Anspruch 1 und 2.

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Antibiotikum Cyclosporin B (S 7481/F-2), Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung in Arzneimitteln gemäß den Patentansprüchen 1,2 und 3. Erfindungsgemäß

_>o gelangt man zu dem neuen Antibiotikum S7481/F-2, indem man den Stamm NRRL 5760 der Pilzspecies CyI-indrocarpon lucidum Booth bzw. den Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Garns auf oder in einem üblichen Nährmedium mit einer assimi-

>5 lierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze und Spurenelemente züchtet, hierauf das erhaltene Mycel des Pizstammes NRRL 5760 (falls erforderlich, unter mechanischer Zerkleinerung) mit 90% Methanol extrahiert, anschließend abdampft, das resultie-

jo rendc wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, wobei diesem Extrakt ein weiterer Extrakt gewonnen durch F.xtraktion des Kulturfiltrates mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel bei-

J5 fügt, hierauf die organische Lösung zur Trockene eindampft, den so erhaltenen Rückstand entweder durch Chromatographie an Kieselgel mit Chloroform mil wenig Methanol, oder durch Verteilung zwischen Petroläther und Methanol, dem eine zur Phasentrennung genügcnde Menge Wasser beigemischt ist, entfettet, im ersten Fall die gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksamen Fraktionen vereinigt und zur Trockene eindampft, im /weiten Fall das Methanol abdestilliert und das wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasscr nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, hierauf zur Trockene eindampfi, den in beiden Fällen erhaltene Rückstand in methanolischer Lösung an Sephadex LH 20 Chromatographien, die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt, hierauf entweder an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S7481/F-I), dann Cyclosporin B (S7481/F-2) eluiert wird, oder an Aluminiurnoxyd mit Toluol und Essigester Chromatographien, worauf zuerst Cydosporin A (S 7481 /F-I), dann ein Gemisch von Cyclosporin A (S748I/F-1) und Cyclosporin B (S7481/F-2) eluiert wird, wobei letzteres durch Chromatographie an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind, aufgetrennt wird, oder die bei der Züchtung des Pilz-Mi Stammes NRRL. 8044 erhaltene Kulturbrühe durch Homogenisieren (unter mechanischer Zerkleinerung des Mycels) aufschließt, mil 1,2-Dichloräthan extrahiert, hierauf /ur Trockene eindampft, den erhaltenen Rückstand in methanolischcr Lösung an Sephadex LH 20

h> Chromatographien, die gegen Aspcrgillus niger aktiven Fraktionen vereinigt, hierauf an Aluininiumoxyd mit Toluol und Kssigester Chromatographien, worauf /uerM Cyelosporin A (S 7481/1·'-!), dann Cyclosporin U

S7481/F-2)eluiertwird.

Der neue erfindungsgemäß verwendete Stamm der Pilzspccies Cylindrocarpon lucidum Booth wurde aus siner im Staate Wisconsin, USA gefundenen lirdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 11U USA unter der Nummer NRRL 5760 deponiert.

Der neue Stamm NRRL 5760 von Cylindrocarpon lucidum Booth stimmt in den wesentlichen Merkmalen überein mit der Originalbeschreibung (C. Booth 1966; The Genus Cylindrocaropon; Mycological Papers No. 104, 21). Auf Kartoffel-Dextrose-Agar bildet der Stamm NRRL 5760 weder Chlamydosporen noch Mikrokonidien. Clilamydosporenartige Zellen der Makrokonidien fehlen jedoch ebenfalls. Die bananenförmigcn. meist mit drei Querwänden unterteilten Makrokonidien sind 28—45x4.8—5,7 μ groß und sind somit bedeutend kleiner als in der zitierten Beschreibung angegeben (45—65x6—6,5 μ). Ein weiterer wichtiger Unterschied besteht in der Wechstumsgeschwindigkeit,· während der Typus in 7 Tagen 1 — 1,5 cm große Kolonien bilden sollte, wächst der Stamm NRRL 5760 in derselben Zeit zu 7—8 cm großen Kolonien heran, wobei auf Kartoffcl-Dextrcse-Agar fast ausschließlich farbloses bis braunes Substratmycel gebildet wird. Die Konidiophoren mit den Phialiden entstehen bereits nach wenigen Tagen in dichten Gruppen und Bündeln, verzweigen sich pcnicilliumbis verticilliumartig und bilden über längere Zeit Makrokonidien aus, die sich als schleimige, beige Masse ansammeln.

