DE2455859C2 - Das Antibiotikum Cyclosporin A (S 7481/F-1), seine Herstellung und Verwendung - Google Patents

Description

28-45x4,8-5,7 μ

groß und sind somit bedeutend !deiner als in der zitierten Beschreibung angegeben

(45-65x6—6,5 μ).

Ein weiterer wichtiger Unterschied besteht in der Wachstumsgeschwindigkeit; während der Typus in 7 Tagen ) —13 cm große Kolonien bilden sollte, wächst der Stamm NRi*L 5760 in derselben Zeit zu 7—8 cm großen Kolonien heran, wobei auf Kartoffel-Dextrose-Agar fast ausschließlich farbloses bis braunes Substratmycel gebildet wird. Die Konidiophoren mit den PhitVden entstehen bereits nach wenigen Tagen in dichten Gruppen und Bündeln, verzweigen sich penicillium- bis verticilHumartig und bilden über längere Zeit Makrokonidien aus, die sich als sch'eimige, beige Masse ansammeln.

Der neue erfindungsgemäß verwendete Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Garns wurde aus einer in Norwegen gefundenen Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, III., USA unter der Nummer NRRL 8044 deponiert.

Aufgrund der Publikation Garns in Persoonia, Vol. 6, P. 2, pp 183—191 (1971) sowie der Bestimmung des Stammes in einer nachstehenden morphologischen Beschreibung ist ersichtlich, daß der Stamm NRRL 8044 als Tolypocladium inflatum Garns und nicht wie ursprünglich angenommen als Trichoderma polysporum zu klassieren ist.

Der neue Stamm NRRL 8044 von Tolypocladium inflatum Garns wächst auf 2% Malzextraktagar zwischen 6 und 33° C, das Wachstumsoptimum liegt um 24° C, wo in 12 Tagen 40 bis 45 mm im Durchmesser mes^nde, rein weiße, oberflächlich samtartige und ungefältete Kolonien gebildet werden. Bei der höchsten, noch gutes Wachstum erlaubenden Temperatur (33° C) wird hingegen überhaupt kein Luftmycel, dafür eine sehr stark gefältelte Kolonie gebildet. Mit zunehmender Kulturtemperatur bildet sich an der Kolonieunterseite vermehrt ein gelbes Pigment, welches bei 27° C und noch ausgeprägter bei 30 bis 33° C in den Agar diffundiert.

Zur Bildung der Konidiophoren, welche sowohl zerstreut, als auch in dichteren Gruppen, vor allem aber am Kulturgefäßrand stehen, benötigt der neue Stamm von Tolypocladium inflatum Garns bei 24° C auf Malzextraktagar 15 bis 20 Tage. Der Hauptast der Konidienträger erreicht einen Durchmesser von 2,0—3,8 μ. Die Phialiden des neuen Stammes von Tolypocladium inflatum Garns sind, insbesondere am Ende ihrer Entwicklung, lang ausgezogen. Die Konidien haben folgenden Durchmesser von:

2.0-3,1 χ 1,5-2,0 μ.

Der vorliegende Tolypocladium inflatum Garns Stamm NRRL 8044 bildet unter allen genannten Kulturbedingungen keine echten Chlamydosporen.

Die neuen Pilzstämme NRRL 5760 und NRRL 8044 lassen sich auf vielartigen Nährböden, die die üblichen Nährstoffe für Pilze enthalten, züchten. So verwenden diese Stämme die für die kohlenstoffheterotrophen Organismen üblicherweise verwendeten Nährstoffe, z.B. Saccharose, Glucose, Maltose, Laktose, Stärke, Malzextrakt als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Maisquellwasser, Sojapepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw, als Stickstoffquelle sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.

Das neue Antibiotikum S 7481/F-l kann man in der Weise herstellen, daß

1. ein flüssiges Medium mit einer Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 beimpft und die Kultur 9—13 Tage, vorzugsweise 11 Tage, bei 24—3O⁰C, vorzugsweise 27°C, und bei einem pH-Wert von 4,8—8,8, vorzugsweise bei 8,1, inkubiert wird. Diese Züchtung erfolgt in Penicillinflaschen unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur,

2. daß ein flüssiges Medium mit einer Konidien- und ίο Mycelsuspension des Stammes NRRL 8044 beimpft und die Kultur 11 — 18 Tage, vorzugsweise 13 Tage, bei 25—30° C, vorzugsweise bei 27° C, und bei einem pH-Wert von 4,3—6,2, vorzugsweise von 5,6 in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) inkubiert wird.

