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EP1290015A2 - Epididymis-spezifische proteine mit fibronektin typ ii-modulen - Google Patents

Epididymis-spezifische proteine mit fibronektin typ ii-modulen

Info

Publication number
EP1290015A2
EP1290015A2 EP01955303A EP01955303A EP1290015A2 EP 1290015 A2 EP1290015 A2 EP 1290015A2 EP 01955303 A EP01955303 A EP 01955303A EP 01955303 A EP01955303 A EP 01955303A EP 1290015 A2 EP1290015 A2 EP 1290015A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
seq
sequences
proteins
epididymis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01955303A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christiane Kirchhoff
Richard Ivell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Original Assignee
IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH filed Critical IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Publication of EP1290015A2 publication Critical patent/EP1290015A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/16—Masculine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the invention relates to new, epididymis-specific proteins with fibronectin type II modules as well as derivatives and fragments thereof, DNA sequences coding therefor and their use for the production of pharmaceutical compositions for the diagnosis and treatment of male infertility and for contraception.
  • the epididymis plays a key role in sperm maturation. In humans, it consists of a single channel about 5 m long, which is wound up in a very meandering manner.
  • the functionally still immature sperm formed in the testis (testis) are transported to the epididymis and undergo a maturation process during a 2 to 3 day passage, during which they, among other things, their directional mobility, their ability to capacitate and to acroso Get reaction.
  • the sperm are in the epididymal fluid, which is also called epididymal plasma. This plasma is a secretion product of the testis, the rete testis and the epididymis itself.
  • the liquid of the ejaculate also contains secretion products of the accessory glands.
  • Both the epididymal plasma and the seminal plasma are a complex mixture of different molecules such as proteins, salts and water, which serves as a medium for the transport and maintenance of sperm. It is assumed that the individual components of the seminal plasma have different functions for the fertility of the ejaculate.
  • BSP protein family A family of closely related proteins with two fibronectin type II domains, known as the BSP protein family, was identified in the bovine seminal plasma (Desnoyers and Manjunath, 1992; Müller et al., 1998).
  • BSP proteins have multiple binding properties, among others bind them to heparin, a glucosaminoglycan that plays an important role in sperm capacitation (Parrish et al., 1988, Chandonnet et al., 1990), as well as to apolipo protein AI in free form or associated with HDL (Manjunath et al., 1989; Chandonnet et al., 1990). It is therefore believed that BSP proteins accelerate sperm capacitation induced by heparin and HDL and that they induce cholesterol efflux from epididymal sperm (Therien et al., 1998).
  • the object is achieved by an epididymis-specific protein which is characterized in that it has the amino acid sequence given in the sequence listing under SEQ ID NO: 2.
  • the object is further achieved by proteins which are characterized in that they are derivatives, isoforms or homologs of the above-mentioned protein according to the invention, the protein
  • a) has the same epididymis specificity and antigenicity; and b) has a homology of at least 55% compared to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2.
  • a protein has the same epididy specificity as the protein with SEQ ID NO: 2 when it is expressed in the same tissues as this protein.
  • a protein also has the same antigenicity as the protein with SEQ ID NO: 2 when it is bound by antibodies that also bind to a protein with SEQ ID NO: 2.
  • fibronectin type II module denotes collagen binding sites in proteins which, inter alia, also occur in fibronectin (Banyai et al., 1985; Constantine et al., 1992). According to the invention, all deviations (deletions, insertions, exchanges, etc.) are included in the amino acid sequence insofar as the consensus sequence is retained.
  • the consensus sequence of the Fibronectin Type II module comprises the following sequence (50% consensus): uss-GssCsFPFpYcG + pYccCTs- GRscshhWCoTTssYDcDc + WGFC.
  • the Fn2 modules of the proteins according to the invention are similar, but not homologous to known Fn2 modules of previously known seminal plasma proteins of ungulates (see FIG. 2b).
  • the proteins of the invention are epididymis specific (see Figure 3), i.e. they are primarily expressed in the epididymis.
  • derivatives are understood to mean all naturally occurring allelic variants and isoforms of the proteins according to the invention, the various forms differing from one another with regard to the sequence length and also with regard to deletions, substitutions, insertions, and exchanges or distinguish additions of amino acids.
  • all naturally occurring variations of the proteins according to the invention are included, in which there are differences at the N-terminus.
  • homologs are understood to mean proteins which originate from species other than humans.
  • proteins or polypeptides with the same antigenicity denotes molecules which react with the same antibodies.
  • the derivatives according to the invention preferably have a homology of at least 65%, particularly preferably of at least 75% and very particularly preferably of at least 80% compared to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2.
  • the derivatives, isoforms or homologs according to the invention have the same biological activity as the protein with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2.
  • the homologs according to the invention come from a species selected from humans, primates, dogs, horses, cattle, pigs.
  • the homologues according to the invention comprise one of the sequences shown in SEQ ID NO: 4, 33 and 34. [ '
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of the human HE12, while the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4 show the amino acid sequence CE12a from the dog.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 33 and 34 are a section of the amino acid sequence CE12b (SEQ ID NO: 33) and CEl2c (SEQ ID NO: 34) from the dog. n
  • the invention relates in particular to derivatives of the proteins according to the invention which comprise at least one fibronectin type II module.
  • the derivatives preferably comprise four fibronectin type II modules.
  • No proteins are known in the prior art which have four fibronectin type II modules. An increased number of fibronectin type II modules is likely to lead to stronger binding to the binding partner (see above).
  • the invention further relates to fragments of the proteins and derivatives according to the invention which have the same biological activity and / or antigenicity as the proteins or derivatives themselves according to the invention.
  • the invention further relates to DNA sequences which code for the proteins, derivatives, isoforms, homologs or fragments according to the invention. These DNA sequences according to the invention are selected in particular from
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the human HE12 sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • Nucleic acid sequence is the CE12a sequence from the dog
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the CE12b sequence from the dog
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 represents a section of the coding sequence for the homologue in the horse.
  • the term “syngeneic sequence” encompasses all sequences which are derived from the same or homologous gene and which code for the proteins, derivatives and fragments according to the invention or can be used for the production of probes.
  • the term also includes sequences which have deviations due to the degeneration of the genetic code.
  • the term “syngeneic sequence” also includes sequences in which the coding region corresponds in whole or in part to the coding regions of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 and 12, but in which the 5 'and 3 'untranslated areas are different.
  • sequence also includes those nucleotide sequences in which the region coding for the mature protein completely or partially corresponds to the coding regions of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 and 12, but in which the for the areas coding the signal sequences are different.
  • the nucleic acids according to the invention comprise one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 and 11.
  • the present invention further relates to fragments of the DNA sequences according to the invention which have a length of at least 40 nucleic acids, preferably 100 nucleic acids, and which are particularly suitable as probes.
  • the DNA sequences according to the invention can be obtained by searching gene banks from epididial tissue with probes, the probes being fragments of those shown in SEQ ID NO: 1, 3 and 5 are proteins. Such methods are known to the person skilled in the art (Sambrook et al., 1989). The determination of the degree of homology is also known to the person skilled in the art (Altschul, et al., 1997).
  • the invention further relates to a vector molecule which contains one or more of the DNA sequences according to the invention.
  • the vector molecule according to the invention contains the DNA sequences according to the invention inserted in such a way that their expression can take place in suitable host organisms.
  • Vectors which are suitable in the context of the present invention for taking up the DNA sequences according to the invention include in particular all plasmid and viral vectors which are suitable for the transformation of bacteria, yeast, insect and mammalian cells.
  • the invention further relates to microorganisms which have the deposit number DSM 13473 or DSM 13474. These microorganisms were deposited in the German collection of microorganisms and cell cultures, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig.
  • the microorganism with the deposit number DSM 13474 contains a plasmid with a DNA sequence with the nucleotides 156-827 from SEQ ID NO: 1 and thus the complete open reading frame of the human HE12 DNA.
  • the microorganism with the deposit number DSM 13473 contains a plasmid with a DNA sequence with the nucleotides 162-917 and thus the complete reading frame for the mature CE12 protein and for part of the signal sequence.
  • the invention further relates to all prokaryotic or eukaryotic host cells which have been transformed with the vectors according to the invention.
  • Suitable host cells are, for example, E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, • Sf9, mammalian cell lines, primary cell cultures.
  • CHO, BHK or COS cells can be used as the mammalian cell line.
  • the invention further relates to a process for the production of the proteins, derivatives or fragments according to the invention, in which the host cells according to the invention are cultivated under conditions which allow the expression of the DNA sequence and the expression product is obtained from the culture mixture.
  • the conditions to be selected depend on the vectors and host cells used in each case and are known to the person skilled in the art (Sambrook et al.).
  • proteins, derivatives, isoforms, homologs, fragments or DNA sequences according to the invention can be according to known
  • the invention further relates to antibodies which are able to initiate an immune reaction with the proteins, derivatives, homologues or fragments according to the invention.
  • these antibodies are polyclonal or monoclonal antibodies.
  • the antibodies according to the invention can be produced with the aid of the high-purity proteins according to the invention in a manner known to the person skilled in the art. Such antibodies can be produced on the basis of the complete proteins as well as on the basis of fragments and active derivatives thereof, provided that they have the same antigenicity (cf. Example 5).
  • the antibodies can be labeled and serve to detect the proteins, derivatives, homologs and fragments according to the invention in vitro or in vivo. ⁇
  • the invention further relates to pharmaceutical compositions which contain the proteins, derivatives, homoigenes, fragments, DNA sequences or antibodies as active ingredient.
  • pharmaceutical compositions In addition to the active ingredient, such pharmaceutical compositions generally contain physiologically tolerable carriers which are known to the person skilled in the art.
  • the invention furthermore relates to the use of the proteins, derivatives, homologues, fragments, DNA sequences and antibodies according to the invention for the production of pharmaceutical compositions for the diagnosis of male reproductive disorders, for the therapy of male reproductive disorders, in particular infertility, and for the manufacture of a medicament for contraception.
  • the complementary DNA sequences according to the invention are used as anti-sense DNA molecules for the production of the pharmaceutical compositions mentioned above, the anti-sense molecules being suitable for suppressing the production of the DNA sequences according to the invention in vivo.
  • compositions according to the invention are preferably used to modulate the heparin and apolipo-protein A-I bonds in the epididymis. They are particularly preferably used for modulating the capacitation of sperm.
  • the present invention thus provides a new family of epididymis-specific proteins which are distinguished by the presence of heparin binding sites.
  • the proteins, DNA sequences and antibodies according to the invention can be used as a reversible male contraceptive which acts post-testicularly and does not interfere with the hormone balance. Such a contraceptive is not known in the prior art.
  • a dog epididymis cDNA library (Eilerbrock et al., 1994) was developed using the method described in Kirchhoff et al. (1990) searched subtraction hybridization strategy. Approximately 10,000 independent cDNA clones were plated out in low density (approx. 500 pfu (plaque forming units) per plate) and searched using a multi-stage process. 32 P-labeled single-strand cDNA pools from dog epididymis were used as probes. 32 P-labeled single-strand cDNA pools from the liver, testis and lungs of the dog served as negative controls.