Der neue erfindungsgemäß verwendete Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Garns wurde aus einer in Norwegen gefundenen Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria. 111., USA unter der Nummer NRRL 8044 deponiert.

Aufgrund der Publikation Garns in Persoonia. Vol. b. P.2, pp 183 —191 (1971) sowie der Bestimmung des Stammes in einer nachstehenden morphologischen Beschreibung ist ersichtlich, daß der Stamm NRRL 8044 als Tolypocladium inflatum Game und nicht wie ursprünglich angenommen als Trichoderma polysporum zu klassieren ist.

Der neue Stamm NRRL 8044 von Tolypocladium inflatum Garns wächst auf 2% Malzextrakiagar zwischen 6 und 33°C, das Wachstumsoptimum liegt um 24"C, wo in 12 Tagen 40 bis 45 mm im Durchmesser messende, reinweiße, oberflächlich samtartige und ungcfältctc Kolonien gebildet werden. Bei der höchsten, noch gutes Wachstum erlaubenden Temperatur (33°C) wird hingegen überhaupt kein Luftmycel, dafür eine sehr stark gefaltete Kolonie gebildet. Mit zunehmender Kulturtemperatur bildet sich an der Kolonieunterscite vermehrt ein gelbes Pigment, welches bei 27°C und noch ausgeprägter bei 30 bis 33° C in den Agar diffundiert.

Zur Bildung der Konidiophoren, welche sowohl zerstreut, als auch in dichteren Gruppen, vor allem aber am Kulturgefäßrand stehen, benötigt der neue Stamm von Tolypocladium infaltum Garns bei 24^UC auf Mal/.cxlraktagar 15 bis 20 Tage. Der Hauptast der Konidienträger erreicht einen Durchmesser von 2,0 — 3,8 μ. Die Phialiden des neuen Stammes von Tolypocladium inflatum Garns sind, insbesondere am Ende ihrer Entwicklung, lang ausgezogen. Die Konidien haben folgenden Durchmesser von: 2,0—3,1 χ 1.5 — 2,0 μ. Der vorliegende ToIynocladium inflatum Garns Stamm NRRL 8044 bildet unter allen genannten Kultlirbedingungen keine echten Chlamydosporen.

Die neuen Pilzstämme NRRL 57fcO und NRRL 8044 lassen sich auf vielartigen Nährböden, die die üblichen

■-, Nährstoffe für Pilze enthalten, züchten. So verwenden diese Stämme die für die kohletistoffheterotrophen Organismen üblicherweise verwendeten Nährstoffe, z. B. Saccharose. Glucose, Maltose, Laktose. Stärke, Malzextrakt als Kohlenstoffquelle, organische und anorgani-

K) sehe stickstoffhaltige Verbindungen, wie Maisqueilwasser, Sojapepion. Hefe- oder Fleischextrakte. Natriumnilrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw., als Stickstoffquelle sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.

r> Das neue Antibiotikum S 7481/F-2 kann man in der Weise herstellen.daß

1. ein flüssiges Medium mit einer Konidien- und Myccisuspension des Stammes NRRL 5760 beimpft und die Kultur 9—13 Tage, vorzugsweise 11 Tage, bei 24—30^uC, vorzugsweise 27° C, und bei einem pH-Wert von 4,8—8,8, vorzugsweise bei 8,1. inkubien wird. Diese Züchtung erfolgt in Penicillinflaschen unter aeroben Bedingungen in einer Oberflä-

2^r> chenkultur,

2. daß ein Flüssiges Medium mit einer Konidien- und Mycolsuspension des Stammes NRRL 8044 beimpft und die Kultur 11 — 18 Tage, vorzugsweise 13 Tage, bei 25—30"C, vorzugsweise bei 27^CC, und bei einem pH-Wert von 4,3—6,2, vorzugsweise von 5,6 in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) inkubiert wird.
Sobald eine maximale Menge an Antibiotika produzierl ist, werden diese aus der Kulturbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Methoden auf an sich bekannte Weise gewonnen.