Sobald eine maximale Menge an Antibiotika produziert ist, werden diese aus der Kulturbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Methoden auf an sich bekannte Weise gewonnen.

Das neue Antibiotikum S 7481/F-l zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als

Heilmittel verwendet werden. So hemmt das Antibiotikum das Wachstum von Aspergillus niger. Insbesondere zeichnet sich die Substanz S 7481/F-l durch eine immunosuppressive Wirkung aus. S 7481/F-l zeigt zudem entzündungshemmende Eigenschaften. Hervorzuheben ist, daß das Antibiotikum zytostatisch wenig aktiv ist.

Die immunosuppressive Wirkung von S 7481/F-l kann wie folgt gezeigt werden:

a) Lokale Hämolyse im Gel in vitro, Jerne-Test:

Die Hemmung der Hämolysenhöfe in % gegenüber Kontrollen beträgt bei einer Dosis von 2 χ 60 mg/kg i. p. 99%, bei einer Dosis von 1 χ 150 mg/kg p. o. 90% und bei einer Dosis von 3 χ 200 mg/kg p. o, 993%. Es wird sowohl die Bildung von Immunoglobulin M- wie auch von Immunoglobulin G-Antikörpern gehemmt.

b) Hämagglutinationstest (HAT) an der Maus:
Erfaßt werden die gegen Schaferythrozyten gebildeten Antikörper. Die Hemmung wird im suppressiven Index (SI) ausgedrückt, wobei die unbehandelte Kontrolle mit 1,00 angegeben wird; SI = 03 nach p. o. 5 χ 200 mg/kg.

c) Hauttransplantationstest bei der Maus:

Bei H-2 histoinkompatiblen Mäusen wird die Überlebenszeitverlängerung des Haupttransplantates gegenüber unbehandelten Kontrolltieren nach einer Dosis von 10x200 mg/kg p. o. knapp signifikant verlängert: ca. 16 Tage länger als Kontrollen.

d) Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) an der Ratte:

Die experimentell hervorgerufenen Nervengewebsschädigungen, die bei unbehandelten Kontrolltieren 8 von 10 Tieren lähmte, ergab bei der gleichen Anzahl Versuchstieren, die mit 13 χ 25 mg/kg Lp. behandelt worden sind, einen 100%igen Schutz.

e) Oxazolon-Test an der Maus:

Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver Index (SI) ausgedrückt; SI=0,6 nach 6 χ 75 mg/kg ρ. ο. ,

f) Zytopenien im Knochenmark und Blut:

Die hohe orale Gabe von 6 χ 500 mg/kg zeigt keine signifikante Depression der blutbildenden Zellen im Knochenmark und keine Leukopenie im Blut am 1., 3. und 7. Tag nach der letzten Substanzverabreichung.

Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung kann die Verbindung 3 7481/F-I zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.

Das neue Antibiotikum S7481/F-1 besitzt ebenfalls eine Arthritis-hemmende Wirkung.

Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, tritt eine Hemmung der Adjuvans Arthritis in niedrigeren Dosen als beim Vergleichspräparat Phenylbutazon ein. zudem weist das Antibiotikum S 7481/F-I im Gegensat?, zu Phenylbutazon praktisch keine Ulcerogenität auf.

Substanz	AA	T UD50 mg/kg p. 0.	U
	L ED50 mg/kg p. o.	12	UD50 mg/kg p. 0.
S 7481/F-l	3	15	300
Phenylbutazon	10		40
AA Adjuvans Arthritis U Ulcerogenität L Latenz T Therapie

Über die verwendeten Untersuchungsmethoden sind 25 Alle stark roten Punkte oder Streifen, die sich unter dem die folgenden Angaben zu machen: fließenden Wasser nicht entfernen lassen, werden als

Ulcera gewertet. Man teilt in folgende Klassen ein:

40

1) Freund Adjuvans Arthritis (AA)

Durch intracutane Applikation von 6 mg Mycobakterien, die in Mineralöl suspendiert sind ( = Freund Adjuvans complet), wird an der Ratte eine generalisierte, auf Oberempfindlichkeit beruhende Arthritis ausgelöst. Man unterscheidet eine primäre Schwellung an der injizierten Pfote und sekundäre Schwellungen, die 12 bis 15 Tage nach der Verabreichung an den übrigen Gelenken auftreten. Auch an den Ohren und am Schwanz kommt es zu Knotenbildung.