  • RNA 5 ug total epididymis RNA was used.
  • Superscript TM reverse transcriptase (Gibco-BRL, Düsseldorf, Germany) was used as the enzyme.
  • the synthesis of the second strand was carried out with E. coli DNA polymerase after incorporation of strand breaks with RNase H (both enzymes from Stratagene, Heidelberg, Germany). Blunt ends were produced with T4-DNA polymerase (Biolabs, Schwalbach / Taunus, Germany) and ligated with T4-DNA ligase (Boehringer, Mannheim, Germany) in order to concatenate and / or circularize the DNA.
  • the inverse PCR was carried out using the following sense primers (CE12: 5 'GTGAAACCAATGAGTATGG3' (SEQ ID NO: 15); HE12: 5 'GTGGTGCTCAGT-CACCTCTG3' (SEQ ID NO: 16)) and the corresponding antisense primers (CE12 : 5'GGTAATCGTCTGCCATGC3 '(SEQ ID NO: 17); HE12: 5' CGTGGGTAATCTTCACTCTG3 '(SEQ ID NO: 18)).
  • the HE 12 clone has an open reading frame (ORF) of 223 codons with an ATG start codon for nucleotides 156-158 and a TGA stop codon for nucleotides 825-827 (FIG. 2a).
  • ORF open reading frame
  • the ORF is followed by a 198 nucleotide 3 'untranslated region that contains an AATAAA polyadenylation signal at nucleotides 1010-1015.
  • the ORF produces a new human epididymal protein. This comprises an N-terminal signal peptide (amino acid 1-23), which is typical for secretory proteins, and which is immediately followed by four Fn2 motifs arranged in tandem (FIG. 2b).
  • CE12 cDNA clones were obtained which have different 5 'UTRs in which there was only one, namely the second ATG start codon. It is therefore assumed that these respective CE12 sequences have different promoters.
  • CE12a- and b clones differ by 22 codons which are either in the present or absent and cDNAs' for which there is no counterpart in the HE12 cDNA sequence is ( Figure 2).
  • the two variants of CE12 cDNAs occur with a frequency of 1: 3.
  • the N-terminus as derived for CE12a contains a consensus sequence for an N-glycosylation site at asparagine +4 (Asn +4), this site is missing in CE12b ( Figure lc).
  • the amino acids that result from the immediately following codon can be either D or N (FIG. 1 c).
  • CE12 mRNAs in the Northern blot (see below) makes it possible that there are additional lengths of polymorphisms even in the 3 'untranslated region, but this was not confirmed by the cDNA clones found.
  • the 3'-UTR of the CE12 mRNA appears significantly longer than that of the HE12 mRNA and contains two possible polyadenylation signals, only the first of which is homologous to the human counterpart.
  • the sequences coding for the Fn2 motifs were identical in all CE12 cDNA variants and also highly homologous to corresponding regions of the HE12 CDNA (approximately 85% sequence identity) (FIG. 2b).
  • PCR analyzes were carried out to rule out the possibility that cloning artifacts occurred during the manufacture of the libraries.
  • Oligonucleotide primer pairs were used in the RT-PCR analysis. The RT-PCR was carried out according to standard methods. The following primer pairs were used for the amplification of CE12, HE12 and EQ12 cDNA fragments from 1 ⁇ g fetal epididymal ⁇ RNA:
  • CE12 750 bp product; used primers 5 'GATCTGTTTACTTCATCTTG3' (SEQ ID NO: 19) and 5 'CCTTTATTGGTGGTTATGCC3' (SEQ ID NO: 20);
  • HE12 837 bp product; used primers 5 'CAACCTTCCTTCTCTATTCC3' (SEQ ID NO: 21) and 5 'TCAAGACTCCTTTATTGGTG3' (SEQ ID NO: 22);
  • EQ12: 752 bp product used primers 5 'GGGTCTTCTTACTTCTCTTG3' (SEQ ID NO: 23) and 5 'TCCTTTATTGGTGGTTATGCAC3' (SEQ ID NO: 24).
  • Each of the products contained those cDNA regions that code for four Fn2 motifs.
  • human and canine epididymic cDNAs were used for PCR amplification.
  • a corresponding primer set was also used for the epididymal horse cDNA preparation.
  • an amplified sequence of approximately 800 bp was obtained.
  • Subcloning and sequencing confirmed the presence of epididymal mRNAs encoding four highly conserved, tandem Fn2 motifs. Such proteins occurred not only in humans and dogs, but also in horses (see Figure 2c). Shorter PCR fragments were also observed during the RT-PCR analyzes of the human epididymal cDNA, but in significantly smaller amounts.
  • RNA from various tissues was in 15 to 20 volumes of a chaotropic solution as in Pera et al. (1996) extracted. 5 to 10 ⁇ g of the total RNA / column, depending on the type of experiment, were separated by means of denaturing agarose gel electrophoresis and transferred to Amersham-Buchler, Braunschweig, Germany) nylon membranes. Equal amounts of RNA were ensured by ethidium bromide staining before the transfer.
  • Digoxigenin (DIG) -labeled cDNA samples were prepared by PCR amplification of purified fragments according to the manufacturer's instructions (Boehringer, Mannheim, Germany). The sequences of the primers were as follows:
  • CE12, 404 bp product used primers 5 'CTCTCCTTGGTGTGCAACC3' (SEQ ID NO: 25) and 5 ⁇ AGTGGCAGGGAAAGCCAG3 '(SEQ ID NO: 26);
  • HE12, 400 bp product used primers 5 'CAACCTTCCTTCTCTATTCC3' (SEQ ID NO: 27) and 5 'TCCATGCAATCAGAGACCAC3' (SEQ ID NO: 28);
  • CE1, 730 bp product used primers 5 'AAGCAGCAGAGCTGGAG3' (SEQ ID NO: 29) and 5 'AATGTCACCTTCACCAG3' (SEQ ID NO: 30);
  • CE4, 370 bp product used primers 5 'ACGCAGGAGTGCGTCTCGGA3' (SEQ ID NO: 31) and 5 'AGCGGTCACTTTATTGGTTG3' (SEQ ID NO: 32).
  • PCR reactions were carried out as described (Pera et al. 1996). Hybridization with the non-radioactive samples was carried out using the DIG Labbeling kit (Boehringer, Mannheim) as described recently (Pera et al., 1996).
  • the expression pattern of the human and dog mRNAs was examined along the length of the epididymis.
  • HE12 mRNA was found in all regions of the human epididymis, although a higher content was found in the more proximal parts of the organ ( Figure 4).
  • CE4 mRNA which is known to be present in all regions of the organ (Beiglböck et al., 1998; Gebhardt et al., 1999) was used as an internal control (FIG. 3).
  • Regionalization of CE12 expression was more evident in the dog than in humans, and all CE12-hybridizing mRNAs showed the same pattern with maximum expression in the corpus region.
  • Hybridization under low stringency conditions using heterologous DIG-labeled CE12-CDNA as a sample showed the cross-hybridizing mRNAs are present in the epididymis of other mammals including humans, cattle, horses, pigs and monkeys (Macaca mullata) (FIG. 5a, b). Although not examined in detail, the largest amounts were found in the epididymis of the pig in the Caput region, which is an exception compared to the other mammals. No cross hybridization with either CE12 or HE12 cDNA samples was found with rodent, rabbit and guinea pig epididymid RNA extracts.
  • CE12 transcripts were localized in tissue sections of the dog epididymis (see Figure 6a and b).
  • the hybridization in sitiz showed strong and highly specific labeling of the epithelium of the epididymal canal, while the lumen of the canal containing the sperm and the tissue between the canal showed no signal.
  • the signal was strongest in the basal region within the epithelium.
  • the maximum staining was found in the distal caput and corpus in good agreement with the Northern blot results, while the proximal caput appeared unlabeled and the distal parts of the organ were only weakly marked (FIGS. 7a-d).
  • a 20 mer oligopeptide (NH 2 -SSFDENQQWKYCETNEYGGN-C00H) which had been derived from the CE12a DNA sequence (amino acids 103-122, see FIG. 1) was selected as the immunogen.
  • the antibodies were produced as described recently (Kirchhoff et al. 1996). After coupling to KLH (keyhole limpet hemocyanine), the conjugate was injected into chicken eggs, guinea pigs and rabbits. The animals were sacrificed after 120 days of immunization, the immunera were collected and stored at 4 ° C using thimorosal as a preservative.
  • the peptide was selected based on its predicted high antigenicity and minimal cross-reactivity with other proteins. In addition, this peptide epitope appears to be highly conserved between the species (FIG. 2b).
  • Raw protein extracts were made from powdered epididymal tissue, epididymal fluid or washed sperm prepared and stored in aliquots of the same size at -80 ° C. Protein extracts from human sperm membranes were prepared as recently described (Alexander and Bearwood, 1984). Samples of 5 to 10 ⁇ l protein extract (depending on the protein concentration or the number of sperm) were separated on 15% SDS polyacrylamide gels and on PVDF membranes (Amersham, Braunschweig, Germany) using a discontinuous buffer system with a semi-dry blotter (phase , Lübeck, Germany).
  • Immunodetection was carried out by blocking the membrane in 1% blocking solution (Boehringer-Mannheim) for one hour, followed by incubation with a guinea pig antiserum (see above, dilution 1: 5000).
  • Antibody binding was determined by a peroxidase-coupled goat anti-guinea pig antibody (Sigma, Deisenhofen, Germany). Alternative methods are known to the person skilled in the art.
  • Protein extracts from canine epididymal tissue and protein extracts from canine epididymal sperm were positive for CE12-related antigens (FIGS. 8a-c).
  • Multiple immunoreactive bands with a molecular weight in the range from 30 to 35 kDa were identified in each protein sample with the exception of the protein extracts of the sperm from the caput. Strong bands can also be found in human epididymal fluid taken from the Cauda region and also in membrane protein preparations from human evacuated sperm. These reactions could be competed by chemosynthetic peptides (Figure 8).
  • Cryostat sections (8 ⁇ m) of the epididymis of prostate carcinoma patients were made and incubated for 18 hours at 8 ° C. with the C12-3 antiserum from rabbits.
  • the antibodies with Specificity for the HE12 protein was visualized by fluorochrome-conjugated antibodies (Cy2 immunofluorescence; Dianova, Amersham). Both antibodies were used in a dilution of 1: 100.
  • FIGS. 9 (a) to (i) Cross sections through the epididymis in the distal area are shown as immunofluorescence images in FIGS. 9 (a) to (i).
  • A shows the cross-section through the epididymis in the distal area;
  • B the comparable region of another patient's tissue;
  • C and
  • e a negative control in which the epididymis was incubated with a pre-C12-3 serum (diluted 1: 100).
  • Figure 10 shows the corresponding result when analyzing the epididymis of a healthy dog.