Das neue Antibiotikum S7481/F-2 zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologischc Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt das Antibiotikum das Wachstum von Aspergillus niger. Insbesondere zeichnet sich die Substanz S7481/F-2 durch entzün-

4¹) dungshemmende Eigenschaften aus.

S7481/F-2 ist eine Verbindung mit deutlicher Wirkung in der Adjuvans Arthritis und nur geringer immuno-supprcssivcr Aktivität. Dies scheint adäquat zu sein für ein potentielles Therapcutikum für die Behandlung

■jo der rhcumaioiden Arthritis. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, tritt zwar eine Hemmung der Adjuvans Arthritis erst in höheren Dosen als beim Vergleichspräparat Phenylbutazon ein, jedoch weist S748I/F-2 im Gegensatz zu Phenylbutazon praktisch

Ti keine Ulccrogcnität auf.

Substanz.

ΛΛ
I.

mg/kg p.o.

S7481/F-2 20

Phenylbutazon 10

AA Adjuvans Arthritis
U Ulccrogcnität
L Lalcns
T Therapie

	U
T	UD_5n
EDi,,	mg/kg
mg/kg p.o.	p.o.
28	300
15	40

Über die verwendeten Untersuchungsmethoden sind die folgenden Angaben zu machen:

1) Freund Adjuvans Arthritis(AA)

Durch intracutane Applikation von 6 mg Mycobakierien, die in Mineralöl suspendiert sind (= Freund Adjuvans complet), wird an der Ratte eine generalisierte, auf Überempfindlichkeit beruhende Arthritis ausgelöst. Man unterscheidet eine primäre Schwellung an der injizierten Pfote und sekundäre Schwellungen, die 12 bis 15 Tage nach der Verabreichung an den übrigen Gelenken auftreten. Auch an den Ohren und am Schwanz kommt es zu Knotenbildung.

Der Versuchsablauf gestaltet sich wie folgt: Die Verabreichung des Freund Adjuvans complet erfolgt intracutan in die Sohle einer Hinterpfote. Pro Dosis werden 10 Tiere eingesetzt. Die Tesisubstanzen verabreicht man während der Latenzzeit p. o., total 14mal. Die therapeutische Behandlung erfolgt nach voller Ausbildung der primären und sekundären Symptome, ca. 14 —21. Tag, mindestens 7mal. Der Pfotendurchmesser wird am Anfang und Schluß der Behandlung bestimmt. In der Mitte der Pfote wird deren Hohe und Breite bestimmt und der Durchschnitt errechnet.

Ein Latenzzeitversuch dauert rund 19 Tage, ein therapeutischer Versuch bis gegen 30 Tage. Von allen 10 Tieren der Dosierungsgruppe wird die mittlere Pfotcnschwellung am Versuchsende errechnet, hiervon der entsprechende Wert vom Versuchsanfang abgezogen und in % der unbehandelten Kontrolle ausgedrückt. Vorderpfoten, Ohren und Schwanz werden subjcctiv bewertet (score 0—3) und ebenfalls mit der unbehandeiten Kontrolle verglichen.

2) Ulcerogenität(U)

Die Ratten werden einzeln während 24 Stunden auf Hunger gesetzt. Zu Versuchsbeginn sollten die Mägen mögliehst leer sein. Die Tiere werden gewogen und die Substanzen in 10 ml/kg p. o. verabreicht, pro Dosis 5 Tiere. 6 Stunden nach Substanzgabe tötet man die Tiere mit Äther, explaniicrt die Mägen und eröffnet sie unter laufendem, lauwarmen Wasser. Zur Beurteilung wird der Magen umgekehrt über einen Zeigefinger gestülpt. Alle stark roten Punkte oder Streifen, die sich unter dem fließenden Wasser nicht entfernen lassen, werden als Ulcera gewertet. Man teilt in folgende Klassen ein:

1 = deutliche Ulcera.