Der Versuchsablauf gestaltet sich wie folgt: Die Verabreichung des Freund Adjuvans complet erfolgt intracutan in die Sohle einer Hinterpfote. Pro Dosis werden 10 Tiere eingesetzt Die Testsubstanzen verabreicht man währen«,⁴: der Latenzzeit p. o, total 14mal. Die therapeutische Behandlung erfolgt nach voller Ausbildung der primären und sekundären Symptome, ca. 14.—21. Tag, mindestens 7mai. Der Pfotendurchmesser wird am Anfang und Schluß der Behandlung bestimmt. In der Mittel der Pfote wird deren Höhe und Breite bestimmt und der Durchschnitt errechnet.

Ein Latenzzeitversuch dauert rund 19 Tage, ein therapeutischer Versuch bis gegen 30 Tage. Von allen 10 Tieren der Dosierungsgruppe wird die mittlere Pfotenschwellung am Versuchsende errechnet, hiervon der entsprechende Wert vom Versuchsanfang abgezogen und in % der unbehandelten Kontrolle ausgedrückt Vorderpfoten, Ohren und Schwanz werden subjectiv bewertet (score 0—3) und ebenfalls mit der unbehandelten Kontrolle verglichen.

2) Ulcerogenität (U)

Die Ratten werden einzeln während 24 Stunden auf Hunger gesetzt Zu Versuchsbeginn sollten die Mägen möglichst leer sein. Die Tiere werden gewogen und die Substanzen in 10 ml/kg p.o. verabreicht pro Dosis 5 Tiere. 6 Stunden nach Substanzgabe tötet man die Tiere mit Äther, explantiert die Mägen und eröffnet sie unter laufendem, lauwarmen Wasser. Zur Beurteilung wird der Magen umgekehrt über einen Zeigefinger gestülpt

0 = keine Ulcera,

1 = deutliche Ulcera,

2 s= starke Ulcera,

3 = sehr starke Ulcera.

Man errechnet das Mittel pro Gruppe und bestimmt die

35 UD₅₀.

Aufgrund seiner Arthritis-hemmenden Wirkung kann das Antibiotikum S 7481/F-l zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.

In B. Hermann und W. Müller, Act. rheumatol. 1979,4, 173 wird erstmals über die Behandlung der chi jnischen Polyarthritis mit dem Antibiotikum Cyclosporin A (S 7481/F-l) berichtet. Bei einer Langzeitbehandlung über 6 Monate und mehr konnte insgesamt ein relativ günstiger Effekt auf den Verlauf der chronischen Polyarthritis erzielt werden, der wahrscheinlich z.T. durch die Immunosuppression, möglicherweise aber auch durch einen antiphlogistischen Effekt der Substanz zu erklären ist

Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäß je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Korpergewicht erzielt Diese Dosis kann

nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für größere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg des neuen Antibiotikums neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.

Als Heilmittel kann das neue Antibiotikum allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

so

Beispiel 1

10 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose. 10 g Corn steep, 3 g NaNO₃, 1 g K₂HPO₄,

0.51; MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5g KCI und 0,01g FeSO₄ · 7 H₂O enthält, werden mit 100 ml Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Penicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27°C inkubiert.

Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Mycel wird im Turrax durch Zerschlagen und Umrühren mit 3,5 Liter 90proz. Methanol extrahiert und das durch Abnutschen vom Lösungsmittel getrennte, zerkleinerte Mycel noch zweimal in gleicher Weise mit 90proz. Methanol behandelt. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei 40⁰C Badtemperatur soweit eingedampft, daß die Flüssigkeit zur Hauptsache nur noch aus Wasser besteht. Das resultierende Gemisch extrahiert man sechsmal mi» dem gleichen Volumen Äthylenchlorid is durch Ausschütteln, worauf die vereinigten Äthylenchloridlösungen durch Ausschütteln mit Wasser gereinigt und im Vakuum bei 40⁰C Badtemperatur eingedampft werden. Den so erhaltenen Rückstand Chromatographien man an 250 g Kieseigei (Kieseigei bO »Merck«, Korngrößen 0,063—0,200 mm) unter Verwendung von Chloroform mit einem Zusatz von 2% Methanol als Eluierflüssigkeit, die in 200 ml messende Fraktionen aufgefangen wird. Die im Platten-Diffusionstest gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksamen Fraktionen werden vereinigt, in beschriebener Weise zur Trockene verdampft und nach Lösen in Methanol an HOg Sephadex LH 20 mit dem gleichen Lösungsmittel chromatographiert, worauf man diejenigen der 20 ml messende Fraktionen vereinigt, die im gleichen Test wie oben sich gegen Aspergillus niger· als antibiotisch aktiv erweisen. Bei der Prüfung im Dünnschichtchromatogramm, z. B. mittels Kieselgel auf »Polygram«-folit;n und Hexan-Aceton (1 :1) als Fließmittel, zeigt sich, daß der Rückstand der in oben beschriebener Weise eingedampften Methanollösung zur Hauptsache aus den beiden neuen Substanzen S7481/F-1 und S7481/F-2 besteht. Sie werden getrennt und gleichzeitig gereinigt, indem man ihr Gemisch unter Verwendung der tausendfachen Menge Kieselgel der oberi erwähnten Qualität und von Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind, erneut chromatographiert. Die Prüfung der Eluatfraktionen, deren Volumen in Milliliter halb so groß ist wie das Gewicht des Kieselgels in Gramm, im Dünnschichtchromatogramm ergibt, daß die Substanz S 7481/F-l zuerst im Eluat erscheint, gefolgt von einem Gemisch der beiden und schließlich von einheitlichem S 7481/F-2. Aus dem Gemisch können durch Wiederholung der Chromatographie unter den gleichen Bedingungen weitere Mengen der Substanzen S 7481/F-l gewonnen werden.

Das neue Antibiotikum S 7481/F-l hat folgende Eigenschaften:

Antibiotikum Cyclosporin A (S 7481/F-l), gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

Amorphes, farbloses Pulver, Fp. 137 bis 140° (Zers.);[_Ä] g> =-236° (CHCI₃₁C=0,5)

einem UV-Spektrum gemäß Fig. 1,

einem I R-Spektrum gemäß F i g. 2,

einem Protonen-NMR-Spektrum gemäß F i g. 3,

einem ^l3C-NMR-Spektrum gemäß nachfolgender

Tabelle: Tabelle

¹³C-Spektrendaten von S 7481/F-l; 250 mg in 1,5 ml CDCl₃ Bruker HX-90 E; Sweep-width 6000 Hz

Adresse	Frequenz [Hz)	δ [ppm)	Intensität ■
1260	3915.5273	173.0237	184
1264	3909.6679	172.7648	192
1293	3867.1875	170.3876	91
1299	3858.3984	170.4992	215
1312	3839.3554	169.6577	207
1317	3932.0312	169.3341	268
1937	2923.8281	129.2014	220
1992	2843.2617	125.6412	225
2745	1740.2343	76.8994	20
2785	1681.6406	74.3102	165
3027	1327.1484	58.6455	187
3642	1305.1757	57.6745	223
3047	1297.8515	57.3509	253
3051	1291.9921	57.0920	40*)
3081	1248.0468	55.1501	844
3159	1133.7890	50.1011	172
3184	1097.1679	48.4828	566
3189	1089.8437	48.1592	276
3239	1016.6015	44.9227	206
3305	'919.9218	4B.6505	158
3327	887.6953	39.2264	192
3332	880.3710	38.9028	222

	Fortsetzung	24 55 859	Frequenz [HzJ	Höchster Massen-Peak	δ [ppm]	14	1
	Adresse		843.7500		37.2845
	3357		834.9609	Dürnschichtchromato-	36.8961	Intensität	I
	3363	810.0585		35.7957	167	I
	3380	799.8046		353426	30*)	I
	3387	764.6484	a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform+4%	33.7891	567	I
	3411	708.9843	Methanol als Fließmittel: Rf=0,52.	313294	304	1
	3449	701.6601	b) Kieselgel auf Folien »Polygram«; Hexan/Ace-	31.0057	182	i
	3454	670.8984		29.6464	167	8
	3475	666.5039		29.4522	518	1
	3478	654.7851		28.9343	544	S
	3486	571.2890		25.2447	179	I
	3543	562.5000	24.8563	310	I
	3549	556.6406	24.5974	287	ρ
	3553	537.5976	23.7559	631	Ϊ
	3566	525.8789	23.2381	843
	3574	514.1601	22.7202	1000	I
	3582	493.6523	21.8140	762
	3596	477.5390	21.1020	58*)
	3607	455.5664	20.1310	606
	3622	446.7773	19.7427	231
	3628	421.8750	18.6422	165
	3645	414.5507	18.3186	254
	3650	408.6914	18.0597	285
	3654	402.8320	17.8007	314
	3658	379.3945	16.7651	278
	3674	359.8867	15.8588	277
	3688	222.6562	9.8389	224
	3781	v.UUUV	Ό.ΌΌνΌ	202
	3933			139
		I *) Registrierte Signale von CDCI3 und höheren	Rauschspitzen.	111™ Tetramethyl-
		ton (1	silan
		: 1) als Fließmittel: Rf=037; Chloro-
13		form/Aceton (2 : l)als Fließmittel: Rf =034.
	Elementaranalyse:
	so Gefunden
	C 61,8 t
■ einem Massen-Spektrum:
m/e= 1183331 (±0,004)	4 9,4 N 13,0 O15,7%
folgenden Rf-Werten im	Bruttoformel C62H111N11O12
gramm:	und einer Cyciopeptidstruktur folgender Formel I:

CH₃ H

H ^CH₂

CH₃ CH₃ I

\ / HO CH

CH CH₃ CHj \ / \ CH₃

I \ / CH CH₃ I

CH₂ CH₃ CH CH₃ CH₂ CH₃

I I I I Il

CH₃-N-CH-CO-N CH-C-N—CH-CO-N-CH-C-N CH₂

L I _L I L Il

ο ho

CO

CH₃ \

CH-CH₂-CHl

CHj

CH₃-N

I D L j

OC-CH—N—CO —CH-N-

I I

CH₃ H

CH₃

CO

N-CH₃

O H

Il i. I

CO-CH-N-C-CH-N-CO-CH

III I

CH₂ CH₃ CH CH₂

I / \ I

CH CHj CH₃ CH

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

Die als Ausgangsmaterial zur Beimpfung verwendete Konidien- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 5760 hergestellt, welche 10 Tage auf einem Agarmedium, das pro Liter 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes Wasser enthält, gezüchtet wird. Die Konidien und das Mycel werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Suspension dient zur Animpfung der oben erwähnten Nährlösung.

Beispiel 2

250 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Saccharose, 10 g Corn steep, 3 g NaNO₃, 1 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄ · 7 H₂O. 0,5 g KCI und 0,01 g FeSO₄ · 7 H₂O enthält, werden mit 2,5 Liter Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 5760 angeimpft und in Penicillinflaschen mit je 700 ml Inhalt während 11 Tagen bei 27" C inkubiert.

Aus der Kulturbrühe wird das Mycel durch Zentrifugieren abgetrennt und im Ultra-Turrax mit 80 Liter 90proz. Methanol homogenisiert, darauf die methanolische Extraktlösung durch Zentrifugieren vom Feststoff getrennt und der letztere noch zweimal in gleicher Weise mit 90proz, Methanol extrahiert, Die vereinigten Extraktlösungen werden im Vakuum bei 30—40°C auf 15 Liter konzentriert. Die verbleibende wäßrige Phase extrahiert man achtmal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid. Jeder der Äthylenchloridextrakte wird mit 5 Liter Wasser gewaschen. Die Äthylenchloridlösungen werden nach Vereinigung im Vakuum bei 30—4O⁰C eingedampft. Zur Entfettung wird der Extraktrückstand in der Weise zwischen Petroläther und 90proz. Methanol verteilt, daß er nach Lösen in 2 Liter 90proz. Methanol nacheinander mit dreimal je 2 Liter Petroläther (Siedepunkt 30—35° C), die sich in drei Schütteltrichtern befinden, geschüttelt wird, worauf die drei Petrolätherphasen hintereinander noch zweimal mit je 2 Liter 90proz. Methanol extrahiert werden. Zu den vereinigten methanolischen Lösungen gibt man 3 Liter Wasser und konzentriert das Gemisch im Vakuum bei 30-40° C auf ein Volumen von 2 Liter. Das wäßrige Konzentrat extrahiert man durch fünfmaliges Ausschütteln mit je 2 Litern Äthylenchlorid; die Äthylenchloridlösungen werden mit je 0,5 Liter Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum bei 30—40°C zur Trockene eingedampft. Den Rückstand unterwirft man der Chromatographie an der 25fachen Menge Sephadex LH 20, wobei Methanol als Elutionsmittel dient. Das Eluat wird in 250 ml messenden Fraktionen aufgefangen; diejenigen von ihnen, die sich im Platten-Diffusionstest als gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksam erweisen, werden vereinigt und im Vakuum bei 30—40^C zur Trockene eingedampft. Anschließend Chromatographien man den Rückstand an der 70fachen Menge Aluminiumoxyd (neutral) der Aktivitätsötufe 1, wobei zur Elution Gemische von Toluol und Essigester dienen. Mit Toluol, dem 15% Essigester zugesetzt wurden, erscheint in den ersten zehn Fraktionen (Volumen der Fraktionen: halb so viele Liter wie Adsorbens in kg) zuerst die Hauptmenge der Substanz S 7481/F-I. gefolgt von einem Gemisch von S 7481/F-I und S7481/F-2. Einen weiteren Anteil desselben Gemisches gewinnt man, zusammen mit wenig Fremdsubstanz, beim nachfolgenden Eluieren mitToluol-Essig-

ester (1:1). Der Nachweis der Substanzen in den Eluatfraktionen erfolgt dabei auf dünnschicht-chromatographischem Wege, z.B. mittels Kieselgel auf »Polygrama-folien und Hexan-Aceton (1:1) als FließmitteL Aus den vereinigten Fraktionen, weiche die Substanz S7481/F-1 in einheitlicher Form enthalten, wird sie durch Eindampfen im Vakuum bei 30—40⁰C und anschließendes Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum bei 50⁰C gewonnen. Die vereinigten Eluatfraktionen, welche das Gemisch enthalten, werden to unter den gleichen Bedingungen ebenfalls eingedampft. Zur Gewinnung von weiterem S7481/F-1 wird der Rückstand der Chromatographie an der tausendfachen Menge Kieselgel unterworfen, wobei Chloroform, das 2% Methanol enthält, als Elutionsmittel verwendet is wird, wie dies, so wie das weitere, in Beispiel 1 beschrieben wurde.

Beispiel3

500 Liter eitxr Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 2 g KH₂PO₄ 3 g NaNO₃, 0,5 g KCl, 0,01g FeSO₄ und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Mia/Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27° C inkubierL

500 Liter Kulturbrühe werden mit dem Ultraturrax aufgeschlossen und mehrmals mit je 500 Liter 1,2-Dichloräthan extrahiert Die organische Phase wird J0 abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Eindamofrückstand wird an der lOOfachen Menge Sephadex LH 20 mit Methanol chromatographiert Die gegen Asper^ülus niger aktiven Fraktionen werden vereinigt und das Gemisch an der 100—200fachen Menge neutralem Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe I) chromatographiert Die Elution erfolgt mit Toluol, dem 10—50% Äthylacetat zugesetzt ist Es werden zuerst vorwiegend Nebenprodukte, dann S 7481/F-l und anschließend S 7481/F-2 eluiert Die Erkennung der Aktivstoffe in den Fraktionen erfolgt wieder durch Aktivitätsprüfung gegen Aspergillus niger; zur Reinheitskonrolle wird dünnschichtchromatographisch aud Kieselgelplatten mit Chloroform-Methanol (96 :4) geprüft, wobei die Antibiotika mit Joddampf sichtbar gemacht werden. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und mit Hexan verrieben, wobei das Antibiotikum S 7481/F-l in Form eines weißen amorpf.2n Pulvers anfallen, das im Hochvakuum bei 50° C getrocknet wird.

Die als Ausgangsmaterial verwendete Vorkultur wird wie folgt erhalten:

Die zur Beimpfung verwendete Sporen- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 8044 hergestellt, weiche 21 Tage bei 27'C auf einem Agarmedium, das pro Liter 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes Wasser enthält gezüchtet wird. Die Sporen und das Mycel dieser Kultur werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.

Mit dieser Suspension werden 50 Liter einer Nährlösung, die die gleiche Zusammensetzung hat wie der 500-Liter-Stahlfermenter, angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (200 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Mio/Liter Nährlösung) 3 Tage bei 27°C inkubiert Diese Fermentationslösung dient als Impfmaterial für den 500-Liter-Stahlfermenter.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

♦ ι ■ Patentansprüche:

1. Antibiotikum Cyclosporin A (S7481/F-1), gekennzeichnet durch folgende Eigenschaf

Amorphes, farbloses Pulver, Fp. 137 bis 140" (Zers.);

[a] *> =-236° (CHCl₃, C=O^), einem '³C-NM R-Spektrum gemäß nachfolgender

Tabelle:

Tabelle

^uC-Spektrendaten von S 7481/F-l; 250 mg in 1,5 ml CDCl₃

Bruker HX-90 E; Sweep-width 6000 Hz

Adresse Frequenz [Hz] δ [ppm] Intensität 1260 3915.5273 173.0237 184 1264 3909.6679 172.7648 192 1293 3867.1875 1703876 91 1299 3858.3984 170.4992 215 1312 3839.3554 169.6577 207 1317 3932.0312 169.3341 268 1937 2923.8281 129.2014 220 1992 28432617 125.6412 225 2745 1740.2343 76.8994 20 2785 1681.6406 74 J102 165 3027 1327.1484 58.6455 187 3042 1305.1757 57.6745 223 3047 1297.8515 57.3509 253 3051 1291.9921 57.0920 40*) 3081 1248.0468 55.1501 844 3159 1133.7890 50.1011 172 3184 1097.1679 48.4828 566 3189 1089.8437 48.1592 276 3239 1016.6015 44.9227 206 3305 919.9218 40.6505 158 3327 887.6953 39.2264 192 3332 880.3710 38.9028 222 3357 843.7500 37.1845 167 3363 834.9609 36.8961 30*) 3380 810.0585 35.7957 567 3387 799.8046 35.3426 304 3411 764.6484 33.7891 182 3449 708.9843 31.3294 167 3454 701.6601 31.0057 518 3475 670.8984 29.6464 544 3478 666.5039 29.4522 179 3486 654.7851 28.9343 310 3543 571.2890 25.2447 287 3549 562.5000 24.8563 631 3553 556.6406 24.5974 843 3566 537.5976 23.7559 1000 3574 525.8789 23.2381 762 3582 514.1601 22.7202 58*) 3596 493.6523 21.8140 606 3607 477.5390 21.1020 231 3622 455.5664 20.1310 165 3628 446.7773 19.7427 254 3645 421.8750 18.6422 285

Fortsetzung

I Adresse Frequenz fHz] δ [ppm] Intensität 1 3650 414.5587 18.3186 314 Ϊ 3654 408.6914 18.0597 278 S
SS 36S8 402.8320 17.8007 277 &
fa 3674 379.3945 16.7651 224 •'S 3688 359.8867 15.8588 2fl2 i 3781 222.6562 9.8389 139 3933 D.DBBB D-BBBB lll^Tetramethyl- silan I

*) Registiieite Signale von CDCI3 und höheren Rauschspitzer.

einem Massen-Spektrum: Höchster Massen-Peak m/e= 1183,831 (±0.004), folgenden Rf-Werten im Dünnschichtchromatogramm:

a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform +4% Methanol als Fließmittel: Rf=0.52.

b) Kieselgel auf Folien »Polygram«; Hexan/Aceton(I :1)als Fließmittel:Rf=037;Chloroform/ Aceton (2 : i) als Fließmittel: Rf=034.

Elementaranalyse:
Gefunden

C61,8;H 9,4;N 13,0;O 15,7%; Bruttoformel C62H111N11O12

und einer Cyclopeptidstruktur folgender Formel L

CH₃ H C

H CH₂

CH₃ CH₃ I

\ / HO CH

CH CH₃ CH₃ \ / \ CH₃

I \ / CH CH₃ '

CH₂ CH₃ CH CH₃

I I CH,

CH₃

!!Il Il

CH₃-N-CH-CO-N CH-C-N —CH-CO-N-CH-C-N CH₂

CH₃
CH₃

CC

CH-CH₂-CHl
CH₃-N

CO

N-CH₃

H OH

D L I L υ L I L

OC-CH — N —CO-CH-N-CO-CH-N-C-CH-N-CO-CH

Ii I ill

CH₃ H CH₃ CH₂ CH₃ CH

CH CH₃ CH₃

CH₃ CH, CH₂

CH

CH, CH₁

2. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Cyclosporin A (S 748l/F-l)gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm NRRL 5760 der Pilzspecies Cylindrocarpon lucidum Booth bzw. den Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Garns auf oder in einem üblichen Nährmedium mit einer assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze und Spurenelemente züchtet, hierauf das erhaltene Mycel des Pilzstammes NRRL 5760 (falls erforderlich, unter mechanischer Zerkleinerung) mit 90% Methanol extrahiert, anschließend abdampft, das resultierende wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, wobei diesem Extrakt ein weiterer Extrakt gewonnen durch Extraktion des Kulturfiltrates mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel beifügt, hierauf die organische Lösung zur Trocken? eindampft, den se erhaltenen Rückstand entweder durch Chromatographie an Kieselgel mit Chloroform mit wenig Methanol, oder durch Verteilung zwischen Petroläther und Methanol, dem eine zur Phasentrennung genügende Menge Wasser beigemischt ist, entfettet, im ersten Fall die gegen Aspergillus niger antibiotisch wirksamen Fraktionen vereinigt und zur Trockene eindampft, im zweiten Fall das Methanol abdestilliert und das wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, hierauf zur Trockene eindampft, den in beiden Fällen erhaltene Rückstand in methanolischer Lösung an Sephadex LH 20 Chromatographien, die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt, hierauf entweder an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/F-I) eluiert wird, oder an Aluminiumoxyd mit Toluol und Essigester Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/F-I), dann ein Gemisch von Cyclosporin A (S 748!/F-I) und Cyclosporin B (S 7481/F-2) eluiert wird, wobei letzteres durch Chromatographie an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind, aufgetrennt wird, oder die bei der Züchtung des Pilzstammes NRRL 8044 erhaltene Kulturbrühe durch Homogenisieren (unter mechanischer Zerkleinerung des Mycels) aufschließt, mit 1,2-Dichloräthan extrahiert, hierauf zur Trockene eindampft, den erhaltenen Rückstand in methanolischer Lösung an Sephadex LH 20 Chromatographien, die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt, hierauf an Aluminiumoxyd mit Toluol und Essigester Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/F-l) eluiert wird.

3. Arzneimittel mit einem Gehalt an Antibiotikum Cyciosporin A (S 7481/F-I) gemäß Anspruch 1.

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Antibiotikum Cyclosporin A (S 7481/F-l), Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung in Arzneimitteln gemäß den Patentansprüchen 1,2 und 3. Erfindungsgemäß gelangt man zu dem neuen Antibiotikum S 748 i /F- i, indem man den Stamm NRRL 5760 der Pilzspecies Cylindrocarpon lucidum Booth bzw. den Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Garns auf oder in einem üblichen Nährmedium mit einer assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze und Spurenelemente züchtet, hierauf das erhaltene Mycel des Pilzstammes NRRL 5760 (falls erforderlich, unter mechanischer Zerkleinerung) mit 90% Methanol extrahiert, anschließend abdampft, das resultierende wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, wobei diesem Extrakt ein weiterer

ίο Extrakt gewonnen durch Extraktion des Kulturfiltrates mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel beifügt, hierauf die organische Lösung zur Trockene eindampft, den so erhaltenen Rückstand entweder durch Chromatographie an Kieselgel mit

is Chloroform mit wenig Methanol, oder durch Verteilung zwischen Petroläther und Methanol, dem eine zur Phasentrennung genügende Menge Wasser beigemischt ist, entfettet, im ersten Fall die gegen Aspergillus niger antibioiisch wirksamen Fraktionen vereinigt und zur Trockene eindampft, im zweiten Fall das Methanol abdestilliert und das wäßrige Gemisch mit einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, hierauf zur Trockene eindampft, den in beiden Fällen erhaltene Rückstand in methanolischer Lösung an Sephadex LH 20 Chromatographien, die gegen Aspergillus niger aktiver Fraktionen vereinigt, hierauf entweder an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/F-l) eluiert wird, oder an Aluminiumoxyd mit Toluol und Essigester Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/F-1), dann ein Gemisch von Cyclosporin A (S 7481/F-l) und Cyclosporin B (S 7481/F-2) eluiert wird, wobei letzteres durch Chromatographie an Kieselgel mit Chloroform, dem 2% Methanol zugesetzt sind, aufgetrennt wird, oder die bei der Züchtung des Pilzstammes NRRL 8044 erhaltene Kuhurbrühe durch Homogenisieren (unter mechanischer Zerkleinerung des Mycels) aufschließt, mit 1,2-Dichloräthan extrahiert, hierauf zur Trockene eindampft, den erhaltenen Rückstand in methanolischer Lösung an Sephadex LH 20 Chromatographien, die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt, hierauf an Aluminiumoxyd mit Toluol und Essigester Chromatographien, worauf zuerst Cyclosporin A (S 7481/F-I) eluiert wird.

Der neue erfindungsgemäß verwendete Stamm der Pilzspecies Cylindrocarpon lucidum Booth wurde aus einer im Staate Wisconsin, USA gefundenen Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research anH Development Division), Peoria, III, USA unter der Nummer NRRL 5760 deponiert. »

Der neue Stamm NRRL 5760 von Cylindrocarpon lucidum Booth stimmt in den wesentlichen Merkmalen überein mit der Originalbeschreibung (C Booth 1966; The Genus Cylindrocarpon: Mycological Papers No. 104,21). Auf Kartoffel-Dextrose-Agar bildet der Stamm NRRL 5760 weder Chlamydosporen noch Mikrokonidien. Chlamydosporenartige Zellen der Makrokonidien fehlen jedoch ebenfalls. Die bananenförmigen, meist mit drei Querwänden unterteilten Makrokonidien sind