  • HE12 is primarily expressed in the epithelial cells and released into the lumen.
  • LIS membrane extracts of the sperm were subjected to a two-dimensional electrophoretic separation (2-DE), marked by the HE-12-specific antibodies and visualized. As shown in Fig. 11 (a), six different isoforms can be detected by this method.
  • Figure 1 cDNA sequences and derived peptide sequences of CE12 variants, a) sequence of the complete CE12a cDNA (upper sequence) and predicted peptide sequence (lower sequence). The arrow points to the probable separation site of the signal peptide. The amino acid sequence, as derived from the first methionine in the reading frame, is shown in gray. The sequence used for the synthesis of the oligopeptide is underlined. Two polyadenylation signals are underlined in the 3'UTR, b) sequences of the CE12 variants at the 5 'end, determined by inverse PCR (only primers).
  • Short lines show both deletions found in CEl2b and c variants and differences in the spaces between the Fn2 motifs. Dotted lines indicate identical amino acid sequences. The arrow shows the different N-terminal amino acids.
  • FIG. 3 Northern blot analyzes of the tissue distribution of CE12 mRNAs, shown by non-reactive hybridization.
  • FIG. 4 Northern blot analyzes of the tissue distribution of HE12, shown by non-radioactive hybridization. Expression of HE12 mRNA was examined in total RNA extracts from different human tissues and different regions of the human epididymis using a 'DIG-labeled HEl2 sample (upper panels).
  • FIG. 5 Northern blot analysis for determining the cross-hybridization of CE12 and HE12 cDNA samples between different types, a) total extracts of epididymal RNA of nine different types were hybridized with a DIG-labeled CE12 sample under non-stringent conditions.
  • FIG. 6 Localization of CE12 transcripts in the ductus epitheliu of the corpus epididymis of the dog by non-radioactive in s ⁇ tu hybridization using DIG-labeled cRNA samples.
  • mRNA that hybridizes with CE12 antisense cRNA was detected in tissue sections using an alkali phosphatase-conjugated anti-DIG antibody in normal bright-light microscopy.
  • Adjacent sections that start with DIG-labeled CE12 sense control cRNA hybridized were negative. The bar represents 50 ⁇ m.
  • FIG. 7 region-dependent differences in the CE12 transcript concentration in the dog epididymis, shown by in s ⁇ iu hybridization using DIG-labeled CE12 antisense cRNA.
  • the bar represents 100 ⁇ m.
  • FIG. 8 Western blot analysis of CE12-related antigens using guinea pig antipeptide antiserum (1: 500 dilution).
  • a broad immunoreactive band of approximately the same size was observed in the dog's cauda, but not in epididymal sperm protein extracts of the caput epididymis.
  • Ca caput sperm extract
  • Cu sperm extract
  • Co epididymal corpus fluid
  • Cu liquid from epididymal cauda.
  • Sp sperm, no competition
  • C competition experiment.
  • FIG. 9 immunofluorescence detection of the HE12 in the epididymis of patients with prostate carcinoma; (a) Cross-section through the epididymis in the distal area; (b) comparative bare region of another patient's tissue; (c) and (d) comparable regions of two anti-androgen-treated patients; (e) Negative control, epididymis incubated with a pre-C12-3 serum (diluted 1: 100).
  • FIG. 11 (a): HE12 bound to sperm after two dimensional electrophoretic separation; (b) SDS-PAGE and Western blot of the wash solutions; 0.6 M NaCl wash buffer Sw; Sperm membrane sp; repeated washing wt.
  • This international depository accepts the microorganism referred to under I, which it received on 2 000 - 04 - 2 8 (date of first deposit) '
  • microorganism referred to under I has been received by this international depository on (date of deposit) and an application for conversion of this first deposit has been received on (deposit of the Budapest Treaty) on (date of receipt of the application for conversion)
  • the viability of the microorganism mentioned in II was checked on 2 00 0 - 05 - 03 2 . At that time the microorganism was
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Abstract

Die Erfindung betrifft neue, Epididymis-spezifische Proteine mit Fibronektin Typ II-Modulen und Derivate und Fragmente derselben, für diese kodierende DNA-Sequenzen und deren Verwendung zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung der männlichen Infertilität sowie zur Kontrazeption.

Description

Epididymis-spezifische Proteine mit Fibronektin Typ-»IIJModulen
Die Erfindung betrifft neue, Epididymis-spezifische Proteine mit Fibronektin Typ II-Modulen sowie Derivate und Fragmente derselben, für diese kodierende DNA-Sequenzen und deren Verwendung zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung der männlichen Infertilität sowie zur Kontrazeption.
Die Epididymis (Nebenhoden) nimmt bei der Reifung der Spermien eine Schlüsselrolle ein. Sie besteht beim Menschen aus einem einzigen etwa 5 m langen Kanal, der sehr stark meanderartig aufgewunden ist. Die im Hoden (Testis) gebildeten, funktioneil noch unreifen Spermien werden zur Epididymis transportiert und während einer 2 bis 3 Tage dauernden Passage einem Reifungs- prozess unterzogen, in dessen Verlauf sie unter anderem ihre gerichtete Beweglichkeit, ihre Fähigkeit zur Kapazitation und zur Akroso en-Reaktion erlangen. In der Epididymis befinden sich die Spermien in der epididymalen Flüssigkeit, die auch epididymales Plasma genannt wird. Dieses Plasma ist ein Sekretprodukt des Hodens, des Rete testis und der Epididymis selbst. Die Flüssigkeit des Ejakulats, das sogenannte Seminalplasma, enthält außerdem Sekretprodukte der akzessorischen Drüsen. Sowohl das epididymale Plasma als auch das seminale Plasma sind ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülen wie Proteinen, Salzen und Wasser, das als Medium für den Transport und den Erhalt der Spermien dient. Es wird angenommen, dass die einzelnen Bestandteile des seminalen Plasmas unterschiedliche Funktionen für die Fertilität des Ejakulats haben.
Das Verständnis der Funktionen der einzelnen Bestandteile des epididymalen sowie des seminalen Plasmas ist eine entscheidende Voraussetzung dafür, in den Reifungsprozess der Spermien in der Epididymis eingreifen zu können. Ein solcher Eingriff kann beispielsweise zur Behebung männlicher Infertilität sowie zur Kontrazeption erforderlich sein. Bislang sind allerdings der post-testikuläre Reifungsprozess sowie das Wechselspiel zwischen den einzelnen Komponenten des epididymalen/seminalen Plasmas und Molekülen auf der Spermienoberflache nur unzureichend erforscht. In der Vergangenheit konnten einige Proteine identifiziert werden, die Bestandteil der humanen epididymalen Flüssigkeit und des seminalen Plasmas sind. Dazu zählen unter anderem die epididymis-spezifischen Proteine HEI bis HE5 (Kirchhoff, C. (1998)) .
Die meisten Studien im Nebenhoden wurden allerdings anhand von Tiermodellen durchgeführt. Fast alle Kenntnisse stammen X aus Arbeiten an Ratten, Mäusen, Hamstern, Ebern, Stieren oder gelegentlich Affen, wobei die artspezifischen Unterschiede groß sind. Im seminalen Plasma des Rindes konnte eine Familie nahe verwandter Proteine mit zwei Fibronektin Typ II-Domänen identifiziert werden, die als BSP-Proteinfa ilie bezeichnet wird (Desnoyers und Manjunath, 1992; Müller et al., 1998). BSP- Proteine weisen multiple Bindungseigenschaften auf, unter anderem binden sie an Heparin, ein Glucosaminoglycan, das bei der Kapazitation von Spermien eine wichtige Rolle spielt (Parrish et al., 1988, Chandonnet et al . , 1990), sowie an Apolipo-Protein A-I in freier Form oder assoziiert mit HDL (Manjunath et al . , 1989; Chandonnet et al . , 1990). Es wird daher angenommen, dass BSP- Proteine die Kapazitation von Spermien beschleunigen, die durch Heparin und HDL induziert wird, und dass sie den Cholesterin- Efflux aus epididymalen Spermien induzieren (Therien et al . , 1998) .
Bisher war es nicht möglich, auch im Menschen ähnliche Proteine zu identifizieren, die mit den BSP-Proteinen verwandt sind. Allgemein lassen sich in Tierversuchen gewonnenen Erkenntnisse aufgrund der hohen Gewebe- und Speziesspezifität der Proteine des epididymalen/seminalen Plasmas schlecht auf den Menschen übertragen (Töpfer-Petersen et al . , 1995). Dies führt dazu, dass eine gezielte Beeinflussung des Befruchtungsvorgangs aufgrund der mangelhaften Kenntnis der beteiligten Faktoren heutzutage nur in Ausnahmefällen möglich ist.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel bereitzustellen, mit denen im Menschen oder in verwandten Säugertieren der Epididymisstoffwechsel gezielt beeinflußt werden kann.
Gemäß eines Aspektes der Erfindung wird die Aufgabe durch ein Epididymis-spezifisches Protein gelöst, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass es die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist .
Gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung wird die Aufgabe ferner durch Proteine gelöst, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie Derivate, Isoformen oder Homologe des oben genannten erfindungsgemäßen Proteins sind, wobei das Protein
a) die gleiche Epididymis-Spezifität und Antigenizität aufweist; und b) im Vergleich zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 55 % aufweist .
Die Kenntnis dieser neuen Proteine ermöglicht die Herstellung reversibler männlicher Kontrazeptiva, die post-testikulär, ,d.h. nicht im Hoden wirken und nicht in den Hormonhaushalt eingreifen. Solche Kontrazeptiva sind im Stand der Technik nicht bekannt.
Erfindungsgemäß weist ein Protein die gleiche Epididy is- Spezifität auf wie das Protein mit der SEQ ID NO: 2, wenn es in denselben Geweben wie dieses Protein exprimiert wird. Ein Protein weist ferner die gleiche Antigenizität auf wie das Protein mit der SEQ ID NO: 2, wenn es von Antikörpern gebunden wird, die auch an ein Protein mit der SEQ ID NO: 2 binden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich überraschenderweise gezeigt, dass zumindest im Menschen, Hund und Pferd eine Familie von mit BSP-Proteinen verwandten Proteinen existiert, die zu den BSP-Proteinen nicht homolog sind. Daher war es in der Vergangenheit auch nicht möglich, mittels Standardmethoden diese neue, erfindungsgemäße Proteinfamilie aufzufinden. Diese Familie zeichnet sich in der Regel durch vier Fibronektin Typ II-Module aus, obwohl mittels der RT-PCR auch einzelne Mitglieder identifiziert werden konnten, welche drei oder ein Fibronektin Typ II (Fn2) -Modul aufweisen. Bislang waren nur Seminalplasma-Proteine mit zwei Fn2-Modulen bekannt.