2 = starke Ulcera,

3 = sehr starke Ulcera.

Man errechnet das Mittel pro Gruppe und bestimmt die UD₅,,

Aufgrund seiner Arthritis-hemmcnden Wirkung kann das Antibiotikum S7481/F-2 zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.

Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäß je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für größere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildoscn beispielsweise etwa 25 bis 300 mg des neuen Antibiotikums neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.

ι Als Heilmittel kann das neue Antibiotikum allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten I lilfssioffen verabreicht werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

id Be i s ρ i e I 1

10 Liier einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose, 10 g Maisquellwasser, 3 g NaNOj, 1 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5 g KCI und 0,01 g Fe-SO₄ ■ 7 H_>O enthält, werden mit 100 ml Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Pcnicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27"C inkubiert.

Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Mycel wird im Turrax durch Zerschlagen und Umrühren mit 3,5 Liter 90-proz. Methanol extrahiert und das durch Abnutschen vom Lösungsmittel getrennte, zerkleinerte Mycel noch zweimal in gleicher Weise mit 90-proz. Methanol behandelt. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei 40°C Badtemperatur soweit eingedampft, daß die Flüssigkeit zur Hauptsache nur noch aus Wasser besteht. Das resultierende Gemisch extrahiert man sechsmal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid durch Ausschütteln, worauf die vereinigten Äthylenchloridlösungen durch Ausschütteln mit Wasser gereinigt und im Vakuum bei 40⁰C Badtemperatur eingedampft werden. Den so erhaltenen Rückstand Chromatographien man an 250 g Kicseigel (Kieselgcl 60 »Merck«, Korngröße 0.063 —0,200 mm) unter Verwendung von Chloroform

si mit einem Zusatz von 2% Methanol als Eluierflüssigkeit. die in 200 ml messenden Fraktionen aufgefangen wird. Die im Platten-Diffusionstest gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksamen Fraktionen werden vereinigt, in beschriebener Weise zur Trockene verdampft und nach Lösen in Methanol an 110 g Sephadex LH 20 mit dem gleichen Lösungsmittel Chromatographien, worauf man diejenigen der 20 ml messenden Fraktionen vereinigt die im gleichen Test wie oben sich gegen Aspergillus nigcr als antibiotisch aktiv erweisen. Bei der Prüfung im Dünnschichtchromatogramm, z. B. mittels Kieselgel auf »Polygram«-folien und Hexan-Aceton (1 :1) als Fließmittel, zeigt sich, daß der Rückstand der in oben beschriebener Weise eingedampften Methanollösung zur Hauptsache aus den beiden neuen Substanzen S7481/F-1 und S 7481/F-2 besieht. Sie werden getrennt und gleichzeitig gereinigt, indem man ihr Gemisch unter Verwendung der tausendfachen Menge Kieselgel der oben erwähnten Qualität und von Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind, erneut Chromatographien.

Die Prüfung der Eluatfraktionen, deren Volumen in Milliliter halb so groß ist wie das Gewicht des Kieselgels in Gramm, in Dünnschichtchromatogramm ergibt, daß die Substanz S 7481/F-I zuerst im Eluat erscheint, gefolgt von einem Gemisch der beiden und schließlich von ein-

bo hcillichem S 7481/F-2. Aus dem Gemisch können durch Wiederholung der Chromatographie unter den gleichen Bedingungen weitere Mengen der beiden Substanzen gewonnen werden.

Das neue Antibiotikum S7481/F-2 hat folgende Ei-

M genschaften:

Amorphes, farbloses Pulver. Fp. 127 — 130" (Zers.): [λ] Ί!= -243° (Chloroform, c = 0.5) einem UV-

Spektrum gemäß Fi g. 1,

einem IR-Spektrum gemäß F i g. 2, einem Protonen-NMR-Spektrum gemäß Fig. 3, Massen-Spektrum: Höchster Massen-Peak m/c = 1169,815 (±0,006),

folgenden Rf-Werten im Dünnschiehlehromaiogramm:

a) Kieselgel auf Glasplatten: Chloroform + 4% Methanol als FlieUmittcl: Rf = 0,46.

b) Kieselgel auf Folien »Polygram«: Hexan/Aceton (1 : I) als Fließmittel: Rf = 0,28: Chloroform/Accton(2 : l)als Flicßmittel: Rl = 0,26.

