DE10028376A1

DE10028376A1 - Epididymis-spezifische Proteine mit Fibronektin Typ II-Modulen

Info

Publication number: DE10028376A1
Application number: DE10028376A
Authority: DE
Inventors: Christiane Kirchhoff; Richard Ivell
Original assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Current assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Priority date: 2000-06-08
Filing date: 2000-06-08
Publication date: 2002-03-28
Also published as: CA2411017A1; EP1290015A2; WO2001094387A2; WO2001094387A3; AU2001277505A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neue, Epididymis-spezifische Proteine mit Fibronektin Typ II-Modulen und Derivate und Fragmente derselben, für diese kodierende DNA-Sequenzen und deren Verwendung zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung der männlichen Infertilität sowie zur Kontrazeption.

Description

Die Erfindung betrifft neue, Epididymis-spezifische Proteine mit Fibronektin Typ II-Modulen sowie Derivate und Fragmente dersel ben, für diese kodierende DNA-Sequenzen und deren Verwendung zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung der männlichen Infertilität sowie zur Kontrazep tion.

Die Epididymis (Nebenhoden) nimmt bei der Reifung der Spermien eine Schlüsselrolle ein. Sie besteht beim Menschen aus einem einzigen etwa 5 m langen Kanal, der sehr stark meanderartig aufgewunden ist. Die im Hoden (Testis) gebildeten, funktionell noch unreifen Spermien werden zur Epididymis transportiert und während einer 2 bis 3 Tage dauernden Passage einem Reifungs prozess unterzogen, in dessen Verlauf sie unter anderem ihre gerichtete Beweglichkeit, ihre Fähigkeit zur Kapazitation und zur Akrosomen-Reaktion erlangen.

In der Epididymis befinden sich die Spermien in der epididymalen Flüssigkeit, die auch epididymales Plasma genannt wird. Dieses Plasma ist ein Sekretprodukt des Hodens, des Rete testis und der Epididymis selbst. Die Flüssigkeit des Ejakulats, das sogenannte Seminalplasma, enthält außerdem Sekretprodukte der akzessorischen Drüsen. Sowohl das epididymale Plasma als auch das seminale Plasma sind ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülen wie Proteinen, Salzen und Wasser, das als Medium für den Transport und den Erhalt der Spermien dient. Es wird angenommen, dass die einzelnen Bestandteile des seminalen Plasmas unter schiedliche Funktionen für die Fertilität des Ejakulats haben.

Das Verständnis der Funktionen der einzelnen Bestandteile des epididymalen sowie des seminalen Plasmas ist eine entscheidende Voraussetzung dafür, in den Reifungsprozess der Spermien in der Epididymis eingreifen zu können. Ein solcher Eingriff kann beispielsweise zur Behebung männlicher Infertilität sowie zur Kontrazeption erforderlich sein. Bislang sind allerdings der post-testikuläre Reifungsprozess sowie das Wechselspiel zwischen den einzelnen Komponenten des epididymalen/seminalen Plasmas und Molekülen auf der Spermienoberfläche nur unzureichend erforscht. In der Vergangenheit konnten einige Proteine identifiziert werden, die Bestandteil der humanen epididymalen Flüssigkeit und des seminalen Plasmas sind. Dazu zählen unter anderem die epididymis-spezifischen Proteine HE1 bis HE5 (Kirchhoff, C. (1998)).

Die meisten Studien im Nebenhoden wurden allerdings anhand von Tiermodellen durchgeführt. Fast alle Kenntnisse stammen aus Arbeiten an Ratten, Mäusen, Hamstern, Ebern, Stieren oder gelegentlich Affen, wobei die artspezifischen Unterschiede groß sind. Im seminalen Plasma des Rindes konnte eine Familie nahe verwandter Proteine mit zwei Fibronektin Typ II-Domänen identifi ziert werden, die als BSP-Proteinfamilie bezeichnet wird (Desnoyers und Manjunath, 1992; Müller et al., 1998). BSP- Proteine weisen multiple Bindungseigenschaften auf, unter anderem binden sie an Heparin, ein Glucosaminoglycan, das bei der Kapazitation von Spermien eine wichtige Rolle spielt (Parrish et al., 1988, Chandonnet et ah, 1990), sowie an Apolipo-Protein A-I in freier Form oder assoziiert mit HDL (Manjunath et al., 1989; Chandonnet et al., 1990). Es wird daher angenommen, dass BSP- Proteine die Kapazitation von Spermien beschleunigen, die durch Heparin und HDL induziert wird, und dass sie den Cholesterin- Efflux aus epididymalen Spermien induzieren (Therien et al., 1998).

Bisher war es nicht möglich, auch im Menschen ähnliche Proteine zu identifizieren, die mit den BSP-Proteinen verwandt sind. Allgemein lassen sich in Tierversuchen gewonnenen Erkenntnisse aufgrund der hohen Gewebe- und Speziesspezifität der Proteine des epididymalen/seminalen Plasmas schlecht auf den Menschen übertragen (Töpfer-Petersen et al., 1995). Dies führt dazu, dass eine gezielte Beeinflussung des Befruchtungsvorgangs aufgrund der mangelhaften Kenntnis der beteiligten Faktoren heutzutage nur in Ausnahmefällen möglich ist.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel bereitzu stellen, mit denen im Menschen oder in verwandten Säugertieren der Epididymisstoffwechsel gezielt beeinflußt werden kann.

Gemäß eines Apektes der Erfindung wird die Aufgabe durch ein epididymis-spezifisches Protein gelöst, dass dadurch gekenn zeichnet ist, dass es die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.

Gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung wird die Aufgabe ferner durch ein Protein gelöst, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Derivat oder Homologes des oben genannten erfindungs gemäßen Proteins ist, wobei das Protein

a) die gleiche Epididymis-Spezifität und Antigenizität aufweist und
b) im Vergleich zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Amino säuresequenz eine Homologie von mindestens 55% auf weist.

Die Kenntnis dieser neuen Proteine ermöglicht die Herstellung reversibler männlicher Kontrazeptiva, die post-testikulär, d. h. nicht im Hoden wirken und nicht in den Hormonhaushalt eingreifen. Solche Kontrazeptiva sind im Stand der Technik nicht bekannt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich überraschender weise gezeigt, dass zumindest im Menschen, Hund und Pferd eine Familie von mit BSP-Proteinen verwandten Proteinen existiert, die zu den BSP-Proteinen nicht homolog sind. Daher war es in der Vergangenheit auch nicht möglich, mittels Standardmethoden diese neue, erfindungsgemäße Proteinfamilie aufzufinden. Diese Familie zeichnet sich in der Regel durch vier Fibronektin Typ II-Module aus, obwohl mittels der RT-PCR auch einzelne Mitglieder identifi ziert werden konnten, welche drei oder ein Fibronektin Typ II (Fn2)-Modul aufweisen. Bislang waren nur Seminalplasma-Proteine mit zwei Fn2-Modulen bekannt.

Erfindungsgemäß werden mit dem Ausdruck "Fibronektin Typ II- Module" Kollagenbindungsstellen in Proteinen bezeichnet, die unter anderem auch in Fibronektin auftreten (Banyai et al., 1985; Constantine et al., 1992). Dabei sind erfindungsgemäß alle Abweichungen (Deletionen, Insertionen, Austausche etc.) in der Aminosäuresequenz eingeschlossen, soweit die Konsensussequenz erhalten bleibt.

Die Konsensussequenz des Fibronectin Typ II-Moduls umfaßt die folgende Sequenz (50%-Konsensus): uss - GssCsFPFpYcG + pYccCTs - GRscshhWCoTTssYDcDc + WGFC.

Die Großbuchstaben stellen Aminosäuren im Ein-Buchstaben-Code dar, die Bedeutung der übrigen Zeichen ergibt sich aus Tabelle 1.

Tabelle 1

Die Fn2-Module der erfindungsgemäßen Proteine sind ähnlich, aber nicht homolog zu bekannten Fn2-Modulen von bislang bekannten seminalen Plasmaproteinen von Huftieren (siehe Fig. 2b). Die erfindungsgemäßen Proteine sind Epididymis-spezifisch (siehe Fig. 3), d. h. sie werden primär in der Epididymis exprimiert.

Unter Derivaten werden im Sinne dieser Erfindung alle natürlich vorkommenden allelischen Varianten der erfindungsgemäßen Proteine verstanden, wobei sich die verschiedenen allelischen Formen jeweils voneinander hinsichtlich der Sequenzlänge als auch in Bezug auf Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Austauschen oder Additionen von Aminosäuren unterscheiden können. Ins besondere sind dabei alle natürlich vorkommenden Variationen der erfindungsgemäßen Proteine eingeschlossen, bei denen Unterschiede am N-Terminus vorliegen. Bevorzugt umfassen die Derivate die in SEQ ID NO: dargestellten Aminosäuresequenzen am N-Terminus.

Unter Homologen im Sinne dieser Erfindung werden Proteine verstanden, die aus anderen Spezies als dem Menschen stammen.

Der Begriff "Proteine oder Polypeptide mit gleicher Antigenizi tät" bezeichnet erfindungsgemäß Moleküle, die mit den gleichen Antikörpern reagieren.

Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Derivate im Vergleich zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 65%, besonders bevorzugt von mindestens 75% und ganz besonders bevorzugt von mindestens 80% auf.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die erfindungsgemäßen Derivate oder Homologe die gleiche biologische Wirksamkeit wie das Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz auf.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammen die erfindungsgemäßen Homologe aus einer Spezies ausgewählt aus Mensch, Primaten, Hund, Pferd, Rind, Schwein.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Homologen eine der in SEQ ID NO: 4, 33 und 34 dargestellten Sequenzen.

Die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz stellt die Aminosäuresequenz des menschlichen HE12 dar, während die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenzen die Aminosäuresequenz CE12a aus dem Hund zeigen. Die in SEQ ID NO: 33 und 34 darge stellte Aminosäuresequenzen sind ein Ausschnitt der Aminosäure sequenz CE12b (SEQ ID NO: 33) und CE12c (SEQ ID NO: 34) aus dem Hund.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Derivate der erfin dungsgemäßen Proteine, die mindestens ein Fibronektin Typ II- Modul umfassen. Vorzugsweise umfassen die Derivate vier Fibronek tin Typ II-Module. Im Stand der Technik sind bislang keine Proteine bekannt gwesen, die vier Fibronektin-Typ II Module aufweisen. Eine erhöhte Anzahl an Fibronektin-Typ II Modulen führt voraussichtlich zu einer verstarkten Bindung an die Bindungspartner (s. o.).

Gegenstand der Erfindung sind ferner Fragmente der erfindungs gemäßen Proteine und Derivate, welche die gleiche biologische Wirksamkeit und/oder Antigenizität wie die erfindungsgemäßen Proteine oder Derivate selbst aufweisen.

Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Proteine, Derivate oder Fragmente kodieren. Diese erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind insbesondere ausge wählt aus

a) der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, 5 und 12 angegebenen Nukleotidsequenzen,
b) zu den vorgenannten Sequenzen homologe Sequenzen mit einem Homologiegrad von mindestens 55%, vorzugsweise 65%, ganz besonders bevorzugt 80%, und
c) syngenen oder komplementären Sequenzen der Sequenzen gemäß a) und b), oder Fragmente derselben, soweit die Fragmente für Proteine oder Polypeptide mit der gleichen biologischen Wirksamkeit und/oder Antigenizität kodieren.

Die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz ist die HE12 Sequenz aus dem Menschen, die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Nukleinsäuresequenz ist die CE12a Sequenz aus dem Hund, die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Nukleinsäuresequenz ist die CE12b Sequenz aus dem Hund, wärend die in SEQ ID NO: 12 dargestellte Nukleinsäuresequenz einen Ausschnitt der kodierenden Sequenz für das Homologe im Pferd darstellt.

Erfindungsgemäß umfasst der Begriff "syngene Sequenz" alle Sequenzen, die sich von dem gleichen oder homologen Gen ableiten und für die erfindungsgemäßen Proteine, Derivate und Fragmente kodieren bzw. zur Herstellung von Sonden verwendbar sind. Der Begriff umfasst insbesondere auch Sequenzen, die Abweichungen aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes aufweisen. Insbesondere umfaßt der Begriff "syngene Sequenz" auch derartige Sequenzen, bei denen zwar der kodierende Bereich ganz oder teilweise mit den kodierenden Bereichen der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 12 dargestellten Sequenzen übereinstimmt, bei denen jedoch die 5'- und 3'-untranslatierten Bereiche unterschiedlich sind. Ferner umfaßt der Begriff "syngene Sequenz" auch diejenigen Nukleotidsequenzen, bei denen der für das reife Protein kodieren de Bereich ganz oder teilweise mit den kodierenden Bereichen der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 12 gezeigten Sequenzen übereinstimmt, bei denen jedoch die für die Signalsequenzen kodierenden Bereiche unterschiedlich sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungs gemäßen Nukleinsäuren eine der in SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 und 11 dargestellten Nukleotidsequenzen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung auch Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die mindestens eine Länge von 40 Nukleinsäuren, vorzugsweise von 100 Nukleinsäuren, aufweisen und die insbesondere als Sonden geeignet sind.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind erhältlich, indem Genbanken aus Epididymisgewebe mit Sonden durchsucht werden, die Fragmente der in SEQ ID NO: 1, 3 und 5 sind. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al., 1989). Die Bestimmung des Homologiegrades ist dem Fachmann ebenfalls bekannt (Altschul, et al., 1997).

Gegenstand der Erfindung sind ferner Mikroorganismen, die die Hinterlegungsnummer DSM 13473 oder DSM 13474 haben. Diese Mikroorganismen wurden bei der deutschen Sammlung von Mikroorga nismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt. Der Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer DSM 13474 enthält ein Plasmid mit einer DNA-Sequenz mit den Nukleoti den 156-827 aus SEQ ID NO: 1 und damit den vollständigen offenen Leserahmen der menschlichen HE12-DNA. Der Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer DSM 13473 enthält ein Plasmid mit einer DNA- Sequenz mit den Nukleotiden 162-917 und damit den vollständigen Leserahmen für das reife CE12-Protein sowie für einen Teil der Signalsequenz.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Vektormolekül, das eine oder mehrere der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthält. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Vektormolekül die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in solcher Weise insertiert, dass deren Expression in geeigneten Wirts organismen erfolgen kann.

Vektoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aufzunehmen, schließen insbesondere alle zur Transformation von Bakterien, Hefen, Insekten- und Säugerzellen geeigneten Plasmid- und viralen Vektoren ein.

Gegenstand der Erfindung sind ferner alle prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformiert sind. Geeignete Wirtszellen sind bei spielsweise E. coli, Piscia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Sf9, Säugerzellinien, Primärzellkulturen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine, Derivate oder Fragmente, bei dem man die erfindungsgemäßen Wirtszellen unter Bedingungen kulti viert, welche die Expression der DNA-Sequenz erlauben, und man das Expressionsprodukt aus dem Kulturansatz gewinnt. Die zu wählenden Bedingungen hängen von den jeweils verwendeten Vektoren und Wirtszellen ab und sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al.).

Ferner können die erfindungsgemäßen Proteine, Derivate, Fragmente oder DNA-Sequenzen nach bekannten Verfahren chemisch syntheti siert werden.

Die Erfindung betrifft ferner Antikörper, die in der Lage sind, mit den erfindungsgemäßen Proteinen, Derivaten, Homologen oder Fragmenten eine Immunreaktion einzugehen. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen sind diese Antikörper polyklonale oder monoklonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können mit Hilfe der erfindungsgemäßen hochreinen Proteine auf dem Fachmann bekannte Weise hergestellt werden. Derartige Antikörper lassen sich auf Basis der vollständigen Proteine sowie auf Basis von Fragmenten und aktiven Derivaten derselben herstellen, soweit diese die gleiche Antigenizität besitzen (vgl. Beispiel 5).

Die Antikörper können markiert sein und dem Nachweis der erfin dungsgemäßen Proteine, Derivate, Homologe und Fragmente in vitro oder in vivo dienen.

Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Zusammen setzungen, welche die erfindungsgemäßen Proteine, Derivate, Homolgen, Fragmente, DNA-Sequenzen oder Antikörper als aktiven Wirkstoff enthalten. Neben dem aktiven Wirkstoff enthalten derartige pharmazeutische Zusammensetzungen in der Regel physiologisch verträgliche Trägerstoffe, die dem Fachmann bekannt sind.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfin dungsgemäßen Proteine, Derivate, Homologen, Fragmente, DNA- Sequenzen, und Antikörper zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Diagnose männlicher Fortpflanzungsstörun gen, zur Therapie männlicher Fortpflanzungsstörungen, ins besondere Infertilität, und zur Herstellung eines Medikamentes zur Kontrazeption.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungs gemäßen komplementären DNA-Sequenzen als Anti-Sense-DNA-Moleküle zur Herstellung der oben genannten pharmazeutischen Zusammen setzungen verwendet, wobei die Anti-Sense-Moleküle geeignet sind, die Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in vivo zu unterdrücken.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammen setzungen zur Modulation der Heparin- und Apolipo-Protein A-I Bindungen in der Epididymis verwendet. Besonders bevorzugt werden sie zur Modulation der Kapazitation von Spermien verwendet.

Mit der vorliegenden Erfindung wird somit eine neue Familie von Epididymis-spezifischen Proteinen zur Verfügung gestellt, die sich durch das Vorliegen von Heparin-Bindungsstellen auszeichnen. Die erfindungsgemäßen Proteine, DNA-Sequenzen und Antikörper können als reversibles männliches Kontrazeptivum eingesetzt werden, das post-testikulär wirkt und nicht in den Hormonhaushalt eingreift. Ein solches Kontrazeptivum ist im Stand der Technik nicht bekannt.

Die Erfindung wird im folgenden durch Figuren und Beispiele weiter erläutert.

Beispiele Beispiel 1 Klonierung neuer Epididymis-spezifischer cDNAs

Eine Hund-Epididymis-cDNA-Bibliothek (Ellerbrock et al., 1994) wurde unter Verwendung der in Kirchhoff et al. (1990) beschriebe nen Subtraktions-Hybridisierungsstrategie durchsucht. Etwa 10 000 unabhängige cDNA-Klone wurden in geringer Dichte ausplattiert (ca. 500 pfu (plaque forming units) pro Platte) und mittels eines mehrstufigen Verfahrens durchsucht. Dabei wurden als Sonden ³²P- markierte Einzelstrang-cDNA-Pools aus Hund-Epididymis verwendet. Als negative Kontrollen dienten ³²P-markierte Einzelstrang-cDNA- Pools aus Leber, Testis und Lunge des Hundes. Epididymis-spezifi sche Plaques wurden durch sukzessives Verdünnen gereinigt, und die eingebaute cDNA wurde durch in vivo-Exzision, wie kürzlich beschrieben, gewonnen (Ellerbrock et al., 1994). Die erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNAs wurden amplifiziert und gereinigt, und die cDNA-Klone wurden mittels Standardverfahren (Sambrook et al., 1989) sequenziert. Dieses Verfahren führte zur Identifizierung einer neuen cDNA-Klonfamilie im Hund, die CE12 genannt wurde. Zwei Varianten mit Unterschieden im offenen Leseraster, CE12a und CE12b (SEQ ID NO: ?) (Fig. 1a bis c) konnten gefunden werden. Beide enthielten vier als Tandem angeordnete Fibronektin Typ II (Fn2)-Module. Diese Module waren ähnlich, aber nicht homolog gegenüber bekannten Fn2-Modulen anderer seminaler Plasmaproteine (Fig. 2b).

Ein in etwa 400 bp cDNA-Fragment, das CE12a und b gemeinsam war, wurde verwendet, um eine humane Epididymis-cDNA-Bibliothek (Kirchhoff et al., 1993) zu durchsuchen. Dasselbe Vorgehen wäre mit einem 750 bp PCR-Produkt möglich, das mit den folgenden Primern gewonnen werden kann: 5'GATCTGTTTACTTCATCTTG3'(SEQ ID NO: 19) und 5'CCTTTATTGGTGGTTATGCC3' (SEQ ID NO: 20). Dies geschah mit dem Fachmann bekannten Verfahren (Sambrook et al., 1989). Eine Anzahl kreuzhybridisierender Klone (0,03% der Bibliothek) wurde isoliert, die längsten cDNA-Inserts wurden in beide Richtungen sequenziert und die Sequenzen wurden verglichen. Die erhaltene HE12-cDNA-Sequenz war beinahe 80% identisch zu der CE12b-cDNA.

Da weder die CE12- noch die HE12-cDNAs am 5'-Ende vollständig waren, wurde eine inverse PCR-Technik durchgeführt, um die noch fehlende Sequenzinformation zu erhalten. Dazu wurde eine modifi zierte Technik angewendet, die kürzlich durch Gebhardt et al. (1999) beschrieben worden war. Humane und Hund-Epididymis-cDNAs, die aus Epididymis-RNA-Extrakten anderer Individuen hergestellt worden waren, wurden dabei verwendet. Antisense-Primer, deren Sequenz sich in den bekannten Sequenzen der partiellen cDNA-Klone befand, wurde für die Reverse Transkription verwendet (CE12-cDNA- Synthese-Primer: 5'GTTGTTTTCATCCTCCATGC3'(SEQ ID NO: 13); HE12- cDNA-Synthese-Primer 5'TCCATGCAATCAGAGACCAC3'(SEQ ID NO: 14)).

5 µg Gesamt-Epididymis-RNA wurden eingesetzt. Als Enzym wurde Superscript™ Reverse Transkriptase (Gibco-BRL, Karlsruhe, Deutschland) verwendet. Die Synthese des zweiten Stranges wurde mit E. coli-DNA-Polymerase nach Einbau von Strangbrüchen mit RNase H durchgeführt (beide Enzyme von Stratagene, Heidelberg, Deutschland). Glatte Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase (Biolabs, Schwalbach/Taunus, Deutschland) hergestellt und mittels T4-DNA- Ligase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) ligiert, um die DNA zu konkatemerisieren und/oder zirkularisieren. Die inverse PCR wurde unter Verwendung der folgenden Sense-Primer (CE12: 5'GTGAAACCAATGAGTATGG3' (SEQ ID NO: 15); HE12: 5'GTGGTGCTCAGT CACCTCTG3' (SEQ ID NO: 16)) und der entsprechenden Antisense- Primer (CE12: 5'GGTAATCGTCTGCCATGC3' (SEQ ID NO: 17); HE12: 5'CGTGGGTAATCTTCACTCTG3' (SEQ ID NO: 18)) durchgeführt.

Auf diese Weise wurden sechs unabhängige CE12 und vier unabhängi ge HE12 kodierende PCR-Produkte subkloniert und sequenziert. Alle HE12-PCR-Produkte waren im Wesentlichen co-linear und endeten beinahe an derselben 5'-Stelle. Ein Zusammensetzen der Sequenzen der aus der Bibliothek erhaltenen HE12-cDNA-Sequenzen und derje nigen der PCR-Fragmente ergab HE12-cDNA-Klon, der 1025 Nukleotide lang war.

Der HE 12 Klon weist einen offenen Leserahmen (ORF) von 223 Kodons mit einem ATG-Startkodon bei Nukleotiden 156-158 und einem TGA-Stopkodon bei Nukleotiden 825-827 (Fig. 2a) auf. Auf den ORF folgt eine 198 Nukleotid lange 3' untranslatierte Region, die ein AATAAA-Polyadenylierungssignal bei den Nukleotiden 1010-1015 enthält. Der ORF ergibt ein neues humanes epididymales Protein. Dieses umfasst ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäure 1-123), das für sekretorische Proteine typisch ist, und das sofort von vier im Tandem angeordneten Fn2-Motiven gefolgt wird (Fig. 2b).

Im Gegensatz dazu ergaben sich verschiedene CE12 RT-PCR-Fragmen te, die aus einem mRNA-Längenpolymorphismus resultierten. Diese Fragmente wiesen unterschiedliche 5'-UTRs und extensive Deletio nen oder Insertionen auch innerhalb ihrer ORFs auf, was zu mindestens zwei verschiedenen CE12-Proteinenführt (Fig. 1b, c). Ein Zusammenbau der erhaltenen Sequenzen ergab einen CE12a-cDNA- Klon mit 1343 Nukleotiden (Fig. 1a). Der ORF in dieser langen cDNA-Variante beginnt bei Nukleotid 129 und enthält zwei Methionine im Leserahmen bei Positionen -39 und -23, wobei das zweite der Position des Startmethionins der HE12-cDNA-Sequenz in Fig. 2a homolog ist. Nur wenn dieses Methionin als Startkodon angenommen wird, kann eine klare Signalpeptidsequenz aus der Sequenz herausgelesen werden. Außerdem wurden CE12-cDNA-Klone erhalten, die unterschiedliche 5'-UTRs aufweisen, in denen es nur ein, nämlich das zweite ATG-Startkodon gab. Daher wird angenom men, dass diese jeweiligen CE12-Sequenzen unterschiedliche Promotoren aufweisen.

Ein weiterer Polymorphismus bei den CE12-Klonen wurde unmittelbar nach der angenommenen Signalpeptidsequenz aufgefunden, was wahrscheinlich zu unterschiedlichen N-Termini bei den CE12-Klonen führte. Die CE12a- und b-Klone unterscheiden sich durch 22 Kodons die entweder in den cDNAs vorhanden oder abwesend sind und für die es kein Gegenstück in der HE12-cDNA-Sequenz gibt (Fig. 2). Die zwei Varianten an CE12-cDNAs kommen mit einer Frequenz von 1 : 3 vor. Der N-Terminus, wie er für CE12a abgeleitet wurde, enthält eine Konsensus-Sequenz für eine N-Glykosylierungsstelle bei Asparagin +4 (Asn +4), diese Stelle fehlt in CE12b (Fig. 1c). Die Aminosäuren, die sich aus dem unmittelbar folgenden Kodon ergeben, können entweder D oder N sein (Fig. 1c). Das Auftreten von kleineren, etwa 1 kb CE12-mRNAs im Northernblot (siehe unten) macht es möglich, dass es zusätzliche Längen Polymorphismen auch im 3' untranslatierten Bereich gibt, was allerdings durch die gefundenen cDNA-Klone nicht bestätigt wurde. Allerdings erscheint der 3'-UTR der CE12-mRNA deutlich länger als derjenigen der HE12-mRNA und enthält zwei mögliche Polyaden ylierungssignale, von denen nur das erste zu dem humanen Gegen stück homolog ist. Auf der anderen Seite waren die Sequenzen, die für die Fn2-Motive kodieren, in allen CE12-cDNA-Varianten iden tisch und auch zu entsprechenden Regionen der HE12-cDNA hoch homolog (etwa 85% Sequenzidentität) (Fig. 2b). Ein Vergleich der vorhergesagten CE12- und HE12-Proteinsequenzen mit denjenigen der BSP-A1/PDC-109 und BSP-A3 seminalen Plasmaproteine (Zugangs nummern P02784 und P04557) ergab eine Sequenzidentität von unter 55%. Dies schließt auch jegliche Kreuzhybridisierung mit den BSPs auf Nukleinsäureebene unter den in dieser Studie verwendeten Stringenzbedingungen aus.

Beispiel 2 Analyse der Struktur der epididymischen Fibronektin Typ II-Domänenproteine auf cDNA-Ebene

Da Proteine, die vier in einem Tandem angeordnete Fn2-Motive enthalten, bislang unbekannt waren, wurden PCR-Analysen durch geführt, um die Möglichkeit auszuschließen, dass Klonierungsartefakte während der Herstellung der Bibliotheken auftraten. Oligonukleotidprimerpaare wurden in der RT-PCR-Analyse verwendet. Die RT-PCR wurde gemäß Standardmethoden durchgeführt. Die folgen den Primerpaare wurden für die Amplifizierung von CE12-, HE12- und EQ12-cDNA-Fragmenten aus 1 µg fötaler epididymaler RNA verwendet:
CE12: 750 bp Produkt; verwendete Primer 5'GATCTGTTTACTTCATCTTG3' (SEQ ID NO: 19) und 5'CCTTTATTGGTGGTTATGCC3' (SEQ ID NO: 20);
HE12: 837 bp Produkt; verwendete Primer 5' CAACCTTCCTTCTCTATTCC3' (SEQ ID NO: 21) und 5'TCAAGACTCCTTTATTGGTG3' (SEQ ID NO: 22);
EQ12: 752 bp Produkt; verwendete Primer 5'GGGTCTTCTTACTTCTCTTG3' (SEQ ID NO: 23) und 5'TCCTTTATTGGTGGTTATGCAC3' (SEQ ID NO: 24).

Jedes der Produkte enthielt diejenigen cDNA-Regionen, die für vier Fn2-Motive kodieren. Wie dargestellt, wurden epididymische cDNAs vom Menschen und Hund für die PCR-Amplifikation verwendet. Als zusätzliche Kontrolle, um jegliche Kontamination von cDNA- Proben auszuschließen, wurde ein entsprechendes Primerset auch bei der epididymalen Pferde-cDNA-Präparation verwendet. In jedem Fall wurde eine amplifizierte Sequenz von etwa 800 bp erhalten. Subklonieren und Sequenzieren bestätigte das Vorkommen von epididymalen mRNAs, die für vier hochkonservierte, im Tandem angeordnete Fn2-Motive kodieren. Solche Proteine traten nicht nur bei Menschen und beim Hund, sondern auch im Pferd auf (siehe Fig. 2c). Während der RT-PCR-Analysen der humanen epididymalen cDNA wurden auch kürzere PCR-Fragmente beobachtet, aber in wesentlich geringeren Mengen. Subklonieren und Sequenzieren dieser Fragmente ergab, dass sie von Varianten abstammten, die weniger als vier Fn2-Motive enthielten. Diese Varianten enthalten höchstwahrscheinlich drei oder ein Fn2-Modul, wobei die Variante mit nur einem Fn2-Modul in wesentlich geringeren Mengen vorkommt. Entsprechende Produkte im Hund und im Pferd konnten nicht gefun den werden.

Beispiel 3 Untersuchung der Gewebeverteilung von CE12- und HE12-mRNAs durch Northern Blot-Analyse

Northern Blot-Analysen wurden mit Gesamt-RNA-Extrakten von ver schiedenen Hund- und menschlichen Geweben durchgeführt, um die Verteilung der CE12- und HE12-mRNAs zu untersuchen (Fig. 3 und 4). RNA von verschiedenen Geweben wurde in 15 bis 20 Volumen einer chaotropen Lösung wie in Pera et al. (1996) beschrieben extrahiert. 5 bis 10 µg der Gesamt-RNA/Spalte, abhängig vom Experiment-Typ, wurden mittels denaturierender Agarose-Gelelek trophorese aufgetrennt und auf Amersham-Buchler, Braunschweig, Deutschland) Nylonmembranen transferiert. Gleiche Mengen an RNA wurden durch Ethidiumbromidanfärben vor dem Transfer sicherge stellt. Digoxigenin (DIG)-markierte cDNA-Proben wurden durch PCR- Amplifikation von gereinigten Fragmenten entsprechend den Anwei sungen des Herstellers (Boehringer, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt:
CE12, 404 bp Produkt; verwendte Primer 5'CTCTCCTTGGTGTGCAACC3' (SEQ ID NO: 25) und 5'AAGTGGCAGGGAAAGCCAG3' (SEQ ID NO: 26);
HE12, 400 bp Produkt; verwendete Primer 5'CAACCTTCCTTCTCTATTCC3' (SEQ ID NO: 27) und 5'TCCATGCAATCAGAGACCAC3' (SEQ ID NO: 28);
CE1, 730 bp Produkt; verwendete Primer 5'AAGCAGCAGAGCTGGAG3' (SEQ ID NO: 29) und 5'AATGTCACCTTCACCAG3' (SEQ ID NO: 30);
CE4, 370 bp Produkt; verwendete Primer 5'ACGCAGGAGTGCGTCTCGGA3' (SEQ ID NO: 31) und 5'AGCGGTCACTTTATTGGTTG3' (SEQ ID NO: 32).

Die PCR-Reaktionen wurden wie beschrieben durchgeführt (Pera et al. 1996). Die Hybridisierung mit den nichtradioaktiven Proben wurde unter Verwendung des DIG Labbeling-Kit (Boehringer, Mann heim) wie kürzlich beschrieben durchgeführt (Pera et al., 1996).

Es ergab sich, dass in beiden Arten (Mensch und Hund) die mRNAs nur in der Epididymis, aber nicht in den anderen untersuchten Geweben vorhanden waren, wobei die untersuchten Gewebe Testis, seminale Vesikel und Prostata einschlossen (Fig. 3 und 4). Eine einzige hybridisierende Bande von etwa 1,1 kb wurde in humanen epididymischen Extrakten gefunden, während mindestens zwei oder mehrere hybridisierende Banden in Hund-epididymaler RNA-Präparationen vorhanden waren. Die Banden bei der Hunde-mRNA traten in einen breiten Bereich von etwa 1,0 bis 1,5 kb auf, was die Annahme unterstützt, dass beim Hund ein Längenpolymorphismus bei der CE12-mRNA auftritt.

Das Expressionsmuster der humanen und Hund-mRNAs wurde entlang der Länge der Epididymis untersucht. HE12-mRNA wurde in allen Regionen der humanen Epididymis gefunden, obwohl ein höherer Gehalt in den proximaleren Teilen des Organs gefunden wurde (Fig. 4). In der Hunde-Epididymis diente CE4-mRNA, von der bekannt ist, dass sie in allen Regionen des Organs vorhanden sind (Beiglböck et al., 1998; Gebhardt et al., 1999) als interne Kontrolle (Fig. 3). Die Regionalisierung der CE12-Expression war deutlicher im Hund als im Menschen, und alle CE12-hybridisieren den mRNAs zeigten dasselbe Muster mit einer maximalen Expression in der Corpus-Region. Unter unilateral-kryptorchiden Bedingungen, bei denen ein Testis plus Epididymis im Abdomen verbleibt, wurden normale Mengen und Expressionsmuster der mRNA in der skrotalen Epididymis beobachtet, die als Kontrolle diente. Eine Reduktion der CE12-mRNA-Mengen wurde in den abdominalen Organen gefunden. Wenn man die verschiedenen Regionen der Hunde-Epididymis betrach tet, war die Reduktion am deutlichsten in der Caput-Region während die CE12-mRNA-Mengen im Korpus nicht betroffen schienen (Fig. 3).

Eine Hybridisierung unter geringen Stringenzbedingungen unter Verwendung heterologer DIG-markierter CE12-cDNA als Probe zeigte, das kreuzhybridisierende mRNAs in den Epididymis anderer Säuger arten einschließlich Mensch, Rind, Pferd, Schwein und Affe (Macaca mullata) (Fig. 5a, b) vorhanden sind. Obwohl nicht im Detail untersucht, wurden die größten Mengen im Schweine-Neben hoden in der Caput-Region gefunden, was eine Ausnahme im Ver gleich zu den anderen Säugern darstellt. Keine Kreuzhybridi sierung mit entweder CE12- oder HE12-cDNA-Proben wurde mit RNA- Extrakten aus Nagern, Kaninchen und Meerschweinchen-Epididymiden gefunden.

Beispiel 4 Lokalisierung von CE12-mRNAs durch in situ-Hybridisierung

Die Epididymis von zwei Hunden mittlerer Größe wurden in Bouin- Lösung 6 Stunden lang inkubiert, in 70% Ethanol gewaschen und in Paraffinwachs eingebettet. 5 bis 7-µm-Sektionen wurden herge stellt und einer nichtradioaktiven Hybridisierungsprozedur wie beschrieben (Beiglböck et al., 1998; Gebhardt et al., 1999) unterworfen, unter Verwendung von in vitro markierten Sense und Antisense cRNA-Proben von subklonierten AccI/XbaI-verdauten CE12- cDNA-Fragmenten, die 404 bp des offenen Leserahmens umfassten (Nukleotide 295-669, vgl. Fig. 1). Die Markierung wurde in Gegenwart von Digoxigenin-UTP (Boehringer-Mannheim) durchgeführt. Die Detektion wurde wie vom Hersteller vorgeschlagen durchge führt. Alternative Methoden sind dem Fachmann bekannt (Kirchhoff et al. 1991; Pera et al. 1994; ansonsten: siehe oben). Negative Kontrollen wurden parallel an benachbarten Schnitten durchge führt, unter Verwendung der entsprechenden Digoxigenin-markierten Sense-Strang-cRNAs. Die Schnitte wurden mittels Lichtmikroskopie analysiert.

CE12-Transkripte wurden in Gewebsschnitten der Hund-Epididymis lokalisiert (siehe Fig. 6a und b). Die in situ-Hybridisierung zeigte eine starke und hochspezifische Markierung des Epithels des epididymalen Kanals, während das Lumen des Kanals, das die Spermatozon enthält, und das Gewebe zwischen dem Kanal kein Signal zeigten. Innerhalb des Epitheliums war das Signal im basalen Gebiet am stärksten. In guter Übereinstimmung mit den Northernblot-Resultaten wurde die maximale Färbung im distalen Caput und im Corpus gefunden, während der proximale Caput unmar kiert erschien und die distalen Teile des Organs nur schwach markiert waren (Fig. 7a-d).

Beispiel 5 Herstellung von Antikörpern

Ein 20 mer Oligopeptid (NH₂-SSFDENQQWKYCETNEYGGN-COOH) das von der CE12a-DNA-Sequenz abgeleitet worden war (Aminosäuren 103-122, vgl. Fig. 1) wurde als Immunogen ausgewählt. Die Herstellung der Antikörper erfolgte wie kürzlich beschrieben (Kirchhoff et al. 1996). Nach Kopplung an KLH (keyhole limpet hemocyanine) wurde das Konjugat in Hühnereier, Meerschweinchen und Kaninchen gespritzt. Die Tiere wurden nach 120 Tagen Immunisierung getötet, die Immunsera wurden gesammelt und bei 4 EC unter Verwendung von Thimorosal als Konservierungsmittel gelagert.

Das Peptid wurde auf Basis seiner vorhergesagten hohen Antigeni zität und minimaler Kreuzreaktivität mit anderen Proteinen ausgewählt. Außerdem erscheint dieses Peptidepitop zwischen den Arten hochkonserviert (Fig. 2b).

Beispiel 6 Proteinherstellung und Westernblot-Analyse

Rohe Proteinextrakte wurden aus pulverisiertem epididymalen Gewebe, epididymaler Flüssigkeit oder gewaschenen Spermatozon hergestellt, und in gleich großen Aliquots bei -80 EC gelagert. Proteinextrakte von humanen Spermienmembranen wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt (Alexander und Bearwood, 1984). Proben von 5 bis 10 µl Proteinextrakt (abhängig von der Proteinkonzen tration oder der Spermienanzahl) wurden auf 15%igen SDS-Poly acrylamidgelen aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (Amersham, Braunschweig, Deutschland) unter Verwendung eines diskontinuier lichen Puffersystems mit einem halbtrockenen Blotter (Phase, Lübeck, Deutschland) transferiert. Immunodetektion wurde durch einstündiges Blockieren der Membran in 1%iger Blockierungslösung (Boehringer-Mannheim), gefolgt durch Inkubation mit einem Meer schweinchen-Antiserum (siehe oben, Verdünnung 1 : 5000) durch geführt. Antikörperbindung wurde durch einen Peroxidase-gekoppel ten Ziege-anti-Meerschweinchen-Antikörper festgestellt (Sigma, Deisenhofen, Deutschland). Alternative Verfahren sind dem Fach mann bekannt.

Proteinextrakte von Hund-epididymalen Gewebe sowie Proteinextrak te von epididymalem Spermium des Hundes waren für CE12 verwandte Antigene positiv (Fig. 9a-c). Multiple immunreaktive Banden mit einem Molekulargewicht im Bereich von 30 bis 35 kDa wurden in jeder Proteinprobe mit Ausnahme der Proteinextrakte der Spermien aus dem Caput identifiziert. Starke Banden und ebenfalls in humaner epididymaler Flüssigkeit festgestellt werden, die aus der Cauda-Region entnommen wurde, und auch in Membranproteinpräpara tionen von humanem evakuliertem Sperma. Diese Reaktionen konnten durch chemosynthetische Peptide kompetitiert werden (Fig. 9).

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 cDNA-Sequenzen und abgeleitete Peptidsequenzen von CE12-Varianten. a) Sequenz der vollständigen CE12a- cDNA (obere Sequenz) und vorhergesagte Peptidsequenz (untere Sequenz). Der Pfeil zeigt auf die wahrschein liche Abtrennungsstelle des Signalpeptids. Die Aminosäuresequenz, wie abgeleitet von dem ersten Methionin im Leserahmen, ist in grau gezeigt. Die Sequenz, die für Synthese des Oligopeptids verwendet wurde, ist unterstrichen. Zwei Polyadenylierungssignale sind im 3'UTR unterstrichen. b) Sequenzen der CE12-Varianten am 5'-Ende, ermittelt durch inverse PCR (ausschließ lich Primer). Die 5'-Regionen der zwei aus der Biblio thek erhaltenen Klone (CE12a und b und der sechs aus der PCR-stammenden Klone (Cinv 1 (SEQ ID NO: 6), 4 (SEQ ID NO: 8), 6 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 9), 11 (SEQ ID NO: 10), 12 (SEQ ID NO: 11) sind einander gegenübergestellt. c) Gegenüberstellung der Amino säuresequenzen der CE12-cDNA-Varianten. 1-23: Signal peptidsequenz; 24-45: N-terminale Extension von CE12a. Römische Zahlen (I-IV) bezeichnen Fn2-Module (CE12b: SEQ ID NO: 33; CE12c: SEQ ID NO: 34).

Kurze Striche zeigen sowohl Deletionen, die in CE12b- und c-Varianten gefunden wurden, als auch Unterschiede in den Zwischenräumen zwischen den Fn2-Motiven an. Gepunktete Linien zeigen identische Aminosäuresequen zen an. Der Pfeil zeigt die verschiedenen N-terminalen Aminosäuren an.

Fig. 2 cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz von HE12 ver glichen mit homologen Sequenzen aus Tieren. a) Sequenz der vollständigen HE12-cDNA und der vorhergesagten Proteinsequenz. b) Vergleich der vorhergesagten humanen (HE12), Hund (CE12), und Pferd (EQ12) Fn2- Modulproteine mit der Aminosäuresequenz an BSP- A1/A2 = PDC-109 (Zugangsnummer P02784)

Fig. 3 Northernblot-Analysen der Gewebeverteilung von CE12- mRNAs, gezeigt durch nichtreaktive Hybridisierung. a) Expressionsmuster von CE12-mRNAs in Gesamt-RNA-Extrak ten von verschiedenen Hundgeweben unter Verwendung einer DIG-markierten Probe (obere Tafel). Ly = Lymph knoten; Mu = Muskel; Di = Diaphragma; Sp = Milz; Lu = Lunge; Li = Leber; Ov = Eierstöcke; Te = Hoden; E1 = Epididymis Hund 1; E2 = Epididymis Hund 2; Du = Ovidukt; Ut = Uterus. Gleiche Beladung (10 µg/Reihe) und die Integrität der ribosomalen RNA (28S und 18S) wurde durch Ethidiumbromidfärbung des Gels vor dem Blotting sichergestellt (untere Tafel). b) Expressionsmuster von CE12 (1,0 bis 1,4 kb) und CE4 (0,7 kb) mRNAs in verschiedenen Regionen des Hund-Epididymis und als Antwort auf die kryptorchide Situation.

Fig. 4 Northernblot-Analysen der Gewebeverteilung von HE12, gezeigt durch nichtradioaktive Hybridisierung. Expres sion von HE12-mRNA wurde in Gesamt-RNA-Extrakten von verschiedenen humanen Geweben und verschiedenen Regio nen des humanen Epididymis unter Verwendung einer DIG- markierten HE12-Probe untersucht (obere Tafeln). Pr = Prostata; Sv = seminale Vesikel; Ep = Epididymis; Te = Hoden; De = Decidua; Ki = Niere; Th = Thymus; Pi = Hirn anhangdrüse; Ln = LnCap-Zellen; Ca = Caput epididymis; Co = Corpus epididymis; Cu = Cauda epididymis. Gleiche Beladung (10 µg/Spalte) und Integrität der ribosomalen RNA (28S und 18S) wurden durch Ethidiumbromidfärbung des Gels vor dem Blotten sichergestellt (untere Ta feln).

Fig. 5 Northernblot-Analyse zur Bestimmung der Kreuzhybridi sierung von CE12- und HE12-cDNA-Proben zwischen ver schiedenen Arten. a) Gesamtextrakte epididymaler RNA neun verschiedener Arten wurden mit einer DIG-markier ten CE12-Probe unter nichtstringenten Bedingungen hybridisiert. Spalte 1: Mensch; Spalte 2: Hengst; Spalte 3: Rind; Spalte 4: Eber; Spalte 5: Ratte; Spal te 6: Maus; Spalte 7: Kaninchen; Spalte 8: Meer schweinchen (degradiert!); Spalte 9: Hund. b) Spalten 1-3: Hengst Caput, Corpus und Cauda epididymis; Spalte 4-5: Eber caput, Corpus und Cauda epididymis; Spalten 6: Stier; Spalte 7: Meerschweinchen (degra diert); Spalten 8-10: Caput, Corpus und Cauda epididy mis von Macaca mullata (hybridisiert mit HE12-cDNA- Probe). Gleiche Beladung (10 µg/Spalte) und Integrität der ribosomalen RNA (28S und 18S) wurde durch Ethidi umbromidfärben des Gels vor dem Blotten sichergestellt (untere Tafeln).

Fig. 6 Lokalisierung von CE12-Transkripten im Ductus epi thelium des Corpus epididymis des Hundes durch nicht radioaktive in situ-Hybridisierung unter Verwendung DIG-markierter cRNA-Proben, a) mRNA, die mit CE12- Antisense-cRNA hybridisiert, wurde in Gewebsschnitten unter Verwendung eines Alkalinephosphatase-konjugier ten anti-DIG-Antikörpers in normaler Hell-Lichtmikro skopie detektiert. b) Benachbarte Sektionen, die mit DIG-markierten CE12-Sense-Kontroll-cRNA hybridisiert wurden, waren negativ. Der Balken stellt 50 µm dar.

Fig. 7 Region-abhängige Unterschiede in der CE12-Transkript konzentration in der Hund Epididymis, gezeigt durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung DIG-markierter CE12-Antisense-cRNA. a) Proximale Caput epididymis; b) Proximaler Corpus epididymis; c) Mitte bis distaler Corpus epididymis; d) Cauda epididymis. Der Balken stellt 100 µm dar.

Fig. 8 Westernblot-Analyse von mit CE12 verwandten Antigene unter Verwendung eines Antipeptid-Antiserums von Meer schweinchen (Verdünnung 1 : 500). a) Multiple, immuno gefärbte Banden wurden zwischen 30 und 35 kDa in rohen Proteinextrakten von Hund-Epididymis beobachtet, die nicht mit Prä-Immunserum reagierten. Die Färbung wurde durch CE12-Peptide (20 µg/ml) kompetitiert. P = Prä- Immunserum; T = Test-Antiserum; C = Kompetitionsexperi ment. Eine breite immunreaktive Bande von etwa dersel ben Größe wurde in der Cauda des Hundes beobachtet, aber nicht in epididymalen Sperm-Proteinextrakten des Caput epididymis. Ca = Caput Spermextrakt; Cu = Sperm extrakt. b) Eine breite Bande von derselben Größe wurde auch in Proteinextrakten aus humaner caudaler epididymaler Flüssigkeit beobachtet, aber nicht vom Corpus, und in LIS-Extrakten von gewaschenem humanem ejakuliertem Sperma. Diese immunpositive Probe wurde durch das chemosynthetische CE12-Oligopeptid kom petitiert. Co = Flüssigkeit aus epididymalem Corpus; Cu = Flüssigkeit aus epididymaler Cauda. Sp = Sperma, keine Kompetition; C = Kompetitionsexperiment.

SEQUENZPROTOKOLL

Referenzen

1. Alexander NJ, Bearwood D. An immunosorption assay for anti bodies to spermatozoa: comparison with agglutination and immobilization tests. Fertil Steril 1984; 41: 270-276.
2. Altschul, SF et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402.
3. Banyai L, Tordai H, Patthty L. Structure and domain-domain interactions of the gelatin binding site of human 72-kilo dalton type IV collagenase (gelatinase A, matrix metallo proteinase 2). J Biol Chem 1996; 271: 12003-12008.
4. Beiglböck A, Pera I, Ellerbrock K, Kirchhoff C. Canine epididymis-specific mRNA encoding secretory glutathione peroxidase-like protein. J Reprod Fertil 1998; 112: 357- 367.
5. Chandonnet L, Roberts KD, Chapdelaine A, Manjunath P. Iden tification of heparin-binding proteins in bovine seminal plasma. Mol Reprod Dev 1990; 26: 313-318.
6. Constantine KL, Madrid M, Banyai L, Trexler M, Patthy L, Llinas M. Refined solution structure and ligand-binding properties of PDC-109 domain b. A collagen-binding type II domain. J Mol Biol 1992; 223: 281-298.
7. Desnoyers L, Manjunath P. Major proteins of bovine seminal plasma exhibit novel interactions with phospholipid. J Biol Chem 1992; 267: 149-155.
8. Ellerbrock K, Pera I, Hartung S, Ivell R. Gene expression in the dog epididymis: a model for human epididymal function. Int J Androl 1994; 17: 314-323.
9. Gebhardt K, Ellerbrock K, Pera I, Ivell R, Kirchhoff, C. Differential expression of novel abundant and highly regio nalized mRNAs of the canine epididymis. J Reprod Fertil 1999; 116: 391-402.
10. Kirchhoff C, Krull N, Pera I and Ivell R. A major mRNA of the human epididymal principal cells, HE5, encodes the leucocyte differentiation CDw52 antigen peptide backbone. Mol Reprod Dev 1993; 34: 8-15.
11. Kirchhoff C. Molecular characterization of epididymal pro teins. Reviews of Reproduction 1998; 3: 86-95.
12. Manjunath P, Marcel YL, Uma J, Seidah NG, Chretien M, Chap delaine A. Apolipoprotein A-I binds to a family of bovine seminal plasma proteins. J Biol Chem 1989; 264: 16853- 16857.
13. Müller P, Erlemann KR, Müller K, Calvete JJ, Töpfer-Peter sen E, Marienfeld K, Herrmann. A. Biophysical characteriza tion of the interaction of bovine seminal plasma protein PDC-109 with phospholipid vesicles. Eur Biophys 1998; 27: 33-41.
14. Parrish JJ, Susko-Parrish J, Winer MA, First NL. Capacita tion of bovine sperm by heparin. Biol Reprod 1988; 38: 1171-1180.
15. Pera I, Ivell R, Kirchhoff C. Regional variation of gene expression in the dog epididymis as revealed by in situ transcript hybridization. Int J Androl 1994; 17: 324-330.
16. Sambrook et al., Molecular cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
17. Therien I, Moreau R, Manjunath P. Bovine seminal plasma phospholipid-binding proteins stimulate phospholipid efflux from epididymal sperm. Biol Reprod 1999; 61: 590-598.
18. Therien I, Bleau G, Manjunath P. Phosphatidylcholine binding proteins of bovine seminal plasma modulate capaci tation of spermatozoa by heparin. Biol Reprod 1995; 52: 1372-1379.
19. Töpfer-Petersen E, Calvete JJ, Sanz L, Sinowatz F. Carbohy drate- and heparin-binding proteins in mammalian fertiliza tion. Andrologia 1995; 27: 303-324.

Claims

1. Epididymis-spezifisches Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 2 angege bene Aminosäuresequenz aufweist.

2. Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Derivat oder Homologes des Proteins nach Anspruch 1 ist, das

a) die gleiche Epididymis-Spezifität und Antigenizität aufweist und
b) im Vergleich zu der in SEQ ID NO 2 angegebenen Amino säuresequenz eine Homologie von mindestens 55% auf weist.

3. Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es dieselbe biologische Wirksamkeit wie das Protein nach Anspruch 1 aufweist.

4. Protein nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeich net, dass es aus einer Spezies aus der Gruppe bestehend aus Hund, Pferd, Schwein, Primaten und Rind stammt.

5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die in SEQ ID NO: 4, 33 oder 34 dargestellten Sequenzen aufweist.

6. Protein nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeich net, dass es mindestens ein Fibronektin Typ II Modul auf weist.

7. Protein nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es vier Fibronektin Typ II Module aufweist.

8. Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Fragment der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 7 ist und die gleiche biologische Wirksamkeit und/oder Antigenizität aufweist.

9. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie für ein Pro tein nach den Ansprüchen 1 bis 8 kodiert.

10. DNA-Sequenz nach Anspruch 9, ausgewählt aus

a) der in SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3, 5 oder 12 angege benen Nukleotidsequenz,
b) zu den vorgenannten Sequenzen homologen Sequenzen mit einem Homologiegrad von mindestens 55%, und
c) syngenen oder komplementären Sequenzen der Sequenzen gemäß a) oder b), oder Fragmenten derselben, soweit sie für Proteine oder Polypeptide mit gleicher biolo gischer Wirksamkeit und/oder Antigenizität kodieren.

11. DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekenn zeichnet, daß sie eine der in SEQ ID NO: 6 bis 11 darge stellten Sequenzen umfaßt.

12. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Fragment der in den SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 12 angegebenen DNA- Sequenzen ist und sie eine Länge von mindestens 40 Nuklein säuren aufweist.

13. Mikororganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er in die Hinterlegungsnummer DSM 13473 oder DSM 13474 hat.

14. DNA-Sequenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie in dem Mikroorganismus nach Anspruch 13 enthalten ist.

15. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 enthält.

16. Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass er die Sequenzen in solcher Weise insertiert enthält, dass deren Expression in geeigneten Wirtsorganismen erfolgen kann.

17. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Vektor nach Anspruch 15 oder 16 transformiert ist.

18. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine prokaryo tische oder eukaryotische Wirtszelle ist.

19. Verfahren zur Herstellung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Wirtszellen nach Anspruch 17 oder 18 unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression der DNA-Sequenz erlauben, und man das Expressionsprodukt gegebenenfalls aus dem Kulturansatz gewinnt.

20. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, mit einem Protein nach den Ansprüchen 1 bis 8 eine Immunreaktion einzugehen.

21. Antikörper nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eines oder mehrere der Proteine nach den Ansprü chen 1 bis 8 als aktiven Wirkstoff enthält.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere der DNA-Sequenzen nach den An sprüchen 9 bis 12 oder 14 als aktiven Wirkstoff enthält.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere der Antikörper nach Anspruch 20 oder 21 als aktiven Wirkstoff enthält.

25. Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8, der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 oder der Antikörper nach den Ansprüchen 20 oder 21 zur Diagnose männlicher Fortpflanzungsstörungen.

26. Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8, der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 oder der Antikörper nach den Ansprüchen 20 oder 21 zur Therapie männlicher Fortpflanzungsstörungen.

27. Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8, der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 oder der Antikörper nach den Ansprüchen 20 oder 21 zur Kontrazep tion.