Erfindungsgemäß werden mit dem Ausdruck "Fibronektin Typ II- Module" Kollagenbindungsstellen in Proteinen bezeichnet, die unter anderem auch in Fibronektin auftreten (Banyai et al . , 1985; Constantine et al . , 1992). Dabei sind erfindungsgemäß alle Abweichungen (Deletionen, Insertionen, Austausche etc.) in der Aminosäuresequenz eingeschlossen, soweit die Konsensussequenz erhalten bleibt. Die Konsensussequenz des Fibronectin Typ II-Moduls umfaßt die folgende Sequenz ( 50%-Konsensus) : uss-GssCsFPFpYcG+pYccCTs- GRscshhWCoTTssYDcDc+WGFC .
Die Großbuchstaben stellen Aminosäuren im Ein-Buchstaben-Code dar, die Bedeutung der übrigen Zeichen ergibt sich aus Tabelle 1.
Tabelle 1
Die Fn2-Module der erfindungsgemäßen Proteine sind ähnlich, aber nicht homolog zu bekannten Fn2-Modulen von bislang bekannten seminalen Plasmaproteinen von Huftieren (siehe Figur 2b). Die erfindungsgemäßen Proteine sind Epididymis-spezifisch (siehe Figur 3), d.h. sie werden primär in der Epididymis exprimiert .
Unter Derivaten werden im Sinne dieser Erfindung alle natürlich vorkommenden allelischen Varianten und Isoformen der erfindungsgemäßen Proteine verstanden, wobei sich die verschiedenen Formen jeweils voneinander hinsichtlich der Sequenzlänge als auch in Bezug auf Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Austauschen oder Additionen von Aminosäuren unterscheiden können. Insbesondere sind dabei alle natürlich vorkommenden Variationen der erfindungsgemäßen Proteine eingeschlossen, bei denen Unterschiede am N-Terminus vorliegen.
Unter Homologen im Sinne dieser Erfindung werden Proteine verstanden, die aus anderen Spezies als dem Menschen stammen.
Der Begriff "Proteine oder Polypeptide mit gleicher Antigenizi- tät" bezeichnet erfindungsgemäß Moleküle, die mit den gleichen Antikörpern reagieren.
Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Derivate im Vergleich zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz 'eine Homologie von mindestens 65 %, besonders bevorzugt von mindestens 75 % und ganz besonders bevorzugt von mindestens 80 % auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung weisen die erfindungsgemäßen Derivate, Isoformen oder Homologe die gleiche biologische Wirksamkeit wie das Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz auf.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung stammen die erfindungsgemäßen Homologe aus einer Spezies ausgewählt aus Mensch, Primaten, Hund, Pferd, Rind, Schwein.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfassen die erfindungsgemäßen Homologen eine der in SEQ ID NO: 4, 33 und 34 dargestellten Sequenzen. [ '
Die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz stellt die Aminosäuresequenz des menschlichen HE12 dar, während die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenzen die Aminosäuresequenz CEl2a aus dem Hund zeigen. Die in SEQ ID NO: 33 und 34 dargestellte Aminosäuresequenzen sind ein Ausschnitt der Aminosäure- sequenz CE12b (SEQ ID NO: 33) und CEl2c (SEQ ID NO: 34) aus dem Hund. n
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Derivate der erfindungsgemäßen Proteine, die mindestens ein Fibronektin Typ II- Modul umfassen. Vorzugsweise umfassen die Derivate vier Fibronektin Typ II-Module. Im Stand der Technik sind bislang keine Proteine bekannt gwesen, die vier Fibronektin-Typ II Module aufweisen. Eine erhöhte Anzahl an Fibronektin-Typ II Modulen führt voraussichtlich zu einer stärkeren Bindung an die Bindungspartner (s.o.).
Gegenstand der Erfindung sind ferner Fragmente der erfindungsgemäßen Proteine und Derivate, welche die gleiche biologische Wirksamkeit und/oder Antigenizität wie die erfindungsgemäßen Proteine oder Derivate selbst aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Proteine, Derivate, Isoformen, Homologe oder Fragmente kodieren. Diese erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind insbesondere ausgewählt aus
a) der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, 5 und 12 angegebenen Nukleotidsequenzen,
b) zu den vorgenannten Sequenzen homologe Sequenzen mit einem Homologiegrad von mindestens 55 % , vorzugsweise 65 % , ganz besonders bevorzugt 80 %, und
c) syngenen oder komplementären Sequenzen der Sequenzen gemäß a) und b) , oder Fragmente derselben, soweit die Fragmente für Proteine oder Polypeptide mit der gleichen biologischen Wirksamkeit und/oder Antigenizität kodieren.
Die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz ist die HE12 Sequenz aus dem Menschen, die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Nukleinsäuresequenz ist die CE12a Sequenz aus dem Hund, die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Nukleinsäuresequenz ist die CE12b Sequenz aus dem Hund, wärend die in SEQ ID NO: 12 dargestellte Nukleinsäuresequenz einen Ausschnitt der kodierenden Sequenz für das Homologe im Pferd darstellt. H i '
Erfindungsgemäß umfasst der Begriff "syngene Sequenz" alle Sequenzen, die sich von dem gleichen oder homologen Gen ableiten und für die erfindungsgemäßen Proteine, Derivate und Fragmente kodieren bzw. zur Herstellung von Sonden verwendbar sind. Der Begriff umfasst insbesondere auch Sequenzen, die Abweichungen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes aufweisen. Insbesondere umfaßt der Begriff "syngene Sequenz" auch derartige Sequenzen, bei denen zwar der kodierende Bereich ganz oder teilweise mit den kodierenden Bereichen der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 12 dargestellten Sequenzen übereinstimmt, bei denen jedoch die 5'- und 3 '-untranslatierten Bereiche unterschiedlich sind. Ferner umfaßt der Begriff "syngene Sequenz" auch diejenigen Nukleotidsequenzen, bei denen der für das reife Protein kodierende Bereich ganz oder teilweise mit den kodierenden Bereichen der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 12 gezeigten Sequenzen übereinstimmt, bei denen jedoch die für die Signalsequenzen kodierenden Bereiche unterschiedlich sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine der in SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 und 11 dargestellten Nukleotidsequenzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die mindestens eine Länge von 40 Nukleinsäuren, vorzugsweise von 100 Nukleinsäuren, aufweisen und die insbesondere als Sonden geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind erhältlich, indem Genbanken aus Epididy isgewebe mit Sonden durchsucht werden, wobei die Sonden Fragmente der in SEQ ID NO: 1, 3 und 5 darge- stellten Proteine sind. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al., 1989) . Die Bestimmung des Homologiegrades ist dem Fachmann ebenfalls bekannt (Altschul, et al . , 1997).
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Vektormolekül, das eine oder mehrere der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthält. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform enthält das erfindungsgemäße Vektormolekül die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in solcher Weise insertiert, dass deren Expression in geeigneten Wirtsorganismen erfolgen kann.
Vektoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aufzunehmen, schließen insbesondere alle zur Transformation von Bakterien, Hefen, Insekten- und Säugerzellen geeigneten Plasmid- und viralen Vektoren ein.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Mikroorganismen, die die Hinterlegungsnummer DSM 13473 oder DSM 13474 haben. Diese Mikroorganismen wurden bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig hinterlegt. Der Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer DSM 13474 enthält ein Plasmid mit einer DNA-Sequenz mit den Nukleoti- den 156-827 aus SEQ ID NO: 1 und damit den vollständigen offenen Leserahmen der menschlichen HE12-DNA. Der Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer DSM 13473 enthält ein Plasmid mit einer DNA- Sequenz mit den Nukleotiden 162-917 und damit den vollständigen Leserahmen für das reife CE12-Protein sowie für einen Teil der Signalsequenz .
Gegenstand der Erfindung sind ferner alle prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformiert sind. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, • Sf9, Säugerzellinien, Primärzellkulturen. Als Säugerzellinie können beispielsweise CHO, BHK oder COS Zellen verwendet werden. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemaßen Proteine, Derivate oder Fragmente, bei dem man die erfindungsgemäßen Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression der DNA-Sequenz erlauben, und man das Expressionsprodukt aus dem Kulturansatz gewinnt. Die zu wählenden Bedingungen hängen von den jeweils verwendeten Vektoren und Wirtszellen ab und sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al. ) .
Ferner können die erfindungsgemäßen Proteine, Derivate, Isoformen, Homologe, Fragmente oder DNA-Sequenzen nach bekannten
Verfahren chemisch synthetisiert werden. i
Die Erfindung betrifft ferner Antikörper, die in der Lage sind, mit den erfindungsgemaßen Proteinen, Derivaten, Homologen oder Fragmenten eine Immunreaktion einzugehen. Gemäß bevorzugten Ausfuhrungsformen sind diese Antikörper polyklonale oder monoklonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können mit Hilfe der erfindungsgemäßen hochreinen Proteine auf dem Fachmann bekannte Weise hergestellt werden. Derartige Antikörper lassen sich auf Basis der vollständigen Proteine sowie auf Basis von Fragmenten und aktiven Derivaten derselben herstellen, soweit diese die gleiche Antigenizität besitzen (vgl. Beispiel 5).
Die Antikörper können markiert sein und dem Nachweis der erfindungsgemäßen Proteine, Derivate, Homologe und Fragmente in vitro oder in vivo dienen. π
Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemaßen Proteine, Derivate, Homoigen, Fragmente, DNA-Sequenzen oder Antikörper als aktiven Wirkstoff enthalten. Neben dem aktiven Wirkstoff enthalten derartige pharmazeutische Zusammensetzungen in der Regel physiologisch verträgliche Trägerstoffe, die dem Fachmann bekannt sind. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine, Derivate, Homologen, Fragmente, DNA- Sequenzen, und Antikörper zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Diagnose männlicher Fortpflanzungsstörungen, zur Therapie männlicher Fortpflanzungsstörungen, insbesondere Infertilität, und zur Herstellung eines Medikamentes zur Kontrazeption.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden die erfindungsgemäßen komplementären DNA-Sequenzen als Anti-Sense-DNA-Moleküle zur Herstellung der oben genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, wobei die Anti-Sense-Moleküle geeignet sind, die Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in vivo zu unterdrücken .
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Modulation der Heparin- und Apolipo-Protein A-I Bindungen in der Epididymis verwendet . Besonders bevorzugt werden sie zur Modulation der Kapazitation von Spermien verwendet.
Mit der vorliegenden Erfindung wird somit eine neue Familie von Epididymis-spezifischen Proteinen zur Verfügung gestellt, die sich durch das Vorliegen von Heparin-Bindungsstellen auszeichnen. Die erfindungsgemäßen Proteine, DNA-Sequenzen und Antikörper können als reversibles männliches Kontrazeptivum eingesetzt werden, das post-testikulär wirkt und nicht in den Hormonhaushalt eingreift. Ein solches Kontrazeptivum ist im Stand der Technik nicht bekannt .
Die Erfindung wird im folgenden durch Figuren und Beispiele weiter erläutert. Beispiele
Beispiel 1
Klonierung neuer Epididymis-spezifischer cDNAs.
Eine Hund-Epididymis-cDNA-Bibliothek (Eilerbrock et al . , 1994) wurde unter Verwendung der in Kirchhoff et al . (1990) beschriebenen Subtraktions-Hybridisierungsstrategie durchsucht . Etwa 10 000 unabhängige cDNA-Klone wurden in geringer Dichte ausplattiert (ca. 500 pfu (plaque forming units) pro Platte) und mittels eines mehrstufigen Verfahrens durchsucht. Dabei wurden als Sonden 32P- markierte Einzelstrang-cDNA-Pools aus Hund-Epididymis verwendet. Als negative Kontrollen dienten 32P-markierte Einzelstrang-cDNA- Pools aus Leber, Testis und Lunge des Hundes. Epididymis-spezifische Plaques wurden durch sukzessives Verdünnen gereinigt, und die eingebaute cDNA wurde durch in vivo-Exzision, wie kürzlich beschrieben, gewonnen (Ellerbrock et al . , 1994). Die erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNAs wurden amplifiziert und gereinigt, und die cDNA-Klone wurden mittels Standardverfahren (Sambrook et al . , 1989) sequenziert. Dieses Verfahren führte zur Identifizierung einer neuen cDNA-Klonfamilie im Hund, die CE12 genannt wurde. Zwei Varianten mit Unterschieden im offenen Leseraster, CE12a und CE12b (Figur la bis c) konnten gefunden werden. Beide enthielten vier als Tandem angeordnete Fibronektin Typ II (Fn2 ) -Module. Diese Module waren ähnlich, aber nicht homolog gegenüber bekannten Fn2-Modulen anderer seminaler Plasmaproteine (Figur 2b) .
Ein in etwa 400 bp cDNA-Fragment , das CE12a und b gemeinsam war, wurde verwendet, um eine humane Epididymis-cDNA-Bibliothek (Kirchhoff et al . , 1993) zu durchsuchen. Dasselbe Vorgehen wäre mit einem 750 bp PCR-Produkt möglich, das mit den folgenden Primern gewonnen werden kann: 5 ' GATCTGTTTACTTCATCTTG3 ' (SEQ ID NO: 19) und 5'CCTTTATTGGTGGTTATGCC3' (SEQ ID NO: 20). Dies geschah mit dem Fachmann bekannten Verfahren (Sambrook et al., 1989). Eine Anzahl kreuzhybridisierender Klone (0,03 % der Bibliothek) wurde isoliert, die längsten cDNA-Inserts wurden in beide Richtungen sequenziert und die Sequenzen wurden verglichen. Die erhaltene HEl2-cDNA-Sequenz war beinahe 80 % identisch zu der CE12b-cDNA.
Da weder die CE12- noch die HEl2-cDNAs am 5 ' -Ende vollständig waren, wurde eine inverse PCR-Technik durchgeführt, um die noch fehlende Sequenzinformation zu erhalten. Dazu wurde eine modifizierte Technik angewendet, die kürzlich durch Gebhardt et al . (1999) beschrieben worden war. Humane und Hund-Epididymis-cDNAs , die aus Epididymis-RNA-Extrakten anderer Individuen hergestellt worden waren, wurden dabei verwendet. Antisense-Primer, deren Sequenz sich in den bekannten Sequenzen der partiellen cDNA-Klone befand, wurde für die Reverse Transkription verwendet (CE12-cDNA- Synthese-Primer: 5 'GTTGTTTTCATCCTCCATGC3 ' (SEQ ID NO: 13); HE12- cDNA-Synthese-Primer 5 'TCCATGCAATCAGAGACCAC3 ' (SEQ ID NO: 14)).
5 μg Gesamt-Epididymis-RNA wurden eingesetzt. Als Enzym wurde Superscript™ Reverse Transkriptase (Gibco-BRL, Karlsruhe, Deutschland) verwendet. Die Synthese des zweiten Stranges wurde mit E. coli-DNA-Polymerase nach Einbau von Strangbrüchen mit RNase H durchgeführt (beide Enzyme von Stratagene, Heidelberg, Deutschland) . Glatte Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase (Biolabs, Schwalbach/Taunus, Deutschland) hergestellt und mittels T4-DNA- Ligase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) ligiert, um die DNA zu konkate erisieren und/oder zirkularisieren. Die inverse PCR wurde unter Verwendung der folgenden Sense-Primer (CE12: 5 ' GTGAAACCAATGAGTATGG3 ' ( SEQ ID NO: 15 ) ; HE12 : 5 ' GTGGTGCTCAGT- CACCTCTG3 ' ( SEQ ID NO: 16)) und der entsprechenden Antisense- Primer (CE12: 5'GGTAATCGTCTGCCATGC3' (SEQ ID NO: 17); HE12: 5 ' CGTGGGTAATCTTCACTCTG3 ' ( SEQ ID NO : 18 ) ) durchgeführt .
Auf diese Weise wurden sechs unabhängige CE12 und vier unabhängige HE12 kodierende PCR-Produkte subkloniert und sequenziert. Alle HEl2-PCR-Produkte waren im Wesentlichen co-linear und endeten beinahe an derselben 5 '-Stelle. Ein Zusammensetzen der Sequenzen der aus der Bibliothek erhaltenen HE12-cDNA-Sequenzen und derjenigen der PCR-Fragmente ergab HE12-cDNA-Klon, der 1025 Nukleotide lang war .
Der HE 12 Klon weist einen offenen Leserahmen (ORF) von 223 Kodons mit einem ATG-Startkodon bei Nukleotiden 156-158 und einem TGA-Stopkodon bei Nukleotiden 825-827 (Figur 2a) auf. Auf den ORF folgt eine 198 Nukleotid lange 3' untranslatierte Region, die ein AATAAA-Polyadenylierungssignal bei den Nukleotiden 1010-1015 enthält. Der ORF ergibt ein neues humanes epididymales Protein. Dieses umfasst ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäure 1-23), das für sekretorische Proteine typisch ist, und das sofort von vier im Tandem angeordneten Fn2-Motiven gefolgt wird (Figur 2b) .
Im Gegensatz dazu ergaben sich verschiedene CE12 RT-PCR-Fragmen- te, die aus einem mRNA-Längenpolymorphismus resultierten. Diese Fragmente wiesen unterschiedliche 5 ' -UTRs und extensive Deletionen oder Insertionen auch innerhalb ihrer ORFs auf, was zu mindestens zwei verschiedenen CE12-Proteinen führt (Figur lb, c) . Ein Zusammenbau der erhaltenen Sequenzen ergab einen CE12a-cDNA- Klon mit 1343 Nukleotiden (Figur la) . Der ORF in dieser langen cDNA-Variante beginnt bei Nukleotid 129 und enthält zwei Methionine im Leserahmen bei Positionen -39 und -23, wobei das zweite der Position des Startmethionins der HE12-cDNA-Sequenz in Figur 2a homolog ist. Nur wenn dieses Methionin als Startkodon angenommen wird, kann eine klare Signalpeptidsequenz aus - der Sequenz herausgelesen werden. Außerdem wurden CE12-cDNA-Klone erhalten, die unterschiedliche 5 '-UTRs aufweisen, in denen es nur ein, nämlich das zweite ATG-Startkodon gab. Daher wird angenommen, dass diese jeweiligen CE12-Sequenzen unterschiedliche Promotoren aufweisen.
Ein weiterer Polymorphismus bei den CE12-Klonen wurde unmittelbar nach der angenommenen Signalpeptidsequenz aufgefunden, was wahrscheinlich zu unterschiedlichen N-Termini bei den CE12-Klonen führte. Die CE12a- und b-Klone unterscheiden sich durch 22 Kodons die entweder in den cDNAs vorhanden oder abwesend sind und' für die es kein Gegenstück in der HE12-cDNA-Sequenz gibt (Figur 2). Die zwei Varianten an CE12-cDNAs kommen mit einer Frequenz von 1 : 3 vor. Der N-Terminus , wie er für CE12a abgeleitet wurde, enthält eine Konsensus-Sequenz für eine N-Glykosylierungsstelle bei Asparagin +4 (Asn +4), diese Stelle fehlt in CE12b (Figur lc ) . Die Aminosäuren, die sich aus dem unmittelbar folgenden Kodon ergeben, können entweder D oder N sein (Figur lc). Das Auftreten von kleineren, etwa 1 kb CE12-mRNAs im Northernblot (siehe unten) macht es möglich, dass es zusätzliche Längen Polymorphismen auch im 3' untranslatierten Bereich gibt, was allerdings durch die gefundenen cDNA-Klone nicht bestätigt wurde. Allerdings erscheint der 3'-UTR der CE12-mRNA deutlich länger als derjenigen der HEl2-mRNA und enthält zwei mögliche Polyaden- ylierungssignale, von denen nur das erste zu dem humanen Gegenstück homolog ist. Auf der anderen Seite waren die Sequenzen, die für die Fn2-Motive kodieren, in allen CE12-cDNA-Varianten identisch und auch zu entsprechenden Regionen der HE12-CDNA hochhomolog (etwa 85 % Sequenzidentität) (Figur 2b) . Ein Vergleich der vorhergesagten CE12- und HEl2-Proteinsequenzen mit denjenigen der BSP-Al/PDC-109 und BSP-A3 seminalen Plasmaproteine (Zugangsnummern P02784 und P04557) ergab eine Sequenzidentität von unter 55 %. Dies schließt auch jegliche Kreuzhybridisierung mit den BSPs auf Nukleinsäureebene unter den in dieser Studie verwendeten Stringenzbedingungen aus .
Beispiel 2
Analyse der Struktur der epididymischen , ' Fibronektin Typ II-Domänenproteine auf cDNA-Ebene
Da Proteine, die vier in einem Tandem angeordnete Fn2-Motive enthalten, bislang unbekannt waren, wurden PCR-Analysen durchgeführt, um die Möglichkeit auszuschließen, dass Klonierungs- artefakte während der Herstellung der Bibliotheken auftraten. Oligonukleotidprimerpaare wurden in der RT-PCR-Analyse verwendet. Die RT-PCR wurde gemäß Standardmethoden durchgeführt. Die folgenden Primerpaare wurden für die Amplifizierung von CE12-, HE12- und EQ12-cDNA-Fragmenten aus 1 μg fötaler epididymaler^ RNA verwendet :
CE12: 750 bp Produkt; verwendete Primer 5 ' GATCTGTTTACTTCATCTTG3 ' (SEQ ID NO: 19) und 5 'CCTTTATTGGTGGTTATGCC3 ' (SEQ ID NO: 20);
HE12: 837 bp Produkt; verwendete Primer 5 'CAACCTTCCTTCTCTATTCC3 ' (SEQ ID NO: 21) und 5 ' TCAAGACTCCTTTATTGGTG3 ' ( SEQ ID NO: 22);
EQ12: 752 bp Produkt; verwendete Primer 5 'GGGTCTTCTTACTTCTCTTG3 ' (SEQ ID NO: 23) und 5 'TCCTTTATTGGTGGTTATGCAC3 ' (SEQ ID NO: 24).