Elementaranalyse:
Gefunden C 61,7 H 9,1 N 13.1 O 16.5%.

Die als Ausgangsmaterial zur Beimpfung verwendete

gen; diejenigen von ihnen, die sich im Platten-Diffusionstest als gegen Aspergillus niger antibiolisch wirksam erweisen, werden vereinigt und im Vakuum bei 30-40^cC /ur Trockene eingedampft. Anschließend

^r, Chromatographien man den Rückstand an der 70fachen Menge Aluniiniumoxyd (neutral) der Aktivitätsstufe 1. wobei zur Elution Gemische von Toluol und Essigester dienen. Mit Toluol, dem 15% Essigester zugesetzt wurden, erscheint in den ersten zehn Fraktionen (Volumen

H) der Fraktionen; halb so viele Liter wie Adsorbens in kg) /.ueisi die Hauptmenge der Substanz S7481/F-1, gefolgt von einem Gemisch von S 7481/F-I und S7481/F-2. Einen weiteren Anteil desselben Gemisches gewinnt man. zusammen mit wenig Fremdsubstanz, beim nach-

v, folgenden Eluieren mit Toluol-Essigester (1 :1). Der Nachweis der Substanzen in den Eluatfraktionen erfolgt dabei auf dünnschicht-chromatographischem Wege, ■/.. B. mittels Kieselgel auf »Polygram«-folien und Hexan-Accton (1 :1) als Fließmittcl. Aus den vereinigten

Konidien- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur 20 Fraktionen, welche die Substanz S7481/F-1 in einheitlides ursprünglich isolierten Stammes N RRL 5760 hcrge- ' ' ' ' ' "¹^ ^J

stellt, welche 10 Tage auf einem Agarmedium, das pro Liter 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes Wasser enthält, gezüchtet wird. Die

eher Form enthalten, wird sie durch Eindampfen im Vakuum bei 30—40°C und anschließendes Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum bei 50°C gewonnen. Die vereinigten Eluatfraktionen, welche das Gemisch ent-

Konidien und das Mycel werden in physiologischer 25 halten, werden unter den gleichen Bedingungen eben-Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Suspension dient
zur Animpfung der oben erwähnten Nährlösung.

Beispiel 2

250 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose, 10 g Maisquellwasscr, 3 g NaNOi, 1 g K.HPO₄. 0,5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5 g KCl und 0,01 g FeSO₄ · 7 H₂O enthält, werden mit 2,5 Liter Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Penicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27° C inkubiert.

Aus der Kulturbrühe wird das Mycel durch Zentrifugieren abgetrennt und im Ultra-Turrax mit 80 Liter

JO

falls eingedampft. Zur Gewinnung von weiterem S7481/F-1 und von einheitlichem S7481/F-2 wird der Rückstand der Chromatographie an der tausendfachen Menge Kieselgel unterworfen, wobei Chloroform, das 2% Methanol enthält, als Elutionsmittel verwendet wird, wie dies, so wie das weitere, in Beispiel 1 beschrieben wurde.

Beispiel 3

500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 2 g KH₂PO₄ 3 g NaNOj, 0,5 g KCI, 0,01 g FeSO₄ und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des

90-proz. Methanol homogenisiert, darauf die methanoli- 40 Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfersehe Extraktlösung durch Zentrifugieren vom Fcststotl
getrennt und der letztere noch zweimal in gleicher Weise mit 90-proz. Methanol extrahiert. Die vereinigten Extraktlösungen werden im Vakuum bei 30—40⁰C auf
15 Liter konzentriert. Die verbleibende wäßrige Phase v, aufgeschlossen und mehrmals mit je 500 Liter 1.2-Diextrahiert man achtmal mit dem gleichen Volumen chlorälhan extrahiert. Die organische Phase wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Eindampfrückstand wird an der

menter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27°C inkubiert.
500 Liter Kulturbrühe werden mit dem Ultraturrax

lOOfachen Menge Sephadex LH 20 mit Methanol chro-

Äthylenchlorid. Jeder der Äthylenchloridextrakte wird mit 5 Liter Wasser gewaschen. Die Äthylenehloridlö-

sur.gen werden nach Vereinigung im Vakuum bei _ .

