DE19740030A1 - Ampullosporin, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung - Google Patents

Description

Antibiotika verschiedenster Strukturen werden bekanntermaßen durch Mikroorganismen produ­ ziert, wobei Peptidantibiotika eine große Subklasse der bekannten antibakteriellen und antifunga­ len Wirkstoffe bilden, die aus verschiedenen pro- und eukaryotischen Mikroorganismen isoliert werden können.

Antibiotika mit peptidischen Strukturen und strukturell ähnliche Wirkstoffe, wie z. B. Enzymin­ hibitoren, zeichnen sich durch interessante biologische Wirkungen aus (z. B. diverse antimikro­ bielle Aktivitäten, kanzerostatische, kardiotone, immunmodulatorische Wirkungen, Wachstums­ förderung von Nutztieren, Wirkungen als Insektizide usw.; siehe z. B. Gräfe, U., Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg, 1992; Takeuchi et al., J. Antibiot. 44) 263-272, 1991; Kane­ da, M., J. Antibiot. 44, 792-796, 1991).

Eine besondere Untergruppe der Peptidwirkstoffe bilden die Peptaibole, lineare Peptide mit bis zu 20 Aminosäurebestandteilen, die durch einen besonders hohen Gehalt an α- Aminoisobuttersäure (Mb) charakterisiert sind (Brückner, H. und Przybylski, M., J. Chroma­ togr. 296, 263-275, 1984; Pandey, R.C. et al., J. Antibiot. 27, 274-282, 1974; Przybylski, M. et al., Biomed. Mass. Spectrom. 11, 569-582, 1984). Für einzelne Vertreter der Peptaibole wurden antimikrobielle Eigenschaften und morphogene Wirkungen auf Pilze berichtet (Argoudelis, A. et al., J. Antibiot. 27, 321-328, 1974; Domberger, K. et al., J. Antibiot. 48, 977-989, 1995).

Von Interesse ist insbesondere der biologische Wirkmechanismus der Peptaibole, der eine Ionen­ kanalbildung in biologischen Membranen beinhaltet (siehe z. B. Grigoriev, P. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1237, 1-5, 1995).

Darüber hinaus wurde für eine Reihe von Peptidwirkstoffen gezeigt, daß sie mit Rezeptoren von Zellen oder mit Enzymen zellulärer Signalketten interagieren und somit antagonistische, agonisti­ sche, inhibitorische und stimulatorische Wirkungen hervorrufen (Miyata, S. et al., J. Antibiot. 45, 74-82, 1992; Kamiyama et al., J. Antibiot. 45, 424-427, 1992; Weber et al., J. Antibiot. 44, 164-171, 1991), jedoch wurde bisher noch nicht über antipsychotische (wie neuroleptische) Wir­ kungen von Vertretern dieser Strukturklasse berichtet. Neuroleptika blockieren prä- und post­ synaptische Dopaminrezeptoren. Sie verdrängen Dopamin aus der Bindung an den Dopaminre­ zeptor. Ihre Wirkung äußert sich in einer Dämpfung der emotionellen Erregbarkeit, in Verminde­ rung des Antriebs und der Spontanbewegung, ohne jedoch die intellektuellen Fähigkeiten zu be­ einträchtigen.

Die für verschiedene Anwendungen vorgesehenen und eingesetzten Wirkstoffe weisen häufig Mängel auf, wie unbefriedigende Wirkungen gegenüber pathogenen Zellen und Rezeptoren, wo­ bei die Entwicklung resistenter Zellinien ein besonderes Problem darstellt, und eine zu hohe Toxizität oder unerwünschte Nebenwirkungen.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen neuen mikrobiellen Wirkstoff mit Peptidstruktur und verbes­ serten pharmazeutischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Pilzstamm Sepedonium spec. DSM 10602 in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie üblichen an­ organischen Salzen fermentiert wird, bis sich der neue Peptidwirkstoff, nachfolgend Ampullos­ porin genannt, in der Kulturbrühe anhäuft, anschließend Ampullosporin aus der Kulturbrühe isoliert und in reiner Form gewonnen wird. Ampullosporin unterscheidet sich von den bisher be­ kannten Peptaibolen durch seine chemische Konstitution, wie durch physikochemische Untersu­ chungen zweifelsfrei festgestellt wurde.

Das Peptidantibiotikum Ampullosporin besitzt antipsychotische (insbesondere neuroleptische) und antibakterielle Wirksamkeit und kann insbesondere als Heilmittel für bakterielle Infektionen und für die Behandlung von Hirnerkrankungen, in erster Linie schizophrenen Zuständen, einge­ setzt werden.

Die Erfindung betrifft somit:

• 1. Eine Verbindung der Summenformel C₇₇H₁₂₆N₁₉O₁₉ (Ampullosporin) I) mit der Formel
  
• 2. Ein Arzneimittel, enthaltend Ampullosporin nebst üblichen Träger- und Hilfsstoffen.
• 3. Ein Verfahren zur Herstellung von Ampullosporin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Sepedonium spec. DSM 10602 in einem Nährmedium kultiviert, bis sich Am­ pullosporin in der Kulturbrühe anhäuft, und man es nachfolgend daraus isoliert.
• 4. Die Verwendung von Ampullosporin (I) laut als pharmakologisch wirksamer Stoff, ins­ besondere als neuroleptisches Arzneimittel.

In Formel (I) haben die Abkürzungen im einzelnen die folgenden Bedeutungen: L-Trp steht für L-Tryptophan, L-Ala für L-Alanin, Aib für α-Aminoisobuttersäure, L-Leu für L-Leucin und L- Gln für L-Glutamin.

Die Erfindung wird im folgenden detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Aus­ führungsformen. Ferner wird sie durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum Ampullosporin (I) wird durch einen Sepedonium spec.- Stamm produziert. Dieser Stamm ist durch spezifische morphologische Merkmale charakterisiert (siehe unten).

Aufgrund von aufeinanderfolgenden Isolierungsschritten wurde von Sepedonium spec. eine Pilz­ kolonie isoliert, die das Peptidantibiotikum Ampullosporin besonders effizient in der Kulturbrühe anhäuft. Ein Isolat von Sepedonium spec. wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga­ nismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braun­ schweig, Deutschland, unter der Hinterlegungs-Nr. 10602 am 21.03.1996 gemäß den Bedingun­ gen des Budapester Vertrages hinterlegt.

Sepedonium spec. DSM 10602 bildet bei Kultivierung auf Malzagar reichlich Mycel, die Hy­ phen sind verzweigt, septiert, hyalin und 3-5 µm dick. Die Lufthyphen werden zu Conidienträ­ gern, die zwei Conidientypen - Meurosporen und Blastosporen - bilden. Aleurosporen sind run­ de, kräftig goldgelbe, stark warzige (Warzen 16-21 µm Durchmesser, 1,2 µm lang, basal teil­ weise miteinander verbunden), solitäre Thalloconidien, die terminal am gesamten Mycel entste­ hen. Blastoconidien sind langgestreckte, fast zylindrische, apikal mitunter kopfige, später koni­ sche, dann abgerundete, basal wenig verschmälerte, oft auffallend gestutzte, 8-28/3,5-5 µm große Conidien. Conidiogene Zellen haben apikal oft eine Kragenstruktur, die die Basis der her­ anwachsenden Blastoconidie umschließt.

In einem Medium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und den üblichen Mineral­ salzen produziert Sepedonium spec. DSM 10602 die erfindungsgemäße Verbindung Ampullos­ porin. Anstelle des Stammes Sepedonium spec. DSM 10602 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden. Als Mutanten und Varianten gelten alle jene Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Verbindung zu synthetisieren.

Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene erzeugt werden.

Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemäße Verbindung synthetisie­ ren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der in der Kulturbrühe angehäuften Wirkstoffe, beispielsweise durch Austesten der antibiotischen Wirkung auf bekannte Testkeime anhand der dem Fachmann bekannten Methoden und durch chromatographischen Nachweis durchgeführt werden.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Koh­ lenhydrate und Zuckeralkohole, wie z. B. Glucose, Lactose, Maltose, Glycerol, Mannitol oder de­ ren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt.

Als Stickstoffquelle eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstel­ lung, Fischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.

Die Bildung des Ampullosporins erfolgt besonders gut in Nährmedien, die 0,2-6% Glycerol, bevorzugt 2-4% Glycerol, 1% Glucose und 0,01-1% Pepton, bevorzugt 0,1-0,6% Pepton, enthaken.

Die Kultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttel­ kolben oder Fermentoren, gegebenenfalls unter Einleiten von Luft oder Sauerstoff oder unter Verwendung von Standkulturen in Glasflaschen. Die Fermentation kann beispielsweise in Steil­ brustflaschen, Erlenmeyer- oder Rundkolben verschiedener Volumina, in Glasfermentoren oder V₂A-Stahltanks durchgeführt werden. Sie wird in einem Temperaturbereich zwischen 15-37°C, besonders bevorzugt zwischen 25-33°C, durchgeführt. Der pH-Wert liegt zwischen 4 und 8, bevorzugt zwischen 5 und 7. Der Mikroorganismus wird unter diesen Bedingungen 5-28 Tage, bevorzugt 10 Tage, kultiviert. Die Fermentation kann im Labormaßstab (Kulturvolumina zwi­ schen 100 ml und 200 ml), aber auch im Produktionsmaßstab (Volumina bis mehrere m³) durch­ geführt werden.

Vorteilhafterweise kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. zunächst werden eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium hergestellt, die dann in das eigentliche Produkti­ onsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1 : 15-1 : 20, überimpft werden.

Die Vorkultur erhält man, indem man ein versportes Myzel von z. B. Malzagar-Nährböden in ei­ ne Nährlösung überführt, beispielsweise durch Einimpfen von Myzel-bewachsenen Agarstücken, und diese 5-28 Tage, vorzugsweise 7 Tage, inkubiert.

Das Pilzmyzel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 7-28 Tage), bevorzugt 15 Tage, auf einem Nährboden, wie z. B. Malz-Agar oder Sojamehl-Glucose-Agar, wachsen läßt.

Das Peptidantibiotikum Ampullosporin ist in wechselnden Anteilen in der Kulturbrühe, sowie vorzugsweise im Myzel, enthalten.

Zum Testen der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolierungsstu­ fen können die üblichen dem Fachmann vertrauten Methoden der biologischen Aktivitätsbestim­ mung, z. B. der Agardiffisions-Lochplattentest oder die Hochleistungsflüssigkeitschromatogra­ phie, beispielsweise an Kieselgel RP₁₈ mit Acetonitril/Wasser-Mischungen als Laufmittel ver­ wendet werden.

Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann durch Ninhydrin- Reagens und durch andere Färbeagentien erfolgen.

Die Isolierung des Ampullosporins (I) aus der Kulturbrühe und dem Mycel erfolgt nach bekann­ ten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigen­ schaften der Produkte.

Zur Isolierung des Ampullosporins wird am Ende einer emersen Fermentation im Labormaßstab wasserunlösliches organisches Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäureethylester, zur Kulturlösung zugesetzt und damit die Kulturbrühe vollständig extrahiert. Zur Isolierung des Ampullosporins aus submersen Kulturansätzen wird am Ende der Fermentation Kulturmedium und Myzel ge­ trennt und das Myzel mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol oder Aceton, vorzugsweise Methanol, extrahiert.

Weitere Mengen an Ampullosporin werden durch Extraktion der vom Myzel abgetrennten Kul­ turlösung mit wasserunlöslichen organischen Lösemitteln, wie z. B. Essigsäureethylester, gewon­ nen.

Nach Einengen der Extrakte und gegebenenfalls Reextraktion des eingeengten Methanolextraktes des Myzels mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Essigsäureethylester oder Dichlormethan, erfolgt die Isolierung des Peptidantibiotikums Ampullosporin unter Einsatz üblicher chromatografischer Adsorbentien bzw. Trägermaterialien, wie z. B. Kieselgel oder orga­ nophile Dextrangele.

Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatographie an Kieselgel, der Gelpermeations- Chromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren organischen Lö­ sungsmitteln, wie z. B. Methanol, der Mitteldruckchromatographie an Kieselgel RP₁₈ unter Ver­ wendung von Acetonitril/Wasser-Gemischen sowie der Hochleistungsflüssigkeitschromatogra­ phie unter Verwendung von Methanol/Wasser- und Acetonitril/Wasser-Gemischen wird schließ­ lich reines Ampullosporin (I) erhalten.

Die chemische Identität des Peptidantibiotikums Ampullosporin (I) wird durch die Ergebnisse der hochauflösenden Massenspektrometrie (FAB-MS, Quadropol-Electrospray-MS, CID- MS/MS) sowie durch hochauflösende 600 MHz-Protonen- und 150 MHz-¹³C-NMR Korrelati­ ons-Spektroskopie, bewiesen (siehe Zuordnung des NMR-Spektrums von Ampullosporin in Ta­ belle 2).

Die antibakterielle Wirkung des Ampullosporins kann durch die dem Fachmann bekannten Me­ thoden, wie beispielsweise die Bestimmung der minimalen Hemmzonenkonzentration (MMK) im Agarplatendiffusionstest (Deutsches Arzneimittelbuch, Stuttgart, 9. Ausgabe, 1986, Deutscher Apothekerverlag Stuttgart, S. 47-48 u. S. 424-428) aufgezeigt werden.

Ampullosporin (I) ist gegen Bakterien, vorzugsweise gegen grampositive Organismen, wie z. B. Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus SG 511, aber auch gegen gramnegative, wie z. B. Escherichia coli SG 458 wirksam.

Die neuroleptische Wirkung von Ampullosporin (I) kann im speziellen Verhaltenstest im Mäu­ semodell festgestellt werden.

Ampullosporin eignet sich aufgrund seiner wertvollen antibakteriellen und antipsychotischen Ei­ genschaften sehr gut zur Anwendung als Therapeutikum, insbesondere antimikrobiell oder an­ tipsychotisch wirksames Therapeutikum.

Amnpullosporin (I) kann als solches in Substanz oder in Mischung mit geeigneten, dem Fachmann bekannten Hilfstoffen oder Trägermaterial verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral appliziert, aber auch eine rektale Anwendung ist möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungs­ formen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Ausführungsbeispiele 1. Fermentation von Sepedonium spec. DSM 10602 1a. Herstellung von Vorkulturen des Stammes Sepedonium spec. DSM 10602

Zur Gewinnung eines versporten Mysels wird Sepedonium spec. DSM 10602 15 Tage bei 25°C auf Nährboden folgender Zusammensetzung (g/l) kultiviert: Malzextrakt 40, Hefe­ extrakt 4, Agar 15, destilliertes Wasser pH 6.0 (Sterilisation 25 min bei 110°C).

1b. Herstellung einer emersen Standkultur bzw. einer Vorkultur von Sepedonium spec. DSM 10602

Dazu wird Sepedonium spec. DSM 10602 in sterilen Plastikboxen mit 400 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung (g/l): Glycerol 30, Glucose 10, Pepton 5, NaCl 2, Zeolith 10 (0,5 nm, Merck), Agar 1, pH 7.0 kultiviert. Die Beimpfung erfolgt mit 2 cm²-Arealen von Oberflächenkulturen von Sepedonium spec. DSM 10602, die auf Agarmedium entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden.

1c. Anlage von Fermenterkulturen des Stammes Sepedonium spec. DSM 10602

150 l Fer­ menter werden mit 20 l Vorkulturen angeimpft. Für die Vorkultur und die Fermenterkul­ turen wird ein Medium mit folgender Zusammensetzung verwendet (g/l): Glycerol 30; Glucose 10; Pepton 5; NaCl 2; Zeolith 10; Agar 10; destilliertes Wasser; pH 7.0 (Sterilisation 25 Min. bei 110°C).

Die Fermentation wird in 150-l-Tankfermentoren für 6-18 Tage, vorzugsweise 12 Ta­ ge, bei 28°C durchgeführt.

2. Gewinnung von Ampullosporin aus der Kulturbrühe

Die gesamte Kulturlösung gemäß Beispiel 1, bestehend aus dem Mycel und dem Medi­ um, wird im Verhältnis 2 : 1 (Kulturbrühe/Lösungsmittel) mit Ethylacetat extrahiert und der Extrakt nach Trocknen über Natriumsulfat bis zum Rückstand im Vakuum einge­ engt.

3. Chromatografische Aufreinigung des Ampullosporins (T)

Ampullosporin (I) wird aus dem eingeengten Ethylacetatextrakt von 20 l Fermentations­ brühe durch die nachfolgenden chromatografischen Aufarbeitungsschritte erhalten:

Zunächst wird der Rückstand des eingeengten Extraktes auf eine Chromatographiesäule, gefüllt mit Dextrangelen, wie z. B. Sephadex LH-20, in Methanol gegeben. Mit dem glei­ chen Lösungsmittel werden zunächst ölige Begleitkomponenten eluiert, danach eluiert man die Hauptmenge an Ampullosporin sowie nachfolgend niedermolekulare Verunrei­ nigungen. Ausbeute: 0,8 g. In einer zweiten säulenchromatographischen Reinigungsstufe erfolgt die Chromatographie an Kieselgel 60 unter Verwendung von Chloro­ form/Methanol/Triethylamin (9 : 1; 0.1; v/v) als Eluent. Ausbeute: 0,4 g. Eine weitere Anreicherung des Ampullosporins kann durch nochmalige Säulenchromatographie an organophilen Dextrangelen, wie Sephadex LH-20, in Methanol erfolgen. Das auf diese Weise erhaltene Ampullosporin kann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Reversphasen-Kieselgelen (z. B. RP₁₈) und eines binären Gradien­ ten Wasser-Acetonitril (95 : 5 zu 5 : 95, 30 min) aufgetrennt werden. Beispielsweise be­ trägt die Ausbeute der Aufarbeitung eines 20-l-Fermentationsansatzes (Umkristallisation aus Acetonitril oder Chloroform/Hexan-Mischungen) 180 mg.

4. Antipsychotische Wirkung von Ampullosporin im Maus-Modell

Die neuroleptische Wirkqualität von Ampullosporin wurde an Versuchsmäusen nach gewiesen. Nach intraperitonealer Verabreichung von 10 bis 100 mg/kg Körpermasse wurden dosisabhängige verminderte Spontanaktivität, Reflexdämpfung und Absenkung der Körpertemperatur beobachtet. Die Schreckreaktion und der Stellreflex blieb erhalten, was eine narkotische Wirkqualität ausschließt.

Tabelle 1 Physikalisch-chemische Eigenschaften des Ampullosporins

Aussehen: farblose kristalline Substanz
Schmelzpunkt: A: < 220°C (Zersetzung)
Schmelzpunkt: B: < 200°C (Zersetzung)
Massenspektrum: Quadrupol-MS: m/z 1623 [Ampullosporin+H]⁺
Bruttoformel: (berechnet aus NMR-Daten): C₇₇

H₁₂₆

N₁₉

O₁₉

Aminosäureanalyse: Aib (α-Aminoisobuttersäure), L-Trp, L-Ala, L-Leu, L-Gln, L- Leucinol
Chromatographische Eigenschaften des Ampullosporins:
Dünnschichtchromatographie an Kieselgel 60-Folien (Merck, Darmstadt, CHCl₃

/MeOH 9 : 1), R_f

-Wert 0,2, Anfärbung Ninhy­ drin-Reagens)
Retentionszeit in der analytischen Hochleistungs-Flüssigkeits­ chromatographie (Grom RP₁₈

, 4,2 mm × 25 mm; Acetonitril/Wasser 87 : 13; v/v); 1 ml/min, 210 nm: 4,8 min

Tabelle 2

NMR-Daten von Ampullosporin (I) in DMSO-d₆ (500 MHz, δ in ppm relativ zum internen TMS-Standard)
Abkürzungen: s: Singulett, d: Dublett, t: Triplett, q: Quartett, br: breit, in: Mul­ tiplett

Claims (6)

1. Verbindung der Formel I (Ampullosporin)

2. Arzneimittel, enthaltend Ampullosporin nach Anspruch 1.

3. Verfahren zur Herstellung von Ampullosporin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Sepedonium spec. DSM 10602 in einem Nährmedium kultiviert und Ampullosporin aus der Kulturbrü­ he isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Varianten oder Mutanten des Stam­ mes Sepedonium spec. DSM 10602 verwendet.

5. Verwendung von Ampullosporin gemäß Anspruch 1 als pharmakologisch wirksamer Stoff.

6. Verwendung von Ampullosporin nach Anspruch 5 als neuroleptischer Wirkstoff.