Jedes der Produkte enthielt diejenigen cDNA-Regionen, die für vier Fn2-Motive kodieren. Wie dargestellt, wurden epididymische cDNAs vom Menschen und Hund für die PCR-Amplifikation verwendet. Als zusätzliche Kontrolle, um jegliche Kontamination von cDNA- Proben auszuschließen, wurde ein entsprechendes Primerset auch bei der epididymalen Pferde-cDNA-Präparation verwendet. In jedem Fall wurde eine amplifizierte Sequenz von etwa 800 bp erhalten. Subklonieren und Sequenzieren bestätigte das Vorkommen von epididymalen mRNAs, die für vier hochkonservierte, im Tandem angeordnete Fn2-Motive kodieren. Solche Proteine traten nicht nur bei Menschen und beim Hund, sondern auch im Pferd auf (siehe Figur 2c). Während der RT-PCR-Analysen der humanen epididymalen cDNA wurden auch kürzere PCR-Fragmente beobachtet, aber in wesentlich geringeren Mengen. Subklonieren und Sequenzieren dieser Fragmente ergab, dass sie von Varianten abstammten, die weniger als vier Fn2-Motive enthielten. Diese Varianten enthalten höchstwahrscheinlich drei oder ein Fn2-Modul, wobei die Variante mit nur einem Fn2-Modul in wesentlich geringeren Mengen vorkommt. Entsprechende Produkte im Hund und im Pferd konnten nicht gefunden werden. Beispiel 3
Untersuchung der Gewebeverteilung von CE12- und HE12-mRNAs durch Northern Blo -Analyse
Northern Blot-Analysen wurden mit Gesamt-RNA-Extrakten von verschiedenen Hund- und menschlichen Geweben durchgeführt, um die Verteilung der CE12- und HE12-mRNAs zu untersuchen (Figuren 3 und 4). RNA von verschiedenen Geweben wurde in 15 bis 20 Volumen einer chaotropen Lösung wie in Pera et al . (1996) beschrieben extrahiert. 5 bis 10 μg der Gesamt-RNA/Spalte, abhängig vom Experiment-Typ, wurden mittels denaturierender Agarose-Gelelek- trophorese aufgetrennt und auf Amersham-Buchler, Braunschweig, Deutschland) Nylonmembranen transferiert. Gleiche Mengen an RNA wurden durch Ethidiumbromidanfärben vor dem Transfer sichergestellt. Digoxigenin (DIG) -markierte cDNA-Proben wurden durch PCR- Amplifikation von gereinigten Fragmenten entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Boehringer, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt:
CE12, 404 bp Produkt; verwendte Primer 5 'CTCTCCTTGGTGTGCAACC3 ' (SEQ ID NO: 25) und 5 ΑAGTGGCAGGGAAAGCCAG3 ' (SEQ ID NO: 26);
HE12, 400 bp Produkt; verwendete Primer 5 'CAACCTTCCTTCTCTATTCC3 ' (SEQ ID NO: 27) und 5 'TCCATGCAATCAGAGACCAC3 ' (SEQ ID NO: 28);
CE1, 730 bp Produkt; verwendete Primer 5 'AAGCAGCAGAGCTGGAG3 ' (SEQ ID NO: 29) und 5 'AATGTCACCTTCACCAG3 ' (SEQ ID NO: 30);
CE4, 370 bp Produkt; verwendete Primer 5 'ACGCAGGAGTGCGTCTCGGA3 ' (SEQ ID NO: 31) und 5 'AGCGGTCACTTTATTGGTTG3 ' (SEQ ID NO: 32).
Die PCR-Reaktionen wurden wie beschrieben durchgeführt (Pera et al. 1996). Die Hybridisierung mit den nichtradioaktiven Proben wurde unter Verwendung des DIG Labbeling-Kit (Boehringer, Mannheim) wie kürzlich beschrieben durchgeführt (Pera et al . , 1996).
Es ergab sich, dass in beiden Arten (Mensch und Hund) die mRNAs nur in der Epididymis , aber nicht in den anderen untersuchten Geweben vorhanden waren, wobei die untersuchten Gewebe Testis, seminale Vesikel und Prostata einschlössen (Figuren 3 und 4). Eine einzige hybridisierende Bande von etwa 1,1 kb wurde in humanen epididymischen Extrakten gefunden, während mindestens zwei oder mehrere hybridisierende Banden in Hund-epididymaler RNA-Präparationen vorhanden waren. Die Banden bei der Hunde-mRNA traten in einen breiten Bereich von etwa 1,0 bis 1,5 kb auf, was die Annahme unterstützt, dass beim Hund ein Längenpolymorphismus bei der CEl2-mRNA auftritt.
Das Expressionsmuster der humanen und Hund-mRNAs wurde entlang der Länge der Epididymis untersucht. HE12-mRNA wurde in allen Regionen der humanen Epididymis gefunden, obwohl ein höherer Gehalt in den proximaleren Teilen des Organs gefunden wurde (Figur 4). In der Hunde-Epididymis diente CE4-mRNA, von der bekannt ist, dass sie in allen Regionen des Organs vorhanden sind (Beiglböck et al., 1998; Gebhardt et al . , 1999) als interne Kontrolle (Figur 3) . Die Regionalisierung der CEl2-Expression war deutlicher im Hund als im Menschen, und alle CE12-hybridisierenden mRNAs zeigten dasselbe Muster mit einer maximalen Expression in der Corpus-Region. Unter unilateral-kryptorchiden Bedingungen, bei denen ein Testis plus Epididymis im Abdomen verbleibt, wurden normale Mengen und Expressionsmuster der mRNA in der skrotalen Epididymis beobachtet, die als Kontrolle diente. Eine Reduktion der CE12-mRNA-Mengen wurde in den abdominalen Organen gefunden. Wenn man die verschiedenen Regionen der Hunde-Epididymis betrachtet, war die Reduktion am deutlichsten in der Caput-Region während die CEl2-mRNA-Mengen im Korpus nicht betroffen schienen (Figur 3) .
Eine Hybridisierung unter geringen Stringenzbedingungen unter Verwendung heterologer DIG-markierter CE12-CDNA als Probe zeigte, das kreuzhybridisierende mRNAs in den Epididymis anderer SäUger- arten einschließlich Mensch, Rind, Pferd, Schwein und Affe (Macaca mullata) (Figur 5a, b) vorhanden sind. Obwohl nicht im Detail untersucht, wurden die größten Mengen im Schweine-Nebenhoden in der Caput-Region gefunden, was eine Ausnahme im Vergleich zu den anderen Säugern darstellt. Keine Kreuzhybridi- sierung mit entweder CE12- oder HE12-cDNA-Proben wurde mit RNA- Extrakten aus Nagern, Kaninchen und Meerschweinchen-Epididymiden gefunden.
Beispiel 4
Lokalisierung von CEl2-ιαRNAs durch in situ-Hybridisierung
Die Epididymis von zwei Hunden mittlerer Größe wurden in Bouin- Lösung 6 Stunden lang inkubiert, in 70 % Ethanol gewaschen und in Paraffinwachs eingebettet. 5 bis 7-μm-Sektionen wurden hergestellt und einer nichtradioaktiven Hybridisierungsprozedur wie beschrieben (Beiglböck et al . , 1998; Gebhardt et al . , 1999) unterworfen, unter Verwendung von in vitro markierten Sense und Antisense cRNA-Proben von subklonierten AccI/Xbal-verdauten CE12- cDNA-Fragmenten, die 404 bp des offenen Leserahmens umfassten (Nukleotide 295-669, vgl. Figur 1). Die Markierung wurde in Gegenwart von Digoxigenin-UTP (Boehringer-Mannheim) durchgeführt. Die Detektion wurde wie vom Hersteller vorgeschlagen durchgeführt. Alternative Methoden sind dem Fachmann bekannt (Kirchhoff et al . 1991; Pera et al . 1994; ansonsten: siehe oben). Negative Kontrollen wurden parallel an benachbarten Schnitten durchgeführt, unter Verwendung der entsprechenden Digoxigenin-markierten Sense-Strang-cRNAs . Die Schnitte wurden mittels Lichtmikroskopie analysiert.
CE12-Transkripte wurden in Gewebsschnitten der Hund-Epididymis lokalisiert (siehe Figur 6a und b) . Die in sitiz-Hybridisierung zeigte eine starke und hochspezifische Markierung des Epithels des epididymalen Kanals , während das Lumen des Kanals , das die Spermatozon enthält, und das Gewebe zwischen dem Kanal kein Signal zeigten. Innerhalb des Epitheliums war das Signal im basalen Gebiet am stärksten. In guter Übereinstimmung mit den Northernblot-Resultaten wurde die maximale Färbung im distalen Caput und im Corpus gefunden, während der proximale Caput unmarkiert erschien und die distalen Teile des Organs nur schwach markiert waren (Figuren 7a-d) . X'
Beispiel 5
Herstellung von Antikörpern
Ein 20 mer Oligopeptid (NH2-SSFDENQQWKYCETNEYGGN-C00H) das von der CE12a-DNA-Sequenz abgeleitet worden war (Aminosäuren 103-122, vgl. Figur 1) wurde als Immunogen ausgewählt. Die Herstellung der Antikörper erfolgte wie kürzlich beschrieben (Kirchhoff et al . 1996). Nach Kopplung an KLH (keyhole limpet hemocyanine) wurde das Konjugat in Hühnereier, Meerschweinchen und Kaninchen gespritzt. Die Tiere wurden nach 120 Tagen Immunisierung getötet, die Immunsera wurden gesammelt und bei 4°C unter Verwendung von Thimorosal als Konservierungsmittel gelagert.
Das Peptid wurde auf Basis seiner vorhergesagten hohen Antigenizität und minimaler Kreuzreaktivität mit anderen Proteinen ausgewählt. Außerdem erscheint dieses Peptidepitop zwischen den Arten hochkonserviert (Figur 2b) .
Beispiel 6
Proteinherstellung und Westernblot-Analyse
Rohe Proteinextrakte wurden aus pulverisiertem epididymalen Gewebe, epididymaler Flüssigkeit oder gewaschenen Spermatozon hergestellt, und in gleich großen Aliquots bei -80°C gelagert. Proteinextrakte von humanen Spermienmembranen wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt (Alexander und Bearwood, 1984). Proben von 5 bis 10 μl Proteinextrakt (abhängig von der Proteinkonzentration oder der Spermienanzahl ) wurden auf 15%igen SDS-Poly- acrylamidgelen aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (Amersham, Braunschweig, Deutschland) unter Verwendung eines diskontinuierlichen Puffersystems mit einem halbtrockenen Blotter (Phase, Lübeck, Deutschland) transferiert. Immunodetektion wurde durch einstündiges Blockieren der Membran in l%iger Blockierungslösung (Boehringer-Mannheim) , gefolgt durch Inkubation mit einem Meer- schweinchen-Antiserum (siehe oben, Verdünnung 1 : 5000) durchgeführt. Antikörperbindung wurde durch einen Peroxidase-gekoppel- ten Ziege-anti-Meerschweinchen-Antikörper festgestellt (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) . Alternative Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
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Proteinextrakte von Hund-epididymalen Gewebe sowie Proteinextrakte von epididymalem Spermium des Hundes waren für CE12 verwandte Antigene positiv (Figur 8a-c) . Multiple immunreaktive Banden mit einem Molekulargewicht im Bereich von 30 bis 35 kDa wurden in jeder Proteinprobe mit Ausnahme der Proteinextrakte der Spermien aus dem Caput identifiziert. Starke Banden und ebenfalls in humaner epididymaler Flüssigkeit festgestellt werden, die aus der Cauda-Region entnommen wurde, und auch in Membranproteinpräparationen von humanem evakuliertem Sperma. Diese Reaktionen konnten durch chemosynthetische Peptide kompetitiert werden (Figur 8).
Beispiel 7
Nachweis des HE12-Proteins im humanen Nebenhoden
Kryostat-Schnitte (8 μm) der Epididymis von Prostata-Karzinom- Patienten wurden erstellt und für 18 Stunden bei 8 °C mit dem C12-3-Antiserum aus Kaninchen inkubiert. Die Antikörper mit Spezifität für das HE12-Protein wurden durch Fluorochrom-kon- jugierte Antikörper (Cy2-Immunfluoreszenz ; Dianova, Amersham) sichtbar gemacht. Beide Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1 : 100 eingesetzt.
Querschnitte durch den Nebenhodengang im distalen Bereich werden als Immunfluoreszenzaufnahmen in Figur 9(a) bis (i) dargestellt. Dabei zeigt (a) den Querschnitt durch den Nebenhodengang im distalen Bereich; (b) die vergleichbare Region eines anderen Patientengewebes; (c) und (d) vergleichbare Regionen zweier Anti- Androgen-behandelter Patienten; (e) eine Negativkontrolle, bei der der Nebenhoden mit einem Pre-C12-3-Serum (1 : 100 verdünnt) inkubiert wurde .
Figur 10 zeigt das entsprechende Ergebnis bei Analyse der Epididymis eines gesunden Hundes . Vor Inkubation mit dem Antikörper (als "Pre" bezeichnet) ergibt sich eine gleichmäßige Färbung der Epididymis (LU = Lumen; EP = Epithel).
Zusammengefaßt kann festgestellt werden, dass HE12 primär in den Epithelzellen exprimiert und in das Lumen abgegeben wird.
Beispiel 8
Nachweis von HE12 auf humanen Spermien
Um zu zeigen, dass HE12 an humane Spermien bindet wurden LIS-Membran-Extrakte der Spermien einer zwei dimensionalen elektrophoretischen Auftrennung (2-DE) unterworfen, durch die HE-12-spezifischen Antikörper markiert und sichtbar gemacht. Wie Fig. 11 (a) zeigt, lassen sich mittels dieses Verfahrens sechs verschiedene Isoformen nachweisen.
Um nähere Informationen zu der Art der Bindung zu erhalten, wurde versucht, die an Spermien gebundenen HE12 Proteine durch Waschen I \ ' zu entfernen. Die jeweils zum Waschen verwendeten Lösungen wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und unter Verwendung des Wester-Blot- Systems auf Gegenwart des HE12 hin analysiert. Wie in Fig. ll(b) gezeigt, lässt sich der größte Teil der Spermien-bindenden Proteinfraktion durch 0,6 M NaCl-Waschpuffer ablösen (Sw) . Eine kleinere Fraktion bleibt jedoch auch danach auf der Spermienmem- bran (Sp) gebunden und lässt sich auch nicht durch wiederholtes Waschen ablösen (Wt) .
Kurze Beschreibung der Figuren
Figur 1 cDNA-Sequenzen und abgeleitete Peptidsequenzen von CE12-Varianten, a) Sequenz der vollständigen CEl2a- cDNA (obere Sequenz) und vorhergesagte Peptidsequenz (untere Sequenz). Der Pfeil zeigt auf die wahrscheinliche Abtrennungsstelle des Signalpeptids . Die Aminosäuresequenz, wie abgeleitet von dem ersten Methionin im Leserahmen, ist in grau gezeigt. Die Sequenz, die für Synthese des Oligopeptids verwendet wurde, ist unterstrichen. Zwei Polyadenylierungssignale sind im 3'UTR unterstrichen, b) Sequenzen der CE12-Varianten am 5 '-Ende, ermittelt durch inverse PCR (ausschließlich Primer) . Die 5 '-Regionen der zwei aus der Bibliothek erhaltenen Klone (CE12a und b und der sechs aus der PCR-stammenden Klone (Cinv 1 (SEQ ID NO: 6), 4 (SEQ ID NO: 8), 6 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 9), 11 (SEQ ID NO: 10), 12 (SEQ ID NO: 11) sind einander gegenübergestellt, c) Gegenüberstellung der Aminosäuresequenzen der CE12-cDNA-Varianten. 1-23: Signalpeptidsequenz; 24-45: N-terminale Extension von CEl2a. Römische Zahlen (I-IV) bezeichnen Fn2-Module (CEl2b: SEQ ID NO: 33; CE12c: SEQ ID NO: 34).
Kurze Striche zeigen sowohl Deletionen, die in CEl2b- und c-Varianten gefunden wurden, als auch Unterschiede in den Zwischenräumen zwischen den Fn2-Motiven an. Gepunktete Linien zeigen identische Aminosäuresequenzen an. Der Pfeil zeigt die verschiedenen N-terminalen Aminosäuren an.
Figur 2 cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz von HE12 verglichen mit homologen Sequenzen aus Tieren, a) Sequenz der vollständigen HE12-CDNA und der vorhergesagten Proteinsequenz. b) Vergleich der vorhergesagten humanen (HE12), Hund (CE12), und Pferd (EQ12) Fn2- Modulproteine mit der Aminosäuresequenz an BSP- A1/A2=PDC-109 (Zugangsnummer P02784)
Figur 3 Northernblot-Analysen der Gewebeverteilung von CE12- mRNAs, gezeigt durch nichtreaktive Hybridisierung. a) Expressionsmuster von CE12-mRNAs in Gesamt-RNA-Extrak- ten von verschiedenen Hundgeweben unter Verwendung einer DIG-markierten Probe (obere Tafel) . Ly= Lymphknoten; Mu= Muskel; Di= Diaphragma; Sp= Milz;jj Lu= Lunge; Li= Leber; 0v= Eierstöcke; Te= Hoden; El= Epididymis Hund 1; E2= Epididymis Hund 2; Du= Ovidukt; Ut= Uterus. Gleiche Beladung (10 μg/Reihe) und die Integrität der ribosomalen RNA (28S und 18S) wurde durch Ethidiumbromidfärbung des Gels vor dem Blotting sichergestellt (untere Tafel) . b) Expressionsmuster von CE12 (1,0 bis 1,4 kb) und CE4 (0,7 kb) mRNAs in verschiedenen Regionen des Hund-Epididymis und als Antwort auf die kryptorchide Situation.
Figur 4 Northernblot-Analysen der Gewebeverteilung von HE12, gezeigt durch nichtradioaktive Hybridisierung. Expression von HE12-mRNA wurde in Gesamt-RNA-Extrakten von verschiedenen humanen Geweben und verschiedenen Regionen des humanen Epididymis unter Verwendung einer' DIG- markierten HEl2-Probe untersucht (obere Tafeln) . Pr= Prostata; Sv= seminale Vesikel; Ep= Epididymis; Te= Hoden; De= Decidua; Ki= Niere; Th= Thymus ; Pi= Hirnanhangdrüse; Ln=LnCap-Zellen; Ca= Caput epididymis; Co= Corpus epididymis; Cu= Cauda epididymis. Gleiche Beladung (10 μg/Spalte) und Integrität der ribosomalen RNA (28S und 18S) wurden durch Ethidiumbromidfärbung des Gels vor dem Blotten sichergestellt (untere Tafeln) . i
Figur 5 Northernblot-Analyse zur Bestimmung der Kreuzhybridi- sierung von CE12- und HEl2-cDNA-Proben zwischen verschiedenen Arten, a) Gesamtextrakte epididymaler RNA neun verschiedener Arten wurden mit einer DIG-markierten CE12-Probe unter nichtstringenten Bedingungen hybridisiert. Spalte 1: Mensch; Spalte 2: Hengst; Spalte 3: Rind; Spalte 4: Eber; Spalte 5: Ratte; Spalte 6: Maus; Spalte 7: Kaninchen; Spalte 8: Meerschweinchen (degradiert!); Spalte 9: Hund, b) Spalten 1-3: Hengst Caput, Corpus und Cauda epididymis; Spalte 4-5: Eber caput, Corpus und Cauda epididymis; Spalten 6: Stier; Spalte 7: Meerschweinchen (degradiert); Spalten 8-10: Caput, Corpus und Cauda epididymis von Macaca mullata (hybridisiert mit HE12-CDNA- Probe) . Gleiche Beladung (10 μg/Spalte) und Integrität der ribosomalen RNA (28S und 18S) wurde durch Ethidiumbromidfärben des Gels vor dem Blotten sichergestellt (untere Tafeln) .
Figur 6 Lokalisierung von CE12-Transkripten im Ductus epi- theliu des Corpus epididymis des Hundes durch nichtradioaktive in sϊtu-Hybridisierung unter Verwendung DIG-markierter cRNA-Proben. a) mRNA, die mit CE12- Antisense-cRNA hybridisiert, wurde in Gewebsschnitten unter Verwendung eines Alkalinephosphatase-konjugier- ten anti-DIG-Antikörpers in normaler Hell-Lichtmikro- skopie detektiert. b) Benachbarte Sektionen, die mit DIG-markierten CE12-Sense-Kontroll-cRNA hybridisiert wurden, waren negativ. Der Balken stellt 50 μm dar.
Figur 7 Region-abhängige Unterschiede in der CE12-Transkript- konzentration in der Hund Epididymis, gezeigt durch in sϊiu-Hybridisierung unter Verwendung DIG-markierter CE12-Antisense-cRNA. a) Proximale Caput epididymis; b) Proximaler Corpus epididymis; c) Mitte bis distaler Corpus epididymis; d) Cauda epididymis. Der Balken stellt 100 μm dar. n
Figur 8 Westernblot-Analyse von mit CE12 verwandten Antigene unter Verwendung eines Antipeptid-Antiserums von Meerschweinchen (Verdünnung 1 : 500). a) Multiple, immuno- gefärbte Banden wurden zwischen 30 und 35 kDa in rohen Proteinextrakten von Hund-Epididymis beobachtet, die nicht mit Prä-Immunserum reagierten. Die Färbung wurde durch CE12-Peptide (20 μg/ml) kompetitiert . P= Prä- Immunserum; T= Test-Antiserum; C= Kompetitionsexperi- ment. Eine breite immunreaktive Bande von etwa derselben Größe wurde in der Cauda des Hundes beobachtet, aber nicht in epididymalen Sperm-Proteinextrakten des Caput epididymis. Ca= Caput Spermextrakt; Cu= Spermextrakt, b) Eine breite Bande von derselben Größe wurde auch in Proteinextrakten aus humaner caudaler epididymaler Flüssigkeit beobachtet, aber nicht!! vom Corpus, und in LIS-Extrakten von gewaschenem humanem ejakuliertem Sperma. Diese immunpositive Probe wurde durch das chemosynthetische CE12-Oligopeptid kompetitiert. Co= Flüssigkeit aus epididymalem Corpus; Cu= Flüssigkeit aus epididymaler Cauda. Sp= Sperma, keine Kompetition; C= Kompetitionsexperiment .
Figur 9 Immunfloureszenz-Nachweis des HE12 im Nebenhoden von Patienten mit Prostata-Karzinom; (a) Querschnitt durch den Nebenhodengang im distalen Bereich; (b) vergleich- bare Region eines anderen Patientengewebes; (c) und (d) vergleichbare Regionen zweier Anti-Androgen- behandelter Patienten; (e) Negativkontrolle, Nebenhoden mit einem Pre-C12-3-Serum (1 : 100 verdünnt) inkubiert .
Figur 10 Immunfloureszenz-Nachweis des HE12 im Nebenhoden eines gesunden Hundes; vor Inkubation mit dem Antikörper ("Pre"), LU = Lumen; EP = Epithel.
Figur 11 (a) : an Spermien gebundenes HE12 nach zwei dimensiona- ler elektrophoretischer Auftrennung; (b) SDS-PAGE und Western-Blot der Waschlösungen; 0,6 M NaCl-Waschpuffer Sw; Spermienmembran Sp; wiederholtes Waschen Wt.
Referenzen
1. Alexander NJ, Bearwood D. An immunosorption assay for anti- bodies to spermatozoa: comparison with agglutination and immobilization tests . Fertil Steril 1984; 41: 270-276.
2. Altschul, SF et al . (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Research 25:3389-3402.
3. Banyai L, Tordai H, Patthty L. Structure and do ain-domain interactions of the gelatin binding site of human 72-kilo- dalton type IV collagenase (gelatinase A, matrix metallo- proteinase 2). J Biol Chem 1996; 271: 12003-12008.
4. Beiglböck A, Pera I, Eilerbrock K, Kirchhoff C. Canine epididymis-specific mRNA encoding secretory glutathione peroxidase-like protein. J Reprod Fertil 1998; 112: 357- 367.
5. Chandonnet L, Roberts KD, Chapdelaine A, Manjunath P. Identification of heparin-binding proteins in bovine seminal plasma. Mol Reprod Dev 1990; 26: 313-318.
6. Constantine. KL, Madrid M, Banyai L, Trexler M, Patthy L, Llinas M. Refined solution structure and ligand-binding properties of PDC-109 domain b. A collagen-binding type II do ain. J Mol Biol 1992; 223: 281-298.
7. Desnoyers L, Manjunath P. Major proteins of bovine seminal plasma exhibit novel interactions with phospholipid. J Biol Chem 1992; 267: 149-155.
8. Eilerbrock K, Pera I, Härtung S, Ivell R. Gene expression in the dog epididymis : a model for human epididymal function. Int J Androl 1994; 17: 314-323.
9. Gebhardt K, Ellerbrock K, Pera I, Ivell R, Kirchhoff, C. Differential expression of novel abundant and highly regio- nalized mRNAs of the canine epididymis . J Reprod Fertil 1999; 116: 391-402.
10. Kirchhoff C, Krull N, Pera I and Ivell R. A major mRNA of the human epididymal principal cells, HE5, encodes the leucocyte differentiation CDw52 antigen peptide backbone. Mol Reprod Dev 1993; 34: 8-15. '.._■
11. Kirchhoff C. Molecular characterization of epididymal proteins. Reviews of Reproduction 1998; 3: 86-95.
12. Manjunath P, Marcel YL, Uma J, Seidah NG, Chretien M, Chap- delaine A. Apolipoprotein A-I binds to a family of bovine seminal plasma proteins. J Biol Chem 1989; 264: 16853- 16857.
13. Müller P, Erlemann KR, Müller K, Calvete JJ, Töpfer-Peter- sen E, Marienfeld K, Herrmann A. Biophysical characterization of the interaction of bovine seminal plasma protein PDC-109 with phospholipid vesicles. Eur Biophys 1998; 27: 33-41. ,-,
14. Parrish JJ, Susko-Parrish J, Winer MA, First NL. Capacita- tion of bovine sperm by heparin. Biol Reprod 1988; 38: 1171-1180.
15. Pera I, Ivell R, Kirchhoff C. Regional Variation of gene expression in the dog epididymis as revealed by in situ transcript hybridization. Int J Androl 1994; 17: 324-330.
16. Sambrook et al . , Molecular cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
17. Therien I, Moreau R, Manjunath P. Bovine seminal plasma phospholipid-binding proteins stimulate phospholipid efflux from epididymal sperm. Biol Reprod 1999; 61: 590-598.
18. Therien I, Bleau G, Manjunath P. Phosphatidylcholine- binding proteins of bovine seminal plasma modulate capaci- tation of spermatozoa by heparin. Biol Reprod 1995; 52: 1372-1379.
19. Töpfer-Petersen E, Calvete JJ, Sanz L, Sinowatz F. Carbohy- drate- and heparin-binding proteins in ma malian fertiliza- tion. Andrologia 1995; 27: 303-324. BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
IHF
Institut für Hormon- und Fortpflanzungs-Forschung GmbH Grandweg 64
EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG,
22529 Hamburg ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen- Von der INTERNATIONALEN' HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: pCE12
DSM 13473
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen)
III. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2 000 - 04 - 2 8 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Eret- hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung m eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschriften) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift. Mascheroder Weg 1b D-38124 Braunschweig (/r
Datum 2000 - 05 - 05
' Falls Regel 6 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 BUDAPb bR VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
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LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG
22529 Hamburg ausgestellt gemäß Regel 102 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I HINTERLEGER II KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name. IHF Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
Institut für Hormon- und zugeteilte EINGANGSNUMMER Anschrift Fortpf lanzungs - Forschung GmbH DSM 13473 Grandweg 64
Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung':
22529 Hamburg 2000 - 04 - 28
III LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 2 00 0 - 05 - 03 2 geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)1 lebensfähig
( y~ nicht mehr lebensfähig
IV BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Perεon(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten.
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38I24 Braunschweig
Datum 2000 - 05 - 05
Angabe des Datums der Ersthinterlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung
In den in Regel 102 Buchstabe a Ziffer n und in vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprüfiing
Zutreffendes ankreuzen
Ausf llen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 01 6 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
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22529 Hamburg ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER pHE12
DSM 13474
II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen)
III EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2 00 0 - 04 - 2 8 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung m eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschriften) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befhgten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Anschrift Mascheroder Weg lb D-38I24 Braunschweig
Datum 2000 - 05 - 05
' Falls Regel 6 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
IHF
Institut für Hormon- und Fortp lanzungs-Forschung GmbH Grandweg 64
LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG
22529 Hamburg ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name: IHF Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
Institut für Hormon- und zugeteilte EINGANGSNUMMER: Anschrift: Fortpflanzungs-Forschung GmbH DSM 13474 Grandweg 64
Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung1:
22529 Hamburg 2000 - 04 -28
III. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 2 000 - 05 - 03 2 geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)1 lebensfähig
( )' nicht mehr lebensfähig
IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST"
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschriften) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befügten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig X
Datum: 2 0 00 - 05 - 05
Angabe des Datums der Erstliinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfung.
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196

Claims

Patentansprüche
1. Epididymis-spezifisches Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
2. Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Derivat, eine Isoform oder ein Homologes des Proteins nach Anspruch 1 ist, das
a) die gleiche Epididymis-Spezifität und Antigenizität aufweist und
b) im Vergleich zu der in SEQ ID NO 2 angegebenen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 55 % aufweist.
3. Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es dieselbe biologische Wirksamkeit wie das Protein nach Anspruch 1 aufweist .
4. Protein nach den Ansprüchen 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Spezies aus der Gruppe bestehend aus Hund, Pferd, Schwein, Primaten und Rind stammt.
5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die in SEQ ID NO: 4, 33 oder 34 dargestellten Sequenzen aufweist .
6. Protein nach den Ansprüchen 2 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Fibronektin Typ II Modul aufweist.
7. Protein nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es vier Fibronektin Typ II Module aufweist.
8. Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Fragment der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 7 ist und die gleiche biologische Wirksamkeit und/oder Antigenizität aufweist.
9. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie für ein Protein nach den Ansprüchen 1 bis 8 kodiert .
10. DNA-Sequenz nach Anspruch 9, ausgewählt aus
\ X a) der in SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3, 5 oder 12 angegebenen Nukleotidsequenz ,
b) zu den vorgenannten Sequenzen homologen Sequenzen mit einem Homologiegrad von mindestens 55%, und
c) syngenen oder komplementären Sequenzen der Sequenzen gemäß a) oder b) , oder Fragmenten derselben, soweit sie für Proteine oder Polypeptide mit gleicher biologischer Wirksamkeit und/oder Antigenizität kodieren.
11. DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in SEQ ID NO: 6 bis 11 dargestellten Sequenzen umfaßt.
!
12. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Fragment der in den SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 12 angegebenen DNA- Sequenzen ist und sie eine Länge von mindestens 40 Nukleinsäuren aufweist.
13. Mikororganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er in die Hinterlegungsnummer DSM 13473 oder DSM 13474 hat.
14. DNA-Sequenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie in dem Mikroorganismus nach Anspruch 13 enthalten ist.
15. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 enthält .
16. Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass er die Sequenzen in solcher Weise insertiert enthält, dass deren Expression in geeigneten Wirtsorganismen erfolgen kann.
17. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Vektor nach Anspruch 15 oder 16 transformiert ist.
18. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine prokaryo- tische oder eukaryotische Wirtszelle ist.
19. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Wirtszellen nach Anspruch 17 oder 18 unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression der DNA-Sequenz erlauben, und man das Expressionsprodukt gegebenenfalls aus dem Kulturansatz gewinnt.
20. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, mit einem Protein nach den Ansprüchen 1 bis 8 eine Immunreaktion einzugehen.
21. Antikörper nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.ij
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eines oder mehrere der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8 als aktiven Wirkstoff enthält.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 als aktiven Wirkstoff enthält.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere der Antikörper nach Anspruch 20 oder 21 als aktiven Wirkstoff enthält.
25. Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8, der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 oder der Antikörper nach den Ansprüchen 20 oder 21 zur Diagnose männlicher Fortpflanzungsstörungen .
26. Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8, der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 oder der Antikörper nach den Ansprüchen 20 oder 21 zur Therapie männlicher Fortpflanzungsstörungen.
27. Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 8, der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 9 bis 12 oder 14 oder der Antikörper nach den Ansprüchen 20 oder 21 zur Kontrazeption.
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