30—4O⁰C eingedampft. Zur Entfettung wird der Ex- 50 matographiert. Die gegen Aspergillus niger aktiven

traktrückstand in der Weise zwischen Petroläthcr und Fraktionen werden vereinigt und das Gemisch an der

90-proz. Methanol verteilt, daß er nach Lösen in 2 Liter !00-200fachen Menge neutralem Aluminiumoxid (Ak-

90-proz. Methanol nacheinander mit dreimal je 2 Liter livitätsstufe I) Chromatographien. Die Elution erfolgt

Petroläther (Siedepunkt 30-35°C), die sich in drei mit Toluol, dem 10-50% Äthylacetat zugesetzt ist. Es

Schütteltrichtern befinden, geschüttelt wird, worauf die 55 werden zuerst vorwiegend Nebenprodukte, dann

drei Petrolätherphasen hintereinander noch zweimal S 7481 /F-1 und anschließend S 7481 /F-2 eluiert. Die Er-

mit je 2 Liter 90-proz. Methanol extrahiert werden. Zu kennung der Aktivstoffe in den Fraktionen erfolgt wie-

den vereinigten methanolischen Lösungen gibt man der durch Aklivilätsprüfung gegen Aspergillus niger;

3 Liter Wasser und konzentriert das Gemisch im Vaku- zur Reinheitskontrolle wird dünnschichtchromatogra-

umbei30—40⁰C auf ein Volumen von 2 Liter. Das wäß- bo phisch auf Kieselgelplatten mit Chloroform-Methanol

rige Konzentrat extrahiert man durch fünfmaliges Aus- (96 :4) geprüft, wobei die Antibiotika mit Joddampf

schütteln mit je 2 Litern Äthylenchlorid; die Äthylen- sichtbar gemacht werden. Die reinen Fraktionen wer-

chloridlösungen werden mit je 0,5 Liter Wasser gewä- den vereinigt und mit Hexan verrieben, wobei die Anti-

schen, vereinigt und im Vakuum bei 30—40⁰C zurTrok- biotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 in Form eines weißen

kene eingedampft. Den Rückstand unterwirft man der 65 atnofpheri Pulvers anfallen, das im Hochvakuum bei

Chromatographie an der 25fachen Menge Sephadex 50° C getrocknet wird.

LH 20, wobei Methanol als Elutionsmittel dient. Das Die als Ausgangsmaterial verwendete Vorkültür wird

Eluat wird in 250 ml messenden Fraktionen aufgefan- wie folgt erhalten:

Die zur Beimpfung verwendete Sporen- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 8044 hergestellt, welche 21 Tage bei 27°C auf einem Agarmedium, das pro Liter 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes Wasser enthält, gezüchtet wird. Die Sporen und das Mycel dieser Kultur werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.

Mit dieser Suspension werden 50 Liter einer Nährlösung, die die gleiche Zusammensetzung hat wie der 500-Liter-Stahlfermenler, angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (200 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 3 Tage bei 27ⁿC inkubiert. Diese Fermentationslösung dient als Impfmaterial für den 500-Liter-Stahlfermentcr.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

η ίο

Vi)

55

60

Claims

Patentansprüche:

1. Antibiotikum Cyclosporin B (S7481/F-2), gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

Amorphes, farbloses Pulver, Fp. 127-130° (Zers.):H f= -243° (Chloroform,c = 0,5).

Massen-Spektrum: Höchster Massen-Peak m/e= 1169,815 (±0,006),

folgenden Rf-Werten im Dünnschichtchromatogramm: